Anti-WSSV effect of inactivated preparation of white spot syndrome virus (WSSV) on Procambarus clarkii

LAI等^[15]研究可知：超声破碎WSSV后获得的蛋白质和核酸可以感染克氏原螯虾并导致其死亡，其有效性与完整的WSSV病毒一样。因此，本研究对病毒进行超声破碎，之后进行BEI灭活，观察BEI灭活制剂是否具有与超声破碎制剂相同的抗WSSV效果。本研究分为口服和注射免疫，免疫7 d后再进行WSSV攻毒感染。具体分组如表1所示。克氏原螯虾购于安徽宣城，养殖于充气水箱中，水温为25 ℃，每日投喂克氏原螯虾专用饲料。

取经过WSSV感染的克氏原螯虾的尾部肌肉，参考ZHU等^[16]的方法提纯WSSV。使用高速分散器将WSSV提纯液快速分散呈匀浆，用超高速冷冻离心机在6 000 g下离心10 min，分离上清液后再次离心，重复3次。离心完成后，肌肉组织已基本去除，WSSV病毒存在于上清液中。将上清液通过300目细胞筛过滤分散后，用离心机在6000 g下离心30 min。再将分离出的上清液通过450 nm的滤膜后，用离心机在30 000 g下离心30 min，最后得到WSSV病毒粒子的白色沉淀。将提取到的病毒粒子用10 mL 磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶解后，使用FS 200 T超声波均质机(上海盛溪)破碎溶解的病毒颗粒。破碎完成后，在30 000 g条件下对超声破碎的病毒粒子离心30 min，离心得到的上清液便是WSSV病毒粒子的破碎液，使用100 nm滤膜进行过滤，即为WSSV超声破碎液。

将0.12 mol·L⁻¹BEI溶液按1∶60的体积比加入到病毒液中，使BEI的最终分子浓度为2 mmol·L⁻¹。在37 ℃下恒温灭活3个不同时间段(1、12、24 h)的病毒液，期间每2 h搅拌1次。经过规定时间后，剩余BEI以50∶1的体积比例加入质量分数2%的硫代硫酸钠使灭活中止，制成WSSV灭活制剂。每100 mL WSSV灭活制剂中含45 mg WSSV粒子，WSSV灭活制剂中WSSV的质量浓度为0.45 g·L⁻¹。

克氏原螯虾养殖于(25±1) ℃控温玻璃缸中，随机分成10组，每组20只，每组设3个重复，投喂配合饲料暂养7 d。将WSSV超声破碎液与饲料混合均匀，混合5 min后用蜂胶液包被，风干10 min后投喂受试克氏原螯虾。将WSSV提纯液与克氏原螯虾饲料混合均匀，混合5 min后用蜂胶液包被，风干10 min后投喂受试克氏原螯虾。7 d后所有实验组进行攻毒研究，期间保证每组克氏原螯虾摄食等量的饲料，同时记录每日死亡率。

从表2可见：经BEI处理WSSV 24 h后，注射和口服免疫克氏原螯虾的死亡率为0，说明没有感染性；而BEI灭活WSSV破碎处理液1 h的注射死亡率为100.0%，口服死亡率为10.0%，BEI处理12 h的注射死亡率为33.3%，口服死亡率为0，说明口服免疫更安全，注射免疫危险性比较高，但是BEI处理时间过短也会使病毒没有完全灭活，因此BEI灭活24 h较为安全，后续实验均采用BEI灭活WSSV破碎液24 h的制剂。

从表3可见：WSSV无论是通过口服感染还是注射感染，死亡率均为100%。用BEI灭活WSSV破碎液1和12 h分别采用注射或口服免疫克氏原螯虾，虽然免疫过程中死亡了一些，但将活着的克氏原螯虾7 d后攻毒，口服的存活率为30%~40%，注射的效果较差，最后的存活率为20%(图1)。以上结果说明灭活时间延长后，不但灭活更完全，而且灭活制剂的保护效果更好，因此在后续的研究中采用了24 h的灭活时间。用BEI灭活WSSV破碎液24 h制成灭活制剂，采用注射或口服免疫克氏原螯虾7 d后分别注射、口服攻毒，结果发现WSSV灭活制剂的口服免疫效果明显，比起注射WSSV组和口服WSSV组的100%死亡率，注射免疫的克氏原螯虾在攻毒后存活率为40%，口服免疫的存活率为50%(图2)；经灭活制剂免疫7 d后，再去感染WSSV，极大地降低了死亡率，免疫效果比较明显。

Figure 1.  Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

Figure 2.  Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV immunization

已有研究表明：WSSV囊膜蛋白可以诱导甲壳动物对WSSV产生抵抗力，从而大幅提高WSSV攻毒后的成活率；多糖(如葡聚糖、壳聚糖、甲壳素)也被认为能提高甲壳动物的免疫力，并被广泛用于提高甲壳动物抗细菌性和病毒性疾病的研究^[6−8]。由BEI灭活的WSSV灭活制剂，可以保护WSSV囊膜蛋白的完整性^[16]，使其免疫原性最大限度不受破坏。

本研究表明：用BEI灭活的WSSV灭活制剂免疫接种克氏原螯虾7 d后，可在一定程度上保护克氏原螯虾免受WSSV的侵害。克氏原螯虾对WSSV非常敏感，通过口服和注射途径的克氏原螯虾死亡率都超过90%^[17]。在本次研究中，随着灭活时间的延长，注射和口服2 mmol·L⁻¹ BEI灭活WSSV制剂的克氏原螯虾存活率越来越高，说明只要灭活时间足够，使用BEI灭活的WSSV灭活制剂可以成功地保护克氏原螯虾免受WSSV的侵害。NAMIKOSHI等^[11]使用甲醛灭活的WSSV也获得了类似的结果，受免疫保护的对虾Penaeus japonicus在WSSV攻毒实验中存活率显著升高。同样，紫外线灭活的WSSV对日本对虾Marsupenaeus japonicus也有一定的免疫保护效果^[18]。这就引发了甲壳动物中是否存在免疫记忆的猜想^[19]，但要证实其中的免疫机制还有待更深入的研究。

综上所述，BEI灭活的WSSV免疫克氏原螯虾的效果十分明显，并且口服免疫的保护效果优于注射免疫。与BEI的灭活纯病毒液24 h相比，BEI灭活的WSSV破碎液减少了灭活时间，但最终也是口服免疫的效果较好。用BEI灭活的WSSV灭活制剂饲喂克氏原螯虾后，可以有效地降低克氏原螯虾感染病毒的死亡率，说明用BEI灭活的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV具有保护性效果，可成为抗白斑综合征的一种免疫策略。

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