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园林绿化废弃物资源化利用[1-2]已成为研究热点,其中堆肥化是一种比较理想的处理方式。由于园林绿化废弃物木质素含量较高、起始微生物数量较少等原因,堆肥效率较低,因此如何提高堆肥过程中的微生物数量成为推进园林绿化废弃物堆肥的关键[3-4]。添加微生物菌剂是提高堆体微生物数量最直接的方式之一。目前,针对木质素降解的菌剂较少,且多集中于液体菌剂。然而液体菌剂对无菌条件要求较高,运输及产品储存有诸多不便[5]。固体菌剂在生产和储存方面能弥补液体菌剂的不足,同时,固体菌剂生产成本更低、生产工艺也相对简单,对促进园林绿化废弃物堆肥化过程的优势更明显[6]。生产固体菌剂,除了设计固体发酵的培养基,还要优化其发酵条件,主要流程为试验设计、数学建模和优化设计3个部分[7]。合理的试验设计能用较少的试验数据进行建模,从而获取各因素范围内的最优解。已有研究对于固态发酵的优化多是使用响应面法[8-9]。但是有研究发现[10]:人工神经网络算法优化培养基比响应面法优化培养基验证结果更准确,误差更小。本研究拟采用单因素试验和正交试验确定作为固态发酵培养基碳源、氮源的较优种类和水平,然后根据碳氮源优化结果,通过单因素试验确定外加营养组分种类,最后采用均匀实验结合人工神经网络建模与优化,寻找2株木质素降解菌的外加营养组分接种量和最佳固体培养基发酵条件,以期得到最大发酵生物量,制作高效固体菌剂用于园林绿化废弃物堆肥。
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由图1可知:2株木质素降解菌菌丝中的核酸量与菌丝干质量在测试的范围之内可呈现良好的线性关系,说明通过测定D(260)来确定2株木质素降解菌固态发酵生物量的方法可行。菌株Q的线性方程为yQ=4.349 3x+0.044 6,R2=0.998 6;菌株A的线性方程为yA=4.081 4x+0.046 3,R2=0.995 7。
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由图2可知:菌株A的4种碳源处理的D(260)差异不显著(P>0.05),但木质素磺酸钠的D(260)最高,分别较米糠、玉米粉和蔗糖处理高出14.900%、8.800%和8.200%。菌株Q的3种碳源处理的D(260)差异不显著(P>0.05),但玉米粉的D(260)最高,分别较木质素磺酸钠、米糠和蔗糖处理高出6.900%、3.600%和0.900%。菌株A为构巢曲霉,分泌的木质素降解相关酶系降解木质素效果显著[16-17],同时木质素磺酸钠是木质素磺化改性得到的衍生化产品,因此,相比其他3种碳源,木质素磺酸钠更有利于促进菌株A细胞的快速生长,获得较高的菌丝生物量[18]。菌株Q在以玉米粉为碳源时的生物量最高,可能是因为玉米粉中含有大量的糖分、淀粉、多种矿质元素和维生素, 这些营养物质有利于菌株Q的生长繁殖[19]。因此,选择木质素磺酸钠作为菌株A的碳源,选用玉米粉作为菌株Q的碳源。
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由图3可知:菌株A的4种氮源处理的D(260)差异不显著(P>0.05),但豆饼粉的D(260)最高,分别较蛋白胨、酒石酸胺和尿素处理高出4.300%、3.000%和15.600%。菌株Q的D(260)在以豆饼粉为氮源时最高,且与其他处理差异显著(P<0.05),分别较蛋白胨、酒石酸胺和尿素处理高出6.700%、8.200%和14.400%。豆饼粉含大量碳水化合物、蛋白质及少量异黄酮类物质和可溶性多糖,可作为发酵的氮源及生长因子,有利于生物量的积累[20-21]。同时,豆饼粉来源稳定,价格低廉,能够快速被微生物利用,因此,选用豆饼粉为后续实验中菌株A和菌株Q的氮源。
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由图4所示:菌株A在以木质素磺酸钠为最佳碳源时,添加量为2.500%、5.000%、10.000%处理间的D(260)差异不显著(P>0.05),但是数值相对较高。因此,菌株A的木质素磺酸钠选用2.500%、5.000%、10.000%添加量进行正交试验。菌株Q在以玉米粉为最佳碳源时,添加量为5.000%时D(260)值最高,与其他处理差异显著(P<0.05),0.625%、2.500%的D(260)也相对较高,因此,菌株Q的玉米粉选用0.625%、2.500%、5.000%添加量进行正交试验。菌株Q在添加量为5.000%时生物量达到最高,可能是由于在培养空间一定时,玉米粉的添加量越多,通气量降低,导致生物量的积累下降从而使菌株Q的生长受到了一定的抑制[16]。由图5可知:菌株A以豆饼粉为最佳氮源时,5种不同添加量处理的D(260)差异不显著(P>0.05)。添加量为10.000%时D(260)最高,但是从经济角度考虑,最终选择豆饼粉添加量为1.250%、2.500%、5.000%进行正交试验。菌株Q以豆饼粉为最佳氮源时,添加量为1.250%、5.000%、10.000%时的D(260)显著高于另外2个添加量,因此选择这3个梯度进行正交试验。
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由表1和表2可知:菌株A的碳氮源添加量为木质素磺酸钠5.000%、豆饼粉5.000%时D(260)最大,高达0.249。菌株Q的碳氮源添加量为玉米粉0.625%、豆饼粉10.000%时D(260)最大,高达0.261。因此选定菌株A的碳氮源添加量为木质素磺酸钠5.000%和豆饼粉5.000%,菌株Q的碳氮源添加量为豆饼粉10.000%和玉米粉0.625%。
处理 豆饼粉/% 木质素磺酸钠/% D(260) T1 1.250 2.500 0.228±0.009 T2 1.250 5.000 0.241±0.001 T3 1.250 10.000 0.207±0.018 T4 2.500 2.500 0.216±0.007 T5 2.500 5.000 0.213±0.008 T6 2.500 10.000 0.245±0.010 T7 5.000 2.500 0.237±0.010 T8 5.000 5.000 0.249±0.003 T9 5.000 10.000 0.241±0.007 Table 1. Orthogonal design experiment of strain A L9 (34)
处理 豆饼粉/% 玉米粉/% D(260) T1 1.250 0.625 0.101±0.003 T2 1.250 2.500 0.224±0.006 T3 1.250 5.000 0.214±0.005 T4 5.000 0.625 0.101±0.003 T5 5.000 2.500 0.162±0.008 T6 5.000 5.000 0.232±0.020 T7 10.000 0.625 0.261±0.003 T8 10.000 2.500 0.191±0.002 T9 10.000 5.000 0.102±0.003 Table 2. Orthogonal design experiment of strain Q L9 (34)
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由图6表明:菌株A的5种外加营养组分处理的D(260)差异不显著(P>0.05),但外加CaSO4、MgSO4、KH2PO4时的D(260)值最大,因此,这3种被定为最佳外加营养组分。微生物除了碳源和氮源,还需要一定量的无机盐来调节其生长代谢。镁盐作为许多重要酶的激活剂能够影响蛋白质的合成以及基质氧化;磷则是核酸和蛋白质的重要组成成分,能够影响微生物的生长[22],这与本研究结果一致。
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在以2.2.4和2.3实验结果为前提的条件下,设计6因素5水平10组的均匀实验。再通过神经网络对所有数据进行预测,得到实测值与仿真值的对比(表3和表4)。结果发现:各观察值与测量值误差较小,基本相同。综上,该模型预测值具备参考性。
试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4110 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4109 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4500 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4499 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4800 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4801 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4430 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4431 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3860 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3859 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4620 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4619 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4630 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4635 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2930 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2929 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4450 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4453 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4230 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4231 Table 3. Strain Q uniform test design and results
试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) CaSO4 MgSO4 KH2PO4 接菌 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 Table 4. Strain A uniform test design and results
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如表5所示:按照人工神经网络算法模型预测的优化后固体发酵培养基进行实验验证,该优化条件下菌株Q的D(260)为0.6020,实测值为0.5960,误差为1.000%;预测得到菌株A的D(260)为0.4850,实测值为0.4780,误差为1.500%。
试验号 实际用量/% D (260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 菌株Q仿真值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.6020 菌株Q实测值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.5960 菌株A仿真值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4850 菌株A实测值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4780 Table 5. Optimization results of artificial neural network
Preparation of two strains of lignin-degrading bacteria solid inoculum
doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210311
- Received Date: 2021-04-21
- Rev Recd Date: 2021-08-16
- Available Online: 2022-03-25
- Publish Date: 2022-03-25
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Key words:
- lignin-degrading bacteria /
- optimization /
- solid inoculum /
- fermentation
Abstract:
Citation: | LI Yalin, LI Suyan, SUN Xiangyang, HAO Dan, CAI Linlin, CHANG Xiaotong. Preparation of two strains of lignin-degrading bacteria solid inoculum[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 364-371. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210311 |