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芽孢杆菌Bacillus是一类产生耐热、耐旱,并且抗紫外线和有机溶剂的好氧细菌[1],具有在不同环境下定殖与繁殖的能力[2],同时具备抵抗真菌和病原细菌等方面的优点[2-3]。芽孢杆菌是一种理想的生防菌,所产生的拮抗物质主要有抗生素、细菌素、细胞壁降解酶、其他抗菌蛋白及挥发性等物质[4],其中脂肽类抗生素是一大类重要的拮抗物质[5]。脂肽类抗生素理化性质稳定,对高温、强酸和弱碱具有一定的耐受能力[6],对胰蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶不敏感[7],表明它是一类稳定态物质。同时脂肽类抗生素可以杀灭病原细菌、真菌和病毒,是一类抑制肿瘤生长的生物活性物质[8],成为芽孢杆菌拮抗物质领域的研究重点。因此,获得高产量的脂肽类抗生素是目前开发芽孢杆菌的主要目的,芽孢杆菌的代谢活动受到多种因素影响,如培养基、初始pH值、温度、接种量、发酵时间、通气量以及发酵工艺等[9]。探索高产量脂肽物质的最佳发酵条件需要进行大量的实验,通过对不同温度、pH值、接种量、通气等条件的试验得到优化组合。目前,主要应用重量法和液相色谱法来衡量脂肽类产量高低。而脂肽类物质定量分析前需要把该物质从发酵液中分离出来,有酸沉降法、超滤法、色谱法、液膜分离法、泡沫分离法、吸附法以及双水相法等分离方法[10],其中酸沉降法(浓盐酸沉淀法)使用最广。芽孢杆菌代谢产生的脂肽类物质产量较低,大部分低于1 000 mg·L-1,有的甚至不足100 mg·L-1[11]。重量法灵敏度较低,需要从较大量的发酵液中分离脂肽类物质,菌体分离(培养结束)和脂肽物质分离(酸沉降后)都需要进行离心,多因素探索优化条件时离心的工作量非常大。液相色谱法虽然灵敏度和准确度均较高,但需要昂贵的液相色谱仪器,色谱测定条件的摸索也费时费工,并且需要有标准样品才能进行绝对定量,而目前市场上除了表面活性素(surfactin)外没有商品化的标准样品。在优化条件时,不需要很高绝对产量的准确度,主要是比较不同培养条件脂肽物质产量相对高低。因此,简单、快捷的产量评测方法可提高工作效率。本研究试图通过测定不同初始pH值的培养基、发酵液酸沉降前后有机碳总量,计算沉降前后有机碳的差值,来推算发酵液中脂肽类粗提物含量,探索一种简单、快捷评价脂肽类物质产量的方法。同时通过测定培养基、含菌体发酵液以及去菌体发酵液的有机碳含量,来评价碳的利用效率。虽然获得脂肽类物质是酵液的最终目的,但如果能探索到一种底物碳利用效率和脂肽物质产量双高的培养条件,可节约原料成本以提高经济效益,也可减少代谢过程中二氧化碳气体排放以保护大气环境。
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通过WK1对病源菌的抑制效果试验,间接确定WK1产脂肽类物质最高产量的发酵时间为72 h。对解淀粉芽孢杆菌WK1与病原菌的平板对峙培养发现,代谢产物通过破坏菌丝和孢子细胞壁、细胞膜,使细胞原生质泄露,菌丝和孢子萎缩的方式抑制山核桃干腐病原菌Bacillus dothidea的生长[11]。因此,将除菌后发酵液直接混入培养基可间接衡量代谢物的产量,通过发酵液对病原菌的抑制效果试验可确定最高产量的发酵时间。观察含有发酵液(48,60,72 h)培养基上病原菌的生长情况(图 1和表 1)发现:发酵液对病原菌生长均有抑制作用,随着培养时间的增加抑制率逐渐增加,1~5 d内抑制率增速快,抑制效果显著,5~10 d内增速变缓,甚至48与60 h共2个处理在第10天出现下降。这是因为开始接种的是单菌落病原菌,1 d时间内繁殖的数量有限,但随着时间的延长病原菌数量不断增加,而代谢产物的脂肽浓度有限,所以病原菌数量增加后抑制效果减弱。综合1~10 d的结果,WK1的发酵时间越长抑制效果越好,在72 h抑制率达到最高值,效果最为显著,培养5和10 d时的抑制率达到83.3%和84.9%,对于抗生素筛选的效果而言,已经达到较强的水平。在解淀粉芽孢杆菌HAB-7的抑菌试验中,经优化后最佳培养条件对芒果炭疽菌的抑制率达到78.3%[14]。大量研究表明[15-17]:解淀粉芽孢杆菌的最优发酵时间都在72 h以内,且在本实验中60 h的抑制率已经达80%,继续增加发酵时间对抑制率的提升不大,且会增加发酵成本。
发酵时间/h 菌落直径/cm 1 2 3 4 5 6 10 d ck 0.5(0.0) 1.0(0.0) 2.0(0.0) 3.5(0.0) 4.8(0.0) 5.8(0.0) 8.6(0.0) 48 0.5(0.0) 0.5(50.0) 0.5(75.0) 0.9(74.3) 1.0(79.2) 1.2(79.3) 2.1(75.6) 60 0.5(0.0) 0.5(50.0) 0.5(75.0) 0.9(74.3) 0.9(81.3) 1.0(82.75) 1.8(79.1) 72 0.5(0.0) 0.5(50.0) 0.5(75.0) 0.8(77.1) 0.8(83.3) 0.9(84.5) 1.3(84.9) 说明:括号中为抑菌率(%) Table 1. Mean diameter and inhibition rate of pathogenic bacteria in PDA medium at different time
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初始pH值对发酵微生物的生长繁殖和代谢产物的合成有非常显著的影响。因此,选择最适合的初始pH值对微生物的培养就显得尤为重要。重量法测得不同初始pH值的培养基在72 h后脂肽物质的产量从高到低依次为pH 6,pH 7,pH 5(图 1),初始pH值为6和7条件下的脂肽物质的产量显著大于pH 5处理(P<0.05),pH值为6和7的发酵液酸沉降时沉淀明显比pH值为5的发酵液多,说明培养液pH值为5时对脂肽物质的生成不利。差减法计算得到不同处理脂肽物质产量差异规律与重量法一致,但产量比重量法高(图 1),初始pH值为5,6,7处理的差减法测定结果分别比重量法高69.9%,15.8%和17.0%。这是因为TOC能检测到溶液有机碳的微小变化,重量法则因为质量太少无法检测到微小变化,因此差减法相比重量法更加灵敏。2种方法的结果存在一定的相关性,但由于重量法的灵敏度较低,导致相关系数仅0.563 2(n=9)。
随着微生物生长繁殖脂肽类物质不断积累,微生物繁殖越多则代谢产量越多。pH值为5时产量低的原因可能是因为酸性环境不利于WK1生长。整个发酵过程中初始pH值为5的发酵液pH值始终低于6.0(图 2),而初始pH值为6和7的发酵液pH值在前24 h急速下降,之后快速回升,到48~56 h恢复到初始水平,之后继续上升,最后达8.14。发酵液pH值的下降主要是代谢过程中产生的有机酸引起的,在最初的24 h培养基中的葡萄糖被快速分解产生大量的有机酸,而之后这些有机酸又被微生物分解利用,溶液中的有机酸慢慢减少。另外,微生物的代谢过程产生氨,随着发酵过程的进行氨浓度增加,pH值逐渐回升。
Figure 2. Dynamics of liquid pH with increasing time of fermentation between different initial Landy medium pH
初始pH值为5处理含菌体发酵液的总有机碳质量浓度明显高于pH 6和pH 7处理(图 3),说明pH值为5条件下WK1代谢消耗最少,再次证明初始pH值为5处理不利于WK1生长。由于所有处理的初始有机碳质量浓度是相等的,微生物代谢越活跃,消耗的有机碳就越多。
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初始pH值为5的培养基中菌株WK1脂肽物质合成效率最低(162 mg·kg-1),排放的二氧化碳也最少(205 mg·kg-1),初始pH值为6和7的培养基中菌株WK1活动排放的二氧化碳相同,显著高于初始pH值为5的处理(P<0.05),pH 6培养基中菌株WK1脂肽物质合成效率高于pH 7培养基。Landy培养基有机碳质量浓度理论值为5 769.55 mg·L-1,重铬酸钾法和TOC分析仪测得Landy培养基初始有机碳质量浓度分别为4 933.30和5 252.43 mg·L-1,分别是理论值的85.51%和90.14%,说明2种方法均不能完全检测溶液中的全部有机碳。通过分析含菌体的发酵液有机碳质量浓度(图 3)以及酸沉降前后的总有机碳质量浓度(图 4)可知:初始pH值为5条件下有机碳质量浓度显著高于其他2个处理,说明pH值为5条件下的培养基中未被微生物同化利用的碳最高。综合图 1,图 3和图 4的结果得知:初始pH值为5条件微生物代谢利用的总碳、合成的脂肽类物质、排放的二氧化碳均为最少。
Figure 4. Comparison of total organic carbon in solution before and after lipopeptide being separated by acid deposition between treatments
由于重铬酸钾法和TOC法对同一溶液的测定结果存在差异,因此,计算差值时必须以同一种方法测定的结果计算。结果表明(表 2):初始pH值为5时培养基中菌株WK1脂肽物质合成效率最低(162 mg·kg-1),二氧化碳排放量也最少(205 mg·kg-1);初始pH值为6和7的培养基中菌株WK1的二氧化碳排放量相同,显著高于初始pH值为5的处理(P<0.05),但初始pH值为6的培养基中菌株WK1脂肽物质合成效率高于初始pH值为7处理,因此,初始pH值为6的培养基为最佳。由于初始pH值为6的处理二氧化碳排放量较高,后期实验可探索初始pH 5和pH 6之间菌株WK1脂肽物质合成效率的变化,有可能找到二氧化碳排放量较低,但又不影响脂肽物质合成效率的pH值。
pH 二氧化碳排放量/(mg·kg-1) 脂肽物质合成效率/(mg·kg-1) 5 205 b 162 b 6 700 a 234 a 7 700 a 219 a 说明:不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05) Table 2. CO2 emission and produced lipopeptide from organic carbon medium