Study on the physiological abscission patterns and control techniques in Carya cathayensis

本研究以山核桃为材料，试验在山核桃核心栽培区杭州市临安区示范园及淳安县临岐镇规模化种植基地开展。分别于2023和2024年生长季(4—7月)选择株高3~5 m，树龄8~10 a，冠层完整且无病虫害侵染的健康植株作为研究对象，同时确保每年的试验气候环境相似。通过物候学观测确定自花授粉完成期(雌花柱头褐变率达90%以上)后，对进入幼果发育阶段(子房直径＞3 mm)的果实进行定位标记，系统观测其落果动态规律。试验采用的活性氧清除剂为碘化钾(西陇科学，CAS 7681-11-0)和没食子酸丙酯(Sigma-Aldrich，CAS 121-79-9)。

选定幼果膨大初期作为处理窗口期。采用分层随机抽样法选取着果量10~30个的二次分枝作为处理小区，每个处理重复3次，以清水为对照组。处理分别为碘化钾(3.0、5.0、10.0 mmol·L⁻¹)和没食子酸丙酯(0.1、0.3、0.5 mmol·L⁻¹)，配制时添加体积分数为0.1%的Triton X-100作为表面活性剂以增强叶面附着性，将试剂喷施于山核桃果实与枝条连接处。处理时段为日均温25~28 ℃、相对湿度60%~75%的晴日8:00—11:00，每次处理间隔7 d，共处理3次。

建立基于时间序列的果实追踪数据库。处理前进行基线果实计数(S₀)，随后在第1次(S₁)、第2次(S₂)、第3次(S₃)处理后第7天分别进行全株果实普查。统计参数包括阶段落果量(ΔS_n = S_n−1−S_n，n=1，2，3)和累计落果率[L = (S₀−S₃)/S₀×100%]。2023年初始统计时间为5月13日，2024年初始统计时间为5月18日。

采集正常果与自然脱落果的果柄离区组织(长度为5 mm)，立即浸入预冷的质量分数为2.5%戊二醛(0.1 mol·L⁻¹ PBS缓冲液，pH 7.2)进行渗透固定(2 h)，再用体积分数为75%乙醇浸泡洗脱2次。

活性氧原位检测：过氧化氢定位采用3,3'-二氨基联苯胺(DAB，1 g·L⁻¹)染色液避光浸渍16 h，利用内源性过氧化物酶催化过氧化氢与3,3'-二氨基联苯胺生成棕色聚合物。${\mathrm{O}}_{2}^{-} $检测采用质量分数为0.1%硝基蓝四氮唑 [NBT，含10.0 mmol·L⁻¹ 三氮化钠(NaN₃)]染色12 h，通过超氧阴离子介导的硝基蓝四氮唑还原反应形成蓝色沉淀。染色完成后，用体积分数为75%乙醇将果实组织进行脱色处理，期间更换3~4次脱色溶液，直至脱色完成。脱色完成后的组织样品用作解剖材料。

使用Leica VT1200S振荡切片机，将脱色完成的组织样品用质量分数为5%琼脂糖包埋，用强力胶固定在载物台上，调制参数收集50 μm的切片，于试管内加入去离子水保存切片，用于后续显微镜观察。使用Leica DM6B全电动正置显微镜(HC PL FLUOTAR 10×/0.30，20×/0.40)进行明场成像，配合LAS X软件(v3.7)进行图像采集。

计算不同处理后的山核桃落果率，通过单因素方差分析不同组别的显著性差异(P＜0.05)，采用Excel 2016整理数据，SPSS 27.0对数据进行ANOVA方差检验和Duncan’s多重比较，并用GraphPad Prism 10.1.2软件绘制图表，用Power Point处理图片。

对浙江淳安、临安地区发育约30 d的山核桃果实进行显微解剖学观察发现：自然脱落进程中果柄与枝条交界处形成典型的离层结构(图1 A和B)。离层细胞是植物在器官脱落过程中形成的一种特殊细胞层，主要存在于木本双子叶植物及裸子植物的叶柄或叶基部，形成一群小型细胞。这些细胞失水皱缩，细胞壁逐渐胶化，对植物器官的支持力量变弱。切取果实与枝条相连的组织在显微镜下观察，发现离层细胞比周围细胞更小，排列更为紧密(图1 C和D)，说明山核桃果实与枝条形成离层过程中产生了细胞和组织的形态变化。

Figure 1.  Formation of the abscission zone during the C. cathayensis fruit abscission process

通过系统解剖学追踪，发现山核桃离层主要分布于2类微解剖位点：果柄-枝条连接处和果实-果柄过渡区(图2)。在山核桃果实的脱落过程中，果柄与枝条、果实与枝条的连结处为新生的组织，质地柔软，牢固性差，表明落果的形成可能与组织结构、细胞紧密程度相关，影响离层的形成。

Figure 2.  Different abscission sites of C. cathayensis fruits

表1为2023—2024年的时序监测数据。由表1可知：2023和2024年对照组平均落果率高达89.55%±2.43%和80.09%±4.05%。在喷施不同浓度的活性氧清除剂后，在2023年中，3.0 mmol·L⁻¹碘化钾、0.3 mmol·L⁻¹ 没食子酸丙酯、0.5 mmol·L⁻¹没食子酸丙酯处理组的落果率相较于对照显著降低(P＜0.05)，分别为57.24%±8.60%、66.66%±3.89%、51.85%±3.15%；2024年，3.0 mmol·L⁻¹碘化钾、0.1 mmol·L⁻¹没食子酸丙酯、0.3 mmol·L⁻¹没食子酸丙酯、0.5 mmol·L⁻¹没食子酸丙酯处理组的落果率相较于对照显著降低(P＜0.05)，分别为 61.22%±2.75%、54.47%±1.34%、58.62%±2.68%、45.77%±2.17%。跨年度数据表明：3.0 mmol·L⁻¹碘化钾与0.5 mmol·L⁻¹没食子酸丙酯具有稳定的落果抑制效果，表明这2种试剂更适宜用作山核桃落果的活性氧清除剂，可进一步用于探究山核桃果实体内活性氧水平的变化差异。

山核桃果实在脱落过程中会产生离层。对正常生长未脱落和已脱落的山核桃果实切片分别进行3,3'-二氨基联苯胺和硝基蓝四氮唑组织化学定位，显微镜观察其着色差异(图3A~B)。结果显示：正常生长的果实内活性氧染色无显著差异，已脱落的果实在离层位置显色加深，说明果实脱落后离层位置的活性氧水平更高。

Figure 3.  DAB staining (A, B) and NBT staining (C) of C. cathayensis fruits

为了研究山核桃果实未完全脱落时体内活性氧的情况，采集瘦弱暗黄生长差的果实切片进行硝基蓝四氮唑试剂染色，观察发现：果实与枝条相连区域有明显的着色差异(图3C)，表明活性氧水平的增加可能是形成离层的化学信号之一。果实体内活性氧水平增加，细胞形态发生变化乃至死亡，果实与枝条之间形成离层直至完全脱落。

用3.0 mmol·L⁻¹碘化钾和0.5 mmol·L⁻¹没食子酸丙酯对正常生长的山核桃果实分别处理1、3 d，采集后同一时间进行组织固定和3,3'-二氨基联苯胺、硝基蓝四氮唑染色，观察切片显色差异(图4)。对比果实与枝条连结的组织切片染色情况。结果表明：正常生长的山核桃果实经过碘化钾、没食子酸丙酯的处理后，比对照处理显色更浅，体内活性氧水平更低，通过3,3'-二氨基联苯胺、硝基蓝四氮唑染色，碘化钾、没食子酸丙酯对活性氧的清除效果得到进一步验证。

Figure 4.  DAB and NBT staining of potassium iodide and propyl gallate treated C. cathayensis fruits

山核桃的生理落果现象呈现复杂的时空动态特征，其发生机制受气候条件、营养分配及解剖结构等多因素协同调控。①受精不良。受精是果实发育的关键环节。如果花粉质量差、授粉时机不当或花粉与雌蕊的亲和性差，都会导致受精失败，从而引起落果。例如，薄壳山核桃柱头张角大于90°时为雌花最佳授粉期^[2]，坐果率最高。②营养竞争。在果实生长发育过程中，尤其是果实膨大期，需要大量的营养物质。如果营养供应不足或分配不均，会导致一些果实因缺乏营养而脱落。研究表明：6月10日至7月10日是山核桃果实快速增长期，也是落果高峰期，这一时期果实生长需要大量营养，竞争激烈^[15]。③环境因素。气候条件对山核桃的落果也有显著影响。干旱、低温、高温等极端天气条件会影响花粉活力和花的发育，进而导致落果。此外，连续的阴雨天气会使果实含水率增高，影响果实的正常发育^[16]。

本研究发现：山核桃果实脱落主要发生在2个解剖学界面，分别为果实-枝条离层区和果柄-枝条离层区。组织学观察显示：这2处离层组织的细胞排列方式存在明显差异，提示不同脱落位点的生物力学特性可能与其细胞学特征密切相关。曹艺洁等^[17]对香梨Pyrus sinkiangensis 果柄形态的研究发现：不同类型果柄的形态结构、细胞结构物质和营养物质均存在显著差异，果柄处的纤维素、半纤维素、木质素含量以及厚壁组织的细胞壁厚度发生变化，导致香梨的抗机械损伤能力不同。ŽNIDARIČ等^[18]在番茄Solanum lycopersicum模型中的研究证实，离层区远端与近端细胞的核内复制差异会通过影响膜运输系统调控器官脱落进程，这与李松刚等^[19]在对龙眼Dimocarpus longan的研究中揭示的果柄离层分离力动态变化规律具有相似性。值得注意的是，4—6月梅雨期与山核桃果实快速发育阶段高度重叠，持续低温和过量降水导致幼果细胞膨压下降，离层区纤维素酶活性升高，最终使该时段落果率增加。进入7月后，日均温升至26~30 ℃，促进离层区愈伤组织形成，使落果率下降^[20]。基于上述规律，建议在5—6月关键窗口期实施靶向干预，现有保果技术主要依赖外源生长调节剂和营养调控。未来研究可聚焦于：①离层特异性启动子驱动RNAi技术抑制脱落相关基因表达；②纳米载体递送系统实现离层区精准施药^[21]。

活性氧的积累与植物细胞的氧化损伤密切相关。在山核桃的生理落果过程中，活性氧的过度积累可能导致细胞膜的脂质过氧化，进而破坏细胞膜的完整性，导致细胞内容物渗漏，激活植物防御系统，最终引发果实脱落^[22]。植物体内的抗氧化系统能够清除过量的活性氧，维持细胞内的氧化还原平衡。此外，植物通过生理和环境信号传递的方式也可以调节活性氧动态平衡。在山核桃中，抗氧化酶的活性变化与落果现象密切相关。例如，当山核桃受到干旱胁迫时，外源应用褪黑素可以调节抗氧化酶的活性，减少活性氧的积累，从而减轻氧化损伤并提高果实的抗逆性^[23]。植物器官脱落过程伴随显著的氧化还原状态重塑。在植物正常的生长发育过程中，活性氧水平较低，当植物受到干旱、盐、病虫害等逆境胁迫时，体内活性氧显著增加。植物器官脱落受到活性氧和抗氧化酶的影响。已有研究表明：活性氧的水平能够影响拟南芥Arabidopsis thaliana细胞壁的降解和细胞分离过程，进而控制花器官脱落区细胞的程序性死亡^[24]。转录组分析也发现拟南芥果荚的脱落与过氧化物酶基因的表达相关^[25]，因此活性氧可能是植物器官脱落的重要信号。

碘化钾和没食子酸丙酯是2种还原性化合物，具有活性氧清除能力，在化工领域研究上常被用来检测活性氧的水平，但在果实发育及落果控制上的应用潜力还少有研究。本研究利用3.0 mmol·L⁻¹ 碘化钾和0.5 mmol·L⁻¹ 没食子酸丙酯处理山核桃果实，发现处理组离层区活性氧积累显著降低。显微观察显示：处理组离层细胞保持完整层状结构，而对照组出现典型离层空腔化特征。通过活性氧清除剂碘化钾和没食子酸丙酯的作用，山核桃果实体内的活性氧水平降低，且不同清除剂可能通过差异化的分子途径发挥作用。

活性氧与果实脱落之间存在着密切的关系。对拟南芥果实进行3,3'-二氨基联苯胺和硝基蓝四氮唑染色可以测定体内活性氧水平^[26]。3,3'-二氨基联苯胺和硝基蓝四氮唑染色表明：已脱落山核桃果实中离层位置的活性氧水平高于正常生长的果实。从山核桃树的落果率统计可知：活性氧清除剂可以调控山核桃树的落果率，表明活性氧水平的高低影响果实的脱落，因此降低山核桃果实体内活性氧水平可以减少落果发生。在山核桃果实上喷施不同浓度的碘化钾和没食子酸丙酯，定期统计落果数量，可以筛选合适的活性氧清除剂浓度。2023和2024年统计数据表明：5—6月山核桃树的平均落果率超过80%。有研究表明：麻核桃Juglans hopeiensis的落果率为76.73%~94.77%^[2]，薄壳山核桃等也有较高的落果率^[27]。经过3.0 mmol·L⁻¹ 碘化钾和0.5 mmol·L⁻¹ 没食子酸丙酯处理后的山核桃落果率均显著降低，经过3.0 mmol·L⁻¹ 碘化钾处理后，2023和2024年落果率分别为57.24%±8.60%和61.22%±2.75%；经过0.5 mmol·L⁻¹ 没食子酸丙酯处理后，2023和2024年落果率分别为51.85%±3.15%、45.77%±2.17%。活性氧清除剂的使用显著减少了山核桃落果的发生。

当前保果技术多聚焦于栽培管理(如环剥、施肥)，对分子调控机制的研究相对滞后。本研究为提高山核桃产量提供了新思路：①开发基于活性氧传感器的精准施药系统；②构建“清除剂-微肥-生长调节剂”复合配方；③筛选耐脱落种质资源。这些技术对香榧Torreya grandis ‘Merrillii’ (胚败育率＞60%)、柑橘Citrus reticulata (6月落果率约50%)等木本经济作物同样具有借鉴价值。未来需重点解析：活性氧信号与激素网络(乙烯和脱落酸)的互作机制；离层区细胞壁重构的氧化还原调控途径；施用清除剂对果实品质的长期影响。

本研究系统揭示了山核桃的生理落果特征，发现在5—6月山核桃的落果率高达72.22%~95.00%，主要发生在幼果形成初期，授粉不良和营养竞争是主要原因。此外，山核桃果实的结缔位置和支撑形态也可能影响落果的发生。研究还发现：山核桃果实发生落果时离层处的活性氧水平更高，而喷施3.0 mmol·L⁻¹ 碘化钾和0.5 mmol·L⁻¹ 没食子酸丙酯等活性氧清除剂可有效降低落果率。