Analysis of molecular networks for dark germination of shallow photodormant Nicotiana tabacum seeds based on transcriptomic and proteomic data

野生型烟草Y85种子由贵州省烟草科学研究院提供。为避免光休眠、成熟度和后熟期差异对实验结果造成影响，种子均为授粉后40 d收获，在40 ℃机械烘干36 h脱粒。

采用质量分数为0.5%硫酸铜溶液进行种子消毒处理；15 min后，用蒸馏水反复冲洗已消毒的种子；最后用滤纸吸附种子表面水分待用。配置质量分数为0.8%的琼脂溶液，进行高压灭菌，将灭菌液倒入直径为9 cm的培养皿中制作琼脂发芽床。每个处理设3次重复，每次重复100粒种子，以10×10模式均匀点播在琼脂床表面，然后将培养皿放置在人工气候箱中(江南仪器RXZ-36C)，设置人工气候箱的温度为25 ℃，光照强度为0 lx，相对湿度为80%，进行种子萌发实验。

分别收集暗萌发第2天和第4天的种子作为转录组测序的样本。使用TRIzol试剂(Tiagen Biochemical)提取种子的总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Science)评估纯度和定量，同时使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)评估RNA的完整性。使用TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina)构建基因库。转录物测序和分析由APTBIO生物技术有限公司(中国上海)完成。文库在Illumina HiSeq X Ten平台上进行测序，产生150 bp的成对末端读数。使用Trimomatic^[9]处理FASTQ格式的原始读数，并为每个样品生成原始读数。通过从原始数据中去除低质量的读数和poly-N的读数，获得准确的读数用于深入分析。使用HISAT2^[10]将处理后的读数映射到野生型烟草Y85基因组上。使用Cufflinks^[11]计算每个基因的每千碱基转录每百万映射读取的片段值^[12]，使用HTSeq-Coun获得每个基因的读数。差异表达分析使用DESeq (2012)R^[13]进行。P＜0.05和差异倍数(F_C)＞2.0或＜0.5被用作差异表达的阈值。对差异表达基因(DEGs)进行了层次聚类分析，以探索基因表达模式。随后，应用数学模型对转录组数据进行分析。首先，筛选出在2和4 d发芽的DEGs，根据超几何分布，使用R软件包对DEGs进行了基因本体(GO)富集及京都基因和基因组百科全书(KEGG)路径富集分析。

将种子样品在液氮中磨成细粉，用3 mL含有1 mm 苯甲基磺酰氟的提取缓冲液[50 mmol·L⁻¹ 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，pH 8.0，0.1 mol·L⁻¹ 氯化钾(KCl)，5 mmol·L⁻¹ EDTA，质量分数为30%蔗糖]提取500 mg样品，持续2 h。在13 000 r·min⁻¹下离心15 min后，将上清液转移到新的试管中。在上清液中加入5倍体积的体积分数为10%冷TCA丙酮，在20 ℃下保存2 h，然后以13 000 r·min⁻¹离心15 min。用体积分数为90%的冷丙酮冲洗，在20 ℃下放置30 min，然后以13 000 r·min⁻¹离心5 min。这个步骤重复3次。

冻干后，最终的颗粒在80 ℃下储存或立即进行分析。将蛋白质样品加入0.5 mL标准缓冲液(质量分数为4%十二烷基硫酸钠，1 mmol·L⁻¹ 二硫苏糖醇，150 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，pH 8.0)，在沸水中孵育5 min，然后超声处理10次(持续时间为5 min，时间间隔为5 min)。

在13 000 r·min⁻¹下离心40 min后，用聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白质浓度。用200 μL 尿酸缓冲液(8 mol·L⁻¹尿素，150 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，pH 8.0)稀释约200 μg蛋白质样品，在14 000 r·min⁻¹下离心30 min，然后加入200 μL UA缓冲液(50 mmol·L⁻¹碘乙酰胺)。加入100 μL UA缓冲液，在黑暗中孵化30 min，离心20 min，重复2次。加入100 μL的溴酚蓝缓冲液(50 mmol·L⁻¹三乙基碳酸铵，pH 8.5)，离心20 min。此步骤重复2次，然后加入40 μL胰蛋白酶溶液(在40 μL DS缓冲液中加入2 μg Pro mega的胰蛋白酶)。样品在37 ℃下培养约17 h，并通过离心收集多肽。用BCA法测定多肽含量。光密度[D(280)]为1.1，表示1 g·L⁻¹。使用iTRAQ (Applied Biosystems) 4plex试剂盒的标准方案对每个样品约100 μg多肽分别进行标记^[14]。

使用TIANGEN RNA Prep Pure植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取总RNA。使用NanoDrop-2000测定RNA的浓度和纯度。使用TaKaRaPrimeScript™ II First Strand cDNA Synthesis Kit将提取的RNA进行逆转录。使用TaKaRaTBGreen®Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus), Batch Fluorescence Quantification Kit 20 µL反应系统进行RT-PCR：10 µL TB Green Premix Ex Taq(2×) (TliRNaseH Plus)，0.4 µL ROX参考染料(50×)，2 µL稀释至40 mg·L⁻¹的cDNA，0.8 µL上游和下游引物，其余用水补足。RT-PCR反应的条件是在95 ℃下预变性0.5 min，95 ℃循环5 s，58 ℃循环30 s。使用Step One Plus实时PCR仪测定每个基因的相对表达水平，每个样品重复3次。根据LIVAK等^[15]的方法计算相对表达水平^[15]。

结果(图1和图2)发现：胚根突出前后种子的差异表达mRNA与蛋白可划分为16个象限，包括5种类型。其中，转录和翻译两者同时无差异的蛋白(基因)最多；其次为仅在蛋白或者mRNA一种水平下差异表达的蛋白(基因)；再次为同时下调的差异蛋白(基因)，有24个；再次为同时上调的差异蛋白(基因)，有15个；而表达趋势相反的差异蛋白(基因)最少，仅为3个。上述结果说明：黑暗条件在转录和翻译水平同时上调或者下调的蛋白(基因)数量相对较少，而更多的基因是在转录或者翻译单一水平表达参与调控胚根突出。

Figure 1.  Quadrant map of differentially expressed genes and differentially expressed proteins

Figure 2.  Schematic diagram of Wien analysis of co-upregulated (co-downregulated) differentially expressed genes (proteins)

本研究重点关注了胚根突出后转录和翻译共同上调或者下调的蛋白(基因)，共同上调表达的蛋白(基因)有β-葡糖苷酶(BoGH3B)、内甘露聚糖-1,4-β-甘露糖苷酶1 (MAN1)、甲基转移酶 PMT21 (ERD3)、MLP-like protein 31 (MLP31)、脂肪酸结合蛋白1 (FAP1)、非特异性脂质转移蛋白C、60伴侣蛋白2β亚基、叶绿体(CPN60B2)、线粒体解偶联蛋白1 (PUMP1)、豇豆球蛋白(CYSEP)、过氧化物酶24 (PER24)、B8网状内皮素蛋白(RTNLB8)等(图2和表1)。而共同下调表达的蛋白(基因)有坏死稳定素1 (NEC1)、母体植株开花时间调控蛋白(MFT)、胚胎晚期丰度蛋白63 (ECP63)、Peroxygenase (SOP1)、跨膜蛋白205 (TMEM205)、胚胎晚期丰度蛋白25 (LE25)、种子维生素内含蛋白(SBP65)、应激蛋白(At3g01520)、莨菪碱6-双加氧酶(H6H)、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶3 (PARP3)等(图2和表1)。

对同时上调或下调的蛋白(基因)进行GO和KEGG富集，富集到的信号通路主要包括果糖和甘露糖代谢、甘露聚糖分解、内甘露聚糖-1,4-β-甘露糖苷酶活性等，发生功能的细胞成分包括细胞外区域、线粒体、膜的组成部分和叶绿体等(图3)。说明在黑暗下种子萌发可能依赖于甘露聚糖分解代谢，而线粒体和叶绿体2个细胞器在种子暗萌发中可能均具有一定的作用。

Figure 3.  Signal enrichment pathway diagram of co-up-regulated (down-regulated) differentially expressed genes (proteins)

对差异蛋白和差异mRNA/基因进行非监督层次聚类(图4)表明：转录组和蛋白组测序样品的重复性较好。同一处理样品可以通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇中的差异蛋白或基因可能具有相似的生物学功能。通过 RT-PCR进一步验证了转录组测序的准确性。由图4可知：第2天转录组测序结果与RT-PCR结果的皮尔逊相关系数为0.44，而第4天转录组测序结果与RT-PCR测序的皮尔逊相关系数为0.96，但随机挑选的10个基因RT-PCR验证结果与转录组测序结果表达趋势一致(图5)，因此认为测序结果是可靠的。

Figure 4.  Clustering analysis of mRNA and protein expression

Figure 5.  Validation of transcriptome sequencing results by RT-PCR

光照是调控种子萌发的重要环境信号，对于嗜光性种子，未完成后熟其种子萌发依赖于光照，如拟南芥、生菜Lactuca sativa和烟草种子等；对于厌光性种子，其萌发被光照所抑制，如番茄和岩芥菜Brassica juncea种子等；对于光中性种子，光照与否种子均可萌发，如玉米Zea mays、水稻Oryza sativa、小麦Triticum aestivum等主要粮食作物种子^[16]。DONG等^[8]研究发现烟草种子萌发普遍对光比较敏感，新采收种子暗发芽率普遍＜50%。宋碧清等^[17]也表明：烟草种子萌发存在光敏感类型，但不敏感品种居多，这可能是由于栽培环境差异导致。DONG等^[8]研究发现：烟草种子萌发光敏感型不仅存在基因型差异，而且存在强烈的母体环境效应，在遮阴环境下成熟的浅光休眠烟草种子萌发率显著提高。与光中性种子类似，浅光休眠烟草种子在光和暗环境下均可萌发，但光可以提高萌发比率和加快萌发速度^[18]。本研究也发现：浅光休眠烟草种子在暗下可萌发，发芽率达50%以上，这与上述研究结果一致。

光通过影响ABA和GA信号和水平来控制种子萌发。在拟南芥中，黑暗条件下PIF1强烈抑制种子萌发。光照下，PHYA和(或)PHYB被光激活，进而促进PIF1的降解，导致GA/ABA升高，GA信号被激发，促进种子萌发^[19−20]。本研究未发现光敏色素协同植物激素ABA和GA信号通路基因(蛋白)参与调控烟草种子暗萌发。2个阶段差异表达基因达到数千个，而差异蛋白仅数百个，且前人在拟南芥种子萌发时研究表明：光主要在转录层面调控ABA和GA代谢和信号基因表达^[19−20]。因此，本研究对转录组数据进行单独分析，但也未富集到光介导的ABA和GA信号通路。说明浅光休眠烟草种子暗萌发可能存在一种新的调控机制。

在种子暗萌发前后多个基因和蛋白表达水平发生了共表达。LEA 广泛参与种子成熟脱水的调控，在种子萌发期间迅速消失^[21]。本研究发现：ECP63、LE25和SBP65等3类胚胎晚期丰度蛋白(基因)在烟草种子萌发后表达量显著下调。MFT (MOTHER-OF-FT-AND-TFL 1)抑制拟南芥种子萌发^[22]。而本研究也发现：MFT抑制烟草种子萌发，这与拟南芥种子研究结果一致。β-1,3-葡聚糖酶是烟草种子萌发时胚乳破裂的关键酶，它的表达介于种皮破裂后和胚乳破裂前^[23]。番茄种子萌发过程中胚根突破种皮需要水解酶软化胚乳帽，与此过程有关的蛋白是 expansion和内β-甘露聚糖酶^[24]。本研究发现：水解酶MAN1无论是转录还是翻译水平在胚乳破裂前显著上调表达，这与上述研究结果类似，说明水解酶亦参与调控黑暗条件下的烟草种子萌发。此外，本研究还筛选到烟草种子暗萌发的正调控因子BoGH3B、ERD3、MLP31、FAP1、CPN60B2、PUMP1、CYSEP、PER24、RTNLB8等和负调控因子NEC1、SOP1、TMEM205、At3g01520、H6H、PARP3等，关于这些基因(蛋白)调控种子萌发的功能还未见报道，可通过遗传学实验进一步证实。

本研究通过整合转录组和蛋白组数据，发现烟草萌发前后蛋白和mRNA表达差异存在5种类型，其中共同上调表达的蛋白(基因)有BoGH3B、MAN1、ERD3、 MLP31、FAP1等，共同下调表达的蛋白(基因)有NEC1、MFT、ECP63、SOP1、LE25、SBP65等。基因富集分析和调控网络预测表明：在黑暗下，种子萌发依赖于甘露聚糖分解代谢，线粒体和叶绿体2个细胞器在种子暗萌发中具有关键作用。