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光强和氮素是陆地多数森林植物进行光合作用的主要限制因子[1]。不同种类的植物对生境光强变化的适应性表现出极大的差异性，喜光植物的光合速率随生境光强增加而大幅增加，阴生植物则受到强烈的光胁迫抑制[2]。一定范围的强光促进植物根系生长、维持水分和营养物质的吸收能力；相反，弱光条件下，植物会提高叶绿素质量分数，增强捕获太阳辐射的能力。植物叶氮含量直接影响光合速率，并最终影响植物光能利用率和生物量的积累。当植物处于一定的氮素供应范围时，增加土壤氮素将提高净光合速率[3]，相反土壤施氮超出一定范围后，将会导致植物光合速率下降，生长速率减缓，严重时植物出现枯死现象[4]。
玉铃花Styrax obassia属于安息香科Styracaceae安息香属Styrax的落叶小乔木或灌木，主要分布于华中和华东地区，向东分布至山东半岛，向北分布至辽宁东南部，为安息香科在中国的分布北界[5]；在国外分布于日本南部和朝鲜半岛西南部。安息香属在中国有31种植物，仅玉玲花、粉花安息香S. roseus呈现粉红色的花朵[6]。玉铃花树形优雅，枝叶扶疏，穗状花下垂，形如“玉铃”，花期长且香气馥郁，为良好的蜜源植物，也是营造城市园林蝴蝶栖息地的优良树种[7]，其花、果实、木材均具有重要的经济价值。
2020年8月作者在清凉峰国家级自然保护区紫茎Stewartia sinensis群落样地调查时仅发现1株玉铃花。该株玉铃花呈单株分布，未见健康的幼苗、幼树。自然条件下玉铃花缺乏幼苗幼树，可能与其种子、幼苗、幼树抗逆性弱有关。种子和幼苗、幼树是植物种群生活史极为脆弱的2个阶段。种子发芽、幼苗阶段对所在生境生活因子的变化幅度最为敏感[8]，往往因为关键生态因子的剧烈波动，如光强和气温、以氮素为标志的土壤肥力状况、土壤水分含量不足或过剩等，导致种子发芽、幼苗生长发育受阻乃至出现死亡，最终被环境筛过滤淘汰。可推测：一方面玉铃花自然落种后难以遇到适宜发芽生境，加上种子发芽的内部抑制因素，种子难以发芽；另一方面幼苗对生境环境质量要求较高，表现为群落下层的光强和土壤肥力条件难以满足玉铃花幼苗的生长发育需求，导致玉铃花天然更新在种子发芽和幼苗生长发育2个环节严重受阻。幼苗生长发育过程往往受到2个或更多生态因子的综合影响，在高效培育苗木过程中，需要调控光和氮肥的交互效应，才能实现苗木生长和苗木质量的优化[9]。目前，有关玉铃花的研究多集中于破除种子休眠[10]、遗传多样性的扩增片段长度多态性(AFLP)分析[11]、种苗特性[12]、开花动态与繁育系统[13]等，对其幼苗生态适应性的研究尚未开展。
基于上述分析，根据玉铃花生物学与生态学特性以及野外生长状况，本研究构建遮光与氮素双因素控制试验，模拟不同光强和氮素的生境组合，通过分析比较玉铃花光合生理参数的差异，筛选最有利于玉铃花幼苗光合生理代谢过程的光强+氮素处理组合。
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试验地位于浙江省杭州市临安区浙江农林大学东湖校区(30°15′20″N，119°43′36″E)。地带性气候属于亚热带湿润季风气候，年均降水量为1 613.9 mm，年均气温为13.0~22.0 ℃，四季分明。地带性植被为亚热带常绿阔叶林。
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于2021年3月从清凉峰自然保护区的苗圃选取长势良好且高度基本一致的玉铃花幼苗100株，株高为(46.08±3.83) cm、地径为(6.12±0.44) mm，移栽至花盆中(直径20 cm，高15 cm)，每盆栽植1株。盆栽土壤的化学性状(平均值±标准误)：pH为5.08±0.01，全氮为(1.53±0.01) g·kg−1，碱解氮为(184.92±8.61) mg·kg−1，有效磷为(8.76±0.11) mg·kg−1，速效钾为(275.00±12.19) mg·kg−1，有机质为(31.58±0.10) g·kg−1。
将移栽的玉铃花幼苗置于3层遮阳网下缓苗，正常浇水。30 d后将成活的植株随机分成9组，每组5盆，移至3个不同光强的遮光大棚，分别为轻度遮光(透光率47.30%，L1)，中度遮光(透光率20.00%，L2)，高度遮光(透光率7.75%，L3)。参考周磊等[14]对细叶桢楠Phoebe hui容器苗的施氮量，每个遮光处理设置1个对照组N0 (不施氮)和2个施氮处理，分别为N1 (施氮0.21 g)、N2 (施氮0.63 g)，氮肥为硫酸铵[(NH4)2SO4]，每隔15 d喷洒1次，对照组则喷洒等量清水，连续施氮4次。
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经遮光与施氮处理70 d后，选择6月5—14日晴天9:00—11:00，借助Li-6400便携式光合仪，测定玉铃花幼苗叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间二氧化碳摩尔分数(Ci)等。每个处理选择3株幼苗，每株测定3片叶片，每个处理共9个重复。设定光强梯度为2 000、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、100、50、20和0 μmol·m−2·s−1，诱导光强为1 500 μmol·m−2·s−1，诱导时间为30 min。
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采用乙醇浸提法测定光合色素质量分数[15]。取玉铃花鲜叶去除主脉，剪成约0.20 cm的碎片，取0.20 g放入10 mL体积分数为95%的乙醇离心管，密封至叶组织完全失绿。借助UV-2550型紫外分光光度计，在波长665、649、470 mm进行比色，读取各波长的吸光度，计算光合色素质量分数。具体计算公式如下：CChl a=[13.95×D(665)−6.88×D(649)]×V/(m×1 000)；CChl b=[24.96×D(649)−7.32×D(665)]×V/(m×1 000)；CCar=[1 000×D(470)×V/(m×1 000)−2.05×CChl a−114.8×CChl b]/245。其中：CChl a、CChl b、CCar分别表示叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素质量分数(mg·g−1)；D(665)、D(649)、D(470)分别表示665、649、470 nm处的吸光度，V为提取液总体积(mL)，m为样品鲜质量(g)
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运用Excel 2010对原始数据进行处理，再借助光合助手(Photosynthesis)软件计算出光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)、表观量子效率(AQY)、暗呼吸速率(Rd)和最大净光合速率(Pmax)；利用SPSS 26.0计算光合-光响应特征参数和光合色素质量分数的平均值、标准差，并检验差异显著性；借助 Origin 2019制图。
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比较图1可知：在L1处理下，当光合有效辐射(PAR)＞30 μmol·m−2·s−1时，玉铃花幼苗各施氮处理的Pn从大到小依次为N1、N0、N2，当PAR增加至2 000 μmol·m−2·s−1时，N1处理玉铃花Pn为N2处理的2.88倍。在L2处理下，当PAR由0增加至300 μmol·m−2·s−1时，各施氮处理玉铃花的Pn快速增加，超过300 μmol·m−2·s−1时，玉铃花的Pn从大到小依次为N0、N2、N1， L2+N1处理下玉铃花的Pn相较于L1处理约降低28.80%。在L3处理下，当PAR在50~400 μmol·m−2·s−1变化时，各施氮处理玉铃花的Pn从大到小依次为N0、N2、N1，当PAR＞400 μmol·m−2·s−1后，N0和N2处理下玉铃花Pn大致接近，且明显高于N1处理。随遮光程度增加，N2处理对玉铃花Pn的抑制作用逐渐减弱，L3+N2处理玉铃花的Pn比L1处理大约增加304.99%。
图 1 光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光响应的影响
Figure 1. Effects of light intensity and nitrogen application on light response of S. obassia seedlings
在不同遮光+施氮处理下，玉铃花幼苗Gs和Tr均随PAR增大呈增加趋势。L1处理下各施氮处理的玉铃花Gs差异较小。随遮光程度增加，各施氮处理间差异逐渐增大。当PAR为2 000 μmol·m−2·s−1时，L3+N2处理的玉铃花Gs相较于L1+N2处理增加了552.70%，为同一遮光下N1处理的2倍。在L2处理下，各施氮处理玉铃花Tr相差较大，当PAR为2 000 μmol·m−2·s−1时，N2处理下玉铃花Tr相较于N0处理下降了67.40%。在L2+N0处理下玉铃花Tr处于最高水平；在L3+N2处理下玉铃花的Tr明显高于其他2个施氮处理。
在L1、L2和L3处理下，玉铃花的Ci随PAR增加大致呈先下降然后缓慢回升的变化特征。当PAR＜400 μmol·m−2·s−1时，N1处理的玉铃花Ci下降幅度最大，随后呈现窄幅波动。
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光响应特征参数能够反映植物在不同环境因子变化下光合潜能、光能利用能力等特性，进而表征植物的利用弱光、适应强光的能力和光强生态幅的大小范围。分析表1可知：随遮光程度增加，玉铃花幼苗的LCP逐渐降低，各施氮处理在L3处理下比L1分别减小了71.16%、72.70%和75.00%，其中N2的LCP减小幅度最大。不同施氮处理在L1、L2和L3处理下，玉铃花幼苗的LCP分别为24.00~34.67、14.67~16.00和6.00~12.00 μmol·m−2·s−1。不同施氮处理在L1、L2和L3处理下玉铃花幼苗的光饱和点LSP分别为140.00~288.00、164.00~324.00和270.00~481.33 μmol·m−2·s−1。在同一光强条件下，不同施氮处理玉铃花幼苗的AQY从大到小依次为N2、N1、N0；同一施氮水平下，从大到小依次为L3、L2、L1，表明施氮和遮光均能促进AQY的增加。L3+N2处理的Pmax为4.121 μmol·m−2·s−1，相较于L3+N0处理增加了50.78%，显著高于其他处理(P＜0.05)。Rd的最小值出现在L3+N2组合处理，说明遮光和施氮能够通过降低呼吸速率来适应弱光环境。
表 1 不同光强与氮肥施加下玉铃花幼苗光合光响应特征参数的变化
Table 1. Changes of photosynthetic light response characteristic parameters of S. obassia seedlings under different light intensity and nitrogen application
处理 LSP/(μmol·m−2·s−1) LCP/(μmol·m−2·s−1) AQY/(mmol−1) Pmax/(μmol·m−2·s−1) Rd/(μmol·m−2·s−1) 光强 氮素 L1 N0 288.00±30.87 b 34.67±5.44 a 0.043±0.301 a 1.649±0.155 de 0.464±0.001 b N1 220.00±28.28 b 29.33±5.76 ab 0.046±0.111 a 1.924±0.225 cde 0.512±0.005 ab N2 140.00±1.89 b 24.00±2.83 ab 0.066±0.080 a 1.247±0.068 e 0.352±0.014 ab L2 N0 164.00±8.49 b 16.00±2.83 ab 0.054±0.305 a 3.246±0.102 b 0.346±0.001 ab N1 226.66±38.84 b 16.00±9.98 ab 0.060±0.056 a 2.276±0.090 cd 0.297±0.009 ab N2 324.00±33.04 ab 14.67±2.18 ab 0.067±0.089 a 2.127±0.217 cde 0.295±0.019 ab L3 N0 270.00±29.70 b 12.00±8.49 ab 0.065±0.080 a 2.733±0.525 bc 0.276±0.002 b N1 306.66±47.19 ab 8.00±3.77 b 0.075±0.110 a 1.943±0.166 cde 0.170±0.011 ab N2 481.33±86.52 a 6.00±1.41 b 0.080±0.421 a 4.121±0.248 a 0.132±0.061 a 说明：数据为平均值±标准误，小写字母表示同一指标在不同处理间差异显著(P＜0.05) -
分析表2可知：在L1处理下，各施氮处理的叶绿素a质量分数(CChl a)存在显著差异(P＜0.05)；随遮光程度的增大，同一遮光处理内的玉铃花叶片CChl a相近，L3处理的不同施氮处理下玉铃花幼苗的CChl a无显著差异(P＞0.05)。同一施氮处理不同光强下的玉铃花CChl a存在显著差异(P＜0.05)。随遮光程度增加，各组叶绿素b质量分数(CChl b)持续增加，不同施氮组的差异性逐渐减小；L1处理下，施氮显著增加了CChl b (P＜0.05)，N1、N2处理分别比对照组增加了237.40%和137.80%；L1+N1处理下的CChl a/CChl b为L1+N0的36.00%。L1处理下，不同施氮组的光合色素质量分数均存在显著差异(P＜0.05)，L2、L3处理下不同施肥处理间差异不显著(P＞0.05)。
表 2 光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光合色素质量分数的影响
Table 2. Effects of light and nitrogen interaction on photosynthetic pgment contents in seedlings of S. obassia
处理 CChl a/(mg·g−1) CChl b/(mg·g−1) (CChl a+CChl b)/(mg·g−1) CCar/(mg·g−1) CChl a/CChl b 光强 氮素 L1 N0 1.621±0.050 d 0.711±0.024 f 2.332±0.074 f 0.253±0.008 a 2.284±0.019 a N1 1.929±0.033 b 2.399±0.115 d 4.327±0.082 d 0.176±0.017 b 0.822±0.054 c N2 2.080±0.016 a 1.691±0.098 e 3.770±0.085 e 0.257±0.029 a 1.269±0.085 b L2 N0 1.799±0.031 c 2.960±0.126 c 4.760±0.098 c 0.083±0.023 cd 0.619±0.037 d N1 1.640±0.014 d 3.598±0.049 b 5.239±0.038 b 0.123±0.017 bc 0.457±0.010 e N2 1.577±0.020 de 3.806±0.082 b 5.382±0.064 b 0.075±0.018 cd 0.417±0.015 e L3 N0 1.525±0.011 e 4.114±0.024 a 5.638±0.018 c 0.073±0.012 cd 0.371±0.005 e N1 1.530±0.014 e 4.134±0.025 a 5.664±0.016 c 0.070±0.018 cd 0.370±0.005 e N2 1.496±0.020 e 4.136±0.056 a 5.632±0.040 c 0.058±0.024 a 0.362±0.009 e 说明：数据为平均值±标准误，小写字母表示同一指标在不同处理间差异显著(P＜0.05) 由表3可知：光强、氮素、光强+氮素对玉铃花幼苗的CChl a、CChl b、CCar、CChl a+CChl b和CChl a/CChl b的影响均达到极显著水平(P＜0.01)，影响的程度从大到小依次为光强、氮素、光强+氮素。
表 3 光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光合色素质量分数影响的方差分析
Table 3. Anova analysis of the effects of light intensity and nitrogen application on photosynthetic pigment content of S. obassia seedlings
变异来源 因变量 平方和 自由度 均方 F P 光强 CChl a 0.722 2 0.361 102.841 0 CChl b 49.298 2 24.649 661.922 0 CCar 0.161 2 0.081 37.618 0 CChl a+CChl b 38.378 2 19.189 727.670 0 CChl a/CChl b 9.629 2 4.814 808.793 0 氮素 CChl a 0.080 2 0.040 11.322 0 CChl b 5.853 2 2.927 78.592 0 CCar 0.008 2 0.004 1.815 0.177 CChl a+CChl b 7.242 2 3.621 137.307 0 CChl a/CChl b 2.666 2 1.333 223.955 0 光强+氮素 CChl a 0.793 4 0.198 56.493 0 CChl b 4.565 4 1.141 30.645 0 CCar 0.032 4 0.008 3.775 0.012 CChl a+CChl b 7.301 4 1.825 69.216 0 CChl a/CChl b 3.859 4 0.965 162.081 0 -
光合作用是植物获取生长所需能量的重要途径，光合能力的大小则反映了植物对某一生境的适应程度。植物光合能力的变化往往受到一系列因素的影响。当Ci下降时，气孔因素是Pn下降的主要原因；相反，当Pn减小未伴随Ci降低，非气孔因素成为光合速率降低的主要原因[16]。本试验中，N2处理下Pn增加的主要原因是气孔因素，随遮光程度的增加，N2处理的玉铃花叶片气体交换能力增强，因而保证了弱光下玉铃花幼苗光合作用所需气体的供给。庞立东等[17]研究发现：施氮能使气孔开放，减少气孔阻力，从而增强蒸腾作用。本研究中，L3处理下施氮增加了气孔开放程度，但Gs的增加并未引起Tr的显著增加，推测可能原因是L3处理下光强较弱，避免了玉铃花幼苗叶片的过度失水。
LSP和LCP可表征植物叶片对强光和弱光的利用能力以及光强生态幅的宽窄幅度。耐荫植物的LSP在50~1000 μmol·m−2·s−1变化或者更低，LCP则小于20 μmol·m−2·s−1[18]。本研究中，玉铃花幼苗的LSP在140.00~481.33 μmol·m−2·s−1变化，LCP在6.00~34.67 μmol·m−2·s−1变化，表明玉铃花幼苗具有较强的耐荫性。
本研究结果显示：随遮光程度增大和施氮量增加，玉铃花幼苗的LCP和Rd逐渐减小，AQY逐渐增大，且相同遮光程度下，施氮处理的LSP、AQY高于不施氮处理，LCP、Rd小于未施氮处理，表明适宜的施氮量有助于玉铃花幼苗更好地适应弱光环境。此变化规律与刘柿良等[19]研究结果相一致。在大棚控制的弱光条件下，玉铃花幼苗通过降低LCP和LSP，增加叶绿素含量等，使光能高效地转化为化学能；同时降低呼吸消耗水平，以维持其基本的代谢平衡，从而保证植物的生长发育[20]。
在本研究中，玉铃花幼苗的Pn在L3+N2处理下达到最大值，为4.121 μmol·m−2·s−1，在L1处理下Pn普遍较小，L0处理下表现最差，出现极严重烧苗、枯死现象；L2处理下，Pn从大到小依次为N0、N1、N2；L3处理下，Pn从大到小依次为为N2、N0、N1。因此，玉铃花幼苗光合能力表现最佳的光强与施氮处理组合为L3+N2，其次为L2+N0。
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植物光合效率的高低还可通过光合色素的质量分数来表征。本研究中，遮光对玉铃花幼苗光合色素质量分数的影响大于施氮，施氮大于遮光+施氮，且差异均达到极显著水平(P＜0.01)。此变化规律与尹子旭等[21]研究结果一致。通常在弱光条件下，植物会通过增加CChl b以提升捕获光能的能力[22]，CChl a/CChl b愈低说明植物愈耐荫[23]。一般的阴生植物CChl a/CChl b低于3[24]。本研究中，玉铃花幼苗CChl a/CChl b的远小于3，进一步证实玉铃花苗期具有较强的耐荫性，与其在重度遮光条件下仍表现出较高的光合速率相符合。增加施氮量并不会使叶绿素质量分数持续增加。在本研究中，L1和L2处理下，玉铃花幼苗的光合色素质量分数差异显著(P＜0.05)，L2与L3差异不显著(P＞0.05)。此变化规律与黄玲璞[25]的研究结果一致。
强光条件下植物需要吸收更多的氮肥，光照越强，氮肥对植物生长的促进效果越显著[26]。在本研究中，L1光强下N1处理表现明显优于N2处理，且N2处理叶片出现边缘内卷、变黄。分析原因可能是：N2施氮过多，且L1遮光条件下PAR较高，植物体内水分蒸发较大，推测引起土壤氮素浓度和玉铃花叶氮含量增加，结果超过玉铃花的可耐受限度，出现玉铃花幼苗叶片卷曲、枯死的现象。
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综上所述，光强和氮素对玉铃花幼苗的光合生理特性有显著影响。玉铃花幼苗表现出较强的耐荫性。在遮光+施氮处理下，玉铃花幼苗通过降低LSP、LCP、Rd、CChl a/CChl b，增加CChl a+CChl b、AQY等，更有效地适应弱光生境，以维持Pn处于较高的水平。本研究中玉铃花幼苗光合生理参数最佳状态的光强、氮素处理组合为L3+N2。
Effects of light intensity and nitrogen application on photosynthetic physiological parameters of Styrax obassia seedlings
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摘要:
目的 筛选更有利于玉铃花Styrax obassia光合生理参数表达的光强、施氮组合处理，揭示光强、氮素变化与玉铃花幼苗生长的关系。 方法 采用盆栽育苗方法，构建光氮双因素控制试验：4种遮光处理[全光对照(透光率100.00%)、轻度遮光(透光率为47.30%，L1)，中度遮光(20.00%，L2)和高度遮光(7.75%，L3)]与3种施氮处理[N2 (施纯氮0.63 g)，N1(施纯氮0.21 g)和N0(不施氮)]，测定分析玉铃花的光响应进程和光合色素质量分数的变化特征。 结果 ①随遮光程度和施氮量的增加，玉铃花幼苗的净光合速率、表观量子效率和总叶绿素质量分数呈现相应的增加，暗呼吸速率则相对减弱，其光饱和点为140.00~481.33 μmol·m−2·s−1，光补偿点为6.00~34.67 μmol·m−2·s−1、叶绿素a/b＜2。②全光及L1+N2处理组合时，玉铃花植株出现枯死现象。③L1处理下，净光合速率的从大到小变化顺序为N1、N0、N2；L3处理下，当光合有效辐射＞400.00 μmol·m−2·s−1时，N2处理玉铃花的净光合速率显著高于N0和N1处理(P＜0.05)；④光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光合色素质量分数的影响均达到极显著水平(P＜0.01)，影响趋势从大到小依次为光照、氮素、光照+氮素。 结论 玉铃花幼苗具有较强的耐荫性，其光合生理参数最佳的光氮处理组合为高度遮光(L3)，并施纯氮0.63 g (N2)。图1表3参26 Abstract:Objective This study aims to screen the combination treatment of light intensity and nitrogen application that is more conducive to the expression of photosynthetic physiological parameters, so as to reveal the relationship between the changes of light intensity and nitrogen and the growth of Styrax obassia seedlings. Method Potted seedling cultivation method was adopted to construct the two-factor control test of light and nitrogen. Four shading treatments were prepared: all-light control with 100.00% transmittance, light shading with 47.30% transmittance (L1), moderate shading with 20.00% (L2) and high shading 7.75% (L3). Three nitrogen application treatments were included: N2 (0.63 g pure nitrogen), N1 (0.21 g pure nitrogen) and N0 (no nitrogen application). The light response process and the variation characteristics of photosynthetic pigment content were determined and analyzed. Result (1)With the increase of shading degree and nitrogen application rate, net photosynthetic rate (Pn), apparent quantum efficiency (AQY) and total chlorophyll (Chl) content of S. obassia seedlings increased, while dark respiration rate (Rd) decreased, and light saturation point (LSP) ranged from 140.00 to 481.33 μmol·m−2·s−1. Light compensation point (LCP) varied from 6.00 to 34.67 μmol·m−2·s−1, and the ratio of Chl a to Chl b was less than 2. (2) Under all light and L1 shading+N2 treatment, the plants died. (3) Under L1 shading, the change of Pn ranging from large to small was N1, N0, and N2. Under L3 shading, when photosynthetic effective radiation (PAR)was greater than 400 μmol·m−2·s−1, the Pn of N2 was significantly higher than that of N0 and N1 (P＜0.05). (4) Both light intensity and nitrogen application had significant effects on photosynthetic pigment content (P＜0.01), and the influence trend in descending order was light, nitrogen, and light+nitrogen. Conclusion The seedlings of S. obassia have strong shade tolerance, and the optimal combination treatment of light and nitrogen is L3+N2. [Ch, 1 fig. 3 tab. 26 ref.] -
阔叶材横截面微观图像由管孔、木射线、生长轮、木纤维和轴向薄壁组织构成，其中管孔是木材研究最重要的特征之一[1-3]。管孔不仅是分析考古木材样品的构造特征与保护状态的研究要素[3]，也是研究某一地区若干年内木材生长量和环境气候变化相关性的依据[4]。管孔的分割是微观木材图像中提取管孔特征量和进行木材树种自动识别的关键步骤[5−6]，因此，微观木材图像中的管孔分割有重要的研究意义。近些年来应用于管孔分割的算法主要有数学形态学、区域生长、目标遗传和水平集等[7-9]。张广群等[9]首先运用多目标遗传算法成功地分割出图像中的大部分管孔，但会出现复管孔或管孔团的漏分，同时部分轴向薄壁组织会连同其附近的管孔一起被分割出来。汪杭军[10]运用局部水平集算法，以局部灰度分布的均值作为统计信息，加强了管孔区域和背景区域的对比度，该算法虽然克服了漏分问题，但出现了噪声的误分割，一部分噪声为一些轮廓较大的木射线组织，另一部分为形状大小与管孔相似的木纤维组织。祁亨年等[11]运用改变结构元素和形态尺度的数学形态学算法对管孔进行分割，该算法克服了木射线和木纤维组织等噪声的影响，但出现了图像边缘细节丢失，如较小的管孔被当作噪声去除或是较大的管孔部分组织缺失。SHEN等[12]通过检测闭合区域的平均面积得出最适合的结构元素，并运用形态学算法对管孔进行分割，但还是会出现小孔漏分，大孔误分的情况。由于木材横截面微观图像中管孔数量众多、形态各异且随机分布，木纤维和轴向薄壁组织横截面也呈现一个个相对较小的孔洞，从而对管孔进行分割较为困难。综上所述，微观木材图像中管孔的分割依然是目前的研究热点和难点。本研究提出了一种改进K-means聚类与分水岭的木材横截面管孔分割算法，旨在解决管孔漏分、误分和噪声去除的问题并快速分割出管孔区域。
1. 数据与方法
1.1 数据来源
日本森林数据库(
https://db.ffpri.go.jp/WoodDB/JWDB/home.php )。该数据库成立于1928年，现有木材标本29 000余号，隶属270科2 050属8 500种；切片标本约90 000号[13]。本研究用到的木材树种为大红叶枫Acer amoenum(15帧图像)、尖齿槭A. argutum(5帧)、细柄槭A. capillipes(4帧)、茶条槭A. ginnala(1帧)、桑叶槭A. morifolium(3帧)、毛果槭A. nikoense(3帧)、日本槭A. nipponicum(5帧)、赛波德槭A. sicboldianum(24帧)、花楷槭A. ukurunduense(6帧)、红脉槭A. rufinerve(25帧)、薄叶槭A. tenuifolium(3帧)和褐枝猕猴桃Actinidia rufa(7帧)。1.2 改进的K-means聚类算法
传统的K-means聚类算法以距离作为相似性的评价指标，基本思想是按照距离将样本聚成不同的簇，两点距离越近，相似度就越大，以得到紧凑且独立的簇作为聚类目标[14-15]。传统的K-means聚类算法将样本映射到RGB颜色特征空间，构造新的映射关系，能够打破聚类只能是球状的限制，但聚类中心的选择会较大程度上影响分类效果，尤其是当聚类中心的选取全部位于管孔以外时，管孔区域会被整体归为噪声。此外，由于初始聚类中心的随机生成，可能会导致分类结果不一致或将木纤维或轴向薄壁组织被整体分割出来。基于此，针对以上问题进行算法改进，实现聚类中心的自适应选取。在RGB色彩空间下提取彩色木材微观图像的三通道分量。结合木材横截面原图，能够看出生长轮和木射线区域颜色较深，颜色值较小，所以其对应颜色值较小的峰值附近区域；管孔区域颜色较浅，颜色值较大，所以其对应颜色值较大的峰值附近区域；轴向薄壁组织和木纤维区域颜色较为平均，颜色值介于前两者之间，所以其对应两峰之间的波谷附近区域。分别取3个分量的均值组成第1个中心点，代表颜色直方图波谷附近区域，该点作为轴向薄壁组织和木纤维区域的簇类中心；遍历三通道分量，对于大于各自均值的所有颜色值取中值作为第2个中心点，由于该点对应颜色值较大，所以该点作为管孔的簇类中心；小于各自均值的所有颜色值取中值作为第3个中心点，由于该点对应颜色值较小，所以作为生长轮和木射线区域的簇类中心，分别代表颜色直方图两峰峰值附近区域。设通道分量为
$ {M}_{j} $ ，$ {M}_{j}\in (r,\;g,\;b) $ ，Xn处的颜色值为In，$ 0 ＜ I $ ≤255。计算每个通道分量的均值$ \overline{M}_{j} $ ，均值两侧的中值为M1和M2，Meidan表示取目标数组的中值函数。$$ {\overline{M}}_{j}=\frac{1}{n}\sum _{{n}}^{1}{I}_{n}； $$ (1) $$ {M_1} = {\rm{Meidan}}\left( {0,\;{{\overline M}_j}} \right)； $$ (2) $$ {M_2} = {\rm{Meidan}}\left( {{{\overline M}_j},\;255} \right)\text{。} $$ (3) 根据图像中各组织部分对应的颜色峰值或波谷得出这一组织部分的中心点，再以这3个点作为初始聚类中心点，运用K-means算法实现管孔的粗分割。
1.3 改进的分水岭算法
虽然K-means聚类算法能够将木材微观图像中的管孔区域和背景区域区分开，但两者的颜色梯度差异较小，这可能会导致分水岭变换的过度分割。为了增加管孔区域和背景区域的颜色梯度差异，使分水岭变换在梯度运算判断极大值点时更加准确，更加有效地实现管孔的精分割，按照聚类的结果将木材微观图像进行3类颜色编码。第1类轴向薄壁组织细胞壁和木纤维区域进行红色编码，第2类管孔区域进行绿色编码，第3类生长轮和木射线区域进行蓝色编码。最后，通过形态学操作和分水岭变换实现管孔的精分割。
1.4 管孔分割
为实现木材横截面微观图像的管孔分割，具体步骤如下(图1)：①提取木材横截面微观图像的RGB分量并绘制颜色直方图；②根据木材微观图像中的3类目标区域，即轴向薄壁组织和木纤维、管孔、生长轮和木射线，确定聚类初始中心点；③根据像素点与聚类中心点之间的欧式距离求出新的簇类中心并判断中心点是否改变，若不一致则继续迭代，一致则进行下一步；④对划分出的3类区域进行颜色编码；⑤最后通过形态学操作去除面积较小的噪声，运用分水岭算法分割出管孔。
1.5 验证
以大红叶枫横截面原图(997×1 418)为例，将本研究算法和现有算法(阈值分割、分水岭、K-means聚类与阈值分割)的分割效果进行对比分析，并以平均管孔有效分割率(F)作为算法分割性能的评价指标进行评价。
$$ {P}_{i}=\frac{{T}_{i}}{{N}_{i}} ； $$ (4) $$ F=\frac{1}{n}\sum\limits_{i=1}^{n}{P}_{i}\text{。} $$ (5) 式(4)~(5)中，Ti表示每张图像的管孔实际分割总数，Ni表示每张图像中的管孔总数，Pi表示每张图像的管孔有效分割率，重复次数n的取值为101，
$ i\in n $ ，F表示平均管孔有效分割率。2. 结果与分析
2.1 算法实现
随机选择3种木材微观横截面原图(图2)。在RGB色彩空间下提取彩色木材微观图像的三通道分量(图3)。可以看出3个分量均有2个峰和1个波谷组成，其中2个峰分别代表管孔区域和生长轮、木射线区域，波谷代表轴向薄壁组织和木纤维区域。
按照颜色直方图得到初始聚类中心点。尖齿槭颜色值为(130.0, 144.0, 169.0)，(20.0, 22.0, 49.0)，(68.0, 78.4, 104.8)；红脉槭颜色值为(84.6, 89.2, 110.4)，(167.0, 184.0, 193.0)，(32.0, 28.0, 56.0)；赛波德槭颜色值为(181.0, 173.0, 207.0)，(64.0, 40.0, 110.0)，(113.0, 99.4, 154.9)。运用改进K-means聚类算法划分簇类(图4)。
为了增加管孔区域和背景区域两者的颜色梯度差异，对聚类粗分割结果进行色彩编码(图5)，第1类对轴向薄壁组织细胞壁和木射线区域进行红色编码，颜色值为(202, 12, 22)；第2类对管孔区域进行绿色编码，颜色值为(53, 106, 195)；第3类对生长轮以及木射线区域归进行蓝色编码，颜色值为(29, 209, 107)。
经过灰度转换、开闭运算等图像形态学处理后，消除了绝大部分的木射线、木纤维和轴向薄壁组织等面积较小的噪声。此外运用分水岭变换对已分类的木材微观图像进行目标分割，即管孔分割(图6)，将管孔快速准确地分割。从最终的分割结果来看，除了极个别的细小管孔未被检测到之外，其余管孔均被完整地分割，分割出的轮廓也与实际轮廓基本吻合。
2.2 验证结果
如图7所示：阈值分割算法每张木材横截面微观图像平均有88.1%的管孔被准确有效地分割出来；分水岭算法每张木材横截面微观图像平均有91.4%的管孔被准确有效地分割出来，但存在噪声误分的问题；K-means聚类与阈值分割算法先运用K-means聚类算法将木材图像分为3类，再采用阈值分割和canny算子做管孔精分割，结果每张木材横截面微观图像平均有96.3%的管孔被准确有效地分割出来，但部分木射线和轴向薄壁组织也被分割出来，且存在轮廓不饱满的问题；本研究算法为改进K-means聚类与分水岭算法，结果每张木材横截面微观图像平均有97.1%的管孔被准确有效地分割出来，分割出的管孔与实际管孔基本吻合。
为验证本研究算法分割管孔的准确性，对12类树种的横截面微观图像在各算法下的分割结果进行了比较(表1)，能够看出阈值分割不存在管孔误分，但因面积较小而漏分的管孔较多；分水岭算法不仅存在管孔漏分且会误分割出木射线、木纤维以及轴向薄壁组织；K-means聚类与阈值分割存在木射线和轴向薄壁组织的误分割；本研究算法基本不存在管孔的漏分和误分问题。
表 1 各算法分割效果对比Table 1 Comparison of segmentation effects of various algorithms算法 管孔
漏分木射线
误分轴向薄壁
组织误分木纤维
误分阈值分割 是 否 否 否 分水岭 是 是 是 是 K-means聚类与阈值分割 否 是 是 否 本研究算法 否 否 否 否 3. 结论
本研究改进的K-means聚类与分水岭的管孔分割算法，解决了初始中心点的随机性，并能有效地区分管孔区域与木纤维、木射线以及轴向薄壁组织等噪声区域，对管孔分割更为准确。本研究算法采用取图像颜色直方图对应的峰值确定初始聚类中心点和色彩编码的方式，充分将管孔与绝大部分噪声区域区分开，更适合于木材横截面微观图像分割任务。通过形态学处理和分水岭算法，对管孔进行精分割，将两者结合从而得到更为准确的分割结果。与其他分割算法相比，本研究算法分割效果显著提升，在大小不一且随机分布的管孔分割过程中鲁棒性高，有效避免了管孔漏分问题，具有良好的分割性能。
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图 1 光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光响应的影响
Figure 1 Effects of light intensity and nitrogen application on light response of S. obassia seedlings
表 1 不同光强与氮肥施加下玉铃花幼苗光合光响应特征参数的变化
Table 1. Changes of photosynthetic light response characteristic parameters of S. obassia seedlings under different light intensity and nitrogen application
处理 LSP/(μmol·m−2·s−1) LCP/(μmol·m−2·s−1) AQY/(mmol−1) Pmax/(μmol·m−2·s−1) Rd/(μmol·m−2·s−1) 光强 氮素 L1 N0 288.00±30.87 b 34.67±5.44 a 0.043±0.301 a 1.649±0.155 de 0.464±0.001 b N1 220.00±28.28 b 29.33±5.76 ab 0.046±0.111 a 1.924±0.225 cde 0.512±0.005 ab N2 140.00±1.89 b 24.00±2.83 ab 0.066±0.080 a 1.247±0.068 e 0.352±0.014 ab L2 N0 164.00±8.49 b 16.00±2.83 ab 0.054±0.305 a 3.246±0.102 b 0.346±0.001 ab N1 226.66±38.84 b 16.00±9.98 ab 0.060±0.056 a 2.276±0.090 cd 0.297±0.009 ab N2 324.00±33.04 ab 14.67±2.18 ab 0.067±0.089 a 2.127±0.217 cde 0.295±0.019 ab L3 N0 270.00±29.70 b 12.00±8.49 ab 0.065±0.080 a 2.733±0.525 bc 0.276±0.002 b N1 306.66±47.19 ab 8.00±3.77 b 0.075±0.110 a 1.943±0.166 cde 0.170±0.011 ab N2 481.33±86.52 a 6.00±1.41 b 0.080±0.421 a 4.121±0.248 a 0.132±0.061 a 说明：数据为平均值±标准误，小写字母表示同一指标在不同处理间差异显著(P＜0.05) 
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表 2 光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光合色素质量分数的影响
Table 2. Effects of light and nitrogen interaction on photosynthetic pgment contents in seedlings of S. obassia
处理 CChl a/(mg·g−1) CChl b/(mg·g−1) (CChl a+CChl b)/(mg·g−1) CCar/(mg·g−1) CChl a/CChl b 光强 氮素 L1 N0 1.621±0.050 d 0.711±0.024 f 2.332±0.074 f 0.253±0.008 a 2.284±0.019 a N1 1.929±0.033 b 2.399±0.115 d 4.327±0.082 d 0.176±0.017 b 0.822±0.054 c N2 2.080±0.016 a 1.691±0.098 e 3.770±0.085 e 0.257±0.029 a 1.269±0.085 b L2 N0 1.799±0.031 c 2.960±0.126 c 4.760±0.098 c 0.083±0.023 cd 0.619±0.037 d N1 1.640±0.014 d 3.598±0.049 b 5.239±0.038 b 0.123±0.017 bc 0.457±0.010 e N2 1.577±0.020 de 3.806±0.082 b 5.382±0.064 b 0.075±0.018 cd 0.417±0.015 e L3 N0 1.525±0.011 e 4.114±0.024 a 5.638±0.018 c 0.073±0.012 cd 0.371±0.005 e N1 1.530±0.014 e 4.134±0.025 a 5.664±0.016 c 0.070±0.018 cd 0.370±0.005 e N2 1.496±0.020 e 4.136±0.056 a 5.632±0.040 c 0.058±0.024 a 0.362±0.009 e 说明：数据为平均值±标准误，小写字母表示同一指标在不同处理间差异显著(P＜0.05)
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表 3 光强与氮肥施加对玉铃花幼苗光合色素质量分数影响的方差分析
Table 3. Anova analysis of the effects of light intensity and nitrogen application on photosynthetic pigment content of S. obassia seedlings
变异来源 因变量 平方和 自由度 均方 F P 光强 CChl a 0.722 2 0.361 102.841 0 CChl b 49.298 2 24.649 661.922 0 CCar 0.161 2 0.081 37.618 0 CChl a+CChl b 38.378 2 19.189 727.670 0 CChl a/CChl b 9.629 2 4.814 808.793 0 氮素 CChl a 0.080 2 0.040 11.322 0 CChl b 5.853 2 2.927 78.592 0 CCar 0.008 2 0.004 1.815 0.177 CChl a+CChl b 7.242 2 3.621 137.307 0 CChl a/CChl b 2.666 2 1.333 223.955 0 光强+氮素 CChl a 0.793 4 0.198 56.493 0 CChl b 4.565 4 1.141 30.645 0 CCar 0.032 4 0.008 3.775 0.012 CChl a+CChl b 7.301 4 1.825 69.216 0 CChl a/CChl b 3.859 4 0.965 162.081 0
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