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小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染山羊Capra hircus、绵羊Ovis aries以及其他野生小反刍兽，以发热，眼、鼻分泌物增多，胃炎、腹泻和肺炎为特征。该病主要流行于亚洲和非洲，2007年中国在西藏阿里地区首次发现该病，2010年8月在阿里地区日土县再次发生疫情[1-2]。2013年末，该病传入中国新疆地区，并迅速传播至22个省份，对中国养羊业造成严重危害[3-4]。PPRV属于副黏病毒科Paramyxovirdae麻疹病毒属Morbolivirus；基因组为单股负链RNA，长度为15 948 nt或者15 954 nt；基因组3′末端为前导序列(leader)，5′末端为尾随序列(trailer)；6个基因排列顺序为3′-N-P-M-F-H-L-5′，依次编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)；P基因还编码2个非结构蛋白C和V。根据F基因或N基因部分核苷酸序列差异可将PPRV毒株分为4个基因系[5-6]，亚洲国家流行的毒株属于基因Ⅳ系[1]。小反刍兽疫病毒在流行过程中，基因组发生点突变，核苷酸变异速率大约为9×10−4位点·a−1[7-8]。对中国2013年11月至2014年6月间25个毒株的基因组序列的比对和分析发现：P基因变异最大，非同义突变率最高[8]。随着全面免疫的实施，受免疫选择压的作用，病毒各基因尤其是P基因的变异率及非同义突变率发生变化，有必要进一步研究。PPRV P基因核苷酸长度为1 530 nt，编码509个氨基酸，编码的P蛋白分子量约54.9 kD。P蛋白在病毒RNA的转录和复制过程中发挥作用，也能单独与N蛋白-RNA模板复合物结合激活转录，同时与L蛋白相结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶，并与N蛋白-RNA模板结合形成核糖核蛋白复合体，进行病毒RNA的转录和复制[9]。本研究对2013年以来中国PPRV流行毒株P基因进行序列测定和分析，探讨病毒流行过程中P基因的序列变异情况。
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2014−2017年，采集到9个省12个疫点的PPRV阳性组织样品12份，由中国动物卫生与流行病学中心保存并提供，具体样品信息见表1。
表 1 2014−2017年中国12株PPRV毒株信息
Table 1. Details of the 12 PPRV strains collected in China during 2014−2017
毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 JL472014 2014-04-06 吉林 JS142016 2016-01-20 江苏 JX62014 2014-07-21 江西 GX22016 2016-08-22 广西 ZJ82014 2014-10-11 浙江 HN182016 2016-10-16 湖南 JX172015 2015-03-30 江西 XJ302017 2017-02-12 新疆 AH162015 2015-04-09 安徽 HN02017 2017-03-05 湖南 GZ112015 2015-09-02 贵州 GZ252017 2017-09-21 贵州 -
取肠系淋巴结组织100 mg，用组织匀浆仪匀浆后，根据High Pure Viral RNA Kit (Roche)的操作说明提取病毒RNA，−80 ℃保存备用。
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采用Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit (TaKaRa)扩增PPRV P基因。反应体系共50 µL，包括2× 1 Step Buffer 25 µL，Primerscript 1 step Enzyme Mix 2 µL，上、下游引物各2 µL，病毒RNA 5 µL。RT-PCR反应条件为：50 ℃逆转录30 min，94 ℃ 2 min，进行Taq酶激活；40个循环的聚合酶链式反应(PCR)(94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min)；72 ℃ 7 min再延伸。对PCR产物进行切胶回收。
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纯化后的PCR产物送青岛华大公司测序，获得12个毒株的P基因序列；从GenBank中下载2013−2014年中国25个PPRV流行毒株的基因组序列[8](表2)，截取P基因序列后进行核苷酸和氨基酸序列比对。从GenBank中下载中国及其他10个国家共15个PPRV代表毒株的基因组序列(表3)，绘制系统进化树。用MEGA 4.0 软件进行序列比对，用最大似然法构建分子进化树，bootstrap测试1 000次重复。用Simplot软件进行序列同源性分析。
表 2 2013−2014年中国PPRV流行毒株信息
Table 2. Details of the PPRV strains collected in China during 2013−2014
病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 XJYL2013 2013-11-30 新疆 山羊 JL2014 2014-04-01 吉林 绵羊 XJ22013 2013-12-20 新疆 山羊 JS2014 2014-04-02 江苏 山羊 XJ32013 2013-12-21 新疆 绵羊 HeN2014 2014-04-03 河南 山羊 XJ42013 2013-12-22 新疆 山羊 HB2014 2014-04-03 湖北 山羊 XJ52013 2013-12-29 新疆 山羊 AH2014 2014-04-03 安徽 山羊 GS2014 2014-01-22 甘肃 绵羊 SX2014 2014-04-05 山西 山羊 NX2014 2014-02-17 宁夏 绵羊 GX2014 2014-04-16 广西 山羊 LN2014 2014-03-17 辽宁 山羊 GZ2014 2014-04-21 贵州 山羊 CQ2014 2014-03-30 重庆 山羊 ZJ2014 2014-04-25 浙江 山羊 HLJ2014 2014-03-31 黑龙江 山羊 HN2014 2014-04-25 湖南 山羊 YN2014 2014-04-01 云南 山羊 GD2014 2014-05-15 广东 山羊 SaX2014 2014-04-01 陕西 山羊 SC2014 2014-06-10 四川 山羊 JX2014 2014-04-01 江西 山羊 表 3 PPRV参考毒株信息
Table 3. Details of the PPRV reference strains used in this study
毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 Tibet/30/2007 2007 中国西藏 山羊 FJ905304 Ethiopia 2010 2010 埃塞俄比亚 山羊 KJ867541 Tibet/33/2007 2007 中国西藏 山羊 KX421388 Ghana NK1 2010 2010 加纳 山羊 KJ466104 Tibet/Bharal/2008 2008 中国西藏 山羊 JX217850 Oman 1983 1983 阿曼 山羊 KJ867544 Côte d' Ivoire 89 1989 科特迪瓦 山羊 EU267273 UAE 1986 1986 阿联酋 山羊 KJ867545 Nigeria 76/1 1976 尼日利亚 山羊 EU267274 India TN Gingee 2014 2014 印度 山羊 KR261605 Turkey 2000 2000 土耳其 山羊 NC-006383 Uganda 2012 2012 乌干达 山羊 KJ867543 CIV 01 P 2009 2009 科特迪瓦 山羊 KR781451 Morocco 2008 2008 摩洛哥 山羊 KC594074 Ethiopia 1994 1994 埃塞俄比亚 山羊 KJ867540 -
2013−2017年，来自中国21个省份37个疫点的37株PPRV毒株P基因核苷酸序列间遗传距离为0~0.009 2。其中，2013年11月至2014年10月间的18个毒株P基因序列完全一致。这些毒株分别来自新疆(XJYL2013、XJ22013、XJ32013、XJ42013、XJ52013)、甘肃(GS2014)、辽宁(LN2014)、重庆(CQ2014)、云南(YN2014)、江苏(JS2014)、湖北(HB2014)、河南(HeN2014)、山西(SX2014)、吉林(JL2014)、贵州(GZ2014)、湖南(HN2014)、四川(SC2014)、浙江(ZJ82014)等14个省份。毒株XJ302017与GZ252017间的基因核苷酸序列差异最大，为0.009 2，共14个位点存在序列差异。
为考察毒株序列变异与流行时间的关系，选取最早采集的XJYL2013毒株作为参照，将其余36个毒株与其进行P基因核苷酸序列比对。结果发现：36个毒株分别在0~8个位点发生了突变。其中2013年11月至2014年10月间来自14省份的17个毒株与XJYL2013的P基因核苷酸序列完全一致。2014年3月至2015年3月黑龙江的HLJ2014、江西的JX2014、安徽的AH2014、广西的GX2014和广东的GD2014等5个毒株在不同位点发生了1个变异。2014年2月至2016年8月宁夏的NX2014、陕西的SX2014、吉林的JL2014、江西的JX2014和JX62014、浙江的ZJ2014、广西的GX62016等7个毒株在2个位点发生了变异。2015年4月安徽的AH162015和2016年1月的江苏JS142016等2个毒株在3个位点发生了变异。2015年9月贵州的GZ112015、2016年10月湖南的HN182016、2017年3月湖南的HN02017等3个毒株在4个位点发生了变异。2017年9月贵州的GZ252017、2017年2月新疆的XJ302017分别在6和8个位点发生了变异。37个毒株之间的核苷酸变异位点分布于P基因的47个位点，其中45个突变位点仅存在于1个毒株中，2个突变位点分别为3个毒株共有。上述结果表明P基因核苷酸序列突变位点数与毒株流行时间正相关，突变无地域相关性。利用Simplot软件对核苷酸序列发生变异的19株PPRV毒株与XJYL2013进行P基因核苷酸序列同源性比较分析(图1)，结果显示：P基因序列的850~1 250 nt间序列同源性较高，突变分布少，500~800 nt区域变异较大。
图 1 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸序列同源性Simplot分析
Figure 1. P gene nucleotide sequence similarity of China 2013−2017 PPRV strains using Simplot analysis
P基因的47个核苷酸变异位点中，有26个核苷酸变异导致了氨基酸序列的改变(表4)：17个变异发生于第1位密码子，其中的16个位点导致氨基酸改变；9个变异位于第2位密码子，全部导致氨基酸改变；21个变异位于第3位密码子，1个位点导致氨基酸改变。
表 4 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸和氨基酸序列变异情况
Table 4. Nucleotide and amino acid diversity of China 2013−2017 PPRV strains
变异位点 核苷酸/个 氨基酸/个 非同义突变率/% 中国2013−2017年流行毒株 第1位密码子 17 16 94.12 第2位密码子 9 9 100.00 第3位密码子 21 1 4.76 合计 47 26 55.32 中国2013−2017年流行毒株与其他代表毒株 第1位密码子 2 1 50.00 第2位密码子 2 2 100.00 第3位密码子 6 0 0.00 合计 10 3 30.00 -
2013−2017年中国37个PPRV毒株P基因氨基酸序列之间的遗传距离为0~0.007 9。P基因编码的509个氨基酸位点中，25个发生了突变，其中氨基端(1~250位氨基酸)16个，羧基端(251~509位氨基酸) 9个(图2)。第21、83、505位氨基酸位点分别有2个、3个和3个毒株发生了变异。在第21位氨基酸位点，XJ302017第1位密码子发生突变，导致丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)，HN182016第2位密码子发生突变，导致丙氨酸(A)突变至缬氨酸(V)。第83位氨基酸位点，3个毒株在同一个核苷酸位点发生不同突变，JL2014和 JX2014导致苯丙氨酸(F)突变至亮氨酸(L)，SaX2014苯丙氨酸(F)突变为缬氨酸(V)。第505位氨基酸位点，3个毒株在同一个核苷酸位点发生相同突变，JX62014、HN182016和GZ112015均发生了亮氨酸(L)至缬氨酸(V)的突变。
图 2 2013−2017年中国37个PPRV毒株P蛋白氨基酸序列比对
Figure 2. P protein amino acid sequence alignment of China 2013−2017 PPRV strains
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比较2013−2017年中国37株PPRV流行毒株与之前15株代表毒株的P基因核苷酸序列，发现遗传距离为0.025 4~0.139 7，其中与2007−2008年中国西藏地区3个毒株P基因核苷酸序列遗传距离为0.025 4~0.031 5，而西藏地区3个流行毒株之间的P基因核苷酸序列遗传距离为0~0.001 3。与15株代表毒株的氨基酸序列比对发现：2013−2017年中国37株PPRV流行毒株P基因的10个位点发生了核苷酸序列突变，其中3个导致了氨基酸序列的改变(表4)；2个变异发生于第1位密码子，其中1个导致氨基酸改变；2个变异位于第2位密码子，全部导致氨基酸改变；6个变异位于第3位密码子，未导致氨基酸改变。
2013−2017年，中国37株PPRV流行毒株与15株代表毒株P基因氨基酸序列的3个变异位点均位于175~243 位氨基酸，全部处在P蛋白的氨基端，其中175和176等2个相邻位点都为变异位点。
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基于P基因核苷酸序列构建系统发育树，发现2013−2017年中国37株PPRV流行毒株构成基因Ⅳ系中1个独立的进化小分支，而中国西藏地区流行毒株与印度2014年毒株形成1个小分支(图3)。
图 3 52个PPRV毒株P基因分子进化树
Figure 3. Phylogenetic relationships of 52 PPRV genome sequences
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本研究对2013−2017年中国21个省份37个疫点的PPRV流行毒株P基因进行序列分析，探明了PPRV流行过程中P基因序列变异情况，为PPR控制和消灭策略的制定提供了数据支持。
2013−2017年中国37个PPRV流行毒株的P基因变异较大。PPRV在中国流行的4 a间，P基因47个核苷酸位点发生了突变，其中26个导致了氨基酸序列的改变，非同义突变率为55.3%。研究[8]发现：2013年11月至2014年6月，25个毒株P基因在12个位点发生突变，其中10个导致了氨基酸序列的改变，非同义突变率为83.3%，高于F、H、L、N和M基因。已有研究[10]表明：2013−2017年中国37个PPRV流行毒株H基因的非同义突变率为58.5%，高于本研究中的P基因。这一结果提示：实施全面免疫后，PPRV在中国的流行受到了免疫选择压的作用，P基因的非同义突变率降低。
2013−2017年中国流行的PPRV毒株P蛋白氨基酸序列在10个位点发生了特征性的核苷酸突变，其中第21、83和505位3个导致了氨基酸序列改变。已有研究[9]表明：P蛋白对病毒RNA合成至关重要，可以分别与N蛋白、L蛋白及核衣壳结合形成不同的复合体发挥作用。P蛋白与L蛋白结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶进行病毒基因组RNA的转录，L蛋白发挥RNA聚合酶(RdRp)的作用，而P蛋白的作用是引导P-L复合体与核衣壳结合。一旦获得足够多的病毒蛋白，N蛋白就与病毒RNA结合，在这个过程中，P蛋白发挥蛋白伴侣的作用，引导N蛋白以游离形式与RNA结合。通常认为[9]：N-P复合体调节从转录到复制的转变。P-L复合体负责病毒基因组的复制，也就是说，先合成全长正链反向基因组RNA，然后以其为模板合成负链基因组RNA，用以组装病毒粒子[11]。P蛋白通过与游离的N蛋白结合，从而阻止N蛋白发生非特异性的自我组装，形成的N0-P复合物在复制过程中对新合成的RNA进行加帽化。副粘病毒P蛋白C末端的X-domain是主要的N蛋白结合位点[9]。PPRV第429~509位氨基酸区域高度保守，推测可能为N蛋白结合位点[12]。P蛋白与其他蛋白相互作用的功能域主要分布于羧基端，因此，在病毒演化过程中，P蛋白的羧基端较为保守。本研究发现：2013−2017年中国流行的PPRV毒株P蛋白氨基酸序列在505位发生了高频突变。该突变对其结构及功能的影响还需要进一步的研究。
在中国流行过程中，PPRV毒株P基因突变位点的数量与毒株流行时间呈正相关。本研究发现：相对于最早分离的XJYL2013，2013−2014年流行的毒株P基因突变位点为0~2个，而2017年流行毒株P基因突变位点为4~8个，随着毒株流行时间增长，P基因突变位点增多。已有研究[8]表明：PPRV毒株基因组在流行过程中的核苷酸突变进化速率为9.54×10−4位点·a−1。在流行过程中PPRV毒株P基因持续发生突变，但不同毒株突变位点不同，表现为相对随机的突变。随着流行时间的增长，在稳定免疫选择压的作用下，是否会出现变异位点的稳定和定植，还有待进一步的研究。持续实时监测PPRV各基因分子变异，对于该病的防控具有重要意义。
Evolution characterization of P gene of peste des petits ruminants virus in China from 2013 to 2017
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摘要:
目的 探究中国小反刍兽疫病毒(PPRV)田间流行毒株P基因的分子进化特征。 方法 对2013−2017年中国21省份37个疫点的小反刍兽疫病毒流行毒株进行磷蛋白基因(P基因)序列比较和分子进化分析。 结果 37个毒株P基因核苷酸序列间的遗传距离为0~0.009 2，变异分布在47个位点；P蛋白氨基酸序列间的遗传距离为0~0.007 9，变异分布在26个位点。与15株代表毒株的序列比对发现：2013−2017年中国37株PPRV流行毒株P基因的10个位点发生了核苷酸序列突变，其中3个导致了氨基酸序列的改变。以最大似然法构建分子进化树，发现2013−2017年中国流行的37个毒株构成基因Ⅳ系中1个独立的进化分支，与2007年传入西藏的毒株处于不同的进化分支。 结论 2013−2017年中国小反刍兽疫病毒P基因变异较大；随毒株流行时间增长，P基因的突变位点增多，但不同毒株突变位点不同，表现为相对随机的突变。图3表4参12 Abstract:Objective The objective of this study is to explore the molecular evolution characteristics of P gene of peste des petits ruminants virus (PPRV) during an epidemic in China. Method Bioinformatics analysis on the sequences of P gene of PPRV strains from 37 epidemic sites in 21 provinces of China from 2013 to 2017 was carried out. Result The genetic distances among the nucleotide sequences of P gene of 37 strains was 0−0.0092, and the variation sites were distributed in 47 sites. The genetic distances among the amino acid sequences of P gene of these strains ranged from 0−0.0079, and the variation sites were distributed in 26 sites. Sequence comparison with 15 representative strains showed that nucleotide sequence mutations occurred at 10 sites of P gene of 37 PPRV epidemic strains in China since 2013, and 3 of them led to the change of amino acid sequence. Phylogenetic analysis of P gene using maximum likelihood method revealed that all the 37 PPRV strains prevalent in China from 2013 to 2017 could be grouped into an independent clade in lineageⅣ, different from the strain introduced into Tibet in 2007. Conclusion From 2013 to 2017, the P gene mutation of peste des petits ruminants virus in China was relatively large. With the increase of epidemic time, the mutation sites of P gene increased, but the mutation sites of different strains were different, showing a relatively random mutation. [Ch, 3 fig. 4 tab. 12 ref.] -
Key words:
- peste des petits ruminants virus /
- P gene /
- sequence mutation /
- genetic evolution
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植物功能性状是指对植物个体生存与发展有着一定影响的植物特征，与植物自身的生存策略密切相关[1-2]。植物的生物学特性间接反映植物各功能性状间的权衡方式，影响着植物在群落中的生存与发展。在植物的各种器官间，小枝和叶片是植物器官分支系统中最敏感的部分，在植物的不同发育阶段，小枝和叶性状是植物与环境相互作用的结果[3]。植物如何通过调整小枝内各构件之间的生长关系，来适应不断变化的环境，是研究植物生态策略的重要内容[4]。作为植物光合作用重要的器官，叶片能够将光能转化为自身发育所需要的物质，其大小直接影响着植物个体的发育模式以及对光能的捕获和转化能力[5]。小枝是植物叶片直接着生的器官，它能够传输茎运输过来的养分及叶光合作用产生的同化物质，与植物在空间上的开展情况密切相关，并决定着叶片的投资方式[6]。小枝与叶片之间的关系是植物个体在不同发育阶段的生态策略体现[7]。不同物种对环境的适应情况不同，因此生存策略方式也不同，即快速高效策略和慢速高质量策略[8-10]。物种内存在不同发育阶段的植物个体，它们在环境中获得的资源情况不同。为了提高对环境的适应性，植物枝叶可能会在不同发育阶段有着不同的投资方式。植物小枝与叶片对环境变化的敏感性强，植物个体在不同发育阶段的生态策略容易在其性状上表现出来[10]。种群空间格局指种群个体在空间上的分布情况，是与外界环境相互作用的结果，在一定程度上反映种群的生态策略方式[11]。目前，关于种群空间格局的研究主要集中在不同物种间、物种内不同发育阶段等方面[11-12]，在植物性状间空间格局的分析较少。地统计学作为研究植物空间格局的重要方法，可以真实反映植物的空间变化[13]。SIEFERT[14]采用半方差变异函数对农田植物叶功能性状的空间格局进行了研究，发现叶功能性状具有中等空间自相关性，植物功能性状在空间上是连续变化的，进而能够预测植物性状的空间变化情况。探究植物枝叶性状的空间变化有助于理解植物对环境的适应策略。峨眉含笑Michelia wilsonii是多年生常绿乔木，主要生长于气候湿润，海拔600~2 000 m的常绿阔叶林中。虽然峨眉含笑的结实量较多，但其自然更新困难，分布区域较小，现已濒临灭绝，为国家Ⅱ级保护树种。目前，对于峨眉含笑的研究主要集中在群落结构、凋落物特征等方面[15-16]，对其生态策略方式还不清楚。因此，本研究以四川省雅安周公山峨眉含笑优势阔叶林为基础，选取种群内不同发育阶段个体为研究对象，分析枝叶性状在空间上的自相关性，以期为了解峨眉含笑枝叶性状之间的资源权衡方式和生态策略方式提供依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于四川省雅安周公山国家森林公园内(29°58′09″N，103°02′58″E)。该区属亚热带季风性湿润气候，降水量大，年均降水量为1 774.3 mm；湿度大，年平均相对湿度79%；气温较低，年平均气温14.0 ℃，海拔900~1 180 m；土壤类型以山地黄壤为主。研究区内植被丰富，以常绿阔叶林为主，除峨眉含笑优势树种外，伴生有杉木Cunninghamia lanceolata、华中樱桃Cerasus conradinae、栗Castanea mollissima、日本杜英Elaeocarpus japonicus、刺楸Kalopanax septemlobus、灯台Bothrocaryum controversum、南酸枣Choerospondias axillaris等乔木树种，林分郁闭度为0.8~0.9；林下主要有水竹Phyllostachys heteroclada、姬蕨Hypolepis punctata及一些禾草等植物，盖度达80%以上[15]。
1.2 样地设置
在峨眉含笑种群分布较多的地区，建立1块200 m×200 m的固定样地，并将样地划分为100个20 m×20 m的样方。逐一对样方内所有胸径≥5 cm的峨眉含笑个体进行挂牌登记，并记录胸径、树高等信息，以便进行后期采样工作。
1.3 枝叶采集
于2018年7月采集样地内峨眉含笑个体的叶片和枝条。根据研究区域峨眉含笑种群的年龄结构及数量动态特征[16]，将其划分为小树(胸径5~15 cm)、中树(胸径15~25 cm)和大树(胸径＞25 cm) 3个阶段。定义当年生小枝为1年生小枝，沿着1年生小枝依次向内为2年生、3年生小枝。为了保证每株树采集的1、2年生枝条和叶来自同一个树枝，本研究在树冠南部枝条分叉处直径约1 cm粗的地方剪取1个树枝，从树枝上采集6个能明显区分1、2年生的小枝。采集小枝上成熟的当年生叶片15片，并将1、2年生小枝中均匀生长的部分截断，将其保存在自封袋中，做好标记带回实验室进行后续指标测定。共采集20株小树、59株中树、34株大树的枝叶。
1.4 指标测定
叶片鲜质量使用电子天平(精度0.000 1 g)称量；将称量过后的叶片放入烘箱中，在105 ℃下烘20 min进行杀青，然后在80 ℃下烘48 h，用电子天平称其干质量(精度0.000 1 g)。用叶面积(LI-3100C，LI COR，美国)扫描仪测定叶片后，在PS6中计算叶片面积；用游标卡尺测量叶片厚度(精度0.01 mm)。叶干鲜比=叶片干质量(g)/叶片鲜质量(g)；比叶面积=叶片面积(cm2)/叶片干质量(g)。将所有小枝浸入去离子水中8~12 h，待小枝达到饱和状态后将其取出，用排水法测量小枝体积。将测量完体积的小枝，用吸水纸吸去表面水分后用电子天平称量(精度0.000 1 g)，获得小枝鲜质量，然后将其放入烘箱中80 ℃烘48 h，用电子天平称量(精度0.000 1 g)，获得小枝干质量。小枝干鲜比=小枝干质量(g)/小枝鲜质量(g)；小枝密度=小枝干质量(g)/小枝体积(cm3)。
1.5 数据处理
采用单因素方差分析对峨眉含笑种群不同发育阶段枝叶性状进行差异分析；采用标准化主轴分析计算枝叶性状间的相关性。为了使枝叶性状呈正态分布，对其进行了对数转换(以10为底数)。数据分析在R语言的smatR包中进行。
通过主成分分析获得每株树木第1轴枝叶性状的得分值，然后采用半方差函数法对峨眉含笑种群不同发育阶段枝叶性状主成分得分进行空间格局分析[17-18]。其计算公式为：
$$ \gamma \left(h\right)=\frac{1}{2N\left(h\right)}\sum _{i=1}^{N\left(h\right)}{[Z\left({x}_{i}\right)-Z({x}_{i}+h\left)\right]}^{2} {\text{。}} $$ 式(1)中：γ(h)为林木个体间距为h时的半方差函数值；N(h)为林木个体间距为h时的样本对数；Z(xi)为林木个体i在位置点xi处的实测值；Z(xi+h)为林木个体在位置点xi+h处的实测值。通过半方差值进行模型拟合，绘制半方差函数图。
本研究选取4种模型进行拟合(球状模型、指数模型、高斯模型和线性模型)，选取模型决定系数(R2)最大和残差最小的模型。通过最优模型获得基台值(C0+C)、偏基台值(C)、块金值(C0)和变程(A)，求得结构方差比[C/(C0+C)]来表示研究区变量的最大变异程度。一般认为结构方差＞75%时，空间自相关性强；结构方差位于25%~75%时，空间自相关性中等，结构方差＜25%时，空间自相关弱，此时不宜采用克里格(Kringing)插值进行变量预测。
2. 结果与分析
2.1 峨眉含笑不同发育阶段枝叶性状特征
不同发育阶段叶鲜质量、叶干质量和2年生小枝密度差异显著(P＜0.05)，大树与中树、小树之间叶面积、比叶面积、1年生小枝密度差异显著(P＜0.05)，中树和小树之间叶干鲜比和2年生小枝干鲜比差异显著(P＜0.05)，其余性状差异不显著(P＞0.05)(表1)。叶鲜质量、叶干质量、叶面积、叶厚、1年生小枝干鲜比、1年生小枝密度随着林木胸径的增加呈显著增加(P＜0.05)，比叶面积随着林木胸径的增加显著降低(P＜0.05)(表2)。主成分分析前2轴的解释总方差为56.99%，其中第1轴的解释方差为39.95%，第2轴的解释方差为17.04%(图1)。对枝叶性状进行排序，叶性状与第1排序轴的相关性较高，枝性状与第2排序轴相关性较好。在第1排序轴中，除比叶面积外，从左到右，枝叶性状增加，幼树有着较高的比叶面积值，而大树除比叶面积外，其他枝叶性状较高；在第2排序轴中，从下到上，枝性状逐渐增加，叶性状逐渐减小，幼树有着较低的枝叶性状。这意味着更高发育阶段的个体有着更高的枝叶性状。
表 1 不同发育阶段枝叶性状特征Table 1 Traits of twig and leaf in different development stages发育
阶段叶鲜
质量/g叶干
质量/g叶厚/mm 叶干鲜比 叶面积/cm2 比叶面积/
(cm2·g−1)1年生小枝
干鲜比1年生小枝
密度/(g·cm−3)2年生小枝
干鲜比2年生小枝
密度/(g·cm−3)大树 1.20±0.23 a 0.44±0.09 a 0.21±0.03 a 0.37±0.05 ab 50.52±6.15 a 113.37±18.12 b 0.38±0.02 a 0.45±0.04 a 0.41±0.03 a 0.45±0.04 a 中树 0.96±0.22 b 0.37±0.10 b 0.18±0.03 b 0.38±0.06 a 46.56±7.42 b 130.10±26.26 a 0.37±0.02 a 0.42±0.04 b 0.41±0.02 a 0.43±0.04 b 小树 0.84±0.14 c 0.31±0.07 c 0.18±0.03 b 0.35±0.03 b 43.41±5.79 b 140.67±21.46 a 0.38±0.03 a 0.42±0.03 b 0.39±0.02 b 0.40±0.04 c 说明：不同字母表示不同发育阶段同一性状差异显著(P＜0.05) 
图 1 不同发育阶段枝叶性状主成分排序图Figure 1 PCA ordination of twig and leaf traits at different developmental stages箭头表示枝叶性状表 2 枝叶性状与胸径之间的相关系数Table 2 Correlation coefficient between twig, leaf traits and DBH性状 叶鲜质量 叶干质量 叶厚 叶干鲜比 叶面积 比叶面积 1年生小枝干鲜比 1年生小枝密度 2年生小枝干鲜比 2年生小枝密度 胸径 0.60** 0.52** 0.38** −0.41** −0.01 0.44** 0.22* 0.41** 0.15 0.41** 说明：*P＜0.05；**P＜0.01 2.2 不同发育阶段枝叶性状相互关系
标准化主轴分析发现(表3)：叶性状之间及枝性状之间有着较强的相关关系，叶性状与茎性状之间相关性较弱，仅叶鲜质量和叶干质量与小枝性状具有相关性。主成分分析(PCA)也发现(图1)：叶性状与小枝性状存在正交关系。从表4~6可以看出：不同发育阶段叶性状间相关显著(P＜0.05)，其中，大树和中树阶段叶性状间相关性均比小树阶的段相关性强；不同发育阶段枝性状之间相关性从大到小依次为小树、中树、大树。枝叶性状之间相关性，除了小树阶段叶干质量和1年生小枝密度，大树阶段叶鲜质量和1年生小枝干鲜比、1年生小枝密度，中、小树阶段比叶面积和1年生小枝密度，中树阶段叶厚和1年生小枝密度显著相关外(P＜0.05)，其余均不显著(P＞0.05)。
表 3 整个发育阶段枝叶性状之间的相关系数Table 3 Correlation coefficient between the twig and leaf traits in the whole development stage性状 LFW LDW LT LDMC LA SLA ABDMC ABTD BBDMC BBTD LFW 1 LDW 0.850** 1 LT 0.585** 0.604** 1 LDMC −0.028 0.304** 0.138 1 LA 0.722** 0.697** 0.408** 0.052 1 SLA −0.588** −0.733** −0.513** −0.496** −0.284** 1 ABDMC 0.310** 0.253** 0.083 0.030 0.065 −0.220** 1 ABTD 0.371** 0.395** 0.295** 0.098 0.151 −0.374** 0.440** 1 BBDMC 0.076 0.133 0.026 0.171 0.031 −0.099 0.255** 0.216** 1 BBTD 0.250** 0.258** 0.149 0.172 0.095 −0.291 0.325** 0.352** 0.507** 1 说明：*P＜0.05；**P＜0.01。LFW. 叶鲜质量；LDW. 叶干质量；LT. 叶厚；LDMC. 叶干鲜比；LA. 叶面积；SLA. 比叶面积； ABDMC. 1年生小枝干鲜比；ABTD. 1年生小枝密度；BBDMC. 2年生小枝干鲜比；BBTD. 2年生小枝密度 表 4 大树阶段枝叶性状之间的相关系数Table 4 Correlation coefficient between the twig and leaf traits in big tree stage性状 LFW LDW LT LDMC LA SLA ABDMC ABTD BBDMC BBTD LFW 1 LDW 0.817** 1 LT 0.623** 0.616** 1 LDMC −0.017 0.183 0.135 1 LA 0.651** 0.638** 0.472* 0.003 1 SLA −0.540** −0.607** −0.433** −0.567* −0.264 1 ABDMC 0.344* 0.170 0.124 0.164 0.108 −0.024 1 ABTD 0.449* 0.305 0.294 −0.026 0.183 0.031 0.547** 1 BBDMC 0.020 −0.077 −0.058 0.226 0.086 −0.056 0.219 0.004 1 BBTD 0.259 0.045 0.244 0.147 0.206 −0.205 0.024 0.176 0.279 1 说明：*P＜0.05；**P＜0.01。LFW. 叶鲜质量；LDW. 叶干质量；LT. 叶厚；LDMC. 叶干鲜比；LA. 叶面积；SLA. 比叶面积； ABDMC. 1年生小枝干鲜比；ABTD. 1年生小枝密度；BBDMC. 2年生小枝干鲜比；BBTD. 2年生小枝密度 表 5 中树阶段枝叶性状之间的相关系数Table 5 Correlation coefficient between the twig and leaf traits in middle tree stage性状 LFW LDW LT LDMC LA SLA ABDMC ABTD BBDMC BBTD LFW 1 LDW 0.831** 1 LT 0.486** 0.573** 1 LDMC −0.043 0.394** 0.248 1 LA 0.732** 0.695** 0.301* 0.125 1 SLA −0.506** −0.718** −0.509** −0.540** −0.212 1 ABDMC 0.228 0.175 −0.033 −0.072 −0.075 −0.248 1 ABTD 0.124 0.236 0.070 0.166 −0.033 −0.348* 0.373* 1 BBDMC −0.047 0.097 −0.044 0.030 −0.086 0.037 0.232 0.187 1 BBTD −0.024 0.066 −0.025 0.118 −0.196 −0.118 0.369* 0.240 0.511** 1 说明：*P＜0.05；**P＜0.01。LFW. 叶鲜质量；LDW. 叶干质量；LT. 叶厚；LDMC. 叶干鲜比；LA. 叶面积；SLA. 比叶面积； ABDMC. 1年生小枝干鲜比；ABTD. 1年生小枝密度；BBDMC. 2年生小枝干鲜比；BBTD. 2年生小枝密度 表 6 小树阶段枝叶性状之间的相关系数Table 6 Correlation coefficient between the twig and leaf traits in small tree stage性状 LFW LDW LT LDMC LA SLA ABDMC ABTD BBDMC BBTD LFW 1 LDW 0.737** 1 LT 0.510* 0.471* 1 LDMC −0.122 0.336 0.105 1 LA 0.438 0.437 0.361 −0.360 1 SLA −0.342 −0.649* −0.246 −0.472* 0.196 1 ABDMC 0.393 0.481* 0.029 0.262 0.219 −0.243 1 ABTD 0.368 0.570* 0.478* 0.315 0.094 −0.645* 0.336 1 BBDMC 0.266 0.346 0.372 0.343 0.007 −0.377 0.413 0.679** 1 BBTD 0.268 0.448 0.126 0.335 0.172 −0.388 0.570* 0.573** 0.775** 1 说明：*P＜0.05；**P＜0.01。LFW. 叶鲜质量；LDW. 叶干质量；LT. 叶厚；LDMC. 叶干鲜比；LA. 叶面积；SLA. 比叶面积； ABDMC. 1年生小枝干鲜比；ABTD. 1年生小枝密度；BBDMC. 2年生小枝干鲜比；BBTD. 2年生小枝密度 2.3 不同发育阶段枝叶性状半方差分析
在不同发育阶段枝叶性状中，选择第1轴的林木个体枝叶性状主成分得分进行半变异函数方差分析(表7和图2)。对整体林分而言，单木整体性状、叶性状和枝性状的结构方差比分别为25.2%、31.8%、0，单木整体性状和叶性状具有中等程度的空间自相关，枝性状空间自相关性弱，拟合最优模型为线性，说明其性状表现呈随机分布。在大树阶段，单木整体、叶性状和枝性状的结构方差比分别为50.5%、50.4%和50.5%，具有中等的空间自相关程度，有效变程分别为75.60、73.70和212.70 m，拟合最优模型分别为球状模型、球状模型和指数模型，呈聚集分布，枝性状的有效变程最大，说明枝性状的空间连续性更大。在中树和小树阶段，模型拟合效果差，且结构方差低，说明小树阶段枝叶性状空间自相关性弱，不宜采用克里格插值(Kringing)空间预测。
表 7 枝叶性状半方差模型及参数Table 7 Isotropic semi-variogram model and parameters of twig and leaf traits发育阶段 变量 模型 块金值C0 基台值C0+C 结构方差比C/(C0+C)/% 有效变程A/m 决定系数R2 残差 整个发育阶段 单木整体性状 线性 0.105 2 0.140 7 25.2 144.95 0.630 0.001 0 叶 线性 0.114 0 0.167 1 31.8 144.95 0.625 0.002 2 枝 线性 0.091 7 0.091 7 0 144.95 0.509 0.004 3 大树 单木整体性状 球状 0.045 9 0.092 8 50.5 75.60 0.382 0.004 6 叶 球状 0.056 1 0.113 2 50.4 73.70 0.328 0.008 9 枝 指数 0.052 1 0.105 2 50.5 212.10 0.370 0.000 3 中树 单木整体性状 高斯 0.009 2 0.083 0 88.9 2.77 0.001 0.001 3 叶 线性 0.113 4 0.113 4 0 78.30 0.039 0.002 2 枝 线性 0.078 9 0.078 9 0 78.30 0.000 0.004 9 小树 单木整体性状 球状 0.015 3 0.085 6 82.1 9.00 0.040 0.020 3 叶 球状 0.003 7 0.059 4 93.8 10.10 0.117 0.008 2 枝 线性 0.144 6 0.144 6 0 82.42 0.449 0.070 9 3. 讨论
3.1 不同发育阶段枝叶性状的差异
植物之间的生存策略方式会在植物的性状上表现出来。比叶面积与植物的光合利用效率有关[19]，本研究中比叶面积随着林木大小增加显著降低，这与其他不同物种及生境下得到的研究结果一致[20]。耿梦娅等[21]通过对不同发育阶段叶性状的研究发现：发育后期的植物个体有着更大更厚的叶片，且不同的发育阶段叶片性状差异显著，与本研究结果相符。较高的林木在进行长距离水分运输时，必须克服阻力问题，而较高的茎干鲜比将有利于水分的运输[22]。本研究发现：枝干鲜比与林木大小的关系不显著，可能是研究区内湿度高，水资源没有成为限制植物生长的环境因子，这与HE等[23]的研究结果一致。研究还发现：随着林木的发育，小枝密度逐渐增大，高密度的小枝除了能够加强对外界环境的抵抗外，还能够承载更大更多的叶片；较低的小枝密度意味着有更低构造细胞的成本，有利于小树阶段枝条的快速生长[24]。这反映了种群的生态策略方式从小树到大树阶段由快收益向慢收益转变，这是物种的生存策略所决定的。自然界中，无论从单个物种的发育阶段还是不同生活型的物种来看，大部分矮小的林木有着小的叶片，高大的林木个体叶片和枝密度更高[25]，与本研究结果相符。
3.2 枝叶性状间的相关性
本研究发现：在小枝与叶片的10个性状中，叶性状间的相关性强，与FORTUNEL等[26]的研究结果一致。部分性状间在小树阶段相关性较低或不显著，可能是在激烈的竞争环境下，由于生存策略的优化方式，不同器官间的权衡方式在各性状间独立运行的原因[27]。小枝与叶功能性状相关性较弱，仅小枝密度与叶鲜质量和干质量呈正相关，然而MÉNDEZ-ALONZO等[28]研究发现：茎密度与水分传导速率呈显著负相关，本研究结果与其相反，原因是茎的密度远大于小枝密度，足以支持林木生长的需要，因此更应该考虑长距离运输过程中高密度组织细胞带来的水分运输问题，这是茎与小枝不同的功能作用造成的。对茎叶经济谱的研究发现[9, 29]：茎经济谱与叶经济谱呈正交状态，本研究中小枝与叶性状在排序轴呈正交状态，这是造成枝叶性状相关性弱的重要原因。叶片质量与枝密度呈显著正相关，较大的枝密度意味着小枝能够承受更多的质量负荷。对不同发育阶段叶片质量与枝密度之间的相关性分析发现：这种现象在大树阶段表现得更加显著，其原因是小枝密度与叶生物量密切相关[6]，本研究也发现大树有着更大更厚的叶。通过研究4个枝性状之间的关系，两两之间呈正相关，较高的小枝密度需要更多的结构组织，这种现象在不同的发育阶段都有着不同程度的表现，小树阶段小枝性状间相关性更大，这主要是因为小树阶段的生物学特征决定的。关于茎经济谱[9]的研究表明：茎密度与茎干鲜比密切相关，本研究中小枝性状间也出现这种相关性。对于茎经济谱理论，同样也能适用于小枝部分性状的研究。
3.3 不同发育阶段枝叶性状空间特征
在地统计学分析中，整体林分的枝叶性状分布模式以随机分布为主，其空间自相关性为中等，其原因是天然林中阔叶树种的分布方式常以随机分布为主[29]。大树阶段，枝叶性状以聚集分布为主，刘妍妍[30]通过对阔叶林的空间格局分析发现：具有较大叶片的个体通常以聚集形式分布，与本研究相符。叶片和小枝性状是影响植物冠幅大小的重要因素，能够影响成年植物冠层的结构形式及发展状态，进而影响植物对资源的获取能力。大树阶段枝性状主成分得分的有效影响变程均大于整体和叶性状，说明枝条的开展情况比叶的大小更能加剧大树个体之间的影响。中、小树阶段枝叶性状的拟合效果和结构方差比较小，不成连续变化状态，中、小树阶段林木枝叶性状的预测不宜采用克里格(Kringing)插值估算，与SIEFERT[14]的研究不一致，主要原因可能是中、小树阶段的空间格局分布方式为随机分布，林木间的距离较远，空间自相关性弱。若要预测样地整体功能性状的表现，需要测量更多林木个体的功能性状值。
综上所述，不同发育阶段枝叶性状差异显著，大树倾向于高质量的投资策略，小树的投资策略为快速投资；不同发育阶段叶性状间和小枝性状间相关性显著；峨眉含笑种群大树阶段枝叶性状具有空间自相关性。
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图 1 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸序列同源性Simplot分析
Figure 1 P gene nucleotide sequence similarity of China 2013−2017 PPRV strains using Simplot analysis
图 2 2013−2017年中国37个PPRV毒株P蛋白氨基酸序列比对
Figure 2 P protein amino acid sequence alignment of China 2013−2017 PPRV strains
表 1 2014−2017年中国12株PPRV毒株信息
Table 1. Details of the 12 PPRV strains collected in China during 2014−2017
毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 JL472014 2014-04-06 吉林 JS142016 2016-01-20 江苏 JX62014 2014-07-21 江西 GX22016 2016-08-22 广西 ZJ82014 2014-10-11 浙江 HN182016 2016-10-16 湖南 JX172015 2015-03-30 江西 XJ302017 2017-02-12 新疆 AH162015 2015-04-09 安徽 HN02017 2017-03-05 湖南 GZ112015 2015-09-02 贵州 GZ252017 2017-09-21 贵州 
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表 2 2013−2014年中国PPRV流行毒株信息
Table 2. Details of the PPRV strains collected in China during 2013−2014
病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 XJYL2013 2013-11-30 新疆 山羊 JL2014 2014-04-01 吉林 绵羊 XJ22013 2013-12-20 新疆 山羊 JS2014 2014-04-02 江苏 山羊 XJ32013 2013-12-21 新疆 绵羊 HeN2014 2014-04-03 河南 山羊 XJ42013 2013-12-22 新疆 山羊 HB2014 2014-04-03 湖北 山羊 XJ52013 2013-12-29 新疆 山羊 AH2014 2014-04-03 安徽 山羊 GS2014 2014-01-22 甘肃 绵羊 SX2014 2014-04-05 山西 山羊 NX2014 2014-02-17 宁夏 绵羊 GX2014 2014-04-16 广西 山羊 LN2014 2014-03-17 辽宁 山羊 GZ2014 2014-04-21 贵州 山羊 CQ2014 2014-03-30 重庆 山羊 ZJ2014 2014-04-25 浙江 山羊 HLJ2014 2014-03-31 黑龙江 山羊 HN2014 2014-04-25 湖南 山羊 YN2014 2014-04-01 云南 山羊 GD2014 2014-05-15 广东 山羊 SaX2014 2014-04-01 陕西 山羊 SC2014 2014-06-10 四川 山羊 JX2014 2014-04-01 江西 山羊
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表 3 PPRV参考毒株信息
Table 3. Details of the PPRV reference strains used in this study
毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 Tibet/30/2007 2007 中国西藏 山羊 FJ905304 Ethiopia 2010 2010 埃塞俄比亚 山羊 KJ867541 Tibet/33/2007 2007 中国西藏 山羊 KX421388 Ghana NK1 2010 2010 加纳 山羊 KJ466104 Tibet/Bharal/2008 2008 中国西藏 山羊 JX217850 Oman 1983 1983 阿曼 山羊 KJ867544 Côte d' Ivoire 89 1989 科特迪瓦 山羊 EU267273 UAE 1986 1986 阿联酋 山羊 KJ867545 Nigeria 76/1 1976 尼日利亚 山羊 EU267274 India TN Gingee 2014 2014 印度 山羊 KR261605 Turkey 2000 2000 土耳其 山羊 NC-006383 Uganda 2012 2012 乌干达 山羊 KJ867543 CIV 01 P 2009 2009 科特迪瓦 山羊 KR781451 Morocco 2008 2008 摩洛哥 山羊 KC594074 Ethiopia 1994 1994 埃塞俄比亚 山羊 KJ867540
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表 4 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸和氨基酸序列变异情况
Table 4. Nucleotide and amino acid diversity of China 2013−2017 PPRV strains
变异位点 核苷酸/个 氨基酸/个 非同义突变率/% 中国2013−2017年流行毒株 第1位密码子 17 16 94.12 第2位密码子 9 9 100.00 第3位密码子 21 1 4.76 合计 47 26 55.32 中国2013−2017年流行毒株与其他代表毒株 第1位密码子 2 1 50.00 第2位密码子 2 2 100.00 第3位密码子 6 0 0.00 合计 10 3 30.00
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