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繁育系统指所有影响后代遗传组成有性特征的总和[1]，主要包括花部形态特征、花各部位的寿命、花的开放式样、传粉者种类和访问频率、自交亲和程度和交配系统。植物的上述有性特征与传粉者以及传粉行为共同影响繁殖后代遗传组成和适应性。因此，繁育系统是影响植物居群遗传多样性及地理分布最关键的生物学性状之一[2]，繁育系统研究在花的适应性、物种形成机制和濒危植物保育方面具有重要价值[3]。玉铃花Styrax obassia属于安息香科Styracaceae安息香属Styrax落叶小乔木或灌木，花朵清香，树姿优美，果实、木材和虫瘿均具有重要的经济价值，是非常珍贵具有潜力的园林绿化观赏与经济树种。玉铃花在中国的分布区北至辽宁东南部，向南可见于河南、山东、安徽和浙江等地[4]，多处于野生状态，尚未开展有效人工扩繁并合理利用。受人类活动干扰、自然生境破坏和传粉者行为影响，加之种子萌发困难等原因，玉铃花野生植株稀少，种群零星分布[5]，天然更新过程受阻。对安息香科另一物种黄梅秤锤树Sinojackia huangmeiensis有性繁殖的研究发现：其繁育类型以异交为主，部分自交亲和且需要传粉者；单株较大的开花量可维持居群的自然更新，部分自交亲和也为其提供一定生殖保障[6]。玉铃花繁育系统与黄梅秤锤树可能存在一定共性，推测植株数量可能受到所分布群落结构的影响，繁育系统和访花者的行为受气候条件影响。目前，有关玉铃花的研究集中于育苗技术和组织培养[7]、种子休眠破解[8-9]、遗传多样性AFLP分析[10]和药用价值[11]等方面，尚无繁育系统的观察研究报道。本研究通过定点观察(测)玉铃花引种植株，从花部结构、开花动态和繁育系统角度，揭示其生物学特性，探讨其天然更新困难可能存在的障碍，以期为玉铃花杂交育种、生境保护提供理论依据，同时为城市园林绿化应用推广提供技术支持。
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试验于2021年3—6月进行。试验材料为引种至浙江农林大学东湖校区(30°15′54″N，119°43′19″E，海拔101.3 m)露地栽培的处于半自然状态的玉铃花。栽植地为平坦沟谷，亚热带季风气候，全年平均气温为17.8 ℃，年均降水量为1 613.9 mm，无霜期为237 d，年日照时数为1 765.6 h。地带性植被为亚热带常绿阔叶林。
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选定5株样株，每日观察开花进程并拍照记录。按照DAFNI [12]的标准，确定始花期、盛花期和末花期。盛花期随机选择尚待开放的花序30个，挂牌标记，测量记录花序长度(mm)和花蕾数(个)，每日观察花序发育情况，直至花瓣脱落，确定单花序和单花开放时间；随机选取单花30朵，挂牌标记后定点观察，用游标卡尺测定花冠直径(mm)、花柱长度(mm)、花丝长度(mm)等指标。在Stemi 508体式显微镜下，对花朵进行实体解剖，观察子房和胚珠等构造。
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以玉铃花单花开放前1 d为检测起点，收集开放前1 d、开放第1、2、3、4和5天的不同个体混合花粉。选用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法[12]评定花粉活力，选用联苯胺-过氧化氢法[13]检测柱头可授性。
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随机采集花药尚未开裂的花蕾，剥离雌蕊与雄蕊。在体式显微镜下用解剖针轻轻划开子房，统计单花胚珠数(个)；采集对应单花的全部花药，用光学显微镜统计花粉粒数量(个)。重复3次，取平均值。平均单花花粉粒总数=平均花粉粒数量×1000；P/O=平均单花花粉粒总数/平均胚珠数。依据CRUDEN [14]标准，确定玉铃花繁育系统类型。
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随机选取30朵花，测定单花直径(mm)、雌雄蕊空间高度差(mm)及雌雄蕊成熟时间间隔。依据DAFNI标准[12]，确定OCI 值，评判玉铃花的繁育系统类型。
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盛花期，晴朗天气下连续1周每天观察样树的昆虫访花情况，拍照记录各种访花昆虫种类、访花行为、访问时间、单花停留时间、单次连续访花朵数等。
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借助Excel 2019处理原始数据，计算平均值与标准误；利用Origin 2019制图。使用佳能M6观察拍摄玉铃花开花植株和花部结构照片。
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玉铃花为腋生或顶生总状花序，花序长(13.29±0.66) cm，含(25.3±1.8)朵花；生长初期花序梗和花序轴密被短绒毛，但随着其生长，下部毛渐渐退化，直至无毛；花梗长(5.61±0.20) mm，稍向下弯；花萼杯状，长(5.68±0.12) mm，宽(4.28±0.05) mm，上端有5~6个三角形萼齿；花梗至花萼筒均密被灰黄色星状短绒毛；花冠直径为(17.37±0.50) mm，花瓣白色，4~6瓣，常见5，椭圆形，长(16.51±0.19) mm，宽(6.47±0.13) mm，花蕾期花瓣呈覆瓦状排列；雄蕊7~11，常见9，基部贴生于花冠，花丝扁平，上下几乎等宽，长(10.17±0.15) mm，花药2室，以其背部贴生花丝，椭圆型，花药长(4.01±0.10) mm，宽(0.97±0.02) mm；花柱与略膨大子房连接，子房3室，半下位或下位，胚珠(12.8±0.7)枚(表1)。
表 1 玉铃花花部器官数量特征统计
Table 1. Statistics on the quantitative characteristics of floral organs of Styrax obassia
参数 花瓣长度/mm 花瓣宽度/mm 花冠直径/mm 花药长度/mm 花药宽度/mm 花丝长度/mm 花柱长度/mm 测定值 16.51±0.19 6.47±0.13 17.37±0.50 4.01±0.10 0.97±0.02 10.17±0.15 17.24±0.22 参数 雄蕊数量/个 子房长度/mm 子房宽度/mm 花筒长度/mm 花柄长度/mm 雄蕊雌蕊高度差/mm 测定值 9.2±0.2 2.79±0.04 1.96±0.05 5.68±0.12 5.61±0.20 2.50±0.16 -
玉铃花花芽膨大期始于3月15—20日，花芽叶芽同期，显蕾期为3月21日—4月15日，花序逐渐伸长，花蕾逐渐膨大(图1A~F)，始花期为4月15－18日，盛花期为4月19—26日，末花期为4月27日—5月2日，花冠凋落，随后成功授粉的子房逐渐膨大，雌蕊干枯败落进入幼果期(图1J~L)。花期持续约15 d，单花花期3~5 d。
图 1 玉铃花开花动态
Figure 1. Flowering dynamics of Styrax obassia
玉铃花开花过程大致分为5个时期(图1M)。①包裹期：花萼包裹着花蕾，上端分5个小型三角形萼裂齿；②退化期：花蕾逐渐膨大，花瓣慢慢伸长，花萼退化成杯状托住花冠，此时雄蕊藏于花冠中；③微绽期：花瓣微微绽开，可见黄色的花药和嫩绿色柱头，花粉囊微纵裂，少量花粉散出；④展开期：花瓣张开角度加大，花药柱头全部露出，柱头高于雄蕊，花粉囊开裂变大，散出花粉增多；⑤完全展开期：花瓣完全展开，花粉囊纵列增大，散出花粉量逐渐变少到散尽，花药颜色变淡。
玉铃花花序开花的顺序由内至外(图1G~I)，整个开花过程受天气和温度影响较大，晴天和气温较高时，花瓣展开速度和散粉速度快，整个开花持续时间较短；阴天、雨天或气温稍低，花瓣开放速度趋慢，开花持续时间较长。
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统计花粉粒染色率发现：开花前1 d，玉铃花花粉活力达74.00%，开花第1天降至50.80%，第2天更低，仅为37.60%，随后持续降低，直到花瓣脱落，花粉殆尽，花粉活力为0。用联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性，结合图2可知：开花前1 d，柱头部分具有可授性，此后可授性呈增强趋势，至开花第2天，达到最强，随后逐渐下降，开花第5天，柱头已无可授性。
图 2 玉铃花花朵发育阶段柱头可授性的变化
Figure 2. Dynamics of stigma acceptability for S. obassia flowers during development
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对花蕾中花药花粉粒和子房胚珠的统计可知：玉铃花单花花粉量为(8 080.0±739.8)粒，胚珠数量为(12.8±0.7)粒，P/O为(646.30±64.35)。依据CRUDEN的标准，玉铃花有性繁育系统为兼性异交。
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玉铃花成熟花朵直径为(17.37±0.49) mm，＞6 mm，OCI记为3；花朵开放前1 d花粉粒活性最强，柱头部分可授，花药开裂时间和柱头可授性具有高度同步性，OCI记为0；所观察的30朵成熟花的柱头位置均高于雄蕊花药，雄蕊花药与柱头间空间分离明显，雄蕊雌蕊高度差为(2.50±0.16) mm，OCI记为1。由此判定玉铃花开放花朵OCI值为4，其有性繁育系统为异交且部分自交亲和，需要传粉者，属于兼性异交，估算结果与P/O一致。
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盛花期观察到的访花昆虫主要有蜜蜂科Apidae的中华蜜蜂Apis cerana、蚁科Formicidae的日本弓背蚁Camponotus japonicus、蝽科Pentatomidae的稻棘缘蝽Cletus punctiger和花蓟马Frankliniella intonsa等。其中，日本弓背蚁、中华蜜蜂出现频率最高，稻棘缘蝽除了盛花期第1天出现外，之后未观察到。
观察发现：8:00—12:00，中华蜜蜂数量和访花次数都处在较高水平，随后减少，至17:00，没有中华蜜蜂采蜜。访花时，中华蜜蜂头部朝下，足部抓住花瓣边沿，头部和胸部的绒毛可粘取花粉，伸长口器吸食花蜜，采完1朵花后携带花粉采食另1朵，触及柱头完成授粉(图3 A~C)。中华蜜蜂收集花粉时，后足绒毛沾满花粉，好似“花粉筐”，有利于传粉(图3 D)。统计发现：中华蜜蜂的单花停留时间为7.5 s，单次连续访花数9朵，单序停留时间约1.4 min。日本弓背蚁(图3 E)出现频率也较高，其单花停留时间为27.5 s，单序停留时间约3.0 min，但是由于日本弓背蚁体型很小，有研究认为其腹腺分泌物含抗生素可降低花粉活力，并且其作为无翅访问者，具有重复访花、花序行为，易促进自花授粉的发生[15]，因此蚂蚁传粉作用较小。甲虫等其他种类昆虫，仅吸取子房上部花被管内的花蜜，稻棘缘蝽刺吸植物茎叶(图3 F)，喜好中午时趴在花筒上吸食汁液，而花蓟马多集于花内取食，两者对玉铃花传粉无太大作用，甚至会造成花朵萎蔫，阻碍传粉。
图 3 昆虫访花行为
Figure 3. Visiting behavior of insects
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植物的花部特征、传粉特性和繁育系统是相互适应的[16]，此种适应性大多体现在2个方面，其一为花部结构、形态的适应，其二为传粉者行为的适应。玉铃花花朵洁白，花冠直径＞6 mm，花药黄色耀眼，具清香气味，具有较强的吸引昆虫特性, 与江南牡丹草Gymnospermium kiangnanense[17]花部表现出的泛化传粉类型特征相似。玉铃花为总状花序，花朵数量较多，自下而上开花，与1年生水生植物冠果草Sagittaria guyanensis的开花顺序一致[18]；单花花期约5 d，整个花序寿命长达15 d，这种花序开花不同步，且花朵耀眼、数量大的特性，有助于延长传粉昆虫的访花时间和增加植物完成异花授粉的成功率，是植物长期适应不稳定传粉环境的表现，与ZHAO等[19]发现的花形态、大小对传粉者多样性和选择性有显著影响，且花展示和数量越多、选择性越强的研究结论一致。
玉铃花在浙江境内的野生居群零星状分布，天然更新受阻，主要原因可能是传粉昆虫数量和种类较少。本研究发现：中华蜜蜂是玉铃花的主要传粉昆虫，体型与其单花大小相适宜，两者存在供食与授粉的互惠关系；中华蜜蜂访花次数和时间与花粉活力、柱头可授性最强的时间一致。可见，玉铃花有性繁育主要依赖中华蜜蜂传粉的异交。观察还发现：大量的日本弓背蚁和花蓟马在玉铃花花朵上出现，但这些昆虫体型小，易出现重复访花行为，增加自花授粉可能性，很难形成有效传粉[20]。此外，外界干扰会影响传粉者的行为，其中天气的干扰影响程度较为突出，特别是阴雨天气，使得昆虫传粉行为受到一定抑制。如在花期遭遇连续数天阴雨的山地生境，玉铃花花期会延长，符合RATHCKE [21]的研究结论，即在传粉者稀少或者不稳定生境时，植物会通过延长花期来提高生殖成功率。本研究中，玉铃花花药不同步开裂，将花粉活力从5 d延长至6~7 d，可视为对传粉者行为受限时的适应。
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花粉/胚珠比和杂交指数被广泛用于植物繁育系统的研究[22-23]。根据DAFNI杂交指数标准，玉铃花繁育系统为异交、部分自交亲和，属于需要传粉者类型；依据GRUDEN花粉/胚珠比测定结果，玉铃花繁育系统属于兼性异交，与安息香科另一植物黄梅秤锤树的研究结论一致[6]。在玉铃花开花过程中，单花尺度的雄蕊和雌蕊始终处于空间分离，柱头高于花药，不利于自花授粉，有利于柱头接受异花授粉；同时，花粉活力和柱头可授性的强弱具有一定的时间间隔，因此避免了同花自交现象的发生。但是花朵开放花药散粉时，柱头已经具有可授性，其花粉活力与柱头可授性存在一段时间重叠，使得玉铃花在时间上又具备自交的可能性。从单株水平看，玉铃花整株同时开放的花朵数量多，且单序分2~3段开放，花朵发育期又不同，在受到外界昆虫访花者及风力的作用下，也会出现同株同花和同株异花授粉，即植物自交。植物自交是被子植物进化的普遍趋势，是植物在恶劣环境中保证繁育成功的一种适应机制[24]。如花期降雨导致传粉受阻时，玉铃花选择自花授粉。因此，自花授粉为适应不断变化的生境提供了一定生殖保障，但是自交是否会对后代适合度造成影响，还有待进一步研究。
有效的授粉可使植株结实，但果实内只有少量种子可以萌发形成新的植株。安息香科植物如秤锤树属Sinojackia、长果安息香属Changiostyrax等大多已经濒危[25]，栖息地被破坏、人为砍伐是直接原因，而植物种子外果皮坚硬、胚乳内源抑制物多、种子萌发率低也是重要原因。玉铃花同其他安息香科植物存在一定共性，即种皮厚、种子存在休眠，因此，玉铃花在浙江省的生存现状需要引起足够重视与并提供有效保护。
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玉铃花为总状花序，单花序开花由基部向先端分2~3区段开放，单花开花持续3~5 d，花期为4月中旬至5月初；玉铃花花朵洁白、花药黄色具芬芳气味均为吸引传粉昆虫的花部特征，主要传粉昆虫为中华蜜蜂、日本弓背蚁等小型昆虫，体型与单花大小、花部结构相适应，玉玲花与传粉昆虫存在供食与授粉的互惠关系；玉铃花昆虫访花的时间与花粉活力、柱头可授性最强的时间一致；花粉胚珠比为(646.30±64.35)，杂交指数为4，证实其授粉方式为依赖昆虫媒介为主的异交类型，繁育系统为异交且部分自交亲和。
Flowering dynamics and breeding system of Styrax obassia
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摘要:
目的 研究玉铃花Styrax obassia的开花动态，揭示其繁育系统的基本特征，认识其生物学特性，为玉铃花杂交育种、生境保护提供理论依据，也为城市园林绿化应用推广提供技术支持。 方法 田间观测玉铃花开花动态特征、花部结构、昆虫访花特性，采用TTC染色法和联苯胺-过氧化氢法，分别测定花粉活力和柱头可授性，运用杂交指数(OCI)、花粉胚珠比(P/O)等方法确定其繁育系统类型。 结果 ①玉铃花的花期为4月中旬至5月初，始花期为4月15—18日，盛花期为4月19—26日，末花期为4月27日—5月2日，单花花期约3~5 d。②总状花序下垂，开花顺序由花梗基部向先端分2~3区段开放, 30个总状花序的小花数量平均为(25.3±1.8)个。③开花1 d后的花粉活力最强，雌雄蕊成熟时间部分重合， P/O为(646.30±64.35)， OCI为4。④访花昆虫主要有中华蜜蜂Apis cerana、日本弓背蚁Camponotus japonicus等。 结论 玉铃花开花始于4月中旬，结束于5月初，盛花期持续1周时间，其繁育系统属于兼性异交、需要传粉者的类型，部分为自交亲和。图3表1参25 Abstract:Objective With an investigation of the flowering dynamics of Styrax obassia, this study is aimed to reveal the basic characteristics of its breeding system for a better understanding of its biological characteristics so as to provide theoretical basis for cross breeding and habitat protection of S. obassia as well as technical support for the application and popularization of urban landscaping. Method Observations were made of the flower dynamic characteristics, floral structure and insect visiting characteristics before the pollen viability and stigma receptivity were determined employing TTC staining and benzidine hydrogen peroxide method whereas the breeding line type was determined using hybridization index (OCI) and pollen ovule ratio (P/O). Result (1) With a single flowering period of about 3 to 5 days, the flowering period of S. obassia is from mid-April to early May with April 15 to 18 being the initial flowering period, April 19 to 26 being the full flowering period and April 27 to May 2 being the final flowering period. (2) With the racemes drooping, its flowering sequence was divided into 2−3 segments from the base of the pedicel to the apex and the average number of florets in 30 racemes was (25.3±1.8). (3) The pollen vigor was the strongest one day after flowering, and the mature time of male and female stamens partially coincided, with a P/O of (646.30±64.35) and an OCI of 4. (4) The flower visiting insects mainly include Apis cerana and Camponotus japonicus. Conclusion The flowering period of S. obassia began in mid-April and ended in early May with the bloom lasting for a week and the breeding system is featured with facultative outcrossing and pollinator and is partially self-compatible. [Ch, 3 fig. 1 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Styrax obassia /
- flowering dynamics /
- breeding system /
- pollen vitality /
- stigma receptivity
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磷是植物生长和发育的必需营养元素，通过多种途径参与植物的代谢过程，对植物的生长发育起到关键作用[1]。在植物生长发育过程中，植物体所需的养分、水分主要通过植物根部进行吸收和运输供应。根部作为直接接触土壤或基质的器官，在低磷逆境中最先受到胁迫[2]。为了适应低磷环境，植物根在进化过程中形成了多种调节磷的吸收以及平衡策略。例如，植物根系会分泌大量的酸性磷酸酶与有机酸，其通过根系，降低土壤的pH，使植物在低磷的土壤中能够活化、动员有机磷[3]，进而提高了有效磷质量分数，促进了植物对土壤中磷的吸收；并且，酸性磷酸酶还可以促进植物体内的磷脂化合物发生水解，并促进植物体内磷的循环，促进有机磷的重复利用[4]。
在正常情况下，植物体细胞内活性氧(ROS)的产生和清除处于一种相对稳定的平衡状态[5]，但在低磷胁迫时，ROS原有的状态被打破，其过量产生会使植物细胞发生膜脂过氧化，并且生成有害物质，破坏细胞膜的结构并影响其功能[6]。ROS的增加导致丙二醛(MDA)过量生产，MDA作为植物细胞膜脂过氧化的产物之一，其含量高低可以反映膜脂过氧化的水平以及细胞膜的损伤程度，可视为植物抗逆性的重要指标。为了消除活性氧对植物造成的伤害，植物自身进化出了一系列措施，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等主要的抗氧化酶等协同作用的抗氧化体系，从而维持了植物细胞膜的稳定性，提高了植物低磷胁迫下的生理抗性；同时，植物还会通过提高根系活力等共同参与调节，以应对低磷胁迫所带来的损伤[7]。
马尾松Pinus massoniana是重要的用材树种，主要分布在中国的亚热带和热带地区，占中国森林总面积的3.6%，是中国亚热带地区荒坡造林的主要先锋树种。马尾松适应能力强，具有耐干旱、耐瘠薄、速生丰产等特点，同时在保持水土、涵养水源、维持区域生态平衡等方面发挥巨大作用[8−9]。然而，在中国南方热带和亚热带地区的酸性土壤中，磷易与铁、铝等金属元素及土壤黏粒等通过吸附、固定等方式保持不溶形式，使土壤中有效磷转化为难溶性磷，最终加重土壤磷对植物的限制[10]，因此，中国南方黄红壤普遍存在pH低、有效磷缺乏等问题[11]。近年来，大气氮沉降逐渐加剧，土壤环境中的氮素有效性随之增加，造成原有低磷土壤中的有效磷水平相对更低，这不但扰乱了土壤的养分平衡，还使得植物对土壤有限磷素的吸收和利用受到影响[12−14]。
结合全国土壤调查和全国第2次土壤普查养分分级标准得知：土壤磷素在马尾松人工林中存在严重亏缺，马尾松林地土壤有效磷在0~20和20~40 cm土层中分别处于缺和极缺状态[15−16]。对全国马尾松林调查发现：大部分地区马尾松并未表现出缺磷症状并且生长依旧良好，这说明马尾松对低磷胁迫的适应有应对机制[17]。而马尾松幼苗对低磷胁迫研究所设置的磷质量分数多高于马尾松生长的实际磷质量分数，如谢钰容等[18]对不同种源的马尾松盆栽低磷胁迫的研究中设置0~100 mg·kg−1的有效磷添加；唐敏[19]对不同种源马尾松种子及幼苗的低磷胁迫响应中设置磷质量分数为0~20 mg·kg−1；徐向华等[17]对马尾松低磷胁迫下生理生化响应研究中设置磷质量分数为0~31 mg·kg−1。以上研究相较于大量样地调查(马尾松分布区14个省32个研究地点113个样地)和文献资料分析所得的磷质量分数(2.250 0 mg·kg−1)要高很多[16]。鉴于此，本研究选择易控制的马尾松幼苗为对象，通过研究幼苗根系生理变化和根抗氧化酶系统的响应，探究马尾松应对低磷胁迫的生理生化特征，以期为阐明其耐低磷的机制提供支持。
1. 材料与方法
1.1 材料及试验设计
研究地点位于湖北省宜昌市秭归县湖北长江三峡库区(秭归)森林生态系统国家定位观测研究站(30°53′N，110°54′E，海拔296 m)，该区属亚热带大陆性季风气候，年均气温为19.0 ℃。
2021年5月1日，选择苗高、地径长势基本一致的2年生马尾松幼苗(苗高为61.0 cm，地径为5.4 mm)移栽入直径16.5 cm，高17.0 cm的花盆中，按m(石英砂)∶m(蛭石)∶m(珍珠岩)=7∶2∶1的比例混合作为幼苗培养基质。移栽后的马尾松幼苗放入透明遮雨棚中，1个月内用Hoagland营养液培养，进行缓苗处理，1个月后对苗木进行不同磷处理。根据中国马尾松林土壤肥力特征调查所获得的马尾松林0~20 cm土层土壤有效磷质量分数的中位数(2.250 0 mg·kg−1)作为对照(ck)[16]，将磷酸二氢钾(KH2PO4)配制成不同浓度的溶液，用氯化钾(KCl)调整使钾离子(K+)浓度一致，用稀盐酸(HCl)调整氯离子(Cl−)浓度，使营养液pH为5.5，并保持其他营养元素浓度相同。每隔3 d，将40 mL营养液沿基质表层幼苗茎干浇下，共浇灌5次，营养液浇灌完成时间为6月15日。使马尾松幼苗盆栽基质中的有效磷质量分数分别为：0 (P0)、0.562 5 (P1)、1.125 0 (P2)、2.250 0 (ck)、4.500 0 (P3)、9.000 0 mg·kg−1 (P4)，每个处理15盆，进行相同光照和水分条件管理。
1.2 样品采集及指标测定
1.2.1 样品采集
在磷处理完成后，结合马尾松生长季节(3月下旬至10月上旬)[20]，分别于处理后1.5个月(8月1日)和3个月(9月16日)，从每个处理中随机选取3株马尾松整株幼苗，共计收获36株。采集时，将植株用剪刀从根茎交界处剪取地上部、地下部，取根系用清水冲洗干净并轻轻擦去表面水分，以备后续生理生化指标测定。
1.2.2 生理生化指标测定
采用北京索莱宝科技有限公司生产的试剂盒对酸性磷酸酶(ACP)活性、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性进行测定。取根鲜样剪碎混匀，用万分之一天平称取0.100 0 g的样品，将样品放入研钵中，加入1 mL提取液在冰上研磨至匀浆，4 ℃下离心10 min，ACP离心转速为10 000 r·min−1，MDA、SOD、POD、CAT离心转速为8 500 r·min−1，取上清液处理后于酶标仪并计算，酶活性单位为16.67 nkat·g−1，MDA质量摩尔浓度单位为nmol·g−1。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定[21]，有机酸采用酸碱滴定法测定[22]。
1.3 数据处理与分析
数据采用Excel 2016和SPSS 26统计分析软件进行处理。运用双因素方差分析比较不同磷质量分数和不同采样时间及其交互作用对马尾松幼苗根系的ACP酶活性、有机酸质量摩尔浓度、根系活力、MDA质量摩尔浓度、SOD活性、POD活性、CAT活性的影响；用单因素(ANOVA)和多重比较(LSD, α=0.05)分析不同磷质量分数处理间生理生化指标的差异；用t检验比较2个采样时间生理生化指标的差异；用Pearson相关系数分析各生理生化指标间的相关性。所有处理在SPSS 26中进行，用Origin 2022软件作图。
2. 结果与分析
2.1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根ACP活性与有机酸质量摩尔浓度的变化
由图1A可知：不同磷质量分数处理下马尾松幼苗根ACP活性在不同采样时间差异极显著(P＜0.01)。2个采样时间的马尾松幼苗根ACP活性随磷质量分数的增加而降低。在8月，P1、P2、P3处理的ACP活性与ck相比均无显著差异；P0处理的ACP活性显著高于ck (P＜0.05)，是ck的1.45倍；P4处理的ACP活性显著低于ck (P＜0.05)，相较ck降低了60.92%。而随着胁迫处理时间的增加，9月P3和P4处理的ACP活性均显著低于ck (P＜0.05)，而P0、P1、P2处理与ck无显著差异。
图 1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根ACP活性和有机酸质量摩尔浓度Figure 1 ACP activity and organic acid content in root of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations由图1B可知：不同磷质量分数下马尾松幼苗根有机酸质量摩尔浓度存在显著差异(P＜0.05)，而不同采样时间差异不显著，且磷质量分数与采样时间对有机酸质量摩尔浓度无交互影响。其中，P2、P3处理的根有机酸质量摩尔浓度与ck差异不显著；P0、P1处理的有机酸质量摩尔浓度显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.25、1.14倍，P4处理的有机酸质量摩尔浓度显著低于ck (P＜0.05)，相比于ck降低了12.53%。整体而言，根系有机酸总量随着磷质量分数的增加呈下降趋势。说明在低磷条件下，马尾松幼苗根系可通过自身调节提高ACP活性，增加有机酸质量摩尔浓度以提高对磷的利用效率，从而适应低磷胁迫环境。
2.2 不同磷质量分数下马尾松幼苗根系活力的变化
由图2可见：不同磷质量分数处理间的马尾松幼苗根系活力在不同采样时间下存在极显著差异(P＜0.01)。其中：在8月，ck处理的马尾松幼苗根系活力与P2处理无显著差异；P0、P1、P3、P4处理的根系活力显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.82、1.35、1.49、1.34倍。而在9月，ck处理与P2、P3处理差异不显著；P0和P1处理的根系活力显著低于ck (P＜0.05)；仅P4处理根系活力显著高于ck (P＜0.05)，是ck的1.25倍。在9月，马尾松幼苗根系活力表现出随磷质量分数的升高而增强。综上所述，在低磷胁迫前期，根系活力虽然保持较高水平，但随着胁迫时间的增加，根系活力急剧下降。
图 2 不同质量分数下马尾松幼苗根系活力Figure 2 Root vigor of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations2.3 不同磷质量分数下马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度及SOD、CAT、POD活性的变化
MDA是植物经受逆境情况下产生的，是一种广泛使用的损伤标志物，其质量摩尔浓度随胁迫程度发生变化[23]。从图3A可以看出：马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度在不同磷质量分数间和不同采样时间下存在极显著差异(P＜0.01)。ck处理的MDA质量摩尔浓度与P1、P2、P3处理无显著差异，马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度随着磷质量分数的降低呈不同程度的增加，尤其在P0处理下，MDA质量摩尔浓度显著高于ck (P＜0.05)，是ck的1.37倍，P4处理则显著低于ck (P＜0.05)，相比于ck降低了18.98%。同时，随着时间的推移，MDA质量摩尔浓度也明显增加，9月马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度显著高于8月(P＜0.05)，涨幅为21.34%。由此可见，缺磷导致MDA积累增加，植物损伤程度增强，且随着胁迫时间增加，MDA也不断积累。MDA积累是马尾松幼苗应答低磷环境的生理变化之一。
图 3 不同磷质量分数下马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度及SOD、CAT、POD活性差异Figure 3 MDA content and the SOD、CAT and POD activity in root of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations不同磷质量分数处理下的马尾松幼苗根SOD、CAT和POD活性均存在极显著差异(图3，P＜0.01)，MDA质量摩尔浓度以及SOD、CAT、POD活性随着磷质量分数的增加而降低。P2、P3、P4处理的SOD、POD、CAT活性均与ck无显著差异，P0、P1处理的SOD、POD、CAT活性显著高于ck (P＜0.05)。其中：P0、P1处理的SOD活性分别是ck的1.67、1.47倍(图3B)；相较于ck处理，P0、P1处理的POD活性分别增加了66.11%和54.43%(图3C)；P0、P1处理的CAT活性分别是ck的1.47、1.26倍(图3D)。
同时，随着处理时间的增加，MDA质量摩尔浓度和POD活性显著增加了21.34%、26.15%(P＜0.05)。SOD、CAT活性在不同采样时间无差异，而POD活性在9月显著高于8月(P＜0.05)，是8月的1.26倍。上述结果说明马尾松幼苗可通过提高抗氧化酶的活性来应对低磷胁迫。
2.4 马尾松幼苗根主要生理变化的相关分析
由表1可知：马尾松幼苗根ACP活性与有机酸质量摩尔浓度相关系数为0.472，呈极显著正相关(P＜0.01)，即有机酸质量摩尔浓度的增加有利于ACP活性的提高；MDA质量摩尔浓度与SOD、POD、CAT活性相关系数分别为0.695、0.694、0.712，呈极显著正相关(P＜0.01)，即在低磷胁迫下膜脂过氧化产物MAD质量摩尔浓度增加，使细胞膜受到破坏，SOD、POD、CAT酶活性增强以适应低磷胁迫的损伤；根系活力与ACP活性呈显著正相关(P＜0.05)，与POD活性呈极显著正相关(P＜0.01)。
表 1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根生理变化指标的Pearson相关性分析Table 1 Pearson correlation analysis of the physiological indexes of P. massoniana seedlings under different phosphorus concentrations指标 有机酸总量 根系活力 MDA SOD活性 POD活性 CAT活性 ACP活性 0.472** 0.392* 0.215 0.466** 0.287 0.415* 有机酸总量 1 −0.190 0.702** 0.658** 0.577** 0.640** 根系活力 1 −0.308 −0.095 −0.432** −0.162 MDA 1 0.695** 0.694** 0.712** SOD活性 1 0.670** 0.671** POD活性 1 0.672** 说明：*表示相关显著(P＜0.05)；**表示相关极显著(P＜0.01) 3. 讨论与结论
在逆境中，植物的根部是最先受到环境胁迫影响的器官，而在植物对低磷环境的响应中，ACP与根的联系最紧密，可以促进根有机磷的重复利用[24]。如ZAHEER等[25]研究认为：植物的ACP活性可衡量植物生理的磷营养情况；程丽莉等[26]对落叶松Larix gmelinii幼苗的研究发现：低磷胁迫下，幼苗根组织内ACP活性增加。本研究也发现：在处理1.5个月后，马尾松幼苗根ACP活性随磷胁迫程度的增加而增强，说明幼苗为满足自身生长对磷元素的需要，通过提高根中ACP活性以增强体内磷的利用效率[27]。但是随着胁迫时间的推移，幼苗生长自身对磷元素的需求有所差异，使得各磷质量分数根ACP活性的差异在2个采样时间有所不同。此外，为维持植物体内有效磷水平，根需要保持旺盛的有机酸分泌活动。俞元春等[28]研究表明：缺磷胁迫下杉木Cunninghamia lanceolata和马尾松苗木根系有机酸分泌量显著增加。在本研究中，马尾松幼苗根有机酸分泌量随着磷质量分数的增加而下降，且有机酸质量摩尔浓度与ACP活性呈极显著正相关，这说明有机酸质量摩尔浓度的增加有利于ACP活性的增强。在磷胁迫下，马尾松幼苗通过提高根ACP活性和增加有机酸分泌量来提高磷的利用效率，进而适应低磷环境。
在逆境条件下，根系活力是表征植物抵御逆境胁迫能力高低的重要生理指标，会直接影响植物的生长状况。研究表明：低磷胁迫下根系活力会降低[29−30]。如崔博文[31]对7个种源马尾松幼苗研究发现：其中4个种源在轻度、中度低磷胁迫时，其根系活力较对照升高，而当低磷胁迫达到重度时，根系活力下降；另外3个种源根系活力随磷胁迫程度增加而降低。然而本研究中，第2次采样时根系活力随磷质量分数的降低而降低，这与上述研究结果一致，说明随磷胁迫程度的增加，根系活力显著下降。但是在处理仅为2个月，即第1次采样时，无磷处理根系活力显著高于ck与其他处理，这可能是在低磷胁迫初期，马尾松幼苗为满足自身生长对磷元素的需求，通过提高对基质中磷的吸收能力，促进根系生长，以此提高根系活力[32-35]。
活性氧的产生和清除在植物正常代谢中处于一个动态平衡的状态，而逆境会导致细胞内活性氧含量上升，并破坏植物膜系统[36]。活性氧的积累会引起膜脂过氧化，MDA作为植物细胞膜脂过氧化的产物之一，在一定程度上能够反映植物体的受害程度[37−38]。MDA的积累会刺激植物保护酶(SOD、POD、CAT)系统活性的提高，通过这些保护酶之间相互协调，加快清除MDA，保持稳定平衡的状态。如于姣妲等[39]对低磷胁迫下杉木的生理响应研究发现：杉木幼苗的根系和叶片会通过改变SOD、POD和CAT 3种保护酶活性来抑制MDA的形成，从而降低MDA对细胞膜系统的破坏。本研究也发现：不同磷质量分数处理下MDA质量摩尔浓度与SOD活性、POD活性和CAT活性均显著正相关，且随着磷质量分数的降低，MDA质量摩尔浓度与SOD活性、POD活性、CAT活性均呈上升趋势，这与乔光等[32]对不同种源马尾松幼苗低磷胁迫的生理响应结果一致。与此同时，随着处理时间的增加，第2次采样时间的根MDA质量摩尔浓度和POD活性均显著高于第1次采样，表明马尾松细胞膜受到的破坏随磷胁迫程度和时间的推移而加重，马尾松幼苗根受到磷胁迫的影响产生更多的自由基，膜脂过氧化程度加快，导致MDA质量摩尔浓度增加，但在受到低磷胁迫后，保护酶系统被激活，其活性增强以提高清除自由基的能力。由此可见，马尾松幼苗中存在着MDA质量摩尔浓度和保护酶活性的保持动态平衡的低磷生理应答机制。
本研究发现：不同磷质量分数下，马尾松幼苗根ACP活性与有机酸质量摩尔浓度随磷胁迫程度的增加而升高，以提高植物体对磷的活化、吸收与利用；在胁迫前期，根系活力在无磷处理下显著高于其他处理，但随着胁迫时间增加，根系活力随磷质量分数的降低而下降，尤其是无磷、低磷处理的根系活力急剧下降；根MDA质量摩尔浓度、SOD活性、POD活性、CAT活性，随磷质量分数的下降而升高，低磷环境下MDA质量摩尔浓度增高，SOD活性、POD活性、CAT活性也随之增强以修复MDA带来的损伤。可见，低磷胁迫下马尾松幼苗会通过调整生理、生化的变化机制来应对低磷环境。
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图 2 玉铃花花朵发育阶段柱头可授性的变化
Figure 2 Dynamics of stigma acceptability for S. obassia flowers during development
表 1 玉铃花花部器官数量特征统计
Table 1. Statistics on the quantitative characteristics of floral organs of Styrax obassia
参数 花瓣长度/mm 花瓣宽度/mm 花冠直径/mm 花药长度/mm 花药宽度/mm 花丝长度/mm 花柱长度/mm 测定值 16.51±0.19 6.47±0.13 17.37±0.50 4.01±0.10 0.97±0.02 10.17±0.15 17.24±0.22 参数 雄蕊数量/个 子房长度/mm 子房宽度/mm 花筒长度/mm 花柄长度/mm 雄蕊雌蕊高度差/mm 测定值 9.2±0.2 2.79±0.04 1.96±0.05 5.68±0.12 5.61±0.20 2.50±0.16 
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