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MYB蛋白质家族成员数量庞大，功能多样，存在于绝大多数真核生物中。大多数MYB蛋白作为转录因子发挥作用，MYB结合域有结合DNA的能力[1−2]，在植物生长发育、次生代谢及抗逆胁迫等方面具有重要作用[3]。R2R3-MYB作为家族中成员最多的一类，对植物生长发育意义重大[4−7]。
MYB基因家族根据MYB结构域的数量和类型分为4类：1R-MYB (或MYB相关)、2R-MYB (R2R3-MYB)、3R-MYB (R1R2R3-MYB)和4R-MYB[8]。2R-MYB类是植物特有的，并且是最大的亚家族，已在许多植物中进行了全基因组注释。R2R3-MYB家族成员数量各不相同，拟南芥Arabidopsis thaliana[9]有126个，水稻Oryza sativa[10]有102个，葡萄Vitis vinifera[11]有108个，甜橙Citrus sinensis[12]有100个，苹果Malus domestica[13]有222个，毛果杨Populus trichocarpa[14]有192个，玉米Zea mays[15]有200多个。LI等[16]在黄瓜Cucumis sativus中仅鉴定出55个R2R3-MYB基因，而黄瓜基因组V2版本中鉴定出69个R2R3-MYB基因[17]。通过最新版黄瓜基因组数据库可知：黄瓜基因组V3版本基因组数量为24 317个，较V2版本(23 248个)增多。鉴于此，本研究对黄瓜基因组数据库V3版本中的R2R3-MYB亚家族进行鉴定，分析黄瓜CsMYB基因家族成员，为研究黄瓜CsMYB家族功能提供参考。
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全基因组序列来源于黄瓜基因组数据库(
http://www.cucurbitgenomics.org/organism/20 )。序列中的MYB结合域(PF00249)使用PFam数据库(http://pfam.xfam.org/ )的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件进行识别和确认，该配置文件用作对先前注释的黄瓜MYB序列的查询，通过HMMER SEARCH进一步识别并使用默认参数手动筛选(目标序列的期望值E≤1.2×10−8)[17]。应用HMMER SEARCH建立黄瓜MYB (CsMYB)基因家族特异性模型[18]，使用黄瓜MYB特异性HMM选择E低于0.001的所有黄瓜MYB蛋白。CsMYB家族的候选基因根据黄瓜特异性MYB HMM确定。以上最初获得的所有候选CsMYB基因均通过保守域数据库(conserved domain database，CDD)[19]和简单模块化架构研究工具(simplemodular architecture research tool，SMART)使用默认参数E≤0.010[20]。根据MYB序列内的特征性保守结构域，分离黄瓜R2R3-MYB基因。 -
通过ClustalW对模式植物拟南芥、木本植物杨梅Morella rubra[21]和草本植物黄瓜[1]的R2R3-MYB序列进行比对，采用MEGA-11软件的邻接法(neighbor-joining，NJ)，设置自展法系数(bootstrap)为1 000次，其余参数按系统默认构建进化树[22]。
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通过筛选结果得到的黄瓜R2R3-MYB基因的序列信息，利用TBtools将其定位于染色体上。采用ExPASy-ProtParam (
https://www.expasy.org/resources/protparam )在线预测黄瓜R2R3-MYB蛋白的氨基酸数量、分子量、理论等电点、不稳定指数及脂肪系数；使用Plant-mPLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )预测亚细胞定位。 -
利用TBtools中的Gene Location Visualize功能绘制黄瓜R2R3-MYB家族成员的染色体定位图，并通过MCscanX将黄瓜R2R3-MYB亚家族成员基因与拟南芥同源基因进行共线性分析。
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利用TBtools对黄瓜R2R3-MYB亚家族成员的基因结构进行可视化分析，并对其蛋白的保守基序进行分析，限值为15，绘制结果图。
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利用TBtools提取黄瓜R2R3-MYB亚家族成员上游1 500 bp的序列，通过PlantCARE 数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )获得启动子顺式作用元件，利用Excel筛选结果，再利用TBtools对其最终结果进行可视化。 -
通过网站STRING (
https://www.string-db.org/ )对黄瓜R2R3-MYB蛋白成员之间进行互作预测分析，研究黄瓜R2R3-MYB蛋白成员之间的作用关系。 -
将黄瓜基因组数据与拟南芥进行比对，根据HMM模型进行搜索，取其交集，筛选鉴定其具有特殊结构域的序列，最终获得黄瓜99个R2R3-MYB基因家族成员。参照DUBOS等[23]的分类方法，将鉴定出的成员进一步分为30个亚组。为了探索系统发育关系，通过ClustalW进行序列比对，使用黄瓜99个CsMYB蛋白、拟南芥125个AtMYB蛋白和杨梅122个MrMYB蛋白构建了系统发育树(图1)。按照染色体定位结果，分别命名为Cs2RMYB1~Cs2RMYB99 (表1)。根据蛋白质序列的相似性和聚类结果的高自举性，将CsMYB进一步分为30个进化枝(指定为C1~C30)，黄瓜R2R3-MYB基因家族成员被分成30个亚组。其中，C16、C20和C23亚组的家族成员数量最多，有21个成员；C18亚组成员数为16个；C14、C24和C27亚组家族成员数均为15个；C10和C28亚组家族成员数量等同，为4个；C9亚组成员数最少，仅3个。黄瓜R2R3-MYB亚家族的进化树聚类方式与拟南芥有一定的相似性。
图 1 黄瓜与拟南芥、杨梅R2R3-MYB亚家族成员的系统进化树构建
Figure 1. Phylogenetic tree construction of C. sativus, A. thaliana and M. rubra R2R3-MYB subfamily members
表 1 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员信息
Table 1. Cucumber R2R3-MYB subfamily member information
基因命名 氨基酸
数量/个分子量/kDa 等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置基因命名 氨基酸
数量/个分子量/
kDa等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置Cs2RMYB1 360 40.91 6.44 52.41 57.17 Chr 1 Cs2RMYB51 268 30.01 8.59 54.65 64.40 Chr 3 Cs2RMYB2 471 54.88 5.91 42.84 66.43 Chr 1 Cs2RMYB52 217 25.13 7.21 55.75 65.21 Chr 3 Cs2RMYB3 367 41.94 5.83 59.22 75.50 Chr 1 Cs2RMYB53 195 22.67 8.37 72.59 73.54 Chr 3 Cs2RMYB4 331 37.60 9.02 65.15 61.90 Chr 1 Cs2RMYB54 355 39.21 6.25 54.46 82.96 Chr 3 Cs2RMYB5 277 31.19 5.90 78.88 66.21 Chr 1 Cs2RMYB55 305 34.19 6.19 45.79 74.52 Chr 3 Cs2RMYB6 232 26.59 8.83 57.26 66.51 Chr 1 Cs2RMYB56 253 28.52 9.10 49.09 65.53 Chr 3 Cs2RMYB7 326 36.76 6.42 53.91 67.94 Chr 1 Cs2RMYB57 313 35.05 4.97 68.24 75.97 Chr 4 Cs2RMYB8 288 32.50 6.31 71.30 64.03 Chr 1 Cs2RMYB58 314 36.06 6.10 62.98 58.06 Chr 4 Cs2RMYB9 377 42.09 6.46 50.23 66.71 Chr 1 Cs2RMYB59 322 35.68 6.14 54.46 67.55 Chr 4 Cs2RMYB10 337 37.92 5.74 45.24 71.19 Chr 1 Cs2RMYB60 377 40.50 5.41 39.90 73.24 Chr 4 Cs2RMYB11 299 33.99 9.17 58.17 61.64 Chr 1 Cs2RMYB61 353 39.81 6.22 60.28 59.92 Chr 4 Cs2RMYB12 372 42.33 6.12 54.32 67.63 Chr 1 Cs2RMYB62 229 25.19 9.29 58.90 61.70 Chr 4 Cs2RMYB13 277 32.11 5.83 63.46 79.96 Chr 1 Cs2RMYB63 263 29.14 8.34 61.14 67.15 Chr 4 Cs2RMYB14 337 38.24 8.66 52.38 59.08 Chr 1 Cs2RMYB64 280 31.51 8.92 59.53 72.11 Chr 4 Cs2RMYB15 370 41.15 6.13 51.97 61.95 Chr 1 Cs2RMYB65 260 28.84 5.00 38.86 76.54 Chr 5 Cs2RMYB16 364 41.75 9.54 55.58 69.81 Chr 1 Cs2RMYB66 323 36.41 6.00 53.24 72.45 Chr 5 Cs2RMYB17 327 37.06 7.68 62.31 69.48 Chr 2 Cs2RMYB67 258 29.46 5.84 45.28 67.67 Chr 5 Cs2RMYB18 295 32.99 9.07 45.41 70.10 Chr 2 Cs2RMYB68 236 26.98 6.71 53.48 74.83 Chr 5 Cs2RMYB19 222 25.74 6.00 53.86 72.43 Chr 2 Cs2RMYB69 284 31.23 6.41 56.18 72.46 Chr 5 Cs2RMYB20 264 29.98 8.97 58.24 63.14 Chr 2 Cs2RMYB70 300 33.77 5.29 55.23 71.50 Chr 5 Cs2RMYB21 265 31.42 9.64 54.52 67.02 Chr 2 Cs2RMYB71 337 38.25 7.69 55.10 66.59 Chr 5 Cs2RMYB22 286 32.59 5.60 58.72 59.69 Chr 2 Cs2RMYB72 210 24.43 5.19 51.25 60.38 Chr 5 Cs2RMYB23 228 26.87 10.27 58.08 65.44 Chr 2 Cs2RMYB73 464 52.29 6.82 66.09 66.85 Chr 5 Cs2RMYB24 256 29.15 8.24 48.25 79.22 Chr 2 Cs2RMYB74 369 41.40 6.61 50.68 56.34 Chr 5 Cs2RMYB25 210 23.54 10.31 65.32 59.48 Chr 2 Cs2RMYB75 307 34.25 7.51 48.64 64.59 Chr 5 Cs2RMYB26 230 26.32 8.83 57.64 63.65 Chr 2 Cs2RMYB76 398 44.52 6.49 53.56 62.29 Chr 5 Cs2RMYB27 204 23.04 8.44 43.78 67.94 Chr 2 Cs2RMYB77 202 23.93 8.25 43.61 58.37 Chr 5 Cs2RMYB28 338 38.46 8.56 58.00 68.99 Chr 2 Cs2RMYB78 294 33.13 8.72 52.07 70.41 Chr 5 Cs2RMYB29 290 31.80 9.23 59.33 65.93 Chr 2 Cs2RMYB79 286 32.77 6.40 64.03 65.17 Chr 6 Cs2RMYB30 297 33.70 9.97 55.65 69.97 Chr 2 Cs2RMYB80 552 61.13 5.50 52.51 61.54 Chr 6 Cs2RMYB31 301 32.30 8.19 55.90 64.15 Chr 2 Cs2RMYB81 301 34.40 5.56 70.97 65.08 Chr 6 Cs2RMYB32 308 34.86 5.93 48.47 84.90 Chr 2 Cs2RMYB82 269 31.33 6.45 45.95 63.42 Chr 6 Cs2RMYB33 519 57.03 7.46 59.70 57.53 Chr 3 Cs2RMYB83 334 38.24 4.96 46.95 59.85 Chr 6 Cs2RMYB34 305 34.64 5.70 57.58 70.72 Chr 3 Cs2RMYB84 286 32.92 5.80 56.50 54.58 Chr 6 Cs2RMYB35 248 29.14 9.10 56.61 66.49 Chr 3 Cs2RMYB85 291 33.53 6.63 61.70 46.94 Chr 6 Cs2RMYB36 259 29.98 6.50 48.74 59.54 Chr 3 Cs2RMYB86 277 32.26 9.35 51.45 59.49 Chr 6 Cs2RMYB37 296 33.70 5.35 56.27 67.20 Chr 3 Cs2RMYB87 301 32.45 9.32 50.91 64.82 Chr 6 Cs2RMYB38 219 25.25 6.32 59.79 70.32 Chr 3 Cs2RMYB88 319 35.85 6.53 48.51 65.49 Chr 6 Cs2RMYB39 354 40.50 9.20 58.22 77.40 Chr 3 Cs2RMYB89 344 38.44 6.12 57.72 80.00 Chr 6 Cs2RMYB40 267 30.10 5.59 55.70 69.33 Chr 3 Cs2RMYB90 387 44.36 5.81 54.93 61.01 Chr 6 Cs2RMYB41 245 28.13 5.75 48.70 62.57 Chr 3 Cs2RMYB91 289 33.19 6.45 53.15 70.17 Chr 6 Cs2RMYB42 224 25.60 7.64 65.43 74.87 Chr 3 Cs2RMYB92 248 27.74 9.11 46.24 76.73 Chr 7 Cs2RMYB43 275 31.61 8.71 39.67 79.75 Chr 3 Cs2RMYB93 500 54.62 5.89 55.46 57.82 Chr 7 Cs2RMYB44 316 36.22 5.63 58.87 56.52 Chr 3 Cs2RMYB94 254 29.45 5.36 74.13 75.63 Chr 7 Cs2RMYB45 312 34.71 6.99 55.70 62.79 Chr 3 Cs2RMYB95 271 31.90 5.56 53.17 62.66 Chr 7 Cs2RMYB46 248 29.70 8.46 52.73 69.60 Chr 3 Cs2RMYB96 254 29.40 5.02 43.86 79.49 Chr 7 Cs2RMYB47 348 39.13 8.86 46.82 64.77 Chr 3 Cs2RMYB97 280 32.36 5.20 59.21 68.86 Chr 7 Cs2RMYB48 294 32.66 6.17 57.40 64.42 Chr 3 Cs2RMYB98 285 32.82 5.32 58.47 64.70 Chr 7 Cs2RMYB49 233 26.13 9.33 51.33 65.41 Chr 3 Cs2RMYB99 248 27.78 6.24 44.80 65.28 Scaffold 72 Cs2RMYB50 313 35.13 5.95 54.63 65.50 Chr 3 说明：Cs2RMYB48基因定位于叶绿体，其他基因定位于细胞核。 -
表1表明：黄瓜R2R3-MYB亚家族成员编码195~552个氨基酸，分子量为22.67~61.13 kDa，理论等电点为4.96~10.31，59个R2R3-MYB蛋白的等电点小于7，40个R2R3-MYB蛋白的等电点大于7，超过半数的蛋白为酸性。除Cs2RMYB43、Cs2RMYB60、Cs2RMYB65外，其余CsR2R3-MYB亚家族成员蛋白质不稳定指数为42.84~78.88，大于40.00，为不稳定蛋白。所有成员的脂肪系数相对较高，说明黄瓜R2R3-MYB亚家族成员适应环境的多样性。Plant-mPLoc 2.0网站预测结果显示：除Cs2RMYB48定位于叶绿体，其他成员均定位于细胞核。
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黄瓜R2R3-MYB亚家族成员映射于1~7号染色体上，Cs2RMYB99的染色体定位结果未知(图2)。每条染色体上的基因分布相对不均匀，1、4、5、7号染色体上基因大多分布在上下两端，而剩下的染色体上基因分布较为均匀。3号染色体上数量最多，可以定位到24个R2R3-MYB亚家族成员；1、2号染色体各有16个R2R3-MYB亚家族成员；5、6号染色体分别为14和13个R2R3-MYB亚家族成员；7号染色体上最少，为7个R2R3-MYB亚家族成员。此外，2号染色体上的Cs2RMYB27和Cs2RMYB28、3号染色体上的Cs2RMYB45和Cs2RMYB46、5号染色体上的Cs2RMYB71和Cs2RMYB72、7号染色体上的Cs2RMYB94和Cs2RMYB95均在各自染色体上形成基因簇。根据进化树分析可知：形成基因簇的成员之间同源性较高，推测成员间功能相对保守。
图 2 黄瓜R2R3-MYB亚家族染色体定位图
Figure 2. Chromosome location map of C. sativus R2R3-MYB subfamily
为揭示黄瓜R2R3-MYB亚家族成员在整个黄瓜基因组中的连锁关系，对黄瓜与拟南芥MYB基因进行共线性分析(图3)，结果表明：25对基因表现出共线性和保守的连锁关系，即表明2个物种之间MYB基因家族存在高同源性。
图 3 黄瓜R2R3-MYB亚家族与拟南芥共线性分析图
Figure 3. Analysis of the collinearity between C. sativus R2R3-MYB subfamily and A. thaliana
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利用TBtools对黄瓜R2R3-MYB亚家族进行保守基序分析(图4)。结果显示：在99个R2R3-MYB蛋白中鉴定出10个不同的基序，其中Motif 3、Motif 7、Motif 2和Motif 4是高度保守的基序，所有成员均含有Motif 3，导致成员间功能相似。表明这些黄瓜R2R3-MYB亚家族成员间拥有特有或相同的基序，导致了它们之间具有特定的或者相似的功能。
图 4 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白保守基序和基因结构
Figure 4. Protein conservative motifs and gene structure of R2R3-MYB subfamily in C. sativus
通过Jalview对黄瓜R2R3-MYB亚家族进行序列比对(图5)。结果显示：2R重复序列中有3个色氨酸残基(W)及3R重复序列中有3个色氨酸残基，形成疏水结构，此为鉴定MYB家族典型的结构域特征。除保守的W外，2R重复序列的末端还存在12个高度保守的氨基酸残基，如精氨酸(R)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、亮氨酸(L)等，3R重复序列中的谷氨酸(E)、G、丙氨酸(A)、R、苏氨酸(T)等。
图 5 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白序列比对图
Figure 5. Sequence comparison of C. sativus R2R3-MYB subfamily proteins
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为了进一步研究黄瓜R2R3-MYB亚家族成员启动子区的顺式作用元件，通过PlantCARE在线网站分析了该亚家族上游1 500 bp区域(图6)。其启动子元件多与激素、抗逆及厌氧诱导相关，大部分黄瓜R2R3-MYB亚家族成员含雌激素响应(ERE)作用元件。从元件类型来看，ERE元件最多，分布于绝大多数成员的启动子区域上。从单个元件的具体分布来看，约68%家族成员启动子区含ERE元件，约60%成员启动子区含脱落酸应答元件(ABRE)。从单个基因家族成员来看，Cs2RMYB92启动子只有TCA-element激素调控相关元件；Cs2RMYB98有MYB结合位点，并富含激素响应与厌氧诱导元件，例如ABRE、ERE、茉莉酸甲酯相关元件(CGTCA)和MYB结合位点元件(MBS)。Cs2RMYB5、Cs2RMYB7和Cs2RMYB8等基因上有ABRE元件，说明这些基因可能与脱落酸响应有关；Cs2RMYB2、Cs2RMYB6和Cs2RMYB9等基因上含ERE元件，说明这些基因可能响应乙烯的调控；Cs2RMYB1、Cs2RMYB16和Cs2RMYB25等基因上有CGTCA元件，说明这些基因可能与茉莉酸甲酯响应有关；Cs2RMYB12、Cs2RMYB25、Cs2RMYB33和Cs2RMYB34等基因启动子元件上都含MBS元件，说明这些基因可能响应干旱胁迫的调控。
图 6 黄瓜R2R3-MYB亚家族上游顺式元件预测
Figure 6. Prediction of upstream homeopathic elements of C. sativus R2R3-MYB subfamily
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为深入了解黄瓜R2R3-MYB亚家族成员蛋白的互作情况，对99个成员进行蛋白质互作预测(图7)，结果表明：Cs2RMYB25、Cs2RMYB3、Cs2RMYB84、Cs2RMYB98、Cs2RMYB6、Cs2RMYB6均与Cs2RMYB44存在互作关系；Cs2RMYB96、Cs2RMYB22、Cs2RMYB31、Cs2RMYB41、Cs2RMYB56、Cs2RMYB75、Cs2RMYB7、Cs2RMYB4、Cs2RMYB50均与Cs2RMYB90存在互作关系，且有较强的关联性。此外，部分成员间虽存在互作相关性，但各成员之间的具体机制并不明晰，仍需进一步深入研究。
图 7 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员蛋白的互作预测
Figure 7. Prediction of protein interactions among R2R3-MYB subfamily members in C. sativus
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本研究共鉴定出99个黄瓜R2R3-MYB亚家族成员，约占黄瓜总MYB数的60%，数量多于西瓜(89个)[4]，少于拟南芥(126个)[9]、水稻(102个)[10]和玉米(200个)[15]。黄瓜的基因组大小为224.8~251.1 Mb[24]，而拟南芥、水稻、玉米和西瓜的基因组大小分别为125.0、430.0、2 300.0和365.1 Mb[25−28]，R2R3-MYB亚家族成员数量与植物的基因组大小并没有直接的相关性。
作为MYB家族最大的亚家族，R2R3-MYB家族成员具有典型的模式结构，在植物发育、新陈代谢、信号转导及响应生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用[29]。为了研究黄瓜基因组进化过程中功能保守的R2R3-MYB基因功能，构建其系统进化树并进行分析，结果表明：黄瓜Cs2RMYB 30个亚组中大多数包含来自拟南芥和杨梅R2R3-MYB成员，然而，C28亚组仅拥有黄瓜和拟南芥R2R3-MYB成员，表明它们可能来自共同的祖先。同时，外显子和内含子的结构分析有利于研究基因家族内部的进化关系，通过分组可以初步推测其功能，聚类较近的基因存在功能相似性，如在C30亚组中，拟南芥AtMYB42和AtMYB85被证明参与木质素生物合成代谢调控[30]，黄瓜Cs2RMYB72和Cs2RMYB73与其表现出较近的亲缘关系，可能与木质素生物合成代谢有关；在C15亚组中，AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114过量表达会促进植物花青素的积累[31]，与黄瓜Cs2RMYB19同属于C15亚组；在C22亚组中，AtMYB93是其分支上唯一一个影响拟南芥侧根发育的负调控因子[32]，而黄瓜Cs2RMYB89与AtMYB93进化关系最近；宫思宇等[33]研究表明：AtMYB94通过调节拟南芥表皮的蜡质含量提高植株耐旱性，而C22亚组中的Cs2RMYB48是其同源基因，可能具有类似功能，同一分支亚家族转录因子可能存在功能相似性[23, 34]。
基序分析结果发现：所有的CsR2R3-MYB基因都有共同的保守基序，但也有独特的基序，这为CsR2R3-MYB亚家族成员的分类提供参考，且可能与CsR2R3-MYB基因的功能分化相关。此外，启动子序列上的顺式作用元件是转录因子识别并发挥转录调控作用的重要识别位点[35]。本研究发现：黄瓜CsR2R3-MYB亚家族成员启动子上的顺式作用元件种类繁多，绝大多数CsR2R3-MYB基因家族成员基因启动子区都含有ERE元件，暗示其可能参与黄瓜性别分化等生长发育过程；富含ABRE和CGTCA等激素响应顺式作用元件，表明CsR2R3-MYB基因家族在黄瓜应答逆境胁迫中发挥重要作用。由于CsR2R3-MYB基因调控元件的不同功能，启动子区域中这些高度多样化的顺式调控元件也可能反映了转录水平上的功能分歧[36]。本研究初步预测了MYB家族CsR2R3-MYB基因与植物生长发育及逆境胁迫响应相关，可为后续该亚家族成员基因功能深入研究提供参考。
Identification and bioinformatics analysis of R2R3-MYB subfamily in cucumber
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摘要:
目的 深入研究黄瓜Cucumis sativus R2R3-MYB亚家族成员的相关功能。 方法 利用生物信息学手段分析黄瓜全基因组，鉴定R2R3-MYB亚家族成员，对其系统进化关系、蛋白理化性质、染色体定位、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白质互作进行分析。 结果 黄瓜全基因组中含99个具有典型结构域的R2R3-MYB转录因子，蛋白序列含195~552个氨基酸，有保守基序及氨基酸位点；基因在染色体上分布不均匀；大部分亚家族成员蛋白质的不稳定指数大于40，属于不稳定蛋白。顺式作用调控元件分析发现：大部分基因启动子区所含元件与激素调节、MYB结合位点、胁迫密切相关。 结论 通过黄瓜全基因组鉴定，获得黄瓜基因组99个R2R3-MYB家族成员，分为30个亚组，映射于7条染色体上，该家族成员的上游启动子区含逆境相关作用元件。图7表1参36 Abstract:Objective This study is aimed to conduct an in-depth study of the functions associated with members of the R2R3-MYB subfamily in cucumber (Cucumis sativus). Method First, an analysis was conducted of the whole cucumber genome so as to identify R2R3-MYB subfamily members. Then, bioinformatics was employed to analyze their phylogenetic relationships, physicochemical properties of proteins, chromosomal localization, gene structure, conserved motifs, and cis-acting elements, as well as the protein interactions. Result The whole cucumber genome contained 99 R2R3-MYB transcription factors with typical structural domains, and the protein sequences contained amino acids ranging from 195 to 552, with conserved motifs and amino acid sites. They were unevenly distributed on chromosomes. They were unstable proteins with the instability index of most subfamily members being greater than 40. As was shown by the analysis of cis-acting regulatory elements, most of the elements contained in the promoter regions of genes were closely related to hormone regulation, MYB binding sites, and stress. Conclusion The R2R3-MYB family members were obtained through whole cucumber genome identification, which were divided into 30 subgroups and mapped on 7 chromosomes and the upstream promoter region of this family members contained stress-related action elements. [Ch, 7 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- Cucumis sativus /
- R2R3-MYB /
- transcription factor /
- whole genome identification
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黄河流域作为具有复杂内部结构的整体系统，兼有黄土高原、青藏高原等生态屏障的综合优势，发挥着水土保持、涵养水源等功能[1]。但黄土高原生态环境脆弱，水土流失严重[2]，是黄河流域需要解决的重要问题之一。晋西黄土区因其水土流失、植被恢复困难，成为了黄土高原水土保持与植被建设工程的重点区域。为恢复和改善生态环境、控制水土流失，晋西黄土区营造了大量以刺槐Robinia pseudoacacia、油松Pinus tabulaeformis纯林为主的人工林[3−4]，在改善林下灌草植物多样性方面发挥关键作用。但是由于造林密度或树种选择不合理，造成树木生长缓慢和林下植被匮乏等问题[5−6]，进而影响植被稳定以及林地灌草植物多样性。
林下灌草作为森林生态系统的重要组成部分，在提高生物多样性、改善立地环境、提升水土保持功能、维持森林生态系统功能稳定等方面发挥着至关重要的作用[7−8]。林分密度是林分结构的重要指标之一，影响着林内光照、湿度以及土壤等条件，进而对林下植物种类与多样性产生影响[9]。林分密度可操作性较强[10]，合理的林分密度对改善林下灌草植物多样性、提高林地水土保持功能具有重要作用，因此，已有较多关于林分密度对云杉Picea[11]、杉木Cunninghamia lanceolata [12]、马尾松Pinus massoniana[13]、油松[14]等人工纯林林下植物多样性影响方面的研究，并探寻合理的造林密度。当林分密度相同，林分类型不同，同样会对植物多样性产生影响。闫玮明等[15]对亚热带地区深山含笑Michelia maudiae、乐昌含笑M. chapensis、红锥Castanopsis hystrix等人工林和天然次生林植物多样性进行研究，得出科红锥与含笑人工林林下灌木Shannon-Wiener 指数低于天然次生林，其林下草本Shannon-Wiener 指数高于天然次生林的结论；宋霞等[16]对广东化州3种不同林龄人工林植物多样性的研究表明：营造人工混交林对提高林下植物多样性更加有利；赵耀等[17]、张桐等[18]在晋西黄土区对人工林、天然林的灌草植物多样性也进行了相关研究。然而以上研究是基于相同的密度条件，并未考虑各林分类型在不同林分密度条件下灌草植物多样性特点，缺乏关于晋西黄土区不同林分类型在不同密度下林下灌草组成和植物多样性的深入研究。本研究以晋西黄土区刺槐林人工林、油松林人工林、刺槐-油松人工混交林以及山杨Populus davidiana-栎类Quercus spp.天然次生林为研究对象，研究4种林分在低密度(800~1 200株·hm−2)、中密度(1 200~1 600株·hm−2)以及高密度(1 600~2 000株·hm−2)条件下灌草组成和植物多样性特征，以期为晋西黄土区植被建设和水土保持功能提升提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于山西省吉县蔡家川流域(36°14′27″~36°18′23″N，110°39′45″~110°47′45″E)，面积约40.15 km2，海拔为897~1 515 m。属于温带大陆性季风气候，该流域年均降水量约579.2 mm，且降水集中在6—9月，约占全年降水的80.6%。具有典型黄土残塬沟壑地貌，水土流失严重，主要土壤类型为褐土，黄土母质，呈弱碱性。该地区乔木以刺槐、油松、侧柏Platycladus orientalis等人工林和山杨-辽东栎Quercus wutaishansea等天然次生林为主。灌木以黄刺玫Rosa xanthine、杠柳Periploca sepium和丁香Syringa oblata等为主。草本主要有薹草Carex spp.、茜草Rubia cordifolia等。
1.2 样地选择与调查方法
于2020年7—8月在山西省吉县蔡家川流域进行全面的野外调查，以不同林分类型和林分密度为依据，选择具有典型性和代表性的刺槐人工林、油松人工林、刺槐-油松人工混交林、山杨-栎类天然次生林。4种林分均为22~25年生的中幼龄林，将每种林分划分为低密度(800~1 200株·hm−2)、中密度(1 200~1 600株·hm−2)、高密度(1 600~2 000株·hm−2)等3种密度，每种密度设置3块20 m × 20 m的样地，共计36块(表1)。每个样地四角及中心设置5个灌木样方(5 m × 5 m)和5个草本样方(1 m × 1 m)，调查每个样方内植物种类、株数、盖度等，将藤本植物及树高＜2 m的乔木幼苗记录在灌木层。
表 1 样地基本情况Table 1 Basic information of the sample plot林分类型 海拔/m 坡度/(°) 胸径/cm 树高/m 郁闭度 林分密度/(株·hm−2) 林分密度 样地1 样地2 样地3 刺槐人工林 1 210 24 9.85±2.68 7.79±1.86 0.38 975 1 000 1 125 低密度 1 150 25 9.98±3.45 7.49±2.34 0.56 1 500 1 550 1 600 中密度 1 150 30 8.15±3.93 7.67±2.86 0.35 1 775 1 850 2 000 高密度 油松人工林 1 130 29 13.04±2.91 6.96±0.85 0.57 900 950 1 050 低密度 1 140 37 13.82±2.38 8.25±0.75 0.62 1 500 1 550 1 550 中密度 1 120 14 10.11±3.63 8.93±2.08 0.43 1 750 1 800 1 875 高密度 刺槐-油松人工混交林 1 120 27 10.36±3.45 7.42±1.25 0.54 1 050 1 150 1 200 低密度 1 140 15 9.93±4.04 9.10±1.89 0.52 1 550 1 550 1 600 中密度 1 140 18 9.61±4.33 7.40±1.72 0.62 1 800 1 850 2 000 高密度 山杨-栎类天然次生林 1 040 20 11.24±4.12 9.46±2.42 0.38 950 1 050 1 150 低密度 1 070 22 10.20±3.77 9.68±2.37 0.41 1 550 1 600 1 600 中密度 1 060 24 10.42±3.14 9.64±2.34 0.68 1 825 1 875 1 950 高密度 说明：胸径和树高数值为平均值±标准误。 1.3 植物多样性分析方法
采用丰富度指数[Patrick丰富度指数(S′)]、多样性指数[Simpson指数(D)、Shannon-Wiener指数(H′)]以及均匀度指数[Pielou均匀度指数(JSW)]表征各林分类型林下灌草的植物多样性[19]。
1.4 数据处理与分析
采用Excel 2019统计数据，采用SPSS 25.0中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)对不同林分类型在不同密度条件下灌草植物多样性进行显著性检验(P＜0.05)，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)分析林分类型、林分密度及其交互作用下的林下灌草植物多样性特征。利用Origin 2021软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 不同林分类型和密度条件下林下灌草植物组成及优势种
经调查，4种林分中共有灌草植物87种，隶属36科69属，其中灌木层植物46种，隶属22科36属(图1A)，草本层植物41种，隶属17科33属(图1B)。从整体上看，山杨-栎类天然次生林中灌木层和草本层植物种数最多，油松人工林最少，且刺槐-油松人工混交林的灌木层植物种数处于较高水平，刺槐人工林草本层植物种数较刺槐-油松人工混交林丰富。不同林分类型林下灌草组成随密度变化呈现一定规律，均在中密度时植物种数最多。综合来看，4种林分灌草植物组成表现为山杨-栎类天然次生林和刺槐-油松人工混交林在中密度时较为丰富。
图 1 不同林分类型和林分密度下灌草植物种数Figure 1 Number of shrub and grass species under different stand types and densities4种林分灌木层主要优势种具有相似性，但也存在一定差别。由表2可知：在灌木层中，黄刺玫在3种人工林中均占较大优势，连翘Forsythia suspensa在山杨-栎类天然次生林中优势较大。可以看出：刺槐人工林在低密度时，杠柳Periploca sepium、沙棘Hippophae rhamnoides占有较大优势；在中密度时，山莓Rubus corchorifolius、杠柳优势较大；在高密度时，茅莓R. parvifolius、乌头叶蛇葡萄Ampelopsis aconitifolia比中密度林占有较大优势。油松人工林在低密度时，黄刺玫占有绝对优势，重要值达到71.87，且杠柳优势较大；在中密度时，沙棘Hippophae rhamnoides、杠柳占有较大优势，有暴马丁香Syringa reticulata var. amurensis零星分布；在高密度时，暴马丁香已占有较大优势。刺槐-油松人工混交林在低密度时，茅莓、杠柳的优势较大；在中密度时茅莓、山莓占有较大优势，此时乌头叶蛇葡萄稍占优势；高密度时，乌头叶蛇葡萄、茅莓成为主要优势种。山杨-栎类天然次生林在低密度时，榆叶梅Amygdalus triloba和黄栌Cotinus coggygria占有较大优势，有辽东栎零星分布；在中密度时，六道木Abelia biflora和鼠李Rhamnus davurica占有较大优势；在高密度时，出现了胡颓子Elaeagnus pungens等耐阴性植物。可见，不同林分类型在不同密度条件下灌木层植物呈现阳生—中生—阴生的变化规律。
表 2 主要灌草植物重要值Table 2 Important values of main shrub and grass plants林分类型 林分密度 植物种数/种 主要植物及重要值 灌木层 草本层 灌木层 草本层 刺槐人工林 低密度 9 15 黄刺玫(42.96)、杠柳(19.64)、沙棘(14.07)、 丁香(4.09) 铁杆蒿(19.88)、马唐(19.20)、风毛菊 (10.77)、益母草(0.39) 中密度 12 13 黄刺玫(34.89)、山莓(24.85)、杠柳(15.05)、 茅莓(9.45)、乌头叶蛇葡萄(4.33) 虉草(27.52)、沿阶草(13.88)、铁杆蒿 (12.34)、薹草(9.21) 高密度 7 7 黄刺玫(30.95)、茅莓(20.87)、乌头叶蛇葡 萄(16.20)、杠柳(13.97)、沙棘(7.04) 沿阶草(34.99)、虉草(30.03)、薹草 (14.43)、茜草(1.75) 油松人工林 低密度 6 7 黄刺玫(71.87)、杠柳(14.12)、沙棘(2.72) 败酱(33.78)、麻花头(29.94)、白莲蒿 (18.82)、薹草(6.68) 中密度 7 8 黄刺玫(39.83)、沙棘(15.36)、杠柳(14.37)、 暴马丁香(12.45) 败酱(34.49)、薹草(18.91)、白莲蒿 (14.23)、茜草(1.48) 高密度 3 5 暴马丁香(58.78)、黄刺玫(29.17)、沙棘 (12.05) 薹草(45.38)、败酱(31.33)、沿阶草(14.23)、 艾蒿(6.64) 刺槐-油松人工混交林 低密度 13 16 黄刺玫(34.54)、茅莓(18.96)、杠柳(17.93)、 乌头叶蛇葡萄(3.83)、丁香(0.44) 白莲蒿 (26.95)、风毛菊(14.34)、麻花头 (10.02)、黑麦草(9.91) 中密度 15 14 黄刺玫(33.10)、茅莓(17.03)、山莓(12.24)、 乌头叶蛇葡萄(11.24) 败酱(27.84)、马唐(19.40)、沿阶草(15.95)、 薹草(15.15) 高密度 11 8 乌头叶蛇葡萄(26.60)、黄刺玫(25.41)、茅 莓(13.39)、连翘(5.31)、酸枣(0.51) 败酱(35.95)、沿阶草(28.71)、薹草(14.30)、 铁杆蒿(4.00) 山杨-栎类天然次生林 低密度 19 13 连翘(30.90)、榆叶梅(14.95)、黄栌(13.09)、 辽东栎(1.70) 薹草(33.68)、天名精(15.13)、龙芽草 (14.25)、山罗花(7.86) 中密度 20 14 连翘(20.80)、六道木(10.16)、鼠李(9.57)、 乌头叶蛇葡萄(5.51) 薹草(39.47)、山罗花(15.20)、假地豆 (9.80)、泥胡菜(6.35) 高密度 12 11 连翘(38.12)、榆叶梅(17.06)、六道木(8.60)、 胡颓子(3.55) 薹草(30.91)、茜草(16.66)、蜻蜓兰(11.35)、 龙芽草(7.01)、川续断(2.12) 说明：括号中数值为重要值。灌木层酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa。草本层艾蒿Artemisia argyi，黑麦草Lolium perenne、泥胡菜Hemisteptia lyrata、益母草Leonurus japonicus。 4种林分草本层主要优势种具有一定规律并存在一定差异。由表2可知：在草本层中，刺槐人工林在低密度时，以铁杆蒿Artemisia gmelinii、马唐Digitaria sanguinalis和风毛菊Saussurea japonica为主；中密度时，铁杆蒿较低密度林的优势有所减小，虉草Phalaris arundinacea、沿阶草Ophiopogon bodinieri占有较大优势；高密度时，沿阶草、虉草所占优势增大，薹草成为优势种之一。油松人工林在低、中、高密度时，败酱Patrinia scabiosifolia均占有较大优势，且随密度增大出现了薹草、沿阶草等优势种；刺槐-油松混交林在低密度时，以白莲蒿Artemisia stechmanniana、风毛菊和麻花头Aristolochia debilis为主；中密度时，败酱、马唐、沿阶草所占优势较大；高密度时，败酱、沿阶草较中密度林时重要值增大，且薹草也占较大优势。山杨-栎类天然次生林在不同密度时，薹草均占有较大优势。低密度山杨-栎类天然次生林中天名精Carpesium abrotanoides和龙芽草Agrimonia pilosa优势较大；中密度时，山罗花Melampyrum roseum和假地豆Desmodium heterocarpon占有较大优势；高密度时，蜻蜓兰Tulotis fuscescens成为主要优势种之一，且零星分布川续断Dipsacus asper、龙芽草等喜湿耐阴性植物。可见，不同林分类型在低密度时草本层主要优势种以阳生植物为主，中密度和高密度时，草本层主要优势种以对生长环境没有较高要求、耐阴及喜湿的植物为主。
2.2 不同林分类型和密度条件下林下灌草植物多样性特征
对不同林分类型和不同密度条件下的林下灌草植物多样性进行双因素方差分析，在林分类型和密度的单一因素作用下，林下灌木层和草本层的S′、D、H′有极显著差异(P＜0.01)，灌木层 Jsw在林分类型作用下有显著差异(P＜0.05)，在林分密度作用下差异极显著(P＜0.01)。在林分类型与密度条件的交互作用下，林下灌草的D、H′有极显著差异(P＜0.01)，灌木层的S′有极显著差异(P＜0.01)，该指数在草本层有显著差异(P＜0.05)。草本层Jsw在林分类型、林分密度及其交互作用下均不显著(表3)。
表 3 不同林分类型和密度条件下林下灌草植物多样性的双因素方差分析Table 3 Two-factor variance analysis of stand type and stand density on understory shrub and grass plant diversity变异来源 S′ D H′ Jsw 自由度 F P 自由度 F P 自由度 F P 自由度 F P 灌木层 林分类型 3 232.838 ＜0.01 3 89.562 ＜0.01 3 128.906 ＜0.01 3 3.362 ＜0.05 林分密度 2 48.091 ＜0.01 2 18.603 ＜0.01 2 20.530 ＜0.01 2 27.792 ＜0.01 林分类型×林分密度 6 14.232 ＜0.01 6 6.181 ＜0.01 6 5.370 ＜0.01 6 11.824 ＜0.01 草本层 林分类型 3 71.152 ＜0.01 3 25.589 ＜0.01 3 42.011 ＜0.01 3 0.370 0.775 林分密度 2 45.818 ＜0.01 2 20.084 ＜0.01 2 32.356 ＜0.01 2 0.428 0.657 林分类型×林分密度 6 2.970 ＜0.05 6 6.613 ＜0.01 6 4.382 ＜0.01 6 2.477 0.052 不同林分类型在相同密度条件下的S′、D、H′以及 Jsw表现出相似的变化规律，但也有所不同(表4)。不同林分类型灌木层S′、H′从大到小依次为山杨-栎类天然次生林、刺槐-油松人工混交林、刺槐人工林、油松人工林，且山杨-栎类天然次生林与人工纯林均存在显著差异(P＜0.05)，不同林分类型草本层S′、H′最高的均为山杨-栎类天然次生林，最低的均为油松人工林。不同林分类型灌木层和草本层的D、Jsw不存在明显规律，且3种人工林草本层的Jsw差异均不显著。不同林分类型灌木层与草本层多样性指数具有明显差异，人工纯林灌木层多样性指数低于草本层，而山杨-栎类天然次生林灌木层多样性指数高于草本层。
表 4 典型林分类型灌草植物多样性Table 4 Bush-grass plant diversity index of typical stand types林分类型 密度类型 灌木层 草本层 S′ D H′ Jsw S′ D H′ Jsw 刺槐人工林 低密度 5.67±0.33 BCb 0.69±0.04 Ba 1.38±0.10 Ba 0.79±0.04 Ab 9.67±0.33 Aa 0.81±0.03 Aa 1.91±0.10 Aa 0.84±0.03 Aab 中密度 9.00±0.33 Ba 0.76±0.01 Ba 1.68±0.04 Ba 0.75±0.01 Bb 8.00±0.58 BCa 0.82±0.01 ABa 1.84±0.08 ABa 0.89±0.01 Aa 高密度 5.00±0.58 Bb 0.74±0.04 Aa 1.45±0.15 Ba 0.91±0.03 ABa 6.67±0.33 Bb 0.74±0.01 ABb 1.56±0.04 Bb 0.82±0.00 Ac 油松人工林 低密度 4.00±0.00 Ca 0.45±0.02 Cb 0.88±0.03 Cb 0.63±0.02 Bb 5.00±0.00 Cb 0.71±0.01 Ba 1.38±0.03 Bb 0.86±0.02 Aa 中密度 4.33±0.33 Ca 0.69±0.04 Ca 1.29±0.11 Ca 0.88±0.03 Aa 6.67±0.33 Ca 0.77±0.01 Ba 1.64±0.05 Ba 0.87±0.01 Aa 高密度 2.00±0.00 Cb 0.48±0.01 Bb 0.67±0.01 Cb 0.96±0.02 Aa 3.00±0.00 Cc 0.56±0.03 Cb 0.89±0.07 Cc 0.81±0.07 Aa 刺槐-油松人工混交林 低密度 7.67±0.33 Ba 0.74±0.02 Ba 1.54±0.08 Ba 0.76±0.03 Aa 7.67±0.88 Ba 0.77±0.03 ABab 1.63±0.12 Bab 0.81±0.05 Aa 中密度 9.33±0.58 Aa 0.80±0.02 Aa 1.81±0.11 Aa 0.82±0.03 Ca 9.00±0.00 Ba 0.84±0.01 Aa 1.97±0.03 Aa 0.90±0.01 Aa 高密度 9.21±0.00 Ba 0.77±0.03 Ba 1.71±0.08 Ba 0.78±0.04 Ba 6.00±0.58 Ba 0.75±0.00 Bc 1.48±0.04 Bc 0.84±0.03 Aa 山杨-栎类天然次生林 低密度 16.33±1.33 Aa 0.85±0.01 Ab 2.30±0.08 Ab 0.83±0.01 Ab 9.67±0.33 Ab 0.81±0.00 Aa 1.91±0.03 Aa 0.84±0.00 Aa 中密度 18.67±0.67 Aa 0.90±0.00 Aa 2.58±0.03 Aa 0.88±0.01 Aa 12.33±0.67 Aa 0.78±0.02 ABa 1.93±0.10 Aa 0.77±0.03 Bb 高密度 10.00±0.58 Ab 0.80±0.01 Ac 1.92±0.04 Ac 0.83±0.01 BCb 8.33±0.33 Ab 0.81±0.02 Aa 1.86±0.08 Aa 0.88±0.02 Aa 说明：大写字母代表相同密度下不同林分类型间差异显著(P＜0.05)；小写字母代表同一林分类型不同林分密度间差异显著(P＜0.05)。 同一林分类型不同密度条件下，随着密度增大，4种林分林下灌木层和草本层植物多样性指数大多呈现先增大后减小的趋势。其中刺槐人工林灌木层D、H′在中密度最大，其次为高密度、低密度，其Jsw在高密度时最大；而刺槐人工林草本层各指数随密度的增大不存在明显规律，但D、Jsw在中密度时最大。油松人工林灌木层D、H′与刺槐人工林表现规律一致，且Jsw在高密度时最大；油松人工林草本层S′、H′从大到小依次为中密度、低密度、高密度，且在不同密度间差异显著(P＜0.05)。刺槐-油松人工混交林灌木层S′、D、H′从大到小依次为中密度、高密度、低密度，且在中密度时均匀度指数
$ {J}_{{\rm{SW}}} $ 最大；草本层多样性指数从大到小依次为中密度、低密度、高密度，在中密度时均匀度最好。山杨-栎类天然次生林灌木层和草本层D、H′均表现为中密度最大，低密度次之，高密度最小。综上所述，山杨-栎类天然次生林和刺槐-油松人工混交林在中密度时的植物多样性较好。3. 讨论
3.1 林分类型对其林下灌草植物组成、结构及多样性的影响
植物组成和结构是植物群落的基本特征，并反映灌木层及草本层的植物种类和分布情况。不同林分类型林下植物组成存在一定规律。本研究中，4种林分灌木层植物种数在不同密度下整体表现为山杨-栎类天然次生林多于人工林，刺槐-油松人工混交林较人工纯林丰富。可能与山杨-栎类天然次生林及刺槐-油松人工混交林的生态位较宽有关，其林内环境复杂，具有较高的空间异质性，更适于不同需求植物的生长。这与赵耀等[17]对晋西黄土区不同林地植物多样性的研究结果近似。本研究中，草本层植物数量表现为山杨-栎类天然次生林处于较高水平，油松人工林草本植物种数最少，说明天然林较人工纯林更有利于草本植物的发育。这与张桐等[18]得出的人工纯林的植物种数高于天然林的研究结果有所差别，可能与立地条件、气候等因素有关。可见，山杨-栎类天然次生林、刺槐-油松人工混交林在各密度下植物组成和结构较好，灌木和草本植物种数量充足。在因地制宜的原则下，可通过相应的林草措施，提升林地植被稳定性[20]，对控制水土流失具有较好的效果。
植物多样性可以通过植物丰富度与植物分布均匀度进行体现，在维持生态系统稳定方面发挥基础性作用[21]。本研究中不同林分类型灌木层的S′、H′在不同密度条件下从大到小均依次为山杨-栎类天然次生林、刺槐-油松人工混交林、刺槐人工林、油松人工林，究其原因是天然次生林是自然封育生长，灌木层受外界条件影响较小。刺槐-油松人工混交林植物组成较人工纯林丰富，与武文娟等[22]的研究结果一致。油松人工林不仅在各密度下灌木层多样性指数最低，在草本层也是如此，可能是油松人工林下难以分解的油性枯枝落叶较多，降低了土壤结构稳定性，造成林下植物多样性较小，不利于发挥水土保持功能[23]。综合来看，在造林时，刺槐-油松人工混交林较人工纯林更具优势。
3.2 林分密度对其林下灌草植物组成、结构及多样性的影响
本研究结果表明：4种林分的灌草植物随林分密度增大呈现由阳生向中生、阴生植物过渡的变化规律，且山杨-栎类天然次生林与人工林的植物种类差别较大。黄刺玫在3种人工林不同密度条件下均有分布，并且是主要优势种，表明黄刺玫是研究区林分灌草的主要适生种，对干旱少雨、土壤瘠薄的环境适应性较强。连翘在山杨-栎类天然次生林不同密度条件下均占有较大优势，不仅喜光，同时具有耐阴性，能更好地适应天然次生林的林下环境，由于低密度时有辽东栎零星分布，说明该林分可能存在自然更新的现象。薹草、沿阶草在各林分中均有分布，说明它们对不同林分类型生态环境适应性较强，是研究区的重要组成植物。山杨-栎类天然次生林在高密度时的优势种出现了蜻蜓兰，该植物对生长环境要求非常严格[18]，说明山杨-栎类天然次生林的生长环境优良。因此，今后的植被建设应当加强对天然林的保护，充分发挥其水土保持功能。
本研究中不同林分类型灌木层和草本层在不同密度条件下存在差异性和规律性，由低密度到中密度时S′及H′增大，而由中密度到高密度时丰富度指数和多样性指数变小。可见，中密度林分的林下灌草种类更加丰富，多样性更高，并且分布较为均匀。这与丁继伟等[24]的研究结果近似。原因可能是林分密度过低或者过高可能都会对林下灌草的植物多样性产生抑制作用。当林分密度较低时，若光照充足，对阳生、耐旱植物的萌发有促进作用，但是阳光照射至土地上导致土壤内水分蒸发限制了林下其他类型植物的生长，导致植物多样性水平较低；随着密度的增加，中生和阴生植物逐渐增多，丰富了林下灌草组成，植物多样性处于较高水平；但密度达到一定峰值，林木直接竞争愈发激烈，且郁闭度随之也会增加，从而破坏了林下植被的生长条件，造成植物多样性降低[25]。这可能是导致刺槐人工林和油松人工林灌木层在高密度时均匀度指数最高，其丰富度指数与多样性指数处于较低水平的原因。不同林分类型灌木层与草本层多样性指数也具有明显差异。王芸等[26]研究表明：人工林和天然次生林林下植物多样性从大到小均为灌木层、草本层，但是本研究得出在人工纯林中林下植物多样性从小到大为灌木层、草本层，而山杨-栎类天然次生林中植物多样性从大到小为灌木层、草本层，与赵耀等[17]的研究结果一致。这可能与海拔、坡向、林分类型、林分密度等因素有关。综合来看，中等密度的刺槐-油松人工混交林林下植物种类较为丰富，植物多样性更高且分布较为均匀，有利于改善土壤质地，控制水土流失，可以将刺槐人工林、油松人工林向混交模式改进，扩大中等密度刺槐-油松人工混交林的造林面积。然而，人工造林与土壤条件、立地条件、混交比例等关系密切，因此有必要研究不同林分类型在不同密度下植物多样性的影响因子，制定合理的刺槐-油松混交林造林方式，以充分发挥林地的水土保持功能。
4. 结论
①不同林分类型中灌草植物组成存在一定差异。4种林分灌草植物共87种，隶属36科69属，其中灌木植物46种，隶属22科36属，草本植物41种，隶属17科33属。4种林分灌草植物组成表现为中密度山杨-栎类天然次生林和刺槐-油松人工混交林较为丰富。②4种林分灌草植物随密度增大呈现由阳生向中生、阴生植物过渡的变化规律。人工林、山杨-栎类天然次生林灌木层主要优势种分别为黄刺玫、连翘，草本层主要优势种是薹草、沿阶草等植物。③不同林分类型灌木层和草本层植物多样性指数存在一定差异。山杨-栎类天然次生林和刺槐-油松人工混交林在中密度时的植物多样性优于人工纯林，且随林分密度的增加，灌木层和草本层植物多样性指数大多呈现先增大后减小的变化趋势。研究区中密度林分更有利于林下植物多样性的维持和改善。
建议通过人工抚育调整林分密度，并向中密度刺槐-油松人工混交林或近自然林进行改造，为黄刺玫、连翘等灌木植物及薹草、沿阶草等草本植物建立良好生长条件，同时保护研究区的山杨-栎类天然次生林，以促进植被恢复建设和强化其水土保持功能。
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图 1 黄瓜与拟南芥、杨梅R2R3-MYB亚家族成员的系统进化树构建
Figure 1 Phylogenetic tree construction of C. sativus, A. thaliana and M. rubra R2R3-MYB subfamily members
图 2 黄瓜R2R3-MYB亚家族染色体定位图
Figure 2 Chromosome location map of C. sativus R2R3-MYB subfamily
图 3 黄瓜R2R3-MYB亚家族与拟南芥共线性分析图
Figure 3 Analysis of the collinearity between C. sativus R2R3-MYB subfamily and A. thaliana
图 4 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白保守基序和基因结构
Figure 4 Protein conservative motifs and gene structure of R2R3-MYB subfamily in C. sativus
图 5 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白序列比对图
Figure 5 Sequence comparison of C. sativus R2R3-MYB subfamily proteins
图 6 黄瓜R2R3-MYB亚家族上游顺式元件预测
Figure 6 Prediction of upstream homeopathic elements of C. sativus R2R3-MYB subfamily
图 7 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员蛋白的互作预测
Figure 7 Prediction of protein interactions among R2R3-MYB subfamily members in C. sativus
表 1 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员信息
Table 1. Cucumber R2R3-MYB subfamily member information
基因命名 氨基酸
数量/个分子量/kDa 等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置基因命名 氨基酸
数量/个分子量/
kDa等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置Cs2RMYB1 360 40.91 6.44 52.41 57.17 Chr 1 Cs2RMYB51 268 30.01 8.59 54.65 64.40 Chr 3 Cs2RMYB2 471 54.88 5.91 42.84 66.43 Chr 1 Cs2RMYB52 217 25.13 7.21 55.75 65.21 Chr 3 Cs2RMYB3 367 41.94 5.83 59.22 75.50 Chr 1 Cs2RMYB53 195 22.67 8.37 72.59 73.54 Chr 3 Cs2RMYB4 331 37.60 9.02 65.15 61.90 Chr 1 Cs2RMYB54 355 39.21 6.25 54.46 82.96 Chr 3 Cs2RMYB5 277 31.19 5.90 78.88 66.21 Chr 1 Cs2RMYB55 305 34.19 6.19 45.79 74.52 Chr 3 Cs2RMYB6 232 26.59 8.83 57.26 66.51 Chr 1 Cs2RMYB56 253 28.52 9.10 49.09 65.53 Chr 3 Cs2RMYB7 326 36.76 6.42 53.91 67.94 Chr 1 Cs2RMYB57 313 35.05 4.97 68.24 75.97 Chr 4 Cs2RMYB8 288 32.50 6.31 71.30 64.03 Chr 1 Cs2RMYB58 314 36.06 6.10 62.98 58.06 Chr 4 Cs2RMYB9 377 42.09 6.46 50.23 66.71 Chr 1 Cs2RMYB59 322 35.68 6.14 54.46 67.55 Chr 4 Cs2RMYB10 337 37.92 5.74 45.24 71.19 Chr 1 Cs2RMYB60 377 40.50 5.41 39.90 73.24 Chr 4 Cs2RMYB11 299 33.99 9.17 58.17 61.64 Chr 1 Cs2RMYB61 353 39.81 6.22 60.28 59.92 Chr 4 Cs2RMYB12 372 42.33 6.12 54.32 67.63 Chr 1 Cs2RMYB62 229 25.19 9.29 58.90 61.70 Chr 4 Cs2RMYB13 277 32.11 5.83 63.46 79.96 Chr 1 Cs2RMYB63 263 29.14 8.34 61.14 67.15 Chr 4 Cs2RMYB14 337 38.24 8.66 52.38 59.08 Chr 1 Cs2RMYB64 280 31.51 8.92 59.53 72.11 Chr 4 Cs2RMYB15 370 41.15 6.13 51.97 61.95 Chr 1 Cs2RMYB65 260 28.84 5.00 38.86 76.54 Chr 5 Cs2RMYB16 364 41.75 9.54 55.58 69.81 Chr 1 Cs2RMYB66 323 36.41 6.00 53.24 72.45 Chr 5 Cs2RMYB17 327 37.06 7.68 62.31 69.48 Chr 2 Cs2RMYB67 258 29.46 5.84 45.28 67.67 Chr 5 Cs2RMYB18 295 32.99 9.07 45.41 70.10 Chr 2 Cs2RMYB68 236 26.98 6.71 53.48 74.83 Chr 5 Cs2RMYB19 222 25.74 6.00 53.86 72.43 Chr 2 Cs2RMYB69 284 31.23 6.41 56.18 72.46 Chr 5 Cs2RMYB20 264 29.98 8.97 58.24 63.14 Chr 2 Cs2RMYB70 300 33.77 5.29 55.23 71.50 Chr 5 Cs2RMYB21 265 31.42 9.64 54.52 67.02 Chr 2 Cs2RMYB71 337 38.25 7.69 55.10 66.59 Chr 5 Cs2RMYB22 286 32.59 5.60 58.72 59.69 Chr 2 Cs2RMYB72 210 24.43 5.19 51.25 60.38 Chr 5 Cs2RMYB23 228 26.87 10.27 58.08 65.44 Chr 2 Cs2RMYB73 464 52.29 6.82 66.09 66.85 Chr 5 Cs2RMYB24 256 29.15 8.24 48.25 79.22 Chr 2 Cs2RMYB74 369 41.40 6.61 50.68 56.34 Chr 5 Cs2RMYB25 210 23.54 10.31 65.32 59.48 Chr 2 Cs2RMYB75 307 34.25 7.51 48.64 64.59 Chr 5 Cs2RMYB26 230 26.32 8.83 57.64 63.65 Chr 2 Cs2RMYB76 398 44.52 6.49 53.56 62.29 Chr 5 Cs2RMYB27 204 23.04 8.44 43.78 67.94 Chr 2 Cs2RMYB77 202 23.93 8.25 43.61 58.37 Chr 5 Cs2RMYB28 338 38.46 8.56 58.00 68.99 Chr 2 Cs2RMYB78 294 33.13 8.72 52.07 70.41 Chr 5 Cs2RMYB29 290 31.80 9.23 59.33 65.93 Chr 2 Cs2RMYB79 286 32.77 6.40 64.03 65.17 Chr 6 Cs2RMYB30 297 33.70 9.97 55.65 69.97 Chr 2 Cs2RMYB80 552 61.13 5.50 52.51 61.54 Chr 6 Cs2RMYB31 301 32.30 8.19 55.90 64.15 Chr 2 Cs2RMYB81 301 34.40 5.56 70.97 65.08 Chr 6 Cs2RMYB32 308 34.86 5.93 48.47 84.90 Chr 2 Cs2RMYB82 269 31.33 6.45 45.95 63.42 Chr 6 Cs2RMYB33 519 57.03 7.46 59.70 57.53 Chr 3 Cs2RMYB83 334 38.24 4.96 46.95 59.85 Chr 6 Cs2RMYB34 305 34.64 5.70 57.58 70.72 Chr 3 Cs2RMYB84 286 32.92 5.80 56.50 54.58 Chr 6 Cs2RMYB35 248 29.14 9.10 56.61 66.49 Chr 3 Cs2RMYB85 291 33.53 6.63 61.70 46.94 Chr 6 Cs2RMYB36 259 29.98 6.50 48.74 59.54 Chr 3 Cs2RMYB86 277 32.26 9.35 51.45 59.49 Chr 6 Cs2RMYB37 296 33.70 5.35 56.27 67.20 Chr 3 Cs2RMYB87 301 32.45 9.32 50.91 64.82 Chr 6 Cs2RMYB38 219 25.25 6.32 59.79 70.32 Chr 3 Cs2RMYB88 319 35.85 6.53 48.51 65.49 Chr 6 Cs2RMYB39 354 40.50 9.20 58.22 77.40 Chr 3 Cs2RMYB89 344 38.44 6.12 57.72 80.00 Chr 6 Cs2RMYB40 267 30.10 5.59 55.70 69.33 Chr 3 Cs2RMYB90 387 44.36 5.81 54.93 61.01 Chr 6 Cs2RMYB41 245 28.13 5.75 48.70 62.57 Chr 3 Cs2RMYB91 289 33.19 6.45 53.15 70.17 Chr 6 Cs2RMYB42 224 25.60 7.64 65.43 74.87 Chr 3 Cs2RMYB92 248 27.74 9.11 46.24 76.73 Chr 7 Cs2RMYB43 275 31.61 8.71 39.67 79.75 Chr 3 Cs2RMYB93 500 54.62 5.89 55.46 57.82 Chr 7 Cs2RMYB44 316 36.22 5.63 58.87 56.52 Chr 3 Cs2RMYB94 254 29.45 5.36 74.13 75.63 Chr 7 Cs2RMYB45 312 34.71 6.99 55.70 62.79 Chr 3 Cs2RMYB95 271 31.90 5.56 53.17 62.66 Chr 7 Cs2RMYB46 248 29.70 8.46 52.73 69.60 Chr 3 Cs2RMYB96 254 29.40 5.02 43.86 79.49 Chr 7 Cs2RMYB47 348 39.13 8.86 46.82 64.77 Chr 3 Cs2RMYB97 280 32.36 5.20 59.21 68.86 Chr 7 Cs2RMYB48 294 32.66 6.17 57.40 64.42 Chr 3 Cs2RMYB98 285 32.82 5.32 58.47 64.70 Chr 7 Cs2RMYB49 233 26.13 9.33 51.33 65.41 Chr 3 Cs2RMYB99 248 27.78 6.24 44.80 65.28 Scaffold 72 Cs2RMYB50 313 35.13 5.95 54.63 65.50 Chr 3 说明：Cs2RMYB48基因定位于叶绿体，其他基因定位于细胞核。 
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