黑果枸杞种子采自青海省大格勒乡，在北京林业大学林木育种国家工程实验室温室内进行播种培养。具体方法：挑选籽粒饱满的黑果枸杞种子播种在以m（花卉土）：m（蛭石）：m（珍珠岩）=3：2：1混合后的穴盘中，每天定时喷施无菌水至发芽后，配制Hoagland营养液进行浇灌。温室温度为（23 ± 2）℃, 光照16 h·d^-1，空气相对湿度控制在70%左右。以生长4周的黑果枸杞幼苗为实验材料。

取4周龄黑果枸杞幼苗的根系，加入液氮研磨至粉末状。根据改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取RNA，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法鉴定其完整性和质量。

利用拟南芥等其他植物的SKOR核苷酸序列在实验室前期建立的本地黑果枸杞转录组数据库中进行Blast分析，得到1条长度为2 500 bp左右的拟SKOR基因。根据转录组数据库中的片段利用Primer 5.0软件设计引物P₁（5′-ATGCACATTAATAATGGAGGAG-3′）和P₂（5′-AGTTGATTCATTGTTCAAGTACAA-3′），由上海生工生物工程技术服务公司合成引物后，用于该黑果枸杞拟SKOR基因序列全长的扩增。

采用RT-PCR法进行基因克隆，PCR扩增反应体系：2× PCR Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，双蒸水7 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。PCR产物用体积分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作说明书进行目的片段的回收和纯化。

将回收的PCR产物连接到PMD18-T载体上，转化Top10大肠埃希菌Escherichia coli感受态细胞，在含50 mg·L^-1氨苄青霉素的LB固体平板培养基上进行蓝白斑阳性克隆筛选，筛选出的阳性克隆经PCR鉴定后，送至上海生工生物工程技术服务公司测序。所测序列的比对分析在DNAMAN 6.0生物软件上进行，在美国生物技术信息中心（NCBI）网站（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上进行Blast搜索。利用NCBI ORFfinder工具确定基因的开放阅读框。蛋白质亲/疏水性预测用ExPASy网站的在线软件ProtScale分析，以Hphob.Kyte& Doolittle为默认值。进化树分析先使用Clustal X 2.1软件对来自番茄Solanum lycopersicum，马铃薯Solanum tuberosum，胡杨Populus euphratica等物种的SKOR成员进行序列比对，然后使用MEGA 5.1 Beta 3软件用邻接法构建。

对4周龄的黑果枸杞苗分别用300 mmol· L^-1氯化钠与450 mmol·L^-1碳酸氢钠（pH 9.0）处理6 h，利用天根生化科技有限公司Real Master Mix（SYBR Green）PCR试剂盒，采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法，检测LrSKOR基因的相对表达量。扩增目标LrSKOR基因引物设计为LrSKOR-F: 5′-ATGCACATTAATAATGGAGGAG-3′和LrSKOR-R: 5′-AGTTGATTCATTGTTCAAGTACAA-3′；以黑果枸杞延伸因子1α基因EF1α^[19]作为内参基因，其引物为EF1αF: 5′-GAAGGGTGTCCCTCAGATCA-3′和EF1α R: 5′-CCGTCC ATGTCGTCTCTTTT-3′，对反转录所得的cDNA按照1，1/10，1/100，1/1 000，1/10 000进行稀释，绘制相对标准曲线。实时荧光定量设置反应程序为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，设置36个循环，各轮循环第3步进行荧光采集，最后95 ℃变性1 min，退火至55 ℃。根据荧光值，绘制熔点曲线。内参基因的表达与LrSKOR基因按照同样的反应程序同时测试。独立提取3次待测样品的RNA作为生物学重复，设置技术性重复3次·样品^-1。

取生长4周的黑果枸杞幼苗根部作为实验材料，提取总RNA，凝胶电泳检测结果显示28 S RNA条带亮度约为18 S RNA的2倍，表明所提取的黑果枸杞总RNA完整性较好。进一步用紫外分光光度计检测得出D_（260）/D_（280）为2.1，说明所提取的RNA纯度较好，可用于进一步实验。

按照反转录试剂盒操作说明，以总RNA反转录得到第1链cDNA后，以该cDNA为模板，以拟SKOR基因的引物P₁和P₂进行PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳检测发现亮带，且上下无杂带，与预期片段大小一致，推测可能是目的基因。将连接有纯化目的片段的PMD18-T克隆载体转化大肠埃希菌Top10后，从转化的平板上随机挑取6个白色菌斑振摇过夜培养，进行PCR扩增，得到的扩增条带大小与RT-PCR结果一致，表明这些克隆为阳性克隆。

将PCR产物进行测序，Genebank登录号为KY563342。测序所得到的SKOR基因序列全长为2 448 bp，包括1个完整的开放阅读框，其编码的SKOR蛋白包含815个氨基酸残基。在NCBI数据库进行Blast序列比对分析结果显示，该基因序列与拟南芥（NM_111153.3），葡萄Vitis vinifera（AJ490336），蓖麻Ricinus communis（XM _002533405）和胡杨（EU382997.1）等植物外整流K⁺通道基因的核苷酸序列的同源性均在65%以上，其中与葡萄推测的外整流K⁺通道基因的核苷酸序列的同源性达到70.36%；通过和茄科植物马铃薯（XM_006352418.2），番茄（XM_004250158.3），甜辣椒Capsicum annuum（XM_016696732.1）等比对同源性很高，其中与马铃薯全长同源性最高，达到90.31%，表明本研究已克隆到外整流K⁺通道基因全长，将其命名为LrSKOR。用ExPASy网站分析该蛋白的理化性质，得到其相对分子量约为9.33×104，理论等电点为6.32，其中数量最丰富的氨基酸依次是亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和丝氨酸（Ser），分别占11.2%，8.6%和7.2%，色氨酸（Trp）含量最少，只占1.2%。

利用NCBI网站Conserved Domain工具对LrSKOR氨基酸结构域进行预测。结果表明：LrSKOR蛋白序列在258~315位存在1个与离子通道Ion_trans_2相似的保守结构域，Ion_trans_2是Ion_trans_2超家族的一个成员。在561~716和741~810氨基酸序列位点还分别存在1个与K⁺运输有关的离子通道的锚蛋白区（ANK）和KHA（钾离子通道的四聚化结构域），KHA在植物中一般位于C末端区。

运用ExPASy网站的在线分析软件ProtScale，以Hphob. Kyte & Doolittle为默认值对LrSKOR编码的蛋白质进行亲/疏水性预测，得到LrSKOR的亲/疏水信号图。疏水性分析结果表明：LrSKOR编码蛋白多肽链的第113号位点的缬氨酸（Val）疏水性最强，具有最高的分值3.167；第321号的精氨酸（Arg）亲水性最强，具有最低的分值-2.956。从整个肽链上氨基酸分布来看，亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，且多于疏水性氨基酸，认为该蛋白是亲水性蛋白（图 1）。

图  1  LrSKOR蛋白亲水/疏水性分析

Figure 1.  Hydrophobicity/phdrophilicity prediction of LrSKOR protein

用DNAMAN 6.0软件对LrSKOR的氨基酸全长序列与多种植物SKOR的氨基酸序列进行多序列比对。结果表明：黑果枸杞LrSKOR与茄科植物甜辣椒、马铃薯、番茄等的外整流K⁺通道的亲缘关系非常近，氨基酸同源性高达90%以上，分别为90.05%，90.70%和90.47%；与拟南芥AtSKOR，苜蓿Medicago truncatula的MtSKOR，玉米的ZmZORK等的亲缘关系相对较远，同源性为62.36%~69.12%（图 2）。

图  2  LrSKOR与其他植物SKOR开放阅读框氨基酸的多序列比对

Figure 2.  Amino sequence alignment of LrSKOR with other plants SKOR

为了分析黑果枸杞与其他植物中的SKOR系统发育进化关系，利用MEGA 5.1 Beta 3软件对黑果枸杞LrSKOR与茄科及其他物种的蛋白氨基酸序列构建了进化树。由图 3进化树可知：黑果枸杞与茄科植物如番茄、马铃薯、甜辣椒等聚在一起，表明它们之间亲缘关系较近，而与胡杨、蓖麻、玉米等分类在不同分支上，表示它们之间进化关系相对较远。

图  3  LrSKOR与其他植物SKOR的系统进化树

Figure 3.  Phylogenetic analysis of LrSKOR with SKOR from different plant species

由于LrSKOR基因可能参与调节黑果枸杞根部的离子选择性吸收，本研究提取黑果枸杞根部总RNA，用荧光定量PCR法研究了该基因在高盐和盐碱不同胁迫下的诱导表达情况，以EF1α在根中的表达量定为“1”。按照相对定量公式2^-△△Ct作图（图 4）。可以看出，LrSKOR基因在对照、高盐胁迫以及盐碱胁迫下均有表达。高盐和盐碱胁迫下的表达量明显高于对照，在盐碱胁迫下的表达丰度最高，是高盐处理的6.81倍，是对照的23.79倍。这表明LrSKOR基因参与高盐及盐碱环境胁迫响应，并且与环境pH值之间可能存在较为紧密的关系。

图  4  LrSKOR在不同pH值盐分胁迫下的表达分析

Figure 4.  Expression level under salt treatment of different pH values

植物体内丰富的K⁺主要由植物根部从土壤中吸收而获得。研究表明^[19]：根部吸收K⁺后经木质部装载，在蒸腾拉力作用下，随木质部流入地上部完成K⁺在地上部分的积累，外整流K⁺通道在此运输过程中发挥重要作用。目前，有关模式植物拟南芥的外整流K⁺通道蛋白的研究最为集中，而其他植物的外整流K⁺通道蛋白的研究还较少。GAYMARD等^[10]从拟南芥中分离得到K⁺外整流通道蛋白基因AtSKOR，通过非洲爪蟾Xenopus laevis卵母细胞异源表达和突变体atskor试验证明，AtSKOR介导K⁺从木质部薄壁细胞向木质部的装载。沙冬青Ammopiptanthus mongolicus保卫细胞外整流K⁺通道AmGORK也被克隆，其活性与拟南芥SKOR一样对细胞外pH值很敏感，在2个pH单元的酸化程度下活性被降低了70%^[20]。另有研究认为，盐分胁迫下的外整流K⁺通道蛋白SKOR可能是唯一对木质部汁液中钾分泌起作用的Shaker K⁺通道，它的活性可由木质部薄壁细胞中Na⁺不断积累引起的薄壁细胞质膜去极化而被激活，进而将K⁺装载到木质部运往地上部芽^[21-22]。木本植物霸王Zygophyllum xanthoxylum的ZxSKOR研究表明^[23]：ZxSKOR主要在根和茎中表达，且其表达水平随叶片中K⁺的浓度增加而显著提高，并认为盐分胁迫下，根和茎中的ZxSKOR相互协调很好地起到对K⁺的长距离运输的作用。因此，SKOR在植物地上部分K⁺积累方面的作用不容忽视，但关于它是如何参与K⁺向木质部的运输还没有明确的证据。WANG等^[24]在小花碱茅Puccinellia tenuiflora中的研究证明，其地上部分K⁺的含量不受外界盐分浓度及处理时间的影响，这是小花碱茅维持植株地上部高K⁺/ Na⁺比的重要原因之一。目前，已克隆得到小花碱茅的外整流K⁺通道PtSKOR基因片段^[25]，这将为进一步研究小花碱茅耐盐机理奠定基础。关于黑果枸杞耐盐生理生态机制的研究结果表明，Na⁺和K⁺主要分布在黑果枸杞地上部分，但根中K⁺/Na⁺比值比叶片中高，与其他积盐盐生植物盐爪爪Kalidium foliatum和白刺Nitraria tangutorum相比，黑果枸杞的K⁺/Na⁺比值高于这两者，从而表现出相对较强的耐盐能力^[26]，由此看出，K⁺的积累和运输在表现黑果枸杞耐盐性方面扮演及其重要的角色，但目前关于黑果枸杞K⁺积累与运输的分子机制尚不清楚。

黑果枸杞作为沙漠中可以建群的多年生灌木，具有很强的抗盐碱能力，加上繁殖力强的特点，有望成为耐盐碱研究的模式植物。近年来，黑果枸杞耐盐碱研究日益受到关注，本研究以前期测的转录组数据为基础，从黑果枸杞根系中成功克隆得到SKOR基因。研究已知，SKOR属于钾转运蛋白中的Shaker家族，典型的植物Shaker通道蛋白从N末端至C末端包括一个大约由60个氨基酸组成的细胞质N末端区、由6个跨膜区构成的疏水核和一个很长序列的细胞质C末端区。其中，C末端区含有调节结构域，包括一个推测的环核苷酸结合区（CNBD）、一个存在于大部分Shaker通道中的锚蛋白区和一个靠近C末端的富含疏水酸性残基区（KHA）^[27]。本研究对该基因编码的蛋白保守结构域预测，发现其分别存在一个锚蛋白区和KHA四聚化保守结构域，说明该基因编码的蛋白属于与K⁺运输有关的Shaker家族蛋白。Shaker通道的一个重要特点是能形成异源四聚体结构，KHA是钾离子通道蛋白的四聚化结构域，可能参与了这个过程，从而使该蛋白起到调节细胞中的K⁺转运活性的功能；锚蛋白结合位点可使该蛋白质特异地定位在质膜上，并潜在地影响蛋白与蛋白之间的相互作用。通过对LrSKOR编码氨基酸同源性序列比对和系统发育进化分析，得出LrSKOR与拟南芥、胡杨、蓖麻等双子叶植物的外整流K⁺通道相比同源性较低，但与茄科植物如马铃薯、番茄等同源性达90%以上，构建进化树中聚在一起（图 2），这表明黑果枸杞与其他茄科植物SKOR蛋白进化程度相似，LrSKOR同样行使推测的参与K⁺向木质部运输的功能，也说明了黑果枸杞与其他茄科植物存在较近的亲缘关系。本研究还发现，LrSKOR在盐碱胁迫下的表达丰度最高，高盐胁迫下次之，对照最低。这表明，黑果枸杞LrSKOR作为外整流K⁺通道，其基因表达除了受盐分胁迫影响外，与土壤pH值还存在密切的联系，这与很多前人研究的推论相一致。因此，LrSKOR很可能在黑果枸杞耐盐性发挥方面具有重要作用。这也为进一步阐明盐生植物黑果枸杞K⁺和Na⁺选择性运输机制提供分子层面的依据，具有重大的研究价值及应用前景。