Correlation analysis of test weight and other quality traits and candidate gene mining in 517 maize germplasms

以 517 份玉米种质资源为材料，其中包括 368 份浙江地方玉米种质以及 149 份国内外骨干自交系。对玉米种质进行自交授粉 4 代。2022年4月种植于浙江省东阳市(29.28′N，120.33′E)、11月种植于海南省乐东县(18.52′N，108.93′E)和7月种植于浙江省杭州市临安区(30.23′N，119.72′E)。玉米种质在每个地点种植设3个随机区组重复。每个材料每行种植 20 株，选取9 个授粉良好的果穗进行测定。

B73作为玉米重要的骨干自交系，被广泛用于品种选育及各种基础研究的参考品种，因此以B73作为参照，以便监测和标准化不同批次样品的品质性状数据。

玉米果穗脱粒后去除杂质，自然干燥后含水量降至14%以下。用 GHCS-1000AP KTW 测定仪(浙江托普云农科技股份有限公司)按照 SAC 方法(GB 1353—2009《玉米》)检测容重。从 9 个果穗的混合籽粒中随机采集约50 g种子，用磨样机粉碎成粉末，进行其他品质性状测定。

取 10 g样本，用电热鼓风干燥器(DHG9030A，浙江托普云农科技股份有限公司)通过高温烘干法测定含水量。

含氮量按照改进的凯氏定氮法^[19]，使用全自动凯氏定氮仪(K9860，海能仪器股份有限公司)进行测定。取约 0.100 0 g的样本，籽粒中粗蛋白是检测含氮量的 6.25倍。

玉米籽粒粗脂肪的测定采用改良索氏抽提法^[20]，参考GB 2906—1982《粮油作物种子粗脂肪测定方法》，用索氏脂肪抽提仪(SOX606，海能仪器股份有限公司)提取2.000 0 g籽粒中的粗脂肪，然后用烘箱(XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司)去除脂肪抽提剂石油醚。

籽粒粗淀粉的测定参考ISO 10520: 1997《本地淀粉 淀粉含量的测定 旋光法》和GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》。将 2.5000 g样本通过氯化钙-乙酸溶液水解，然后使用硫酸锌和亚铁氰化钾溶液进行提取，使用全自动旋光仪(P850，海能仪器股份有限公司)进行测定。

直链淀粉的测定参考GB 7648—1987《水稻、玉米和谷子籽粒直链淀粉测定法》的改进方法^[21]。用 Synergy H1 多模式微孔板酶标仪(BioTek 仪器公司)测定直链淀粉-碘复合物在 720 nm 波长处的吸光度。

支链淀粉质量分数的计算方法是从粗淀粉中减去直链淀粉质量分数。每个样品测定2个重复，如果2次重复偏差超过5%，重复测定1次。直支比为直链淀粉质量分数与支链淀粉的比值。

授粉20~25 d是玉米种子发育和灌浆的重要阶段^[22−23]，因此RNA提取自授粉20 d的籽粒。2023年8月，将517份玉米种质种植于浙江省杭州市临安区，种植区域与2022年相同，进行3个随机区组重复，每个材料每行种植 20 株。 根据2022年品质分析结果，从具有极端表型的种质中分离籽粒，筛选4个容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低、粗脂肪质量分数较低的种质(梅玉米、F1白轴、 CML324、975-12)，以及 4 个容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高、粗脂肪质量分数较高的种质(浙单14、M270、孝丰白马玉米、金辉黑糯玉米)，上述8个极端种质的生育期均为101 d。将9个果穗的籽粒混合作为1个重复。提取的RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA-Seq测序和分析。

授粉 20 d后，采集籽粒并保存在−80 ℃冰箱。使用 TransZol Up Plus RNA试剂盒(北京全式金生物科技股份有限公司)提取总RNA。使用 Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 逆转录试剂盒(上海翌圣生物技术有限公司)将 RNA 反转录为 cDNA，使用稀释的 cDNA 进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)鉴定。以玉米管家基因ZmGAPDH作为内参，对样本进行RT-qPCR鉴定。引物组合：Zm00001d043468，使用引物1F 和1R；Zm00001d028709，使用引物2F和2R；Zm00001d021653，使用引物3F和3R；Zm00001d004438，使用引物 4F 和 4R；Zm00001d043511，使用引物 5F 和 5R； Zm00001d041775 使用引物 6F 和 6R；Zm00001d032224 使用引物 7F 和 7R；Zm00001d035156 使用引物 8F 和 8R；ZmGAPDH 使用引物 9F 和 9R，检测各基因表达。每个样品包含3个生物学重复，3个玉米的籽粒作为1个生物学重复。

利用Excel和SPSS 19.0进行数据分析，计算最大值、最小值、平均数、标准差、变异系数，绘制群体频率分布图，对玉米籽粒品质性状数据进行联合方差分析和相关性分析等。

从表1可见：玉米籽粒容重最大值和最小值均在东阳，分别为 904.00和 254.55 g·L⁻¹。东阳容重的变异系数最大，临安的变异系数最小。经过最佳线性无偏预测法(BLUP)分析后，容重为431.41~798.55 g·L⁻¹，变异系数降至 8.47%。粗蛋白质量分数最大值在乐东，最小值在东阳。东阳粗蛋白质量分数的变异系数最大，临安的变异系数最小。经 BLUP 分析，粗蛋白质量分数为6.17%~17.89%，变异系数降至 10.09%。粗脂肪质量分数最大值和最小值均在东阳，分别为 14.57%和 2.01%。东阳的粗脂肪质量分数变异系数最大，而临安最小。经 BLUP 分析，粗脂肪质量分数为 2.64%~12.99%，变异系数降至 29.01%。粗淀粉质量分数最大值在乐东，最小值在东阳。东阳的变异系数最大，临安的变异系数最小。经 BLUP 分析，粗淀粉质量分数为 12.45%~71.25%，变异系数降至 11.04%。直链淀粉质量分数最大值和最小值均在东阳，分别为 36.44% 和 2.66%。东阳的直链淀粉质量分数变异系数最大，而临安最小。经 BLUP 分析，直链淀粉质量分数在 5.70%~32.68%，变异系数降至 26.44%。支链淀粉质量分数最大值和最小值均在乐东，分别为65.94%和18.66%。经 BLUP 分析，支链淀粉质量分数为 16.65%~61.79%，变异系数降至 16.65%。直支比最大值在东阳，最小值在乐东。东阳的变异系数最大，而乐东的变异系数最小。经 BLUP 分析，直支比为 0.16~2.30，变异系数降至 33.08%。

如图1所示：容重主要分布在 650.00~700.00 g·L⁻¹，群体分布呈标准正态分布。粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比分别主要分布在 12.00%~13.00%、4.00%~5.00%、64.00%~68.00%、24.00%~27.00%，40.00%~46.00%，0.60~0.80内。粗蛋白、粗淀粉质量分数的群体分布呈正态分布，粗脂肪、直链淀粉质量分数和直支比的群体分布呈偏态分布。

Figure 1.  Histogram of frequency distribution of kernel test weight and quality traits in different inbred lines

品质性状作为因变量，品种和环境作为自变量进行分析(表2)发现：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的极显著影响(P＜0.01)。直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响极显著(P＜0.01)，但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响。粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响(P＜0.01或P＜0.05)，但不受品种和环境之间交互作用的影响。

相关性分析(图2)显示：容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈极显著负相关(P＜0.01)，而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)。容重与直支比之间无相关性。粗蛋白、粗脂肪质量分数与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉呈极显著负相关(P＜0.01)，而粗蛋白与粗脂肪质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)。粗淀粉与直链淀粉、支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)，而与直支比呈极显著负相关(P＜0.01)。直链淀粉与支链淀粉质量分数呈极显著负相关(P＜0.01)，而与直支比呈极显著正相关(P＜0.01)。支链淀粉质量分数与直支比呈极显著负相关(P＜0.01)。

Figure 2.  Correlation coefficients between kernel test weight and other quality traits

通过主成分分析，容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低的种质被划分为 A 组，而容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高的种质被划分为 B 组(图3A)，说明 A 组和 B 组之间的基因表达量有显著性差异。在主成分分析中，PC1 可解释 43.9% 的表型，PC2 可解释 15.7% 的表型(图3B)。与 A 组相比，B1、B2、B3、B4中分别有1 847、4 729、2 273、1 918个基因上调，而 B1、B2、 B3 、 B4 中分别有 391 、 350 、 433 、 352 个基因下调(图3C~D)。经过韦恩分析发现：其中140个基因在B组中共同上调，19个基因受到下调。对上述159个基因进行基因本体(GO)富集分析，发现分别有 50 和 47 个基因富集于细胞过程、生物过程的代谢，54 个基因富集在细胞构造及组成中，46 个基因分别具有结合和催化活性的分子功能(图3E)。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，有 7 个基因富集于糖酵解/葡萄糖生成(ko00010)，5 个基因富集于光合生物碳固定(ko00710)，8 个基因富集于碳代谢(ko01200)，7 个基因富集于氨基酸生物合成中的碳固定(ko01230) (图3F)。

Figure 3.  Transcriptome screening of control genes for traits such as bulk density and quality

为了进一步挖掘控制容重和品质性状的关键基因，从与碳代谢、光合组织中的碳固定以及氨基酸的生物合成相关途径中筛选出 8 个候选基因，通过 RT-qPCR 或 RNA-Seq 进行了验证分析。通过 RT-qPCR 分析，编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468 在 B2 中的表达量是 A2 的 3.7 倍。RNA-Seq 数据中，Zm00001d043468 的表达水平在 B 组中较 A 组升高 2.8 倍，而通过RT-qPCR检测发现该基因在 B 组中的表达量是 A 组的 2.7 倍 (图4A)。通过 RT-qPCR 分析，编码抗坏血酸过氧化物酶同源基因-3的Zm00001d028709在B1和B4组的表达量是 A1 组的51倍。通过 RNA-Seq 分析发现，Zm00001d028709 的表达水平在 B 组较 A 组升高 3.1 倍，而RT-qPCR分析显示该基因在 B 组中表达量是 A 组的 4.9 倍 (图4B)。通过RT-qPCR 分析，编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体-2 的 Zm00001d021653 在 B4 组的表达量是 A4 组的 21.4 倍。通过 RNA-Seq分析发现 Zm00001d021653 的表达水平在B 组较 A 组升高 10.2 倍，而RT-qPCR实验验证发现该基因在 B 组表达量是 A 组的 4.6倍 (图4C)。通过 RT-qPCR 分析，编码普鲁兰酶型淀粉脱支酶 1 的 Zm00001d004438 在 A4 组的表达量是 B3 组的 1.4 倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d004438在A 组的表达量较 B 组升高 2.3 倍，而使用RT-qPCR验证发现该基因在 A 组的表达量是 B 组的1.9倍 (图4D)。通过 RT-qPCR分析，编码己糖激酶-6 的 Zm00001d043511 在 B3 组的表达量是 A2 组的 6.9 倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d043511在 B 组的表达量较A 组升高 2.1 倍，而RT-qPCR验证该基因在 B 组表达量是 A 组的 2.6 倍 (图4E)。通过RT-qPCR分析，编码2-脱氢-3-脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775 在 B2 中的表达量是A2的17倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d041775在 B 组中的表达量较 A 组升高 3.4 倍，而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 3.4 倍 (图4F)。通过RT-qPCR分析，编码丙酮酸脱氢酶复合体叶绿体二氢脂酰赖氨酸-残基乙酰转移酶组分-4的 Zm00001d032224 在 B4 组的表达量是A2组的 46.9倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d032224 在B 组的表达量较 A 组升高 1.8倍，而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 4.6倍 (图4G)。通过 RT-qPCR 分析，编码细胞膜甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2的Zm00001d035156在B4组的表达量是A4组的25.6倍。通过 RNA-Seq分析发现：Zm00001d035156在B组的表达量较A组升高 2.8 倍，而RT-qPCR显示该基因在B组的表达量是 A 组的3.4倍 (图4H)。从以上结果可以看出：RT-qPCR和 RNA-Seq 检测基因表达的趋势是一致的。相关性分析发现：RT-qPCR 和 RNA-Seq 数据具有很高的相关性，R² 为 0.831 8 (图4I)。

Figure 4.  Relative expression of candidate genes detected by RNA-Seq and RT-qPCR

容重是一个复杂的数量性状，受多因素影响，但与其他品质性状的关系仍有争议。在玉米中，张丽等^[8]研究表明：容重与蛋白质质量分数呈正相关，也有研究发现容重与蛋白质质量分数呈负相关^{[7, 9]}。本研究发现玉米籽粒容重与粗蛋白质量分数呈负相关。向日葵Helianthus annuus中粗脂肪质量分数与容重呈正相关，但在燕麦Avena sativa中无显著关系，在大豆Glycine max中呈负相关^[24−26]。在玉米中，吴春胜等^[7]发现籽粒容重与脂肪质量分数呈负相关，张静等^[9]发现容重与脂肪质量分数呈正相关。本研究发现玉米容重与粗脂肪质量分数呈负相关。玉米籽粒主要由胚和胚乳组成，胚乳质量占了85%，且以淀粉为主，而胚的主要成分是蛋白质、脂肪和水。这可能有助于解释容重与粗脂肪和粗蛋白质量分数之间的负相关关系。张丽等^[8]利用29个山东省审定玉米品种研究发现玉米籽粒容重和淀粉呈正相关关系，但是DORSEY-REDDING 等^[10]分别使用183和195个玉米杂交种发现玉米籽粒容重和淀粉呈负相关。本研究利用517个玉米种质发现淀粉质量分数和容重呈正相关。此外，容重与直链淀粉或支链淀粉的质量分数之间存在弱的正相关性，而容重与直支比之间没有相关性。这表明容重可能是由淀粉质量分数决定，而不是由淀粉类型决定。

容重是一个可遗传的数量性状，但它也受环境因素的影响。本研究表明：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境或品种和环境交互作用的影响，而直链淀粉和支链淀粉只受品种影响，不受环境影响。这些结果说明在不同环境下的容重可能受到粗蛋白、粗脂肪或粗淀粉质量分数的影响，而不受到直链淀粉和支链淀粉的影响。

在玉米中，ZHANG等^[11]利用 B73 × Mo17(IBM)Syn10 DH群体进行 QTL 关联分析，筛选到3个与容重相关的候选基因 ZmSWEET4c、ZmYUC1和 ZmTCRR，这些基因均与胚乳发育及碳代谢有关^{[11, 27−28]}。本研究通过RT-qPCR 方法筛选并验证了 8 个与碳代谢和氨基酸代谢相关的基因。其中，与碳代谢相关的海藻糖-6-磷酸对胚发育、产量形成和非生物胁迫耐受性非常重要^[29−30]。在水稻Oryza sativa中，OsTPS8在耐盐性和糖分积累方面起着重要作用^[31]。本研究发现编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468与容重和品质性状有关。在拟南芥Arabidopsis thaliana中，基质抗坏血酸过氧化物酶(s-APX)已被证明可通过调节抗坏血酸的生物合成来控制碳水化合物的供应^[32]。编码抗坏血酸过氧化物酶同源物 3 并与碳水化合物代谢(K00434)相关的 Zm00001d028709在容重较低的种质中上调，该基因位于容重相关QTL位点 PZE-103144282或qKTW3-2附近^[11]。在拟南芥中，葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体 2(GPT2)可增加叶绿体内膜的碳还原，影响光合作用和植物生长^[33]。在玉米中，编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体2的 Zm00001d021653可能是容重增加的原因。Zm00001d004438编码普鲁兰酶型淀粉脱分支酶1 (Zpu1)，可能在胚乳发育过程中起重要作用^[34]，在容重较高的种质中高表达，该基因位于已报道容重关联位点 SYN18432、qKTW7和phi082-umc1799附近^{[11, 17]}。ZmHXK3a 催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸在淀粉代谢中发挥关键作用^[35]。本研究表明编码己糖激酶-6的Zm00001d043511在容重和粗淀粉质量分数较高的种质中高表达。在桑Marus alba叶中，编码 2-脱氢-3-脱氧磷酸醛缩酶的 KdsA 在高盐和干旱胁迫下下调^[36]。本研究发现编码 2 -脱氢- 3 -脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775与容重和品质性状的形成有关，该基因位于容重关联位点PZE-10314428和qKTW3-2附近^[11]。在拟南芥中，细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2在细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用^[37]。本研究发现编码细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPC2 的 Zm00001d035156 在容重较高的种质中高表达。

群体结构分析表明：玉米籽粒容重，粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比的主要分布符合正态分布或近似正态分布。联合方差分析表明：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的显著影响；直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响较大，但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响；粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响，但不受品种和环境之间交互作用的影响。品质性状之间相关性分析表明：容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈显著负相关，而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈显著正相关。容重与直支比之间无相关性。

进一步对极端玉米种质籽粒进行RNA-Seq，共鉴定到8个与碳代谢和氨基酸代谢途径相关的基因，并利用RT-qPCR验证其在极端种质中的表达差异，发现这些基因在不同种质中的表达变化规律与品质性状差异变化趋势一致，其中Zm00001d021653、Zm00001d004438、Zm00001d043511、Zm00001d035156可能在碳还原、胚乳发育、淀粉代谢、细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用。

本研究筛选获得了可能与品质性状相关的候选基因，可以为高品质玉米新品种选育提供特异性种质资源及候选基因，但是对于这些基因调控玉米籽粒品质性状的分子机制仍然不够清晰，还需要进一步通过分子生物学实验来鉴定这些基因的功能，以揭示玉米籽粒品质性状的分子调控机制。