Programmed cell death events during the petal senescence of Osmanthus fragrans ‘Huangchuan Jingui’

选取华中农业大学校园内40~50年生、健康、无病虫害、四周光照均匀的‘潢川金桂’植株，分别采收不同开花阶段的桂花花朵，收集花瓣后称量，保存在冰盒或者液氮中，立即带回实验室，进行指标的检测并存至−80 ℃超低温冰箱备用。

参考ZOU等^[4]桂花开花级数的划分体系，将 ‘潢川金桂’开花级数划分为：①铃梗期(花苞期)，花朵呈紧闭的花苞状，未展开；②初花期，花朵微张，呈半开放状态；③盛花期，花瓣完全展开，柱头产生黄色黏性物时进行授粉，花径达到最大；④盛花末期，花瓣略微开始失水，有的花瓣伴随褐斑出现；⑤萎蔫期，花朵失水萎焉并留在树体上，花瓣呈黄褐色，子房略膨大。

参考ZOU等^[4]的方法测定ROS质量摩尔浓度(nmol·g⁻¹)，参考林植芳等^[8]的方法测定过氧化氢质量摩尔浓度(nmol·g⁻¹)。称取新鲜花瓣组织0.2 g，按材料与提取液1∶1的质量比加入4 ℃下预冷丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管10 000 r·min⁻¹离心10 min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。用Ti₂(SO₄)-浓氨水法制作过氧化氢标准曲线，取样品提取液1 mL用于反应测定。

参考ZOU等^[5]的方法，以小鼠细胞色素c单克隆抗体(Merck & Co., Inc)作为一抗(1∶200稀释)，用封闭液按1∶50 000稀释相应的HRP标记羊抗小鼠二抗。参照ZOU等^[5]的方法，采用高效液相色谱法检测ATP质量分数(ng·g⁻¹)。

参考ZOU等^[4]的方法测定桂花乙烯释放量(nL·g⁻¹)。

参考YAMADA等^[9]的方法，采用流式细胞法测定不同衰老时期桂花花瓣中核含量(DNA团块)的变化。将桂花花瓣置于细胞核提取缓冲液中，将提取物通过50 μm尼龙网过滤，收集分离介质和DNA凝聚物，DAPI染色后，将溶液旋涡混合，用流式细胞仪分析从细胞核中分离出的DNA，计算并分析5 000个样品细胞中所含有核的DNA相对含量。流式细胞仪的仪器型号为BECKMAN COULTER (Cell Lab Quanta^TM)，仪器条件为：Ev 2.36；FL1 5.12、5.9；SS 5.12；5 000个细胞。

每处理3次生物学重复，数据为平均值±标准误。用SAS v.8.0.软件进行方差分析和多重比较分析(Duncan, P=0.05)。

在‘潢川金桂’桂花开花至衰老过程中，超氧阴离子质量摩尔浓度在初花期显著上升到最大值，为344.6 nmol·g⁻¹，其后逐渐降低至200 nmol ·g⁻¹(图1 A)。在‘潢川金桂’初花期花朵刚开放时，过氧化氢的质量摩尔浓度也显著地迅速上升到最大值，为437 nmol·g⁻¹，此时过氧化氢质量摩尔浓度是花苞期的3倍。在随后衰老过程中，过氧化氢又下降到花苞期的水平(图1 B)。

Figure 1.  Changes in content of free radicals (O₂ ^·−, A) and hydrogen peroxide (H₂O₂, B) in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

如图2所示：从线粒体释放细胞质中的细胞色素c在初花和盛花期变得明显，表明此时已经发生了线粒体细胞色素c的泄漏；在盛花末期开始逐渐减弱，在萎蔫期的花瓣中则逐渐消失，可能与此时花瓣衰老细胞膜功能逐渐丧失有关。

Figure 2.  Release of cytochrome c during the petals senescence of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

如图3 所示：在‘潢川金桂’的铃梗期花瓣中测量到较高的ATP水平(63.9 ng·g⁻¹)，但随着花朵的开放至萎蔫期时，‘潢川金桂’花瓣中的ATP质量分数为31.8 ng·g⁻¹，只有花苞期的一半。由此可见，在桂花花瓣衰老过程中ATP消耗或缺乏可能是PCD发生的早期信号。

Figure 3.  ATP content in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

在‘潢川金桂’开放及衰老过程中，乙烯释放量从盛花期开始逐渐上升；盛花末期花瓣出现可见的外观衰老特征时，其释放量显著增加到35.9 nL·g⁻¹·h⁻¹，而在萎蔫期时上升至最大值，为91.2 nL·g⁻¹·h⁻¹(图4)，因此乙烯释放类型表现为典型的末期上升型，其释放量的增加可能与花瓣晚期PCD事件的发生相关。

Figure 4.  Ethylene production in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

如图5所示：DNA相对含量在开花早期相对稳定，而随着花瓣衰老进程的发展，核DNA相对含量逐渐降解，直到萎蔫期花瓣的核DNA基本消失，暗示着核DNA完全降解。

Figure 5.  DNA content the petals senescence of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

花瓣衰老标志着花朵生命的最后阶段，是发育相关的PCD^[9]。PCD的诱发和执行过程都常常伴随一系列典型的生理、生化、形态学上的变化以及特征事件^[10-11]。在动物细胞PCD进程中，ROS可以作为信号分子激活线粒体上非特异性的通透性孔道(PTP)开放^[11-17]，从而造成线粒体中细胞色素c和凋亡诱导因子(AIF)释放到细胞质中，而后细胞色素c与凋亡酶激活因子(Apaf-1)结合，从而促使细胞发生PCD^[10]。在本研究中,‘潢川金桂’活性氧含量在初花期急剧增加，可能是桂花花瓣PCD早期诱导因子。作为线粒体中电子传递链的重要组成成分，细胞色素c泄露会导致电子传递链受阻，线粒体功能活性下降，从而导致ATP减少^[18]，最终加快花瓣衰老。在‘潢川金桂’花瓣衰老过程中，细胞质中细胞色素c逐渐积累，至盛花期达到最大，ATP水平从初花期开始持续下降，说明此时线粒体功能活性已逐渐丧失。在郁金香花瓣中，能量损耗也被认为是诱发细胞程序性死亡的早期信号^[15]。

有些不结实的桂花栽培品种，盛花后2~3 d，在花瓣仍然具有膨压时便脱落^[5-6]；而在大多结实的桂花栽培种中，通常以花瓣萎蔫为衰老特征。乙烯是一种促进成熟与衰老的激素，也是导致花瓣发生细胞程序性死亡的因素之一，在促进DNA片段化、导致花瓣脱落和枯萎等方面发挥着作用^[12]。研究表明：大多数植物的花瓣脱落都对乙烯敏感，且受到内源乙烯的调控^[19-20]。在‘柳叶金桂’衰老过程中，乙烯的增加导致花瓣细胞中液泡结构损坏，在外观上表现为花瓣褐化和失水萎蔫^[4]。也有研究发现：花瓣明显可见的萎蔫常常伴随着乙烯峰骤变，该乙烯骤变多又与授粉结实有关^[21-23]。在本研究中，当结实型桂花品种‘潢川金桂’萎蔫期花瓣内乙烯释放量增加到最大值时，对应的外观形态上表现出枯萎、褐化，细胞内部发生核DNA的降解等现象，说明乙烯可能是导致结实型桂花花瓣衰老的主要执行因子。在月季Rosa × hybrida花瓣程序性死亡的研究中发现：施用外源乙烯可以诱导ACC基因的表达，促进内源乙烯的生物合成，从而加速PCD进程^[24]。

DNA断裂和降解作为PCD发生的标志性特征之一^[25]，常表现出经典的“DNA ladders”，如唐菖蒲Gladiolus、六出花Alstroemeria和飞燕草Delphinium belladonna^{[9, 26-27]}；而有些植物衰老过程中并没有出现“DNA ladders”，如矮牵牛Petunia^[28-29]。在‘柳叶金桂’的花瓣衰老过程中也未检测到“DNA ladders”，但通过原位末端标记法(TUNEL)发现：其花瓣在盛花末期开始发生明显的DNA断裂和降解；且其DNA降解受内源乙烯调控^{[4, 7]}。在本研究中，花瓣衰老后期乙烯的骤变与后期DNA相对含量的下降，说明乙烯可能促进了“潢川金桂”花瓣DNA的降解，在矮牵牛^[30]和豌豆Pisum sativum^[31]中也有类似报道。

本研究探索了结实桂花品种‘潢川金桂’衰老的PCD特征，表明ROS激发、细胞色素c释放和ATP质量分数下降是早期PCD诱导因子；乙烯跃变可能作为晚期作用因子促进花瓣细胞的失水、萎蔫和DNA降解。