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NAC(NAM-ATAF1/2-CUC2)是植物中最大的转录因子家族之一，成员众多，功能多样[1]。NAC转录因子参与植物多个生物学过程，如植物茎尖分生组织的形成[2]、植物次生生长[3]、组织愈合过程中的细胞增殖[4]、生物和非生物胁迫响应[5-6]、植物开花时间调节[7-8]、叶片和花瓣衰老[9]和果实成熟时颜色变化等[10]。花瓣细胞的伸长和扩展也受到NAC转录因子的调控。花瓣的扩展是引起植物花开放的重要原因[11-13]，主要受花瓣细胞的膨压变化、细胞壁代谢变化等影响[14]。研究发现：NAC转录因子NAP可能通过抑制拟南芥Arabidopsis thaliana花瓣细胞扩张而影响花器官生长，且在花发育细胞分裂向细胞扩展过渡阶段发挥重要作用[15]。RhNAC3可以作为上游调控因子结合具有调节渗透压功能的基因从而影响月季Rosa hybrida花瓣细胞扩张[16]。桂花Osmanthus fragrans是中国传统的十大名花之一，花是其最重要的观赏器官。桂花花的开放受到温度、湿度等环境因子的影响，其具体的分子机制至今尚未阐明。本研究通过桂花NAC家族基因鉴定和筛选，预测它们的理化性质，运用荧光定量PCR分析花开放进程中的表达模式，筛选出参与桂花花开放调控的关键NAC转录因子成员，为明确其在花开放中的功能作用奠定基础。
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以桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhonggui’盆栽植株为材料，种植于浙江农林大学桂花资源圃。选取株龄相同、生长一致的健康植株，分别于起始期(S1)以及花开放不同阶段：圆珠期(S2)、顶壳期(S3)、铃梗期(S4)、初开期(S5)、盛花期(S6)进行取样[17]。每个时期样品采集3份，取样时间均为10:00，液氮速冻后储藏于−80 ℃冰箱备用。
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本研究从已构建的桂花‘堰虹桂’转录组数据库[18]中对NAC转录因子进一步进行NCBI-Blast(http://www.ncbi.nLm.nih.gov/BLAST/)比对分析。通过PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)以及Pfam(https://pfam.xfam.org/)查询候选基因中的NAC的结构域，并通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)进行保守功能域预测，利用TBtools工具进行桂花NAC保守结构域可视化分析，TBtools-ORF finder分析开放阅读框[19]，并通过NCBI-Blast获得开放阅读框完整的桂花OfNAC序列。运用ExPASy在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白质分子量、理论电点、酸碱性等。
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用DNAMAN对已筛选的桂花OfNAC转录因子氨基酸序列进行比对，分析其保守亚结构域；在线分析软件MEME 5.1.0分析NAC的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme)，对桂花OfNAC蛋白质二级结构以及跨膜结构分别采用在线软件SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-sopma.html)和TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行分析。用在线分析软件Wolfp sort Genscript(https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)进行亚细胞定位预测。
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从PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)中获取拟南芥、水稻Oryza sativa的NAC序列，使用MEGA 6.0软件构建系统发育树，采用邻近法(neighbor-joining)，1 000 次Bootstrap抽样。
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RNA提取采用UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit试剂盒(诺禾致源公司，中国天津)，方法参照说明书。使用核酸分析仪(IMPLEN公司，德国)对RNA的纯度与浓度进行检测，并用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。依据说明书使用PrimeScript™RT Master Mix Perfect Real Time(TaKaRa，中国大连)试剂盒对桂花不同花开放时期的cDNA进行合成。利用Primer Premier 5.0对22个OfNAC基因进行定量特异性引物设计，桂花OfACT作为内参基因[20]，引物序列如表1所示。荧光定量反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物和下游引物(10 μmol·L−1)各8 μL，双蒸水(ddH2O)补足至20 μL，每个样品设置3次生物学重复。反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性30 s，共40个循环；然后以95 ℃持续5 s，60 ℃持续1 min，95 ℃持续15 s作为溶解曲线分析程序。循环阈值由Light Cycler 480软件自动计算。最后根据
${2^{{\rm{ - }}\Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}} $ 法计算目的基因的相对表达量。表 1 桂花OfNAC转录因子RT-PCR特异性引物
Table 1. Specific primers for RT-PCR of OfNAC in O. fragrans
基因名称 用于荧光定量的引物序列(5′→3′) 基因名称 用于荧光定量的引物序列(5′→3′) OfNAC100-1 F: TGAACAAGATTGAGCCTTGGG OfNAC104 F: TGCATTTTACATTGGTGAAGATGTC R: CCTTTCCTGTGGCTTTCCAG R: GCTCGTACACTTGACACACCA OfNAC53 F: AGATTGTGGGGATGAAGAAAA OfNAC92 F: TCCTAGTCGGAATGAAGAAAACTC R: CAACTCCATATCAGTAAGCCG R: ATGGCTTTCTAATCTGTATTCGTGC OfNTM1-9 F: GGTTGCTCTAATGCCCACTTC OfNAC72-1 F: GGAAAAGCCCCCAAAGGAAC R: CTGGTTCCGTAGCACGATACT R: CCCAATCATCCAACCTTGAGC OfNAC73 F: AGGCAAGGATGGCCAAATTC OfNAC72-2 F: ACGTAGGAAAAGCACCAAAAGG R: TTGTGCCATCTTGTTTCTCC R: AGCATCCAACCTTGCGCTTC OfNAC43 F: AGGCTACTGGTCGTGATAAAG OfNAC29-1 F: TTACAAGGGAAGGCCTCCAAAG R: GGGGTCATGAGTGTCGTCC R: TTGAGCCATTTTGCGTGTTAGG OfNAC91 F: TCTACAAAGGTCGTGCTCCG OfNAC29-2 F: CCCAAAGGGCGTCAAAACTG R: CCCTGACCAGGATAAGTGCC R: GCACACAATCATCCAACCTCA OfNAC50-X2 F: TGGCAAAGGGTATTGGAAAGC OfNAC71 F: CTATCGTGGAAGAGCACCACT R: TCGCCCACTATGGAAAACAAG R: TCCCTGAAATCTTGGGGTGTC OfNAC50 F: AAGCAACTGGAAAGGATCGC OfNAC2 F: TTGGGAATAAAGAAGGCTCTGGTG R: AATTCTGCATCGCAAAGCCTG R: ACACAACACCCAATCATCAAGCCTC OfNAC21/22 F: GAAGGGAAGCCTGGTTGGAAT OfNAC100-2 F: TCAGAGGAAAAATCCTCGTCGG R: CCCAATCCTCCTTGACAGATG R: TTTGGGAGGTTGTGGATCGAG OfNAC56 F: TCTATGGTGGAAAGCCTCCT OfNAC32 F: AAGCCTTGGTTTTCTATGCCG R: CATCAAGCCTTAAAGAGCCC R: AAGCTGTTGTTCTTGTTTCGA OfNAC17-X2 F: TCCTGTTGGGGTGAAGAAGA OfACT F: CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT R: ATAGTCATCCTGTGCATCCTGC R: ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfNAC17 F: TGGTCTTCCATAAAGGTCGTGC R: TTGTACAGAGCATAGCAATCCCGTG -
通过对桂花‘堰虹桂’转录组数据分析，并结合NCBI-Blast筛选，对其中22个桂花OfNAC基因进行分析。结果显示：它们均含有NAC家族蛋白特有的NAM保守功能域(图1)。通过ExPASy对22条桂花OfNAC转录因子进行理化性质分析(表2)，结果表明：22条桂花OfNAC基因的氨基酸(OfNAC104~OfNAC91)长度为186~609个；蛋白质(OfNAC104~OfNAC17)相对分子量为21 498.77~68 408.12；等电点为4.59~9.33，其中OfNAC100-1、OfNAC73、OfNAC56、OfNAC72-1、OfNAC72-2、OfNAC29-1、OfNAC29-2、OfNAC32等8个蛋白质等电点大于7，偏碱性，其余14个OfNAC等电点小于7，偏酸性。OfNAC的不稳定系数为29.27~52.83，OfNAC53、OfNAC73、OfNAC56、OfNAC92、OfNAC29-2等5个蛋白质不稳定系数低于40，为稳定蛋白质，其余17个不稳定系数均高于40，为不稳定蛋白质。脂溶性指数为53.37(OfNAC71)~77.70(OfNAC17-X2)，总平均疏水值为−0.816~−0.530，蛋白质的平均疏水指数均小于0，表明OfNAC均为亲水性蛋白质(表2)。
图 1 桂花NAC的NAM保守功能域分析
Figure 1. NAM conserved functional domain about NAC
表 2 桂花OfNAC蛋白质理化性质及二级结构分析
Table 2. Physicochemical properties and secondary structure analysis of OfNAC of O. fragrans
序列名称 氨基酸长度/个 相对分子量 等电点 碱性氨基酸 酸性氨基酸 不稳定系数 脂溶性指数 总平均疏水值 亚细胞定位 位置 预测值/% OfNAC100-1 345 38 986.11 8.69 40 36 40.06 61.01 −0.574 细胞核 61.54 OfNAC53 558 62 807.47 4.60 51 88 38.87 69.37 −0.564 内质网 42.42 OfNTM1-9 606 68 053.70 5.63 71 86 51.49 62.43 −0.725 细胞核 76.92 OfNAC73 300 33 768.95 8.79 39 34 38.21 69.47 −0.754 细胞核 76.92 OfNAC43 399 45 513.66 5.77 43 55 46.31 63.26 −0.752 细胞核 69.23 OfNAC91 609 67 741.52 4.98 63 86 52.83 71.07 −0.593 细胞核 76.92 OfNAC50-X2 389 43 765.29 5.29 46 58 47.83 69.43 −0.629 叶绿体 58.33 OfNAC50 399 44 952.52 5.35 46 61 50.45 67.69 −0.652 叶绿体 46.15 OfNAC21/22 296 33 613.15 6.54 33 34 51.26 66.52 −0.570 细胞核 71.43 OfNAC56 322 35 946.51 8.62 37 34 39.48 64.81 −0.725 细胞核 92.30 OfNAC17-X2 573 64 828.71 4.87 63 91 40.60 77.70 −0.530 细胞核 53.85 OfNAC17 606 68 408.12 4.85 60 97 46.79 74.62 −0.571 细胞核 30.77 OfNAC104 186 21 498.77 4.59 19 31 46.96 68.60 −0.695 细胞核 84.61 OfNAC92 325 36 813.71 6.47 40 42 29.27 71.35 −0.579 细胞核 38.46 OfNAC72-1 339 38 289.93 8.64 40 37 40.14 64.96 −0.671 细胞核 84.61 OfNAC72-2 342 38 848.46 8.64 42 39 40.04 61.64 −0.762 细胞核 100 OfNAC29-1 280 32 538.56 7.71 36 35 42.96 61.96 −0.816 细胞核 52.50 OfNAC29-2 275 31 330.36 9.33 35 26 33.81 61.35 −0.741 细胞核 100 OfNAC71 303 34 864.61 5.42 33 43 51.89 53.37 −0.795 细胞核 85.71 OfNAC2 296 34 249.55 6.09 35 38 50.01 66.22 −0.735 细胞核 69.23 OfNAC100-2 334 37 778.80 6.51 38 40 43.10 67.96 −0.540 细胞核 85.71 OfNAC32 263 30 253.45 8.45 38 35 43.91 69.32 −0.635 细胞核 61.54 说明：不稳定系数大于40为不稳定序列，小于40为稳定序列 -
使用DNAMAN软件对桂花OfNAC转录因子的氨基酸序列进行比对，结果显示(图2)：22个OfNAC的氨基酸序列均具有保守的亚结构域(A~E)。对这5个亚结构域进行分析发现：A区较为保守的氨基酸是甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)；B区较为保守的氨基酸是脯氨酸(P)；C区较为保守的氨基酸是苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、甘氨酸(G)；D区较为保守的氨基酸是甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、色氨酸(W)；E区没有完全稳定的氨基酸。各保守亚域的保守性由强到弱依次为C、A、D、B、E。对所有OfNAC的氨基酸序列进行保守基序分析发现(图3)：大多数OfNAC均含有较保守的元件，除OfNAC73只有2个保守元件(元件1、元件2)外，其余OfNAC均含有4个保守元件(元件1、元件3、元件4、元件5)。另外，22条OfNAC转录因子中元件7、元件9和元件10出现在一些OfNAC蛋白质的C端，且对应的序列亲缘关系较近。桂花OfNAC蛋白质二级结构分析表明：OfNAC蛋白质的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲4种结构，且不同结构占比从大到小依次表现为无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-折叠(表3)。OfNAC32的无规则卷曲占比最高，为67.30%。此外，OfNAC73、OfNAC92、OfNAC29-2结构中α-螺旋占比均小于延伸链。跨膜结构预测分析表明(图4)：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9均在C端有1个跨膜结构。亚细胞定位预测分析表明：OfNAC53定位于内质网，OfNAC50-X2和OfNAC50定位于叶绿体，其余OfNAC蛋白质均定位在细胞核中。
图 2 OfNAC转录因子氨基酸序列比对
Figure 2. Sequence alignment of OfNAC transcription factor
图 3 桂花OfNAC转录因子进化分析及保守基序分析
Figure 3. Evolution analysis of 22 OfNAC transcription factors and analysis of conserved motif
表 3 桂花OfNAC蛋白质理化性质及二级结构分析
Table 3. Secondary structure analysis of OfNAC of O. fragrans
序列名称 二级结构占比 序列名称 二级结构占比 α-螺旋/% β-螺旋/% 延伸/% 无规则卷曲/% α-螺旋/% β-螺旋/% 延伸/% 无规则卷曲/% OfNAC100-1 15.07 3.19 14.78 66.96 OfNAC17 24.59 2.81 12.71 59.90 OfNAC53 21.33 3.76 14.52 60.39 OfNAC104 18.82 3.76 15.59 61.83 OfNTM1-9 23.27 3.14 9.74 63.86 OfNAC92 14.15 3.69 15.69 66.46 OfNAC73 13.00 3.67 20.00 63.33 OfNAC72-1 17.99 3.54 16.22 62.24 OfNAC43 21.55 4.26 14.29 59.90 OfNAC72-2 16.96 3.51 16.08 63.45 OfNAC91 20.36 2.63 10.51 66.50 OfNAC29-1 3.21 3.57 17.86 55.36 OfNAC50-X2 31.11 5.91 12.34 50.64 OfNAC29-2 15.64 4.36 16.73 63.27 OfNAC50 27.82 5.01 10.53 56.64 OfNAC71 16.17 4.95 14.52 64.36 OfNAC21/22 17.23 3.04 15.20 64.53 OfNAC2 21.62 4.05 11.82 62.50 OfNAC56 16.15 3.11 15.84 64.91 OfNAC100-2 16.47 3.59 14.07 65.87 OfNAC17-X2 25.83 2.97 12.91 58.29 OfNAC32 17.11 2.66 12.93 67.30 
图 4 桂花OfNAC蛋白质跨膜结构预测
Figure 4. Transmembrane structure prediction related to OfNAC protein
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为了进一步研究OfNAC的进化关系，对桂花、拟南芥和水稻的NAC蛋白构建系统进化树。结果表明：22个桂花OfNAC与拟南芥和水稻的NAC蛋白质共划分为11个亚族(图5)，除a、b、c、e、h亚族外，其他亚族均有OfNAC分布。其中i亚族桂花NAC蛋白质较多，有8个OfNAC蛋白质。
图 5 桂花OfNAC与拟南芥、水稻的系统进化树
Figure 5. Phylogenetic tree of OfNAC, A. thaliana and O. sativa
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为了研究OfNAC在桂花花开放进程中的表达模式，对其进行荧光定量表达分析(图6)。OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相对表达量在铃梗期(S4)出现表达高峰，在此之后相对表达量大幅度降低，其中OfNAC43只在铃梗期(S4)相对表达量最高，其余时期相对表达量很低；OfNAC56从铃梗期开始呈现上升趋势，并在盛花期(S6)到达顶峰；OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22从起始期(S1)缓慢上升，在顶壳期 (S3)到达最高，随后急剧下降；OfNAC29-2在圆珠期(S2)相对表达量达到最大，之后在铃梗期(S4)相对表达达到最低。OfNAC在花开放不同阶段的表达情况说明：OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2可能参与花开放的调控，其中又以OfNAC43和OfNAC29-2关联最为紧密。
图 6 22个OfNAC基因在不同花开放时期的表达结果
Figure 6. Expression results of 22 OfNAC genes in different flower opening periods
OfNAC50-X2、OfNAC50、OfNAC17-X2整体呈现上升趋势，并在初开期(S5)达到最高；OfNAC100-1、OfNAC92、OfNAC72-1、OfNAC91、OfNTM1-9、OfNAC53在起始期(S1)表达量较高，整体呈下降趋势；OfNAC104、OfNAC32、OfNAC2、OfNAC17、OfNAC72-2均呈现先下调后上升的表达趋势，到盛花期(S6)相对表达量较高。这说明，这些基因成员可能不参与桂花花开放的调控。
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NAC转录因子最初在矮牵牛Petunia hybrida中发现[21]。在模式植物拟南芥、水稻以及园艺作物中的研究较多。在拟南芥、水稻、黄瓜Cucumis sativus、紫花苜蓿Medicago sativa中分别有151、117、91、113个NAC基因被鉴定[22-24]。目前关于桂花OfNAC转录因子的报道较少。通过桂花OfNAC转录因子的鉴定与分析，可为进一步了解桂花OfNAC的生物学功能及其在花开放过程中的作用奠定基础。
本研究通过转录组测序鉴定出22条开放阅读框完整的OfNAC转录因子，对它们进行跨膜结构预测发现：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9这5个转录因子均在C端有1个跨膜结构，推测它们可能是NAC膜结合转录因子。大多数OfNAC蛋白质预测定位在细胞核中的可能性较高，因此推测，OfNAC转录因子可能大多依旧在细胞核内发挥功能。目前，已经在模式植物中发现NAC膜结合转录因子，如拟南芥和水稻NAC基因组中已发现分别有18和6个膜结合NAC转录因子[25-26]，其中拟南芥膜结合转录因子NTM1调节细胞分裂素信号传导而参与细胞分裂；NTL8调节拟南芥开花时间，过表达转基因植株出现晚花现象；ANAC089被确定为另一个膜结合转录因子，也有调控拟南芥开花时间的功能[27-28]。由此推测，桂花OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9可能也具有调控开花时间的功能。
桂花22个OfNAC与拟南芥和水稻NAC蛋白质共同划分为11个亚族。根据亲缘关系推测相关OfNAC基因的功能，如OfNAC100-1、OfNAC100-2与拟南芥At5G6140.1、At5G7680.1、At5G39610.1、At3G29035.1亲缘性较高，其中At5G39610.1(ANAC92/ATNAC2)存在于部分或完全开放的花的花器官中，且参与叶和花的衰老过程[29]。在月季中，RhNAC100是At5G39610.1(ANAC92/ATNAC2)的同源基因，乙烯通过微调microRNA164-RhNAC100模块来调节细胞的扩张从而影响月季花瓣的扩展[30]，OfNAC100-1和OfNAC100-2与拟南芥At5G39610.1亲缘关系较近，所以推测OfNAC100-1与OfNAC100-2可能有调节花瓣扩展的相关功能。OfNTM1-9与At1G33060.1同源性较高，且At1G33060.1是膜结合转录因子，在拟南芥各个器官均有表达，影响叶片衰老[25]，推测OfNTM1-9可能作为NAC膜结合转录因子参与细胞衰老。
花开放的主要原因是花瓣细胞的扩展[11-13]，对OfNAC基因在桂花花开放时期的荧光定量表达分析表明：OfNAC在桂花花开放过程中发挥重要作用，且不同的OfNAC在此过程中表达模式有差异。OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22在顶壳期相对表达到达最大。罗云等[31]发现：OfEXPA2和OfEXLA1在桂花花开放的顶壳期相对表达急剧增加并到达顶峰，推测此时期的高丰度表达是后续花开放的基础。OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22与OfEXPA2和OfEXLA1表达模式相似，推测它们参与花开放进程。OfEXPA4在花芽萌发期至圆珠期表达量较低，而顶壳期开始急剧上升，铃梗期表达量达到最大。罗云等[31]推测：OfEXPA4是参与花瓣扩展的关键基因，OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相对表达量也在铃梗期出现峰值，推测它们亦作为关键基因参与桂花花瓣扩展。对月季的研究发现：RhNAC2和RhEXPA4参与月季花瓣细胞扩展，且RhEXPA4的表达可能受到RhNAC2的调控[32]，拟南芥中NAC25和NAC1L被确定是EXPA2(EXPANSIN2)的上游调控因子[33]。以此推测，NAC转录因子可能与EXP的启动子结合，是EXP的上游调控因子，则OfNAC29-2在圆珠期相对表达最大，可能是作为OfEXPA2和OfEXLA1调控因子调节OfEXP影响花瓣细胞扩张从而为后续花瓣展开奠定基础，所以OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2可能是参与桂花花开放的关键基因。由于OfNAC43、OfNAC29-2相对表达差异明显，推测它们与花开放关系更为紧密，但这些关键基因在桂花开花中的具体作用还需要进一步研究。
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本研究从桂花品种‘堰虹桂’转录组数据中筛选得到22条OfNAC序列，生物信息学分析结果表明：22条OfNAC转录因子氨基酸序列含有5个保守的亚结构域(A~E)，其保守性由强到弱依次为C、A、D、B、E；亚细胞定位及跨膜结构预测表明：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9是膜结合转录因子，且大多数 OfNAC 定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析表明：在桂花花开放进程中，22个OfNAC基因表达模式不同，其中OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相对表达量在铃梗期(S4)达到顶峰，在此之后相对表达降低。OfNAC43在铃梗期骤然升高，并且在此时期相对表达最大；OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22从起始期呈缓慢上升趋势，在顶壳期到达最高，随后整体呈现下降趋势；OfNAC29-2在圆珠期相对表达量陡然上升，在铃梗期相对表达最低，推测OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2等成员极有可能参与调控桂花的花开放。
Identification and expression analysis of OfNAC transcription factors in Osmanthus fragrans during flower opening stage
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摘要:
目的 研究OfNAC基因对桂花Osmanthus fragrans花开放的调控作用。 方法 从桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhonggui’转录组数据中，筛选获得相关OfNAC基因序列，分析预测其理化性质和结构，运用实时荧光定量PCR技术分析花开放过程的表达特性。 结果 筛选得到22条OfNAC序列。生物信息学分析发现：22条OfNAC转录因子均含有NAM结构域，氨基酸序列含有5个保守的亚结构域(A~E)，其保守性由强到弱依次为C、A、D、B、E；二级结构中不同结构的占比由大到小表现为无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-折叠；亚细胞定位及跨膜结构预测表明：OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9是膜结合转录因子，且大多数OfNAC定位在细胞核。在桂花花开放进程中，OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相对表达量在铃梗期(S4)到达顶峰，在此之后相对表达降低；OfNAC43在铃梗期(S4)骤然升高，并且在此时期相对表达最大；OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22从起始期(S1)呈缓慢上升趋势，在顶壳期 (S3) 到达最高，随后整体呈现下降趋势；OfNAC29-2在圆珠期(S2)相对表达量陡然上升，在铃梗期(S4)相对表达最低。 结论 推测OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2等成员极有可能参与调控桂花的花开放。图6表3参33 Abstract:Objective This study aims to investigate the regulation of OfNAC genes on flower opening of Osmanthus fragrans. Method From the transcriptome data of O. fragrans ‘Yanhonggui’, the related OfNAC g enes were screened and analyzed to predict the physicochemical properties and structure. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression characteristics of the flower opening process. Result 22 OfNAC sequences were screened from transcriptome. Bioinformatics analysis showed that all of the 22 OfNAC transcription factors contained NAM domains, and the amino acid sequence contained 5 conserved subdomains (A−E). The sequence of conservatism ranging from strong to weak was C, A, D, B, and E. The proportion of different structures in the secondary structure from large to small was random coils, α-helices, extended strands, and β-sheets. Subcellular localization and transmembrane structure prediction showed that OfNAC17, OfNAC17-X2, OfNAC53, OfNAC91, OfNTM1-9 were membrane-bound transcription factors, and most OfNACs were located in the nucleus. During the O. fragrans flowering process, the relative expression levels of OfNAC100-2, OfNAC43 and OfNAC73 reached the peak at the boll stem stage (S4), and then decreased. The relative expression of OfNAC43 was the highest at the boll stem stage (S4). The relative expression of OfNAC71, OfNAC29-1, and OfNAC21/22 increased slowly from the initial stage (S1), reached the highest at the apical shell stage, and then decreased as a whole. The relative expression of OfNAC29-2 increased sharply at the bead stage (S2) and reached the lowest at the boll stem stage (S4). Conclusion It is speculated that OfNAC100-2, OfNAC43, OfNAC73, OfNAC71, OfNAC29-1, OfNAC21/22, OfNAC29-2 may be involved in the regulation of O. fragrans flower opening. [Ch, 6 fig. 3 tab. 33 ref.] -
Key words:
- botany /
- Osmanthus fragrans /
- flower opening /
- NAC transcription factor /
- expression analysis
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无距虾脊兰Calanthe tsoongiana为兰科Orchidaceae虾脊兰属Calanthe地生草本，花朵娇艳，造型独特，受到人们的喜爱。近些年来，由于人为破坏，以及自身繁殖困难，导致野生无距虾脊兰种群数量锐减，现已被列为极度濒危等级[1]。
植物和真菌之间的互惠共生是自然界中普遍存在的现象[2]。兰科菌根真菌是一类与兰科植物形成共生关系并生成菌丝团的真菌，隶属于根系内生真菌，对兰科植物生长起促进作用[3]。研究表明：兰科植物的整个生命活动都需要菌根真菌的参与，菌根真菌不仅可以帮助兰花种子萌发[4−5]，也在其生长发育过程中扮演着重要的角色。它可以吸收土壤中的矿质元素、有机物等，在侵染兰科植物后被宿主细胞分解并向其传输营养物质[6−7]，若缺乏菌根真菌，兰科植物将无法长期存活。除了菌根真菌，兰科植物中非菌根真菌的数量也十分庞大，远远超过了菌根真菌。镰孢属Fusarium、木霉属Trichoderma和青霉属Penicillinum是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长[8−10]。由此可见，非菌根真菌的作用也不容忽视。兰科菌根真菌不仅广泛存在于根系内，也存在于植株周围土壤中，且距离植株越远，其相对丰度越低[11−12]，但也有研究表明：菌根真菌少量或者不存在于土壤中[13−14]。蒋玉玲等[15]研究表明：通过对周围土壤中真菌类群的分析，可推断兰科植物能否长期在此生存。因此，研究根际土壤真菌类群对兰科植物保育十分重要。
目前，虾脊兰属植物的研究集中在分类鉴别、育种和繁殖等方面，具体有资源调查、遗传多样性研究、化学与药用价值研究、快速繁育以及引种驯化等等[16−17]。国内外对虾脊兰属根系内生真菌多样性研究较少，尚处于初步阶段，未得到系统且全面的数据，尤其是无距虾脊兰还未见相关报道。鉴于此，本研究以浙江省天目山野生无距虾脊兰为材料，通过分析无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌多样性，明确其优势真菌和共有真菌类群，以期为无距虾脊兰资源有效保护提供科学参考。
1. 材料与方法
1.1 研究地点与样品采集
所用材料采自浙江天目山国家级自然保护区内无距虾脊兰野生居群(海拔550 m，30°21′47″N，119°25′30″E)。该研究区属亚热带季风气候，雨水充沛，年降水量达1 870 mm，相对湿度较大，自然条件优越。
无距虾脊兰生长在海拔450~1 450 m的阔叶混交林下，生长周期可分为萌芽期、花期、果期和衰亡期[18]。选择未遭到破坏、分布集中且长势一致的植株，分别于2、5、7和11月进行根段采集。每次选取9株植株，每株取3~4个长约4~5 cm的根段，用根围土包裹装入采样袋，做好标记并放入4 ℃冰箱保存。
1.2 研究方法
1.2.1 样品处理
取出根系并用流水冲洗干净，无菌水冲泡，用体积分数为70%的乙醇洗涤2 min，质量分数为2.5%的次氯酸钠浸泡5 min，体积分数为70%的乙醇洗涤30 s，再经无菌水冲洗2~3次，用无菌滤纸吸去多余水分后转入液氮中紧急速冻。初步处理完成，置于−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.2 根际土提取
在超净台上抖掉根围土，保留附着在根系1 mm左右的根际土。用无菌镊子将根系转移至装有磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中，全温摇床下震荡20 min，挑出根系，将剩余悬浮液6 000 r·min−1高速离心20 min，弃上清液得到根际土。做好标签记录，将离心管放入液氮，待其彻底急速冷冻后，放入−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.3 DNA提取及PCR扩增
使用DNA提取试剂盒提取无距虾脊兰根系与根际土壤DNA，提取后利用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，引物合成和测序由上海美吉生物医药科技有限公司进行。
PCR 仪采用ABI Gene Amp® 9700型，每个样本3个重复，20.0 μL PCR反应体系为10.0 μL 2× ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye 1，2.0 μL DNA模板，ddH2O补至20.0 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。同一样本的PCR产物混合后用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物使用Illumina MiSeq平台进行测序。
1.2.4 序列分析与处理
首先根据overlap关系利用FLASH (v1.2.11)软件对Illumina测序得到的原始数据进行拼接，并通过FASTP (v.0.19.6)软件对序列质量进行质控、过滤和优化。区分样本后，在97%相似度水平下使用UPARSE (v11.0)软件对优化序列进行分类操作单元(OTU)聚类分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于97%相似水平下采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列与UNITE (v.8.0)数据库进行分类学比对。
基于OTU聚类分析结果，通过Mothur (v1.30.2)软件进行多样性指数分析，从而得到所有样本群落中物种的丰富度、覆盖度和多样性等信息。根据分类学分析结果，通过Qiime (v1.9.1)软件生成各分类学水平丰度表，进行Beta多样性距离计算，找出各样本在某一分类学水平上的优势物种、样本中各优势物种的相对丰度以及不同样本中物种的组成相似性，并利用R语言(version 3.3.1)工具统计和作图，将差异和距离通过二维坐标图呈现出来，从总体上反映各组样本之间的差异和组内样本之间的变异度大小。基于Kruskal-Wallis秩和检验(Kruskal-Wallis H test)，通过R (version 3.3.1)的stats包和python的scipy包运用DP的方法计算影响大小(effect size)，从而找出多组样本的物种进行差异显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 无距虾脊兰根系内生真菌多样性分析
无距虾脊兰萌芽期根系测序共获得31 987条优化序列。由图1可知：在门水平上担子菌门Basidiomycota和被孢霉门Mortierellomycota占比较大，属于萌芽期根系内生真菌优势门；在属水平上，被孢霉属Mortierella和红菇属Russula真菌序列占比相差不大，共同作为该时期优势内生真菌。花期根系测序共获得51 913条优化序列。其中，担子菌门为最大优势菌门；在属水平上，粗糙孔菌属Trechispora为该时期优势内生真菌。相较于萌芽期，花期真菌类群中担子菌门和子囊菌门Ascomycota相对丰度分别为萌芽期的1.33和1.97倍，被孢霉门、被孢霉属和红菇属的相对丰度呈现下降趋势，分别减少了67.82%、67.39%和75.70%。
图 1 不同时期无距虾脊兰根系内生真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 1 Community composition of root endophytic fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level果期根系测序共获得43 793条优化序列。其中担子菌门真菌在数量上占绝对优势；在属水平上，蜡壳耳属Sebacina为该时期优势内生真菌。相较于花期，担子菌门、子囊菌门、被孢霉门和红菇属相对丰度变化不大，但Saitozyma、锁瑚菌属Clavulina相对丰度有所增加，由原来占比不足3.00%增长到13.09%和10.29%，蜡壳耳属增加了67.30%。衰亡期根系测序共获得30 000条优化序列。该时期，子囊菌门属于优势菌门，镰孢属为优势内生真菌，相较于其他3个时期，衰亡期根系内生真菌多样性整体出现骤降现象。
2.2 无距虾脊兰根际土壤真菌多样性分析
在萌芽期，无距虾脊兰根际土壤测序共获得31 673条优化序列。由图2可知：萌芽期根际土壤与根系在门水平上真菌类群一致，但相对丰度稍有变化；在属水平上，红菇属相对丰度明显下降，占比仅为3.55%，其余真菌相对丰度较小，被孢霉属为该时期根际土壤优势真菌。
图 2 不同时期无距虾脊兰根际土壤真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 2 Community composition of rhizosphere soil fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level在花期，根际土壤测序共获得41 062条优化序列。与同时期根系内生真菌相比，担子菌门相对丰度减少，子囊菌门相对丰度增加。在属水平上，根际土壤和根系真菌类群相对丰度明显不同，其中青霉属Penicillium为该时期根际土壤优势真菌。相较于萌芽期根际土壤真菌，花期子囊菌门和罗兹菌门Rozellomycota相对丰度分别为萌芽期的1.34和4.74倍，担子菌门、被孢霉门真菌相对丰度分别减少了31.93%和67.82%。
在果期，根际土壤测序共获得47 863条优化序列。与根系内生真菌相比，门水平上子囊菌门和担子菌门变化最大，在属水平上，Paraboeremia仅存在于根际土壤真菌中，且占比较大，为该时期根际土壤优势真菌。相较于花期根际土壤真菌，果期子囊菌门、被孢霉门、Paraboeremia和Saitozyma相对丰度分别为花期的1.34、1.61、4.03和1.07倍，担子菌门和罗兹菌门相对丰度分别降低到花期的89.45%和42.21%。
在衰亡期，根际土壤测序共获得28 997条优化序列。在门水平上，担子菌门为根系内生真菌的5.61倍，根系内生真菌无被孢霉门，而在根际土壤中其真菌序列占7.29%。在属水平上，各真菌相对丰度差别较大，其中Paraboeremia为该时期根际土壤优势真菌。相较于果期根际土壤真菌，蜡壳耳属仅存在于衰亡期根际土壤中，担子菌门和被孢霉属真菌相对丰度分别为果期的1.53和1.31倍，Saitozyma相对丰度降低到果期的32.32%。
2.3 不同时期真菌群落差异性分析
通过对无距虾脊兰根际土壤与根系测序分析，发现不同生长发育时期物种注释结果存在较大差别，具体差异见表1。其中萌芽期根际土壤和根系优势真菌分别为被孢霉属和红菇属，花期优势真菌分别为青霉属和粗糙孔菌属，果期优势真菌分别为Paraboeremia和蜡壳耳属，衰亡期优势真菌分别为Paraboeremia和镰孢属，不同生长发育时期优势真菌不同。
表 1 物种注释结果统计Table 1 Species annotation results statistics生长
时期优化序
列/条门/个 纲/个 目/个 科/个 属/个 萌芽期 63 660 11 41 91 193 359 花期 92 975 13 46 101 217 367 果期 91 656 12 48 108 224 377 衰亡期 58 997 8 33 75 162 264 在门水平上，子囊菌门真菌在萌芽期、花期和果期的根际土壤与根系中存在显著差异；而被孢霉门真菌则在萌芽期与衰亡期的根际土壤和根系中存在显著差异(图3A，P＜0.05)。在属水平上，被孢霉属、红菇属、罗兹菌门未分类属以及青霉属在萌芽期的根际土壤与根系真菌上差异较为明显。由图4可知：有虫草菌属Cordyceps等321个属为4个时期共有真菌；裸盖菇属Psilocybe等29个属为萌芽期和花期共有真菌，复膜孢酵母属Saccharomycopsis等43个属为花期和果期共有真菌，Melanopsamma等36个属为果期和衰亡期共有真菌，Stenella等23个属为衰亡期和萌芽期共有真菌。
图 3 根际土壤真菌与根系内生真菌在门(A)、属(B)水平下差异显著的类群Figure 3 The endophytic fungi in rhizosphere soil and root were different at phylum (A) and genus (B) level
图 4 属水平不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌分布韦恩图Figure 4 Venn diagram of endophytic fungi distribution in rhizosphere soil and root at genus level at different periods从表2可见：果期根系内生真菌的ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Sobs指数最高，其次是花期，然后是萌芽期，衰亡期Alpha指数最低。意味着果期根系内生真菌多样性和丰富度最高，衰亡期根系内生真菌多样性和丰富度最低。在无距虾脊兰根际土壤真菌中，花期Alpha多样性指数高于其他3个时期，果期ACE指数、Chao指数和Sobs指数高于萌芽期和衰亡期，萌芽期和衰亡期Alpha多样性指数相对一致。综合来讲，花期的根际土壤真菌多样性和丰富度最高，果期次之。
表 2 Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity indexes样本 Alpha多样性指数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Sobs指数 Coverage指数 MG 1 983±26 c 1 379±81 ab 3.734±0.522 b 680±104 cd 0.964±0.004 a HG 4 078±3 043 bc 2 337±50 ab 3.724±1.606 b 987±423 bcd 0.968±0.009 a GG 8 681±439 ab 4 499±351 ab 4.221±0.501 b 1 342±161 abc 0.926±0.006 b SG 817±292 c 630±308 b 3.298±0.788 b 210±31 d 0.990±0.005 a MT 4 642±3 043 bc 3 057±1 539 a 5.042±0.191 a 1 243±322 abc 0.926±0.017 b HT 12 860±9 858 a 7 178±4 937 a 5.423±0.221 b 1 926±847 a 0.891±0.027 c GT 6 559±1 695 abc 4 109±826 ab 4.713±1.078 b 1 580±398 ab 0.931±0.017 b ST 5 182±642 abc 3 323±465 ab 4.713±0.684 b 1 198±229 abc 0.908±0.014 bc 说明：数据均为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同样本间差异显著(P＜0.05)。MG. 萌芽期根系；HG. 花期根系；GG. 果期根系；SG. 衰亡期根系；MT. 萌芽期根际土壤；HT. 花期根际土壤；GT. 果期根际土壤；ST. 衰亡期根际土壤。 在同一时期中，萌芽期、花期和衰亡期根际土壤真菌的Alpha多样性指数均高于根系内生真菌，说明在该时期根际土壤真菌多样性和丰富度高于根系内生真菌。果期根系内生真菌ACE指数、Chao指数高于根际土壤真菌，但是根际土壤真菌Shannon指数和Sobs指数高于根系内生真菌。
为了进一步明确无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌和根系内生真菌群落结构的差异，本研究采用主成分分析(PCA)分析其真菌群落的相似性和差异性。PCA结果显示：无距虾脊兰在花期、果期、萌芽期、衰亡期有明显的聚类区分(图5A)，主成分1解释了差异的12.92%，主成分2解释了差异的7.73%。其中在主成分1轴上花期区分较为明显，主成分2轴上果期区分较为明显，萌芽期和衰亡期距离较近，意味着衰亡期和萌芽期根际土壤真菌、根系内生真菌类群相似度高，进一步说明无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌群落在整个生长发育时期存在阶段性差异。由图5B可知：4个时期根系内生真菌相较于根际土壤真菌，距离较近，意味着根际土壤真菌彼此间真菌类群差异较大，其中花期和果期尤为明显。另外，在每个时期中根际土壤与根系之间彼此分开较远，相较于各自内部样品之间两者真菌类群差别较为明显，其中根系样品之间内生真菌类群差别小于根际土壤。
图 5 根际土壤真菌与根系内生真菌群落主成分分析Figure 5 Principal component analysis of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi3. 讨论
本研究表明：无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌优势菌门均为担子菌门和子囊菌门。根际土壤真菌类群与根系内生真菌类群相互重叠存在一定相似性，说明有一部分根系内生真菌来自根际土壤真菌。推测由于根系与根际土壤长期互相接触，彼此真菌类群相互影响[19]，且根系对根际土壤真菌具有一定的选择性等原因造成的[20]。从另一方面来讲，彼此之间也相互独立具有一定差异性，根际土壤真菌群落的丰富度、均匀度以及多样性均高于根系内生真菌。在根际处根系经常与其他根系、土壤微生物互作，从而导致了根际土壤真菌多样性高于根内真菌。
在根系内生真菌中，真菌多样性和丰富度从萌芽期到果期依次递增，并在果期达到顶峰，衰亡期又急剧下降。而根际土壤真菌类群变化情况却与之相差较大，从萌芽期到花期逐渐增加，在花期达到顶峰后逐渐下降，衰亡期与萌芽期真菌多样性和丰富度变化相对平稳。这与吕立新等[21]的观点相吻合，夏季真菌多样性高于春季和秋季，随着季节变化，温度、土壤含水量等环境因子相继发生变化，真菌群落结构也随之发生变化。YOKOYA等[22]在研究兰花时也发现了在雨季分离出的真菌，在旱季不一定出现，而同一类真菌的相对丰度也不尽相同。花期为无距虾脊兰生长初期，此时温度适宜、光线充足，周围伴生植物数量增加，土壤和根际土壤真菌丰富度也相应增加。无距虾脊兰果期为每年的7—9月，此时温度高，周围植物数量相较于花期会有所减少，所以果期根际土壤真菌丰富度少于花期。而根系内生真菌出现上述差异情况可能是从萌芽期到果期，无距虾脊兰生长发育需要大量营养物质持续输入，且夏季温度高，需要增加自身抗逆性，因此根系内生真菌种类和丰富度显著增加并在果期达到顶峰。随着冬季的到来，周围植物逐渐进入休眠期，植被凋落物、土壤微生物的分解等都会使土壤有机质增加，从而促进微生物的生长，造成衰亡期真菌群落丰富度的降低[23]。
兰科植物在自然状态下无法自主萌发，内生真菌通过向兰科植物传输营养物质，从而促进种子萌发和原球茎的分化[24]。李孟凯等[25]用镰孢属菌液处理过的铁皮石斛Dendrobium officinale种子胚膨大，种皮有被假根冲破的迹象。内生真菌对兰科植物的促生作用在生长期也有体现。王亚妮[26]研究发现：接种了内生真菌的铁皮石斛，其鲜质量、移栽成活率相比对照均有所增加；此外，张霞[27]研究表明：接种内生真菌的铁皮石斛，其抗旱性明显增强。由此可见，内生真菌在兰科植物生长发育过程中的作用不可忽视。本研究显示：无距虾脊兰不同时期优势真菌及相对丰度不同，推测兰科植物在相应生长期会选择对自己生长益处最大的真菌共生。有研究表明：在碳的需求方面，果期需求是花期的2倍[28]，而花期的优势真菌不能满足果期对生长素等方面的需求，所以不同时期优势真菌的相对丰度会随之发生变化，也进一步证实了内生真菌极易受周围环境和生长阶段影响[29]。
镰孢属和青霉属是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长。这2种真菌类群在花期和衰亡期属于优势真菌，由此可以推测：镰孢属和青霉属在无距虾脊兰中同样可以促进其生长，并提高其抗病性。庄鑫等[30]研究不同地点朝鲜淫羊藿Epimedium brevicornu生长时期内生真菌表明：蜡壳耳属真菌与淫羊藿中黄酮类化学成分含量成正比，证明蜡壳耳属真菌可以促进植物对磷元素的吸收，促进植物生长，同时增强植株抗灰霉病的能力。被孢霉属真菌被证实在生物分解以及土壤养分转化的过程中发挥重要作用[31]。红菇属曾被认定为菌根真菌，并与多种兰科植物存在共生关系[32]。上述几类真菌均为无距虾脊兰不同时期的优势真菌，但是这几类优势真菌是否与无距虾脊兰菌根真菌存在共生关系，是否对无距虾脊兰生长发育过程中起促进作用，还需采用石蜡切片观察是否在根细胞中形成菌丝结，并结合共生培养视植株的生长状况而定。然而，另外一些公认的菌根真菌，如胶膜菌科Tulasnellaceae在本研究中尚未见到，有研究表明可能与DNA测序区域有关[33]，在后续实验进行高通量测序时可以采取不同的引物。除此之外，可能与植物种类有关，有些真菌广泛存在于多种植物体内，而有些真菌却只与某种特定植物产生共生关系[34]。
4. 结论
本研究表明：在不同生长发育时期，无距虾脊兰真菌群落多样性和丰富度存在较大差异。根际土壤真菌多样性高于根系内生真菌，花期根际土壤真菌多样性最高，果期根系内生真菌最丰富。不同时期优势真菌差别较大，萌芽期根际土壤和根系内生优势真菌分别为被孢霉属、红菇属，花期优势真菌分别为青霉属、粗糙孔菌属，果期分别为Paraboeremia、蜡壳耳属，衰亡期分别为Paraboeremia、镰孢属。
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图 1 桂花NAC的NAM保守功能域分析
绿色部分表示NAM保守功能域
Figure 1 NAM conserved functional domain about NAC
图 2 OfNAC转录因子氨基酸序列比对
黑色区域表示序列一致，红色区域保守性稍弱，蓝色区域保守性较差。字母A、B、C、D、E下面的方框部分为OfNAC转录因子N端保守区5个保守亚结构域
Figure 2 Sequence alignment of OfNAC transcription factor
图 3 桂花OfNAC转录因子进化分析及保守基序分析
Figure 3 Evolution analysis of 22 OfNAC transcription factors and analysis of conserved motif
图 4 桂花OfNAC蛋白质跨膜结构预测
Figure 4 Transmembrane structure prediction related to OfNAC protein
图 5 桂花OfNAC与拟南芥、水稻的系统进化树
标黄色阴影的是桂花OfNAC
Figure 5 Phylogenetic tree of OfNAC, A. thaliana and O. sativa
图 6 22个OfNAC基因在不同花开放时期的表达结果
Figure 6 Expression results of 22 OfNAC genes in different flower opening periods
表 1 桂花OfNAC转录因子RT-PCR特异性引物
Table 1. Specific primers for RT-PCR of OfNAC in O. fragrans
基因名称 用于荧光定量的引物序列(5′→3′) 基因名称 用于荧光定量的引物序列(5′→3′) OfNAC100-1 F: TGAACAAGATTGAGCCTTGGG OfNAC104 F: TGCATTTTACATTGGTGAAGATGTC R: CCTTTCCTGTGGCTTTCCAG R: GCTCGTACACTTGACACACCA OfNAC53 F: AGATTGTGGGGATGAAGAAAA OfNAC92 F: TCCTAGTCGGAATGAAGAAAACTC R: CAACTCCATATCAGTAAGCCG R: ATGGCTTTCTAATCTGTATTCGTGC OfNTM1-9 F: GGTTGCTCTAATGCCCACTTC OfNAC72-1 F: GGAAAAGCCCCCAAAGGAAC R: CTGGTTCCGTAGCACGATACT R: CCCAATCATCCAACCTTGAGC OfNAC73 F: AGGCAAGGATGGCCAAATTC OfNAC72-2 F: ACGTAGGAAAAGCACCAAAAGG R: TTGTGCCATCTTGTTTCTCC R: AGCATCCAACCTTGCGCTTC OfNAC43 F: AGGCTACTGGTCGTGATAAAG OfNAC29-1 F: TTACAAGGGAAGGCCTCCAAAG R: GGGGTCATGAGTGTCGTCC R: TTGAGCCATTTTGCGTGTTAGG OfNAC91 F: TCTACAAAGGTCGTGCTCCG OfNAC29-2 F: CCCAAAGGGCGTCAAAACTG R: CCCTGACCAGGATAAGTGCC R: GCACACAATCATCCAACCTCA OfNAC50-X2 F: TGGCAAAGGGTATTGGAAAGC OfNAC71 F: CTATCGTGGAAGAGCACCACT R: TCGCCCACTATGGAAAACAAG R: TCCCTGAAATCTTGGGGTGTC OfNAC50 F: AAGCAACTGGAAAGGATCGC OfNAC2 F: TTGGGAATAAAGAAGGCTCTGGTG R: AATTCTGCATCGCAAAGCCTG R: ACACAACACCCAATCATCAAGCCTC OfNAC21/22 F: GAAGGGAAGCCTGGTTGGAAT OfNAC100-2 F: TCAGAGGAAAAATCCTCGTCGG R: CCCAATCCTCCTTGACAGATG R: TTTGGGAGGTTGTGGATCGAG OfNAC56 F: TCTATGGTGGAAAGCCTCCT OfNAC32 F: AAGCCTTGGTTTTCTATGCCG R: CATCAAGCCTTAAAGAGCCC R: AAGCTGTTGTTCTTGTTTCGA OfNAC17-X2 F: TCCTGTTGGGGTGAAGAAGA OfACT F: CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT R: ATAGTCATCCTGTGCATCCTGC R: ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfNAC17 F: TGGTCTTCCATAAAGGTCGTGC R: TTGTACAGAGCATAGCAATCCCGTG 
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表 2 桂花OfNAC蛋白质理化性质及二级结构分析
Table 2. Physicochemical properties and secondary structure analysis of OfNAC of O. fragrans
序列名称 氨基酸长度/个 相对分子量 等电点 碱性氨基酸 酸性氨基酸 不稳定系数 脂溶性指数 总平均疏水值 亚细胞定位 位置 预测值/% OfNAC100-1 345 38 986.11 8.69 40 36 40.06 61.01 −0.574 细胞核 61.54 OfNAC53 558 62 807.47 4.60 51 88 38.87 69.37 −0.564 内质网 42.42 OfNTM1-9 606 68 053.70 5.63 71 86 51.49 62.43 −0.725 细胞核 76.92 OfNAC73 300 33 768.95 8.79 39 34 38.21 69.47 −0.754 细胞核 76.92 OfNAC43 399 45 513.66 5.77 43 55 46.31 63.26 −0.752 细胞核 69.23 OfNAC91 609 67 741.52 4.98 63 86 52.83 71.07 −0.593 细胞核 76.92 OfNAC50-X2 389 43 765.29 5.29 46 58 47.83 69.43 −0.629 叶绿体 58.33 OfNAC50 399 44 952.52 5.35 46 61 50.45 67.69 −0.652 叶绿体 46.15 OfNAC21/22 296 33 613.15 6.54 33 34 51.26 66.52 −0.570 细胞核 71.43 OfNAC56 322 35 946.51 8.62 37 34 39.48 64.81 −0.725 细胞核 92.30 OfNAC17-X2 573 64 828.71 4.87 63 91 40.60 77.70 −0.530 细胞核 53.85 OfNAC17 606 68 408.12 4.85 60 97 46.79 74.62 −0.571 细胞核 30.77 OfNAC104 186 21 498.77 4.59 19 31 46.96 68.60 −0.695 细胞核 84.61 OfNAC92 325 36 813.71 6.47 40 42 29.27 71.35 −0.579 细胞核 38.46 OfNAC72-1 339 38 289.93 8.64 40 37 40.14 64.96 −0.671 细胞核 84.61 OfNAC72-2 342 38 848.46 8.64 42 39 40.04 61.64 −0.762 细胞核 100 OfNAC29-1 280 32 538.56 7.71 36 35 42.96 61.96 −0.816 细胞核 52.50 OfNAC29-2 275 31 330.36 9.33 35 26 33.81 61.35 −0.741 细胞核 100 OfNAC71 303 34 864.61 5.42 33 43 51.89 53.37 −0.795 细胞核 85.71 OfNAC2 296 34 249.55 6.09 35 38 50.01 66.22 −0.735 细胞核 69.23 OfNAC100-2 334 37 778.80 6.51 38 40 43.10 67.96 −0.540 细胞核 85.71 OfNAC32 263 30 253.45 8.45 38 35 43.91 69.32 −0.635 细胞核 61.54 说明：不稳定系数大于40为不稳定序列，小于40为稳定序列
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表 3 桂花OfNAC蛋白质理化性质及二级结构分析
Table 3. Secondary structure analysis of OfNAC of O. fragrans
序列名称 二级结构占比 序列名称 二级结构占比 α-螺旋/% β-螺旋/% 延伸/% 无规则卷曲/% α-螺旋/% β-螺旋/% 延伸/% 无规则卷曲/% OfNAC100-1 15.07 3.19 14.78 66.96 OfNAC17 24.59 2.81 12.71 59.90 OfNAC53 21.33 3.76 14.52 60.39 OfNAC104 18.82 3.76 15.59 61.83 OfNTM1-9 23.27 3.14 9.74 63.86 OfNAC92 14.15 3.69 15.69 66.46 OfNAC73 13.00 3.67 20.00 63.33 OfNAC72-1 17.99 3.54 16.22 62.24 OfNAC43 21.55 4.26 14.29 59.90 OfNAC72-2 16.96 3.51 16.08 63.45 OfNAC91 20.36 2.63 10.51 66.50 OfNAC29-1 3.21 3.57 17.86 55.36 OfNAC50-X2 31.11 5.91 12.34 50.64 OfNAC29-2 15.64 4.36 16.73 63.27 OfNAC50 27.82 5.01 10.53 56.64 OfNAC71 16.17 4.95 14.52 64.36 OfNAC21/22 17.23 3.04 15.20 64.53 OfNAC2 21.62 4.05 11.82 62.50 OfNAC56 16.15 3.11 15.84 64.91 OfNAC100-2 16.47 3.59 14.07 65.87 OfNAC17-X2 25.83 2.97 12.91 58.29 OfNAC32 17.11 2.66 12.93 67.30
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