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香榧Torreya grandis‘Merrillii’为红豆杉科Taxaceae榧属Torreya植物，是榧树Torreya grandis中的变异类型经无性繁殖形成的品种[1−2]。香榧为常绿针叶乔木，主要生长在中国南方较为湿润的地区，包括浙江、江苏、安徽、福建等省份。香榧种仁是珍贵的干果，油脂含量高，尤其富含金松酸等多种功能性多不饱和脂肪酸，对预防心脑血管疾病、防治中风和老年痴呆方面具有显著疗效[3−4]。关于香榧油脂的研究主要包括油脂组成、提取方法和功能特性等方面[5−7]。近年来，香榧油脂的分子调控机制研究表明：油脂合成相关基因和一些关键转录因子对香榧油脂合成产生重要作用[8−9]。基于此，本研究对香榧种仁营养成分中的油脂及其合成调控机制进行了综述，以便为香榧油脂的深度开发和利用提供参考。
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香榧干果口感香脆、经济价值高，这主要得益于其高含油率及丰富的功能性不饱和脂肪酸。香榧种仁含油率为42.67%~61.47%[2]。香榧种仁含有饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中以不饱和脂肪酸为主，主要为亚油酸、油酸和金松酸；饱和脂肪酸以山嵛酸和棕榈酸为主[4]。陈振德等[5]研究发现：榧属种子脂肪酸组成在种间无明显差异，榧属种仁不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸含量的比例为76.1%~82.0%。将香榧与大豆Glycine max、花生Arachis hypogaea的油样进行比较，其脂肪酸成分如表1所示[6]。香榧种实中的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生一烯酸的含量与大豆、花生中的同类脂肪酸含量接近；香榧中亚麻酸、花生酸、木焦油酸含量略低于大豆、花生中的同类脂肪酸含量；而香榧中的山嵛酸和金松酸含量远高于大豆和花生中的含量；香榧总脂肪酸含量也略高于大豆和花生。同时，香榧油的折光率和皂化值与大豆油和花生油相近，碘价比花生油高。这说明香榧的脂肪酸营养价值高，是一种优质的植物油资源。
表 1 香榧、大豆、花生中脂肪酸成分和理化性质对比
Table 1. Comparative analysis of fatty acids from T. grandis‘Merrillii’, G. max and A. hypogaea
物种 脂肪酸含量/% 棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸 亚麻酸 花生酸 花生一烯酸 金松酸 香榧 7.45~10.24 3.24~3.45 26.00~35.52 39.60~41.90 0.33~0.65 0.18~0.39 0.66~0.94 9.13~12.96 大豆 10.20~12.15 3.24~4.15 17.29~46.84 33.43~57.80 3.86~8.76 0.26~0.38 0.18~0.30 0 花生 5.26~13.76 1.73~6.49 36.97~82.20 25.18~44.60 0.05~0.58 0.90~2.61 0.63~2.45 0 香榧种实的油脂及其组成在不同发育阶段会发生变化。田荆祥等[10]研究发现：香榧种子在不同发育时期含油率有极显著差异，呈先逐渐增加后逐渐下降的趋势；香榧种实中不饱和脂肪酸总量随着种实成熟度提高而逐渐增加。王玫鹃等[11]探究了香榧种仁生长后期油脂、脂肪酸组分及典型脂溶性活性物质的变化趋势，发现香榧种实生长发育后期油脂含量由35.65%增长到54.50%，是油脂积累的关键时期。叶珊等[12]对香榧成熟后期的营养成分、脂肪酸组分变化进行研究，发现香榧裂果较青果含油率高5.6%。
香榧不同种源的油脂含量不同。朱海东等[13]对浙江诸暨、嵊州、磐安和安徽黄山等不同产地的香榧油的理化性质、脂肪酸、生育酚组成、多酚含量进行分析，发现各地区香榧脂肪酸组成几乎相同，但含量略有不同：以安徽黄山香榧油含量最高，为53.16%；浙江嵊州香榧亚油酸含量最高，达47.05%，浙江诸暨香榧油酸含量和单不饱和脂肪酸含量最高，分别为37.54%和38.03%。
香榧油脂含量高低与香榧生长环境密切相关。随着海拔高度的升高，香榧油脂含量变化并不显著，但香榧种实中的二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、油酸和硬脂酸含量随之升高。香榧林土壤有机质含量、细菌多样性、土壤酶活性与香榧出仁率、种子形状、油脂及蛋白质含量均呈正相关[14−15]。HU等[16]研究发现：光合作用对香榧生物量积累和油脂合成产生重要的作用。ZHANG等[17]研究表明：施加小麦Triticum aestivum秸秆生物质炭在酸性土壤中会提高香榧种实的品质和营养成分。
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陈振德等[3]研究发现：香榧种仁油脂可促进前列环素(prostacyclin，PGI2)合成，抑制血清血栓素(thromboxane，TXA2) 分泌，从而防治动脉粥样硬化。香榧种仁中的脂肪酸还可以降低血液中的三酰基甘油(triacylglycerol，TAG)水平。KHATTAB等[18]研究了日本榧Torreya nucifera的脂肪酸对大鼠Rattus norvegicus新陈代谢的作用，发现该脂肪酸可以有效降低大鼠肝脏及血清中的TAG水平，有利于促进大鼠的新陈代谢。香榧种仁油还具有抗氧化功能。CUI等[7]研究了香榧不同品种油脂的脂肪酸组成、抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性，发现野生型香榧种仁油有较强的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性。
金松酸(sciadonic acid，SA)是香榧油的特殊脂肪酸，属于二十碳三烯酸(eicosadienoic acid，C20H34O2)。金松酸主要存在于裸子植物的种子[19−21]、叶[22−23]、木材[24]等器官中，极少数存在于被子植物的种子中。牛丽影等[25]在香榧油中发现金松酸占总含量的8.65%。金松酸对大鼠的血脂具有显著的调节作用，能抑制肝脏中脂肪酸合成酶(FASN)的活性，从而抑制恶性肿瘤产生[26]。金松酸还可通过促进甘油三酯分解代谢来抑制甘油三酯的合成代谢，使得HepG2细胞内甘油三酯的积累减少[27]。
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油脂酸败是不饱和脂肪酸在储藏过程中，受环境、光照、氧气、水分、金属离子等因素的影响，被氧化成低分子脂肪酸的过程[28]。香榧种仁含有丰富的不饱和脂肪酸，在加工和储藏过程中极易发生氧化酸败，引起香榧种实品质下降。油脂过氧化值和油脂酸价是目前衡量香榧氧化酸败和品质优劣的重要指标[29]。
叶珊等[12]研究了不同成熟度和堆沤方式对香榧种仁品质的影响，发现在香榧假种皮开裂时采摘可明显提高种仁的可溶性蛋白含量和含油率，增加香榧种仁中的不饱和脂肪酸，有助于香榧炒制过程中的脱衣，从而提高香榧产品品质；对裂果采摘的种子进行1次堆沤，与传统2次堆沤相比，既能在时间上加快香榧后熟进程，又能达到一样的效果，保证香榧产品的优良品质。ZHOU等[30]研究发现：低温会通过增加去饱和酶(FAD2)生物合成和减少脂质过氧化来提高不饱和脂肪酸含量，从而提高香榧采后成熟期的出油率。ZHANG等[31]探究了温度和相对湿度对采后香榧油脂的交互影响，发现高湿度处理会导致香榧后熟过程提前；将温度设定在20 ℃，相对湿度为90%，可以延缓脂质氧化，提高油脂品质。
葛林梅等[28]研究发现：在香榧加工过程中，酸价和过氧化值均表现为不同程度的增加，香榧油脂发生水解氧化酸败。在氧化酸败的同时，香榧油脂组织中也存在例如多肽、酚等抗氧化物质，以抵御外界环境因素的影响。杨蕾等[32]对香榧种仁进行不同的加工方式，比较分析了香榧的香气物质和油脂品质，发现烘烤工艺更有利于保留香榧的特征香气，炒制香榧的酸败程度显著高于烘烤香榧，酸价高达0.767 mg·kg−1。罗凡等[33]研究了榨前处理对香榧油脂品质的影响，发现随热风处理时间的延长，香榧油的酸价呈先下降后略上升的趋势，拐点约在热风处理90 min时，但长时间高功率微波加热可能加速香榧油酸败，热风和微波处理均提高了香榧油的氧化诱导时间，在经过120和150 ℃热风的高强度加热后，氧化诱导时间均呈现2次上升，再次上升可能是因为产生了美拉德反应。
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目前，香榧种仁油脂的提取方法主要有：水蒸气蒸馏法、有机溶剂提取法和超临界二氧化碳萃取法。水蒸气蒸馏法是指通过外部加热物料和水的混合物，利用精油不溶于水且沸点较低的特点，使水蒸气将精油带出，由冷凝管冷凝后收集[34]。该方法操作简便，但蒸馏过程中水或高温可能会破坏油脂成分。有机溶剂提取法是指通过有机溶剂的多次提取制备油脂，存在溶剂回收困难、有机溶剂残留的问题[35]。近年来一般采用超临界二氧化碳萃取法，通过对脂质的特殊溶解作用进行油脂制备，该方法具有操作简便、无溶剂残留等特点[36]。梁玉清等[37]用超临界二氧化碳萃取法和水蒸气蒸馏法提取香榧外种皮化学成分，发现超临界二氧化碳萃取法提取率为17.5%，产物为黄色膏状物；水蒸气蒸馏法提取率为7.7%，产物呈微黄色透明清澈油状。可见，超临界二氧化碳萃取法得率更高，成分比较全面，更适合萃取香榧外种皮。香榧种仁中油脂的研究内容及提取方法如表2所示。
表 2 香榧种仁中的油脂研究内容及提取方法
Table 2. Recent publications on the extraction and analysis of oils from T. grandis ‘Merrillii’ kernels
研究内容 提取及分析方法 研究结果 文献来源 香榧种仁油脂分析 浸提法；气相色谱分析 香榧种仁含油量为54.39%，存放1 d后含油量略降 余象煜等[38] 国产榧属种仁油含量及脂肪酸测定 索氏抽提；气相色谱分析 种仁油脂含量42.67%~54.39%，脂肪酸组成以亚麻酸和油酸为主 陈振德等[5] 香榧种仁油脂肪酸和不皂化物组成分析 索氏抽提；气相色谱分析 香榧种仁油主要脂肪酸组成及含量，确定金松酸含量，并指出不皂化物组成 牛丽影等[25] 香榧种仁油脂理化性质及脂肪酸组成 浸提法；气相色谱-质谱分析 香榧油含量、酸值碘价等理化性质以及12种脂肪酸组成中主要脂肪酸含量 李红等[4] 香榧种仁油萃取及脂肪酸组成比较分析 超临界CO2流体萃取；气相色谱-质谱分析 萃取最佳工艺为：压力30 MPa、温度50 ℃、时间2 h，萃取率达16.2%；香榧种仁油主要含10 种脂肪酸 阙斐等[39] 香榧种仁超临界萃取物分析 超临界CO2流体萃取；气相色谱-质谱分析 超临界萃取脂肪油含量为16.21%，气相色谱-质谱分析确定脂肪酸主要组成 赵粼等[40] -
DING等[8]对10个不同的地方品种的香榧进行转录组测序，鉴定出175个与香榧油脂生物合成相关的基因，并提出了香榧油脂生物合成的代谢途径，如图1所示。在香榧基因组中，LOU等[9]比较分析了金松酸的合成途径及其关键合成酶。亚油酸和亚麻酸在C18Δ9-脂肪酸伸长酶(C18Δ9-elongase) 的作用下生成二十碳二烯酸和二十碳三烯酸；之后，二十碳二烯酸在C20Δ5-脂肪酸去饱和酶(C20Δ5-desaturase)的作用下生成金松酸。
图 1 香榧脂肪酸合成通路
Figure 1. Fatty acid biosynthetic pathway in T. grandis ‘Merrillii’
DING等[8]研究发现：香榧PDH同源基因的BRD_TGR20275和TR56397-c0_g1_i1分别与油酸和二十碳二烯酸显著负相关，表明PDH可能会减少香榧的油脂积累。ACCase是油脂合成途径的初始步骤和限速步骤，目前，小麦、玉米Zea mays、拟南芥Arabidopsis thaliana等作物的ACCase已被鉴定[41]。DING等[8]对不同地方品种的香榧种实进行比较转录组分析，发现ACCase的BC基因和BCCP基因参与脂质生物合成。
GPAT是肯尼迪途径第1个反应的关键酶。郝静芳[42]发现GPAT7和GPAT9参与拟南芥种子中TAG的合成及一些不饱和脂肪酸的合成和调节。刘聪等[43]研究发现：甘蓝型油菜 Brassica napus的GPAT6可以改变拟南芥种子脂肪酸成分的比例。皮广静等[44]在研究花生油脂合成酰基转移酶基因表达与籽仁含油量相关性分析时发现：GPAT9在油脂积累的3个关键期(R4、R5、R6)的平均表达量与含油量显著正相关。香榧中也有GPAT基因，但目前香榧GPAT基因对油脂合成的调控作用以及它的生物学功能尚不清楚。
磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)和二酰甘油-O-酰基转移酶同源物(DGAT)是有助于拟南芥种子中TAG生物合成的2种主要酰基转移酶[45]。然而，这2种酶在TAG生物合成中的相对贡献尚不确定。DING等[8]研究发现：PDAT与香榧油脂含量的关系比DGAT更紧密，这表明PDAT对油积累的贡献大于DGAT。DGAT对于许多油籽的TAG生物合成也起到重要作用。JAKO等[46]在拟南芥中过表达AtDGAT，发现转基因拟南芥发育过程中的种子内DGAT表达比野生型提高了10%~70%，并且提高了种子含油量和种子的千粒重。DGAT2在TAG的组装中选择性的积累更多的不饱和脂肪酸。在紫苏Perilla frutescens和烟草Nicotiana tabacum中过表达DGAT2，可使不饱和脂肪酸含量升高，饱和脂肪酸含量下降[47]。
SAYANOVA等[48]研究发现：在转基因拟南芥植物中，C18Δ9-elongase与C20Δ5-desaturase的共表达导致水杨酸(SA)的产生。WU等[49]对圆榧T. grandis ‘Yuanfei’和细榧T. grandis‘Xifei’品种进行转录组测序，各找到2和1个C20Δ5-desaturase，1和2个C18Δ9-elongase；并将圆榧和细榧中的C18Δ9-elongase命名为TgELO1和TgELO2，发现与藻类中的OtELO1接近，并发现2个特征结构域(L-H-X-X-H和M-Y-X-Y-Y)。
在拟南芥中，Oleo1是种子油体蛋白最丰富的亚型，抑制其表达会导致脂质体变大[50]。CROWE等[51]研究发现：油体蛋白的表达在发育上受到反式激活剂ABI3的调节。PASARIBU等[52]研究表明：在大肠埃希菌Escherichia coli中过表达马尾松Pinus massoniana油体固醇蛋白，其形成的油滴比天然油体大，特别是对缺乏甾醇结合结构域的重组固醇蛋白。DING等[8]研究发现：在香榧发育过程中油体蛋白总体表达呈上升趋势；在烟草中过表达TgSLO1会导致油体尺寸变大和数量增加。
转录因子在调节脂质合成和积累方面发挥重要作用。转录因子WRI1在油脂积累方面作用显著。WRI1受到丙酮酸激酶(PKp-β1)、ACCase和KAS等下游基因的驱动[53−55]。LIU等[56]研究发现：在拟南芥中过表达WRI1基因可以增加拟南芥的种子质量和含油量。在香榧转录组中，TgWRI1与脂肪酸合成代谢通路关键酶的表达量呈负相关，但TgWRI1对油脂的调控作用有待进一步验证[8]。LBD基因家族在参与花青素和调节氮代谢方面起着重要作用，但在调节油脂合成的作用尚未报道[57]。LOU等[58]研究发现：TgLBD40可能通过调节赤霉素对油脂合成进行调控，通过在拟南芥中过表达TgLBD40，发现转基因种子含油量多于野生型。TgLBD40可以直接和TgDGAT1启动子结合，但需要与TgWRI1结合一起提高TgDGAT1的表达。
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香榧含有丰富的油脂、蛋白质、维生素等营养物质，有巨大的经济价值和开发潜力。随着香榧种植面积和产量的增加，香榧种仁营养物质的有关研究需尽快推进，以适应市场多样化需求。同时研究香榧种仁营养物质也为提高香榧剩余副产品的再回收利用作出贡献。对于香榧油脂的研究，从最初香榧的脂肪酸组成，到香榧油脂的提取方法，再到香榧的分子调控机制，标志着对香榧油脂认识一直不断深入和完善。分子生物学的进步和各种新方法的出现，为进一步提高香榧油脂的提取效率和研究香榧油脂形成过程的分子机制提供了良好的条件和平台。如何在香榧油脂萃取工艺上减少香榧油脂的消耗，更加全面地反映香榧脂肪酸组成的问题仍需解答，需要深入研究香榧油脂的提取方法。今后可以通过改变适当的酶解条件，使油脂的释放率和产率得到提高，从而寻找新的萃取溶剂、调整萃取比例等方式提高油脂的提取效率。研究油脂合成代谢途径上调控基因的表达，以及其与转录因子之间的复杂网络关系，解析香榧油脂的分子调控机制，为选育高油含量的香榧品种提供基础。未来，随着香榧遗传转化体系的不断完善，将香榧油脂调控关键酶与香榧遗传转化技术有机结合，实现高含油量香榧优良品种的繁育，这对开发和利用香榧种仁种质资源具有十分重要的意义。
Research progress on synthesis and regulation mechanism of Torreya grandis‘Merrillii’ kernel oil
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摘要: 香榧Torreya grandis‘Merrillii’是珍贵经济树种之一，具有极高的营养价值和药用价值。香榧种仁含有丰富的油脂、蛋白质、维生素等营养物质。香榧油脂的主要成分是脂肪酸及其衍生物，在降低血脂、抗氧化和预防心脑血管等方面起着重要作用。过去香榧油脂的相关研究集中在油脂组成、提取方法和功能特性等方面，随着林木分子生物学的发展，香榧油脂合成及其调控机制研究越来越多，主要包括香榧油脂合成代谢通路挖掘、油脂累积、特殊脂肪酸合成关键基因鉴定及调控网络构建等方面。本研究结合香榧油脂的相关研究，对香榧种仁的脂肪酸组成、油脂品质和油脂的提取方法、油脂合成调控机制等方面进行了综述，为后期开发利用香榧坚果资源提供方法和思路。图1表2参58Abstract: Torreya grandis‘Merrillii’is one of the precious economic tree species with high nutritional and medicinal value. T. grandis‘Merrillii’ kernels are rich in nutrients such as oil, protein, and vitamins. The main components on T. grandis‘Merrillii’ kernel oil are fatty acids and their derivatives, which play an important role in reducing blood lipids, antioxidant and preventing cardiovascular and cerebrovascular diseases. In the past, studies on T. grandis‘Merrillii’ kernel oil mainly focused on the composition, extraction methods and functional characteristics. With the development of forest molecular biology, more and more studies have been conducted on T. grandis‘Merrillii’ kernel oil synthesis and regulation mechanism, including the excavation of anabolic pathway for oil synthesis, identification of key genes for oil accumulation and special fatty acid synthesis, and construction of regulatory networks. This study is to review the current research status of T. grandis‘Merrillii’kernel oil, including studies on fatty acid composition, oil quality, oil extraction methods, and oil synthesis regulation mechanism of T. grandis‘Merrillii’ kernels, so as to provide ideas and methods for the later development and utilization of T. grandis‘Merrillii’ kernel resources. [Ch, 1 fig. 2 tab. 58 ref.]
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Key words:
- Torreya grandis‘Merrillii’ /
- kernel oil /
- synthetic pathway /
- molecular mechanism /
- review
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密码子承担着生物体内遗传信息传递的重要功能，是DNA转录与翻译、蛋白质合成与表达过程中的关键单元。在生物体共用的一套密码子中，终止密码子不编码氨基酸，甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)分别由1种密码子编码。其余59个密码子具有简并性，即1种氨基酸可由2~6个密码子对应编码，编码相同氨基酸的密码子即为同义密码子[1]。基因并非完全随机地使用同义密码子，而是存在一定的偏好性。特定的密码子偏好性是生物体长期适应性进化的结果，能够反映生物对环境的分子适应机制[2]。分析密码子偏好性及其影响因素，对生物遗传育种、进化基因组学以及系统发育学研究具有深远的意义。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco酶)是植物叶绿体基质中参与光合作用的关键酶，约占可溶性蛋白质总量的50%[3]。Rubisco酶具有催化1,5-二磷酸核酮糖(Ribulose-1,5-disphosphate, RuBP)与二氧化碳(CO2)羧化反应和光呼吸中RuBP与氧气(O2)加氧反应的双重活性，对净光合率有决定性影响[4]。Rubisco酶由8个大亚基(催化亚基)和8个小亚基(调节亚基)组成，前者是固定CO2的活性位点和催化位点，由叶绿体基因组大单拷贝区的rbcL基因编码[5-6]。环境的变化会导致rbcL基因产生适应性进化，从而影响植物光合效率[7]。因此，研究rbcL基因的密码子使用模式有利于理解高等植物对环境的适应机制。千屈菜科Lythraceae包括许多重要的园林植物，具有重要的观赏价值和经济价值[8]。目前，rbcL基因在千屈菜科中的研究应用仅局限于系统发育[9-10]，对于该科密码子使用偏好性的相关研究尚未见报道。本研究选取了千屈菜科具有代表性的10属20种植物，分析rbcL基因的碱基组成、密码子使用偏好性及其影响因素，并与模式物种进行比较，为该科物种rbcL基因异源高效表达提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 基因序列和密码子使用频率数据获取
20条rbcL基因全长编码区序列(CDS)数据来源于美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，详见表1。
表 1 20种千屈菜科植物rbcL基因信息Table 1 Information of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 GenBank登录号 CDS位置 物种 GenBank登录号 CDS位置 萼距花 Cuphea hyssopifolia MN833211 58955~60382 南洋紫薇 Lagerstroemia siamica MK881628 55129~56556 八宝树 Duabanga grandiflora MK881638 56823~58250 绒毛紫薇 Lagerstroemia tomentosa MK881632 54873~56300 黄薇 Heimia myrtifolia MG921615 58612~60039 西双紫薇 Lagerstroemia venusta MK881630 55159~56586 副萼紫薇 Lagerstroemia calyculata MK881636 54873~56300 散沫花 Lawsonia inermis MK881631 58836~60263 川黔紫薇 Lagerstroemia excelsa MK881635 54910~56337 千屈菜 Lythrum salicaria MK881629 59099~60526 屋久岛紫薇 Lagerstroemia fauriei NC_029808 54810~56237 石榴 Punica granatum NC_035240 59017~60444 多花紫薇 Lagerstroemia floribunda NC_031825 54776~56203 圆叶节节菜 Rotala rotundifolia MK881626 58835~60262 桂林紫薇 Lagerstroemia guilinensis NC_029885 54697~56124 细果野菱 Trapa maximowiczii NC_037023 58322~59770 云南紫薇 Lagerstroemia intermedia NC_034662 54948~56375 欧菱 Trapa natans MK881634 58387~59814 福建紫薇 Lagerstroemia limii MK881627 54830~56257 虾子花 Woodfordia fruticosa MK881637 59444~60871 1.2 CDS碱基组成和密码子使用偏好性参数统计
通过CodonW 1.4.4软件和在线工具EMBOSS explorer(http://emboss.toulouse.inra.fr./)中的CUSP和CHIPS程序，统计rbcL基因密码子末端各类型碱基含量(A3s、T3s、C3s和T3s)、GC总含量(GC)、密码子各位点GC含量(GC1s、GC2s和GC3s)、有效密码子数(ENC)和密码子适应指数(CAI)。利用SPSS 22.0软件，选用皮尔森相关系数评估碱基组成和密码子偏好性相关显著水平[11]。
1.3 同义密码子相对使用度统计与分析
同义密码子相对使用度(RSCU)是同义密码子的实际使用频次与无使用偏好性时期望频次的比率，去除了碱基成分对密码子使用产生的影响。RSCU＞1，表示该密码子在同义密码子中使用相对较多；RSCU=1，表示该密码子在同义密码子中使用无偏好性；RSCU＜1表示该密码子在同义密码子中使用相对较少[12]。通过CodonW 1.4.4软件计算千屈菜科植物的RSCU，并利用TBtools 0.6软件绘图。
1.4 ENC绘图分析
以GC3s和ENC为横、纵坐标，通过Origin 9.1绘制ENC-GC3s散点图。标准曲线为ENC期望值，即NENC=2+MGC3s+29/[MGC3s2+(1−MGC3s)2]，其中NENC表示有效密码子数，MGC3s表示密码子第3位碱基平均GC含量，该公式的成立表示密码子的偏好性仅受突变压力约束[13]，此条件下，散点应位于标准曲线上部或紧贴标准曲线下部；当散点分布于曲线下方较远距离的区域时，表明除突变压力作用外，选择压力对偏好性产生主要影响。
1.5 中性绘图分析
以GC3s为横坐标，密码子第1、2位点GC含量平均值(GC12)为纵坐标，利用Origin 9.1绘制散点图并做线性回归分析，分析密码子不同位点碱基组成差异性[14]。当回归曲线斜率趋近1时，密码子各位点碱基成分差异不大，偏好性主要受到突变的影响；当斜率趋近0时，密码子第3位点和第1、2位点碱基变异模式差异较大，偏好性主要受到选择压力影响。
1.6 奇偶偏差(PR2)分析
奇偶偏差分析可评估密码子第3位点嘌呤和嘧啶组成偏差对密码子使用偏好性的影响[15]。以G3s/(G3s+C3s)和A3s/(A3s+T3s)为横、纵坐标，利用Origin 9.1绘制奇偶偏差图，交点(0.50, 0.50)表示无碱基突变和选择压力下，A=T且G=C。
1.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
参照巫伟峰等[16]方法，以59个密码子(去除AUG、UGG和3个终止密码子UAA、UAG、UGA)的RSCU为变量，20条CDS为个体，通过SPSS进行系统聚类，类间距离为组内联接法，基因间距离为平方欧式距离。分别利用DAMBE 5.2.73和MEGA-X软件对CDS进行碱基替换饱和度检测和总体平均距离(d)计算，同时满足替换饱和度指数(Iss)小于饱和度标准指数(Iss.c)，即Iss＜Iss.c，表明碱基替换未饱和，且P=0.000和0＜d＜1后，通过MEGA-X软件邻接法(NJ)构建系统发生树，重复1 000次。
1.8 密码子使用频率比较分析
密码子相对使用频率比值是评估不同生物密码子使用偏好性差异程度的重要参数。当比值为0.5~2.0时，认为物种密码子偏好性差异较小[17]。拟南芥Arabidopsis thaliana、烟草Nicotiana tabacum、番茄Solanum lycopersicum、大肠埃希菌Escherichia coli和酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组密码子使用频率来源于密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。千屈菜科物种整体密码子平均使用频率通过EMBOSS explorer中CUSP计算获得[18]。利用Origin 9.1进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 rbcL基因碱基组成和密码子使用偏好性
从表2可见：GC含量为0.425~0.437，平均为0.431。结合密码子各位点GC含量(GC1s为0.567~0.582，平均0.573；GC2s为0.429~0.437，平均0.432；GC3s为0.275~0.300，平均0.288)，表明rbcL基因CDS在组成上更倾向于使用A/T碱基。第3位点各类型碱基含量从大到小依次为T3s、A3s、C3s、G3s，表明rbcL基因更偏向于使用A/T碱基结尾的密码子。
表 2 20种千屈菜科植物rbcL基因碱基组成和密码子使用特性Table 2 Base composition and codon usage characteristics of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 A3s T3s G3s C3s GC GC1s GC2s GC3s CAI ENC 萼距花 0.376 0.531 0.157 0.173 0.435 0.582 0.437 0.286 0.276 45.392 八宝树 0.380 0.526 0.152 0.180 0.431 0.571 0.433 0.288 0.278 45.942 黄薇 0.390 0.508 0.145 0.194 0.434 0.571 0.433 0.296 0.283 46.540 副萼紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 川黔紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 屋久岛紫薇 0.379 0.529 0.146 0.184 0.431 0.571 0.431 0.290 0.272 45.659 多花紫薇 0.378 0.526 0.148 0.184 0.432 0.576 0.429 0.292 0.276 45.625 桂林紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 云南紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 福建紫薇 0.379 0.531 0.142 0.184 0.430 0.571 0.431 0.288 0.274 45.564 南洋紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 绒毛紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 西双紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 散沫花 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 千屈菜 0.389 0.535 0.138 0.173 0.428 0.576 0.433 0.275 0.285 45.007 石榴 0.381 0.518 0.153 0.184 0.436 0.578 0.437 0.294 0.275 46.153 圆叶节节菜 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 细果野菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.425 0.567 0.431 0.277 0.274 44.181 欧菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.426 0.569 0.431 0.277 0.274 44.029 虾子花 0.376 0.516 0.163 0.184 0.437 0.576 0.435 0.300 0.270 46.458 ENC和CAI是衡量密码子使用偏好性程度的主要指标。ENC从20(氨基酸只由1种同义密码子编码)至61(同义密码子的使用没有偏好性)，越接近20偏好性越强。一般认为，ENC＜35表示密码子的使用偏好性较强[19]。20种千屈菜科植物ENC为44.029~46.540，平均45.493，分布范围较小且均远大于35，表明rbcL基因整体偏好性不强。CAI取值0~1，越接近1密码子偏好性越强[20]。20种植物CAI为0.270~0.285，平均0.276，同样说明偏好性强度不大。一般情况下，基因的密码子使用偏好性越强，在生物体内的表达水平越高[21]，可推测rbcL基因在千屈菜科植物中表达水平较低。
2.2 rbcL基因同义密码子相对使用度分析
图1显示：在25个高频密码子(RSCU＞1)中，23个以A/U结尾，仅2个由C(AUC和AGC)结尾。其中RSCU最高的5个密码子(RSCU＞2)末尾均为U碱基，表明rbcL基因CDS对于末端A/U(T)密码子具有的使用偏好性。
2.3 密码子碱基组成和使用偏好相关分析
相关分析(表3)表明：ENC和GC、GC3s在0.01水平上显著相关(Pearson相关系数分别为0.855和0.856)，表明碱基组成，尤其是密码子第3位点碱基类型对千屈菜科rbcL基因的密码子偏好性有明显影响。GC3s和GC12相关不显著，说明不同位点组成上关联不大，碱基变异模式存在差异，rbcL基因较保守，突变偏性较小。
表 3 碱基组成与密码子使用偏好相关性Table 3 Correlation between base composition and codon usage bias参数 CAI ENC GC GC1s GC2s GC3s ENC 0.062 GC − 0.136 0.855** GC1s 0.138 0.403 0.712** GC2s 0.029 0.229 0.348 0.314 GC3s − 0.264 0.856** 0.846** 0.324 − 0.074 GC12 0.112 0.403 0.684** 0.869** 0.743** 0.190 说明：**表示在0.01水平上显著相关(双尾) 2.4 ENC绘图分析
图2显示了rbcL基因ENC和GC3s的关系。所有散点分布在标准曲线下方一定距离处，表明千屈菜科植物rbcL基因的密码子偏好性除了受到碱基突变压力外，更主要受自然选择压力的约束；散点集中分布在较小范围内说明自然选择压力强度相近。
2.5 中性绘图分析
中性分析结果(图3)显示：所有散点均落在直线y=x(GC12)上方。GC3s与GC12的回归曲线(斜率为0.069 4，R2=0.036 1)近似平行于X轴，表明千屈菜科植物rbcL基因密码子第1、2位点与第3位点碱基类型相差较大。结合表3，GC3s与GC12相关性较低(Pearson相关系数为0.190)，说明碱基突变对于密码子第3位点的作用比第1、2位点弱，密码子偏好性主要受自然选择压力的作用，受突变压力的影响则较小。
2.6 奇偶偏差(PR2)分析
图4显示：当密码子偏好性只受碱基突变影响时，密码子第3位点上嘌呤和嘧啶含量应相同，即A3s=T3s或C3s=G3s[22]。所有散点均明显偏离交点(0.50, 0.50)，且都分布在左下象限[G3s/(G3s+C3s)＜0.5，A3s/(A3s+T3s)＜0.5]，密码子第3位点上嘧啶含量高于嘌呤[(A3s+G3s)＜(T3s+C3s)]。4种碱基在密码子第3位点上分布不均匀，说明相较于碱基突变压力，自然选择压力对rbcL密码子偏好性有更强的影响。
2.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
20条CDS碱基替换未饱和(Iss=0.025 3，Iss.c=0.785 2，P=0.000)，总体平均遗传距离为0.2。系统聚类树状图和邻接树均将20种千屈菜科植物聚成了4~5个支系(图5)，说明不同支系的植物密码子使用特性存在一定区别。虽然两者在部分支系的内部结构上存在较大矛盾，但在支系水平(属)上，两者对10个紫薇属Lagerstroemia植物、散沫花和圆叶节节菜以及2个菱属Trapa植物之间的聚类结果相对一致，说明基于密码子RSCU的系统聚类能在某种程度上反映千屈菜科植物属间水平的亲缘关系，即不同植物密码子的使用偏好性与亲缘关系存在局部对应。
图 5 基于rbcL基因CDS的邻接树(左)和基于59个密码子RSCU的聚类树状图(右)Figure 5 NJ tree based on CDS of rbcL genes (left) and cluster dendrogram based on RSCU of 59 codons (right)2.8 千屈菜科植物与模式物种密码子使用频率比较分析
从图6可以看出：与千屈菜科植物rbcL基因密码子平均使用频率相比，大肠埃希菌有28个密码子相差较大，最大值5.76(AGA)；酵母有26个密码子相差较大，最大值4.33(CGU)，说明酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因异源表达的受体。拟南芥、烟草和番茄分别存在20、19和17个使用频率相差较大的密码子，且最大值均出现在CGU，初步说明相较于拟南芥和烟草，番茄更适合作为千屈菜科植物rbcL基因遗传转化的受体。
图 6 千屈菜科植物与模式生物密码子使用频率比值Figure 6 Ratios of codon usage frequency of Lythraceae species to model organisms3. 结论与讨论
特定的密码子使用偏好性是生物对环境变化适应性的体现，不同物种、不同功能基因的密码子偏好性存在明显差异。大部分双子叶植物密码子偏好A/T碱基结尾，单子叶植物则偏好G/C结尾[23]，与本研究中千屈菜科植物rbcL基因密码子A3s+T3s远远大于G3s+C3s的偏好性结果一致。李国灵等[13]对红藻门Rhodophyta植物rbcL基因密码子偏好性研究也得到了类似结果，虽然红藻科和千屈菜科植物生活型、生理特性等相差较大，但千屈菜科也包括许多水生或湿生植物。两者研究结果显示：植物从水生向陆生过渡过程中，rbcL基因密码子使用偏好性的变化可能较为稳定，这也许是rbcL基因受到强烈自然选择作用的结果。生物体内高表达的基因，其密码子偏好性也相对较强，反之亦然[24]。千屈菜科植物rbcL基因ENC较高，CAI较低，说明千屈菜科植物rbcL基因整体的密码子使用偏好性不强，在植物体内表达水平也不高。但仍存在CGU、CCU、ACU等13个偏好性相对较强的密码子(RSCU＞1.5)，其在氨基酸中残基含量也相对丰富。
密码子使用偏好性的影响因素包括碱基组成、突变、自然选择、漂变、基因长度、tRNA丰度以及基因表达水平的高低等，但最主要的压力来自于突变和自然选择[25]。本研究中，千屈菜科植物rbcL基因GC3s和GC、ENC的相关性显著，表明密码子偏好性在一定程度上受到了碱基组成的影响，之前的研究也证明GC3s和GC含量之间存在明显的线性关系[26]。但GC3s与GC12相关程度较低，且GC3s集中分布在0.275~0.300内，KAWABE等[23]研究表明：密码子使用偏好性主要受自然选择的影响，而碱基突变的影响则较小，ENC分析、中性分析、奇偶偏差分析也得出相同的结论。这可能是由于rbcL基因本身为叶绿体基因，分子进化速率相较于核基因更慢，且编码的二磷酸核酮糖羧化酶是参与光合作用的关键蛋白，相对比较保守，所以突变压力对其密码子使用偏好性的作用相对较弱；而正选择、协同进化等作用在陆生植物的rbcL基因中被证明广泛存在，也表明rbcL基因密码子使用偏好性可能广泛受到选择约束[27-28]。
与RSCU聚类分析结果相比，基于CDS的邻接树在理论上更接近真实的物种系统发育关系。两者相对一致的部分说明千屈菜科植物rbcL基因密码子使用特性与属间亲缘关系存在一定程度的对应；两者之间较为矛盾的分支可能是系统聚类仅选取单一RSCU数据分析导致的，结合密码子偏好性的其他参数，或许能获得更加一致的结果。由于单基因建树也可能会受到旁系同源基因干扰、水平基因转移等多种因素影响产生误差[29]，因此基于密码子偏好性的聚类分析也可对系统发生的研究内容进行一定补充。
转基因过程中，选择密码子使用偏好性相近的物种作为异源表达受体，有利于外源基因的高效表达[30]。千屈菜科植物多数都是木本植物，遗传转化体系尚未成熟，由于受限于同源物种生活史长、生长速度慢等因素，其基因功能研究十分依赖模式物种。通过与模式物种密码子使用频率的初步比较，酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因的异源表达受体；与拟南芥、烟草相比，番茄的密码子使用频率与千屈菜科植物rbcL基因差异性最小，更适合作为rbcL基因功能验证的理想受体材料。但相对于番茄，拟南芥和烟草遗传转化体系建立相对较早，发展较为完善，已实现了多种木本植物叶绿体基因的遗传转化，积累的技术经验较多，遗传转化的难度也相对较小[31]。在观赏植物研究中，番茄更多作为植物呈色相关基因的遗传转化受体，验证其在色素积累与代谢中的调控作用[32]。因此，密码子使用频率的比较结果仅能为千屈菜科植物rbcL基因异源表达受体选择提供初步的预测，受限于该科木本植物当前采样难度较大，且遗传转化体系尚未成熟建立等因素，最适的异源表达受体仍须在进一步的实验中进行深入研究和严格筛选。
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表 1 香榧、大豆、花生中脂肪酸成分和理化性质对比
Table 1. Comparative analysis of fatty acids from T. grandis‘Merrillii’, G. max and A. hypogaea
物种 脂肪酸含量/% 棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸 亚麻酸 花生酸 花生一烯酸 金松酸 香榧 7.45~10.24 3.24~3.45 26.00~35.52 39.60~41.90 0.33~0.65 0.18~0.39 0.66~0.94 9.13~12.96 大豆 10.20~12.15 3.24~4.15 17.29~46.84 33.43~57.80 3.86~8.76 0.26~0.38 0.18~0.30 0 花生 5.26~13.76 1.73~6.49 36.97~82.20 25.18~44.60 0.05~0.58 0.90~2.61 0.63~2.45 0 
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表 2 香榧种仁中的油脂研究内容及提取方法
Table 2. Recent publications on the extraction and analysis of oils from T. grandis ‘Merrillii’ kernels
研究内容 提取及分析方法 研究结果 文献来源 香榧种仁油脂分析 浸提法；气相色谱分析 香榧种仁含油量为54.39%，存放1 d后含油量略降 余象煜等[38] 国产榧属种仁油含量及脂肪酸测定 索氏抽提；气相色谱分析 种仁油脂含量42.67%~54.39%，脂肪酸组成以亚麻酸和油酸为主 陈振德等[5] 香榧种仁油脂肪酸和不皂化物组成分析 索氏抽提；气相色谱分析 香榧种仁油主要脂肪酸组成及含量，确定金松酸含量，并指出不皂化物组成 牛丽影等[25] 香榧种仁油脂理化性质及脂肪酸组成 浸提法；气相色谱-质谱分析 香榧油含量、酸值碘价等理化性质以及12种脂肪酸组成中主要脂肪酸含量 李红等[4] 香榧种仁油萃取及脂肪酸组成比较分析 超临界CO2流体萃取；气相色谱-质谱分析 萃取最佳工艺为：压力30 MPa、温度50 ℃、时间2 h，萃取率达16.2%；香榧种仁油主要含10 种脂肪酸 阙斐等[39] 香榧种仁超临界萃取物分析 超临界CO2流体萃取；气相色谱-质谱分析 超临界萃取脂肪油含量为16.21%，气相色谱-质谱分析确定脂肪酸主要组成 赵粼等[40]
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