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白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

裘杰珂 赖勇勇 许英蕾 朱斐

裘杰珂, 赖勇勇, 许英蕾, 朱斐. 白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
引用本文: 裘杰珂, 赖勇勇, 许英蕾, 朱斐. 白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
QIU Jieke, LAI Yongyong, XU Yinglei, ZHU Fei. Anti-WSSV effect of inactivated preparation of white spot syndrome virus (WSSV) on Procambarus clarkii[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
Citation: QIU Jieke, LAI Yongyong, XU Yinglei, ZHU Fei. Anti-WSSV effect of inactivated preparation of white spot syndrome virus (WSSV) on Procambarus clarkii[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459

白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
基金项目: 浙江省自然科学基金面上资助项目(LY20C190001)
详细信息
    作者简介: 裘杰珂(ORCID: 0000-0002-0613-4427),从事水产动物免疫研究。E-mail: 2472723249@qq.com
    通信作者: 朱斐(ORCID: 0000-0003-1711-1914),副研究员,博士,从事水产动物病害与免疫研究。E-mail: zhufei@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S945.4

Anti-WSSV effect of inactivated preparation of white spot syndrome virus (WSSV) on Procambarus clarkii

  • 摘要:   目的  研究经双乙烯亚胺(BEI)灭活的白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂保护克氏原螯虾Procambarus clarkii抗WSSV感染的效果,以期为白斑综合征的防治提供有效的免疫方法。  方法  应用BEI对WSSV和WSSV超声破碎液进行灭活,通过口服和注射分别对克氏原螯虾进行免疫,再对其进行抗WSSV感染的效果研究。  结果  WSSV在BEI处理24 h可以被完全灭活,通过口服途径用灭活制剂免疫克氏原螯虾7 d后攻毒,克氏原螯虾死亡率显著下降,且口服免疫的效果要好于注射免疫。  结论  经BEI灭活24 h的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾是安全的,口服免疫后可以显著降低克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的死亡率。图2表3参19
  • 图  1  BEI灭活WSSV破碎液免疫7 d后攻毒克氏原螯虾的存活率

    Figure  1  Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

    图  2  BEI灭活WSSV制剂免疫7 d后攻毒克氏原螯虾的存活率

    Figure  2  Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV immunization

    表  1  WSSV灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的实验分组

    Table  1.   Experimental groups of anti-WSSV effects of WSSV inactivated preparation on P. clarkii

    组别实验内容组别实验内容
    1 口服WSSV对照 6 注射BEI灭活WSSV破碎液12 h,免疫7 d后攻毒
    2 注射WSSV对照 7 口服BEI灭活WSSV破碎液24 h,免疫7 d后攻毒
    3 注射WSSV超声破碎液对照 8 口服BEI灭活WSSV破碎液1 h,免疫7 d后攻毒
    4 注射BEI灭活WSSV破碎液24 h,免疫7 d后攻毒 9 口服BEI灭活WSSV破碎液12 h,免疫7 d后攻毒
    5 注射BEI灭活WSSV破碎液1 h,免疫7 d后攻毒 10 磷酸盐缓冲溶液(PBS)阴性对照
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    表  2  BEI灭活WSSV感染克氏原螯虾的死亡率

    Table  2.   Mortality of P. clarkii infected with BEI-inactivated WSSV

    组别灭活时间/h死亡率/%
    注射BEI灭活WSSV破碎液1100.0
    1233.3
    240
    口服BEI灭活WSSV破碎液110.0
    120
    240
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    表  3  BEI灭活WSSV制剂免疫7 d后攻毒克氏原螯虾的死亡率

    Table  3.   Mortality rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

    组别灭活时间/h死亡率/%
    PBS 0 0
    注射WSSV 0 100
    口服WSSV 0 100
    口服BEI灭活WSSV破碎液 1 70
    口服BEI灭活WSSV破碎液 12 60
    注射BEI灭活WSSV破碎液 12 80
    注射BEI灭活WSSV(7 d后注射攻毒) 24 60
    口服BEI灭活WSSV(7 d后口服攻毒) 24 50
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-07-11
  • 修回日期:  2022-12-08
  • 网络出版日期:  2023-05-22
  • 刊出日期:  2023-05-20

白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
    基金项目:  浙江省自然科学基金面上资助项目(LY20C190001)
    作者简介:

    裘杰珂(ORCID: 0000-0002-0613-4427),从事水产动物免疫研究。E-mail: 2472723249@qq.com

    通信作者: 朱斐(ORCID: 0000-0003-1711-1914),副研究员,博士,从事水产动物病害与免疫研究。E-mail: zhufei@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S945.4

摘要:   目的  研究经双乙烯亚胺(BEI)灭活的白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂保护克氏原螯虾Procambarus clarkii抗WSSV感染的效果,以期为白斑综合征的防治提供有效的免疫方法。  方法  应用BEI对WSSV和WSSV超声破碎液进行灭活,通过口服和注射分别对克氏原螯虾进行免疫,再对其进行抗WSSV感染的效果研究。  结果  WSSV在BEI处理24 h可以被完全灭活,通过口服途径用灭活制剂免疫克氏原螯虾7 d后攻毒,克氏原螯虾死亡率显著下降,且口服免疫的效果要好于注射免疫。  结论  经BEI灭活24 h的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾是安全的,口服免疫后可以显著降低克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的死亡率。图2表3参19

English Abstract

裘杰珂, 赖勇勇, 许英蕾, 朱斐. 白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
引用本文: 裘杰珂, 赖勇勇, 许英蕾, 朱斐. 白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
QIU Jieke, LAI Yongyong, XU Yinglei, ZHU Fei. Anti-WSSV effect of inactivated preparation of white spot syndrome virus (WSSV) on Procambarus clarkii[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
Citation: QIU Jieke, LAI Yongyong, XU Yinglei, ZHU Fei. Anti-WSSV effect of inactivated preparation of white spot syndrome virus (WSSV) on Procambarus clarkii[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 680-684. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220459
  • 白斑综合征病毒(WSSV)是线头病毒科Nimaviridae白斑病毒属Whispovirus的唯一成员[1]。在电子显微镜下可以观察到WSSV的核衣壳呈棒状,核衣壳表面有3层膜交叉覆盖,并形成阴影,核衣壳的一端还有一个独特的尾状结构。WSSV的核衣壳由14个环组成,其中包含1个约300 kb的圆形dsDNA基因组[2],是迄今为止被完全测序的最大动物病毒之一[3]。在养殖条件下,感染WSSV的虾类可在3~10 d内死亡[4]。另外,WSSV还会感染其他甲壳类动物,其中就包括克氏原螯虾Procambarus clarkii[56]。WSSV危害大、传播快,已对中国虾类养殖业造成了数十亿美元的经济损失。然而常规的化学和物理方法并不能有效地控制WSSV对虾类的感染。因此,找到并采取合理的预防手段才是控制该病毒病的关键。有关物理和化学消毒方法对WSSV的灭活作用已有较多报道[710],已确定了温度、紫外线、pH、臭氧、盐度、干燥和化学消毒剂等因素对WSSV灭活的影响。有研究发现:大部分化学试剂对WSSV灭活后,WSSV的免疫原性会受到损害[7, 911],而双乙烯亚胺(BEI)对免疫原性的损害相对较小,因此BEI是对含有DNA或RNA基因组动物病毒的首选灭活剂[1214]。基于此,本研究从WSSV灭活制剂着手,用BEI灭活WSSV,通过口服和注射途径分别建立克氏原螯虾的主动免疫体系,再对其进行抗WSSV感染的效果研究,分析WSSV灭活制剂对WSSV的防治效果,为防治WSSV提供科学依据。

    • LAI等[15]研究可知:超声破碎WSSV后获得的蛋白质和核酸可以感染克氏原螯虾并导致其死亡,其有效性与完整的WSSV病毒一样。因此,本研究对病毒进行超声破碎,之后进行BEI灭活,观察BEI灭活制剂是否具有与超声破碎制剂相同的抗WSSV效果。本研究分为口服和注射免疫,免疫7 d后再进行WSSV攻毒感染。具体分组如表1所示。克氏原螯虾购于安徽宣城,养殖于充气水箱中,水温为25 ℃,每日投喂克氏原螯虾专用饲料。

      表 1  WSSV灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的实验分组

      Table 1.  Experimental groups of anti-WSSV effects of WSSV inactivated preparation on P. clarkii

      组别实验内容组别实验内容
      1 口服WSSV对照 6 注射BEI灭活WSSV破碎液12 h,免疫7 d后攻毒
      2 注射WSSV对照 7 口服BEI灭活WSSV破碎液24 h,免疫7 d后攻毒
      3 注射WSSV超声破碎液对照 8 口服BEI灭活WSSV破碎液1 h,免疫7 d后攻毒
      4 注射BEI灭活WSSV破碎液24 h,免疫7 d后攻毒 9 口服BEI灭活WSSV破碎液12 h,免疫7 d后攻毒
      5 注射BEI灭活WSSV破碎液1 h,免疫7 d后攻毒 10 磷酸盐缓冲溶液(PBS)阴性对照
    • 取经过WSSV感染的克氏原螯虾的尾部肌肉,参考ZHU等[16]的方法提纯WSSV。使用高速分散器将WSSV提纯液快速分散呈匀浆,用超高速冷冻离心机在6 000 g下离心10 min,分离上清液后再次离心,重复3次。离心完成后,肌肉组织已基本去除,WSSV病毒存在于上清液中。将上清液通过300目细胞筛过滤分散后,用离心机在6000 g下离心30 min。再将分离出的上清液通过450 nm的滤膜后,用离心机在30 000 g下离心30 min,最后得到WSSV病毒粒子的白色沉淀。将提取到的病毒粒子用10 mL 磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶解后,使用FS 200 T超声波均质机(上海盛溪)破碎溶解的病毒颗粒。破碎完成后,在30 000 g条件下对超声破碎的病毒粒子离心30 min,离心得到的上清液便是WSSV病毒粒子的破碎液,使用100 nm滤膜进行过滤,即为WSSV超声破碎液。

    • 将0.12 mol·L−1BEI溶液按1∶60的体积比加入到病毒液中,使BEI的最终分子浓度为2 mmol·L−1。在37 ℃下恒温灭活3个不同时间段(1、12、24 h)的病毒液,期间每2 h搅拌1次。经过规定时间后,剩余BEI以50∶1的体积比例加入质量分数2%的硫代硫酸钠使灭活中止,制成WSSV灭活制剂。每100 mL WSSV灭活制剂中含45 mg WSSV粒子,WSSV灭活制剂中WSSV的质量浓度为0.45 g·L−1

    • 克氏原螯虾养殖于(25±1) ℃控温玻璃缸中,随机分成10组,每组20只,每组设3个重复,投喂配合饲料暂养7 d。将WSSV超声破碎液与饲料混合均匀,混合5 min后用蜂胶液包被,风干10 min后投喂受试克氏原螯虾。将WSSV提纯液与克氏原螯虾饲料混合均匀,混合5 min后用蜂胶液包被,风干10 min后投喂受试克氏原螯虾。7 d后所有实验组进行攻毒研究,期间保证每组克氏原螯虾摄食等量的饲料,同时记录每日死亡率。

    • 表2可见:经BEI处理WSSV 24 h后,注射和口服免疫克氏原螯虾的死亡率为0,说明没有感染性;而BEI灭活WSSV破碎处理液1 h的注射死亡率为100.0%,口服死亡率为10.0%,BEI处理12 h的注射死亡率为33.3%,口服死亡率为0,说明口服免疫更安全,注射免疫危险性比较高,但是BEI处理时间过短也会使病毒没有完全灭活,因此BEI灭活24 h较为安全,后续实验均采用BEI灭活WSSV破碎液24 h的制剂。

      表 2  BEI灭活WSSV感染克氏原螯虾的死亡率

      Table 2.  Mortality of P. clarkii infected with BEI-inactivated WSSV

      组别灭活时间/h死亡率/%
      注射BEI灭活WSSV破碎液1100.0
      1233.3
      240
      口服BEI灭活WSSV破碎液110.0
      120
      240

      表3可见:WSSV无论是通过口服感染还是注射感染,死亡率均为100%。用BEI灭活WSSV破碎液1和12 h分别采用注射或口服免疫克氏原螯虾,虽然免疫过程中死亡了一些,但将活着的克氏原螯虾7 d后攻毒,口服的存活率为30%~40%,注射的效果较差,最后的存活率为20%(图1)。以上结果说明灭活时间延长后,不但灭活更完全,而且灭活制剂的保护效果更好,因此在后续的研究中采用了24 h的灭活时间。用BEI灭活WSSV破碎液24 h制成灭活制剂,采用注射或口服免疫克氏原螯虾7 d后分别注射、口服攻毒,结果发现WSSV灭活制剂的口服免疫效果明显,比起注射WSSV组和口服WSSV组的100%死亡率,注射免疫的克氏原螯虾在攻毒后存活率为40%,口服免疫的存活率为50%(图2);经灭活制剂免疫7 d后,再去感染WSSV,极大地降低了死亡率,免疫效果比较明显。

      表 3  BEI灭活WSSV制剂免疫7 d后攻毒克氏原螯虾的死亡率

      Table 3.  Mortality rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

      组别灭活时间/h死亡率/%
      PBS 0 0
      注射WSSV 0 100
      口服WSSV 0 100
      口服BEI灭活WSSV破碎液 1 70
      口服BEI灭活WSSV破碎液 12 60
      注射BEI灭活WSSV破碎液 12 80
      注射BEI灭活WSSV(7 d后注射攻毒) 24 60
      口服BEI灭活WSSV(7 d后口服攻毒) 24 50

      图  1  BEI灭活WSSV破碎液免疫7 d后攻毒克氏原螯虾的存活率

      Figure 1.  Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

      图  2  BEI灭活WSSV制剂免疫7 d后攻毒克氏原螯虾的存活率

      Figure 2.  Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV immunization

    • 已有研究表明:WSSV囊膜蛋白可以诱导甲壳动物对WSSV产生抵抗力,从而大幅提高WSSV攻毒后的成活率;多糖(如葡聚糖、壳聚糖、甲壳素)也被认为能提高甲壳动物的免疫力,并被广泛用于提高甲壳动物抗细菌性和病毒性疾病的研究[68]。由BEI灭活的WSSV灭活制剂,可以保护WSSV囊膜蛋白的完整性[16],使其免疫原性最大限度不受破坏。

      本研究表明:用BEI灭活的WSSV灭活制剂免疫接种克氏原螯虾7 d后,可在一定程度上保护克氏原螯虾免受WSSV的侵害。克氏原螯虾对WSSV非常敏感,通过口服和注射途径的克氏原螯虾死亡率都超过90%[17]。在本次研究中,随着灭活时间的延长,注射和口服2 mmol·L−1 BEI灭活WSSV制剂的克氏原螯虾存活率越来越高,说明只要灭活时间足够,使用BEI灭活的WSSV灭活制剂可以成功地保护克氏原螯虾免受WSSV的侵害。NAMIKOSHI等[11]使用甲醛灭活的WSSV也获得了类似的结果,受免疫保护的对虾Penaeus japonicus在WSSV攻毒实验中存活率显著升高。同样,紫外线灭活的WSSV对日本对虾Marsupenaeus japonicus也有一定的免疫保护效果[18]。这就引发了甲壳动物中是否存在免疫记忆的猜想[19],但要证实其中的免疫机制还有待更深入的研究。

      综上所述,BEI灭活的WSSV免疫克氏原螯虾的效果十分明显,并且口服免疫的保护效果优于注射免疫。与BEI的灭活纯病毒液24 h相比,BEI灭活的WSSV破碎液减少了灭活时间,但最终也是口服免疫的效果较好。用BEI灭活的WSSV灭活制剂饲喂克氏原螯虾后,可以有效地降低克氏原螯虾感染病毒的死亡率,说明用BEI灭活的WSSV灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV具有保护性效果,可成为抗白斑综合征的一种免疫策略。

    • 感谢浙江杭州康德权科技有限公司的经费支持。

参考文献 (19)

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