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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉,春初出叶,叶片为带状,宽约1.0 cm,长约30.0 cm,叶顶钝圆;秋初开花,花茎高约60.0 cm,伞形花序4~6朵,6片倒披针形花瓣,长约4.5 cm,宽约1.0 cm;花多淡紫红色,花被顶端蓝色,花色花型丰富,是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前,换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主,分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术,以换锦花为母本,中国石蒜L. chinensis为父本,选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans;张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源,表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长,在自然状态下授粉率低且结实少,种子萌发率低,制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷,不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径,主要由结构基因和调控基因共同调控,花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响,植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7],花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明:R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子,常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因,周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列,为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络,本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析,通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能,结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
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2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣,取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B),液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
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采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15],参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
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根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F:CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R:AGAACAGCACTACTAAAGGT,参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列,PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s;58 ℃ 退火30 s;72 ℃延伸90 s,32个循环,72 ℃延伸10 min,质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照;采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA,于−20 ℃保存备用。
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参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体,转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞;在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜,挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中,37 ℃振荡培养,PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序;采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA,于−20 ℃保存。
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采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1),使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法,于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL):cDNA(<100 ng) 1.6 uL,正反引物各0.8 uL,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL,RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s,95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,循环40次。以LsGADPH为内参基因[15],2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量,重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物
Table 1. Primers for fluorescence RT-qPCR
引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明:引物参考文献[16]。 -
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g,加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液,振荡混匀;20 ℃超声提取30 min;12 000 r·min−1,离心15 min,取上清液;0.45 μm滤膜过滤;梯度洗脱:流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B),0~20 min(A体积分数从5%升至60%),20~25 min(A体积分数从60%升至100%),25~30 min(A体积分数保持100%),流速1 mL·min−1,检测波长280 nm,柱温30 ℃,进样量10 uL;以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
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采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580,再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上,并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选,挑选阳性克隆进行菌液PCR检测,成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体,采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA;聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体,用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
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采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7:利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R:GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG;用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列,T4 DNA连接酶连接载体与目的序列,转化大肠埃希菌DH5α,并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选,提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
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采用微量注射法转化换锦花花苞[12],将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101,于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中,28 ℃,220 r·min−1振荡培养12~14 h;4 000 r·min−1, 离心10 min,去上清液;加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2,pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0;将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀,室温黑暗静置4~6 h;使用1 mL注射器,吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞,在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液,充分侵染换锦花花苞,侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
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采用Excel 2020 统计和整理数据,采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析,采用Graphpad 8.0作图。
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以换锦花花瓣的cDNA为模板,采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF),编码274个氨基酸,分子量为6.84 kD,蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258,理论等电点(pI)为5.04,不稳定系数为43.43,总体亲水性(GRAVY)为0.936。
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通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对,发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3),属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%,其中,与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%,其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%),与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%,且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域,而C端的同源性较低。
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从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19],LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类,由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程,响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应,同一亚族基因的功能相似,结合花色基因表达分析,推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
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利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B),结果表明:换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素,含有少量的天竺葵素和飞燕草素,说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育,花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势,小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍,说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A);在浅色换锦花无性系H4和H5中,矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此,从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看,矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大,矢车菊素质量浓度越高,换锦花花瓣的颜色就越深。
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利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析,结果(图6)表明:LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势,LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达,LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达,盛花期开始大量表达,而在败花期表达量开始下降;LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
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LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反,而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致,这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此,LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
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通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7,转化烟草原生质体,于激光共聚焦荧光显微镜观察,LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8),说明LsMYB7基因为转录因子基因,在细胞核中起转录调控的作用。
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构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7,通过微量注射法转化换锦花花苞,LsMYB7 基因沉默后,换锦花同朵花中一半花瓣明显变短,且颜色变深(图9A);对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C),与ck (空载)相比,LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降,同时,花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P<0.01),而LsF3H基因的表达量反而上升,LsC4H基因表达变化不大,说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育,且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用,而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
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植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同,拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族,其中,拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22],换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明,LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应,其中,AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下,ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗,获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明:LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3,属R2R3-MYB类转录因子,且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源,系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类,推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中,LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致,推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族,未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26],而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性,其中,花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明:干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达,通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后,花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降,说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累,而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类,由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月,此时多为高温和干旱季节,因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达,大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似,因此,植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累,进而提高抗旱能力。
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本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列,开放阅读框(ORF) 825 bp,编码274个氨基酸,LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族,定位于细胞核,与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类;LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达,与花色苷合成相关基因的表达趋势一致;LsMYB7基因沉默后,换锦花部分花瓣明显变短,颜色变深,LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调,因此,LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育,且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外,LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累,进而提高换锦花的抗旱能力,LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
Cloning and function analysis of LsMYB7 gene in Lycoris sprengeri
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摘要:
目的 研究转录因子LsMYB7基因对换锦花Lycoris sprengeri花色苷积累的调控作用。 方法 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法从换锦花花瓣中克隆获得花色苷形成相关R2R3-MYB转录因子LsMYB7基因,并进行生物信息学分析,再通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究LsMYB7基因对花色苷积累的调控作用。 结果 克隆到1条长951 bp的 LsMYB7基因cDNA序列,开放阅读框(ORF)为825 bp,编码274个氨基酸,LsMYB7蛋白含有2个R2和R3结构域,属R2R3-MYB转录因子家族;系统进化分析表明LsMYB7与拟南芥Arabidopsis thaliana S22亚族基因聚为一类;LsMYB7亚细胞定位于细胞核,在不同花发育阶段和不同花色无性系中,LsMYB7基因表达与花色苷合成相关基因的表达趋势一致,主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达;LsMYB7基因沉默后,换锦花花瓣明显变短,颜色变深,且LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调。 结论 LsMYB7属R2R3-MYB转录因子家族S22亚族,通过正向调控LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷生物合成相关基因的表达促进花色苷积累。图9表1参31 -
关键词:
- 换锦花 /
- R2R3-MYB转录因子 /
- 花色苷积累 /
- 病毒介导的基因沉默 /
- 调控作用
Abstract:Objective The purpose is to study the regulatory effect of LsMYB7 gene on the accumulation of anthocyanins in Lycoris sprengeri. Method R2R3-MYB transcription factor LsMYB7 was screened from petals of L. sprengeri. The expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosynthesis was analyzed by real-time quantitative PCR technology (RT-qPCR). The function of LsMYB7 on anthocyanin accumulation was studied by virus-induced gene silencing (VIGS) technology. Result A 951 bp LsMYB7 gene cDNA sequence was cloned from petals in L. srprengei, containing 825 bp open reading frame (ORF) which encoded 274 amino acids. LsMYB7 protein contained two R2 and R3 domain, and belonged to R2R3-MYB transcription factor family. Phylogenetic analysis showed that LsMYB7 was clustered one group with Arabidopsis thaliana S22 subfamily genes, involved in regulating responses to abiotic stress such as drought and high temperature. LsMYB7 was localized in the nucleus. The expression trend of LsMYB7 gene was consistent with genes related to anthocyanin biosynthesis in different flower development stages and different flower color clones, and mainly expressed in petals of H1 clones with high anthocyanin content and last flowering period. The petals of L. sprengeri became significantly shorter and darker in color, and the expression of genes related to anthocyanin biosynthesis, such as LsCHS, LsF3'H, LsANS, LsUFGT1, and LsUFGT2, was significantly downregulated after LsMYB7 gene being silenced. Conclusion LsMYB7 belongs to S22 subfamily of the R2R3-MYB transcription factor family, and gets involved in regulating the expression of genes (like LsCHS, LsF3'H, LsANS, LsUFGT1 and LsUFGT2) related to anthocyanin biosynthesis and promoting anthocyanin accumulation. [Ch, 9 fig. 1 tab. 31 ref.] -
在全球范围内,土壤盐渍化是威胁农业的主要问题之一。据统计,全球20%的耕地面积受到了不同程度的盐渍化危害[1]。土壤盐渍化会对植物形成盐胁迫,引起离子失衡和高渗透胁迫来影响植物。在盐胁迫下,植物组织中的离子浓度增加产生离子毒害,还会使体内活性氧的产生和清除失调,造成活性氧的过量积累,导致细胞膜受损,植物正常生长发育受阻,甚至还会导致植物体死亡[2−4]。盐胁迫严重降低了农作物的产量和品质,减轻或解决盐胁迫对作物的伤害对粮食安全有重要意义。
钙(Ca)是植物生长发育所必需的营养元素之一,其作为第二信使在维持植物细胞膜的结构和功能完整性、稳定细胞壁结构、调节离子转运和选择性以及控制离子交换行为的过程中起着至关重要的作用[4]。有研究表明:当植物受到盐胁迫时,过量的钠离子(Na+)降低了钙离子(Ca2+)向植物生长区域的运输和迁移,而适量施加外源Ca2+不仅可以缓解因钙不足造成的矿质营养缺乏,还能增强植物体内细胞膜的稳定性和抗氧化酶活性,从而提高植物对逆境胁迫的抗性[5]。张胜珍等[6]研究发现:在150 mmol·L−1氯化钠(NaCl)胁迫下,20 mmol·L−1氯化钙(CaCl2)浸种可显著提高荆芥Nepeta cataria幼苗的抗氧化酶活性,有效缓解荆芥种子受到伤害。ZHAO等[7]发现:在高温和强光交叉胁迫下,Ca2+预处理小麦Triticum aestivum可通过减少氧离子(O2 −)的产生、抑制膜脂过氧化和延缓细胞的电解质渗漏来保护光合作用系统免受氧化损伤。赵腾飞等[8]研究表明:外源施加CaCl2可提高铅(Pb)胁迫下小麦的抗氧化酶活性、降低丙二醛(MDA)含量、恢复小麦根系活力,一定程度上缓解了Pb对小麦的毒害作用。王宝增等[9]研究表明:对盐胁迫下的小麦幼苗施加CaCl2可使其脯氨酸含量增加,过氧化物酶活性增强,MDA降低,提高了小麦幼苗的耐盐性。因此,选用CaCl2作为缓解小麦盐胁迫的外源物质具有一定的可行性。
小麦是世界上的主要粮食作物之一,中国产量和种植面积仅次于水稻Oryza sativa和玉米Zea mays,占全国粮食作物面积的21.4%。衰老是小麦生长发育的最后阶段,是在细胞水平、组织水平、器官水平和整个有机体水平上共同协作完成的,是积极主动的过程[10]。在衰老过程中,小麦器官和细胞会经历一系列复杂的生理和生物生化变化,将营养物质,特别是氮(N)从叶片中重新分配到正在发育的籽粒中被认为是叶片衰老的主要功能。有研究表明:谷物中大约80%的N是由衰老过程中叶绿体蛋白的回收提供的[11]。小麦早衰会引起叶片提早黄化,光合效率下降,降低籽粒千粒重,影响产量。也有学者表明:小麦叶片衰老推迟1 d,可增产2%[12]。
本研究以小麦加倍单倍体群体(DH)[13]中的叶片早衰株系DH70和叶片延迟衰老株系DH106为研究材料,分析2个株系小麦在正常环境、盐胁迫以及施加外源CaCl2等不同处理下的幼苗形态指标、抗氧化酶活性、MDA等生理指标之间的差异,为探讨小麦早衰株系和延迟衰老株系对盐胁迫的抗性差异以及筛选外源CaCl2缓解的最佳浓度提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 材料和预试验
以小麦DH群体的2个株系DH70 (早衰)和DH106 (延迟衰老)为研究材料,于2021年4—6月在浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室进行试验。选取颗粒饱满大小一致的小麦种子于100、200、300、400 mmol·L−1 NaCl溶液下处理7 d。试验发现400 mmol·L−1 NaCl处理下小麦种子基本不发芽,100、200、300 mmol·L−1 NaCl处理均抑制了小麦的发芽及幼苗的生长,其中300 mmol·L−1 NaCl处理下抑制效果最明显,2个株系间差异最大,且不会导致小麦死亡。因此选择300 mmol·L−1 NaCl为最佳处理浓度。
1.2 试验设计
取大小相似、颗粒饱满、无病虫害的2个DH株系的小麦种子若干,在体积分数为75%的乙醇中浸泡1 min,倒掉乙醇后用纯水冲洗2遍,再将种子放于体积分数为5%的次氯酸钠溶液中消毒30 min,消毒后用纯水冲洗3遍,使种子表面无残留的次氯酸钠溶液。将消毒完的小麦种子用吸水纸吸去多余水分,整齐排列在装有湿润双层滤纸的培养皿中,室温下发芽。待种子露白时,挑选露白程度一致的小麦种子放置于18 cm×12 cm×12 cm的发芽盒中进行试验,共设7个处理,3次重复,每个处理30粒小麦种子,以纯水和300 mmol·L−1NaCl溶液处理做为对照1 (ck1)和对照2 (ck2),CaCl2缓解浓度为5、10、20、40、60 mmol·L−1,具体处理见表1。
表 1 试验处理Table 1 Treatment处理 处理浓度 ck1 纯水 ck2 300 mmol·L−1NaCl 处理1 300 mmol·L−1NaCl + 5 mmol·L−1CaCl2 处理2 300 mmol·L−1NaCl + 10 mmol·L−1CaCl2 处理3 300 mmol·L−1NaCl + 20 mmol·L−1CaCl2 处理4 300 mmol·L−1NaCl + 40 mmol·L−1CaCl2 处理5 300 mmol·L−1NaCl + 60 mmol·L−1CaCl2 1.3 测定指标与方法
1.3.1 种子发芽率和发芽势测定
小麦种子发芽标准为胚芽长至种子长度的1/2,胚根与种子一样长视为该种子发芽。发芽率=(7 d内发芽种子数/供试种子总数)×100%;发芽势=(3 d内发芽种子数/供试种子总数) ×100%;发芽指数=∑(Gt/Dt),其中Gt表示t日的发芽数,Dt表示t日相应的发芽天数;活力指数=发芽指数×幼苗鲜质量。
1.3.2 幼苗形态指标测定
处理14 d后,每个重复随机选取5株正常生长的小麦幼苗,分别测定苗长(从苗基部到叶尖)、胚芽鞘长、总根长以及鲜质量。
1.3.3 生理指标测定
处理14 d后,每个重复称取0.5 g小麦嫩叶放入研钵中,加入10 mL磷酸缓冲液(50 mmol·L−1,pH 7.8),在冰上研磨成匀浆,匀浆倒入10 mL离心管中,以10 000 r·min−1的转速低温(4 ℃)离心20 min,离心后取上清液即为粗酶液,用于超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性及MDA的测定。SOD活性采用氮蓝四唑法测[14];POD活性采用愈创木酚法测定[15];CAT活性采用紫外吸收法测定[16];MDA采用硫代巴比妥酸法测定[17]。
1.4 数据处理
采用Excel 2010、SPSS 19.0等对所测得的各项生理指标进行单因素方差(one-way ANOVA)分析。
2. 结果与分析
2.1 外源Ca2+对盐胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长的影响
由表2可知:300 mmol·L−1 NaCl处理下株系DH70和DH106的发芽率、发芽势、发芽指数以及活力指数与ck1相比均显著降低(P<0.05),株系DH70分别降低了70.4%、15.2%、40.9%和64.2%;株系DH106分别降低了67.7%、12.3%、36.3%和59.5%。施加不同浓度CaCl2后,2个株系小麦的发芽率、发芽势以及发芽指数与ck2相比均有不同程度的上升,且都以40 mmol·L−1 CaCl2的处理效果最佳。在40 mmol·L−1 CaCl2处理下,株系DH70的发芽率、发芽势、发芽指数以及活力指数比ck2分别显著提高了182.8%、33.4%、53.8%和125.7% (P<0.05),且发芽势较ck1相比提高了13.0%;株系DH106的发芽率、发芽势、发芽指数以及活力指数比ck2分别显著提高了159.3%、38.9%、50.0%和103.6% (P<0.05),且发芽势较ck1相比提高了16.3%。由此可见,300 mmol·L−1 NaCl处理显著抑制了2个株系小麦种子的萌发,而不同浓度的CaCl2处理均可不同程度缓解盐胁迫带来的伤害,其中以浓度40 mmol·L−1 CaCl2缓解效果最佳,但2个株系的缓解效应没有明显的差异。
表 2 CaCl2对盐胁迫下小麦种子萌发的影响Table 2 Effect of CaCl2 on wheat seed germination under salt stress处理 株系DH70 株系DH106 发芽率/% 发芽势/% 发芽指数 活力指数 发芽率/% 发芽势/% 发芽指数 活力指数 ck1 97.8±1.9 f 45.8±3.1 d 22.4±0.6 a 2.3±0.2 a 98.9±1.9 f 43.1±2.9 b 22.6±0.6 a 2.4±0.3 a ck2 28.9±3.9 a 38.6±2.2 f 13.5±0.4 d 0.8±0.3 e 32.2±2.0 a 35.8±1.2 c 14.4±0.5 d 1.0±0.2 e 处理1 47.8±1.9 b 38.3±1.9 ef 14.3±0.5 cd 1.0±0.2 e 46.7±3.1 b 36.2±3.3 c 15.1±0.4 d 1.1±0.5 de 处理2 63.3±3.3 c 40.9±1.3 ef 15.6±0.5 bcd 1.1±0.4 de 64.4±1.8 c 40.8±2.2 b 16.6±0.6 bc 1.2±0.2 cde 处理3 74.4±1.9 d 46.1±3.1 d 17.1±0.5 bc 1.3±0.2 cd 76.7±6.6 d 44.9±2.3b 18.3±0.5 cd 1.4±0.2 c 处理4 82.2±5.1 e 51.6±2.0 c 20.1±0.6 a 1.9±0.2 b 83.3±3.3 e 50.2±1.4 a 21.4±0.5 ab 2.0±0.4 b 处理5 66.7±3.3 c 41.8±1.8 e 17.3±0.5 b 1.4±0.2 c 64.3±8.4 c 49.4±2.4 a 17.5±0.5 cd 1.3±0.2 cd 说明:数据为平均值±标准差;不同小写字母表示同一株系在不同处理间差异显著(P<0.05)。 由表3可以看出:盐胁迫显著降低了株系DH70和DH106的苗长、总根长以及鲜质量,但是对胚芽鞘长影响不大,说明300 mmol·L−1 NaCl处理明显抑制了2个株系的幼苗生长。相比ck1,株系DH70苗长、总根长和鲜质量分别显著下降了53.0%、64.7%和40.5% (P<0.05);株系DH106的苗长、总根长和鲜质量分别显著下降了48.4%、63.4%及36.4% (P<0.05)。施加不同浓度CaCl2后,相比ck2,2个株系的苗长、总根长和鲜质量都有不同程度的增加,且都以40 mmol·L−1 CaCl2处理效果最佳,在该处理下,株系DH70的苗长、总根长和鲜质量比ck2分别提高了128.6%、165.0%及50.8%;株系DH106的苗长、总根长和鲜质量比ck2分别提高了101.2%、157.7%及37.1%。由此可得,300 mmol·L−1 NaCl显著抑制了2个株系小麦幼苗生长及生物量的积累(P<0.05),而施加不同浓度的CaCl2可不同程度缓解盐胁迫的抑制,且以施加40 mmol·L−1 CaCl2缓解的效果最好。株系DH70在苗长、总根长和鲜质量上得到的缓解效应高于DH106。
表 3 CaCl2对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响Table 3 Effect of CaCl2 on the growth of wheat seedlings under salt stress处理 株系DH70 株系DH106 鲜质量/g 苗长/cm 胚芽鞘长/cm 总根长/cm 鲜质量/g 苗长/cm 胚芽鞘长/cm 总根长/cm ck1 0.103±0.003 a 15.5±0.8 a 5.8±0.3 a 42.7±3.4 a 0.105±0.002 a 14.5±0.7 a 4.8±0.3 a 45.3±1.7 a ck2 0.061±0.002 e 7.1±0.4 d 5.5±0.4 a 15.1±0.6 f 0.067±0.010 d 7.5±0.7 e 4.8±0.5 a 16.6±0.8 f 处理1 0.067±0.008 de 9.2±0.6 c 5.7±0.3 a 21.6±0.9 e 0.076±c0.002 d 10.2±0.9 d 5.0±0.1 a 22.5±1.7 e 处理2 0.069±0.001 d 11.5±0.7 b 5.9±0.3 a 28.2±0.6 d 0.074±0.002 cd 12.0±0.3 bc 5.0±0.4 a 29.2±1.2 d 处理3 0.077±0.006 c 12.7±0.8 b 5.7±0.6 a 33.4±0.9 c 0.079±0.003 c 12.3±0.6 b 4.5±0.4 a 33.4±0.8 c 处理4 0.092±0.005 e 16.2±0.9 a 5.7±0.3 a 40.0±0.6 b 0.091±0.001 b 15.0±0.7 a 4.9±0.3 a 42.8±0.7 b 处理5 0.082±0.002 c 15.4±1.3 b 5.9±0.3 a 34.5±0.9 b 0.075±0.006 c 14.9±0.5 a 4.8±0.1 a 34.7±1.2 c 说明:数据为平均值±标准差;不同小写字母表示同一株系在不同处理间差异显著(P<0.05)。 2.2 外源Ca2+对盐胁迫下小麦叶片抗氧化酶活性的影响
从图1可以看出:在盐胁迫下,2个株系的SOD活性与ck1相比均显著下降(P<0.05),株系DH70和DH106的SOD活性较ck1分别下降了38.5%、39.3%。施加不同浓度CaCl2后,2个株系的SOD活性均有提升。在5、10、20、40、60 mmol·L−1 CaCl2处理下,株系DH70的SOD活性较ck2相比分别提高了16.0%、26.9%、45.4%、58.0%、41.7%,株系DH106的SOD活性较ck2相比分别提高了14.3%、22.7%、38.6%、52.9%、40.9%,2个株系的SOD活性都在CaCl2浓度为40 mmol·L−1时达到最高,即该浓度的CaCl2对盐胁迫的缓解效果最佳,而当浓度达60 mmol·L−1时,SOD活性下降,说明过高浓度的CaCl2缓解能力反而下降,且株系DH70比株系DH106具有更高的缓解效应。
由图2可知:盐胁迫显著提高了小麦幼苗的POD活性(P<0.05),株系DH70的POD活性较ck1相比增加了45.5%,株系DH106的POD活性较ck1相比增加了43.9%。在5、10、20、40、60 mmol·L−1 CaCl2处理后,小麦幼苗的POD活性均得到了提升,株系DH70的POD活性较ck2分别提高了20.7%、27.0%、37.6%、43.5%、27.8%,株系DH106的POD活性较ck2分别提高了18.8%、27.8%、31.4%、42.3%、32.5%,都以40 mmol·L−1 CaCl2处理缓解效果最好。当CaCl2浓度达60 mmol·L−1时,小麦POD活性开始下降,说明缓解效果减弱。由图3可以看出:各处理下CAT活性的变化趋势与POD活性的变化趋势相似,都呈先提高后下降的趋势。在300 mmol·L−1的盐胁迫下,小麦CAT活性较ck1显著提高(P<0.05),株系DH70的CAT活性提高了61.3%,株系DH106的CAT活性提高了56.4%。CaCl2处理提高了小麦CAT活性,其中40 mmol·L−1 CaCl2处理缓解效果最佳。在5、10、20、40、60 mmol·L−1 CaCl2处理后,株系DH70的CAT活性较ck2相比分别提高了4.1%、8.4%、13.3%、21.8%、10.7%,其中只有40 mmol·L−1 CaCl2处理达到了显著水平(P<0.05);株系DH106的CAT活性较ck2相比分别提高了6.1%、17.9%、22.4%、35.7%、18.9%。
2.3 外源Ca2+对盐胁迫下小麦叶片MDA质量摩尔浓度的影响
由图4可以看出:300 mmol·L−1盐胁迫使小麦幼苗的MDA质量摩尔浓度显著增高(P<0.05),说明在盐胁迫下细胞受损严重,株系DH70和DH106在盐胁迫下的MDA比ck1分别显著增加了81.0%和60.2% (P<0.05)。CaCl2处理可缓解小麦细胞损伤,减少MDA的积累,且以浓度为40 mmol·L−1时效果最佳,达到了显著水平(P<0.05)。在5、10、20、40、60 mmol·L−1 CaCl2处理后,株系DH70的MDA质量摩尔浓度较ck2相比分别减少了22.2%、25.9%、28.7%、33.0%、27.7%,株系DH106的MDA质量摩尔浓度较ck2相比分别减少了5.8%、11.6%、13.9%、21.1%、13.5%,说明CaCl2缓解效应在不同小麦株系中存在差异,株系DH70响应稍强于DH106。
3. 讨论与结论
本研究表明:盐胁迫显著降低了2个株系小麦的发芽率、发芽势、发芽指数、苗长、根长以及鲜质量,这与QUAN等[18]的研究结果相一致,说明盐胁迫抑制了小麦种子的萌发及生长,且早衰株系DH70的下降幅度要大于延迟衰老株系DH106。外源施加Ca2+可有效缓解盐胁迫对小麦的抑制作用,显著提高小麦种子的萌发率和生长能力,其最佳缓解浓度为40 mmol·L−1,且对株系DH70的缓解效应强于株系DH106。表明早衰型小麦的耐盐性要低于延迟衰老型的小麦,但早衰型小麦受到外源物质的缓解作用要比延迟衰老型小麦强。
活性氧(ROS)是植物在细胞代谢过程中的天然副产物,并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用,盐胁迫等极端的环境条件会导致植物体内ROS水平急剧增加,从而导致脂肪、蛋白质和核酸的恶化,最终导致植物死亡[19]。因此细胞需要形成一个平衡的系统来抵御ROS的影响,如抗氧化防御系统,抗氧化酶包括SOD、POD、CAT等。SOD可以与抗坏血酸过氧化物酶(APX)、POD和CAT共同作用清除ROS,使自由基活性氧维持在一个对植物细胞无害的水平,减轻ROS对植物的伤害。在本研究中,施加不同浓度CaCl2使得小麦幼苗的SOD、POD和CAT活性较ck2均显著提高,说明外源CaCl2处理可以显著提高逆境胁迫中植物体内的抗氧化酶活性,一定程度缓解盐胁迫对植物的伤害,这与刘艺平等[20]、宋珊珊等[21]、刘丽云等[22]的研究结果一致。随着CaCl2浓度的增加,小麦幼苗的抗氧化酶活性均呈先上升后下降的变化趋势,且在CaCl2浓度为40 mmol·L−1时达到最大。本研究表明:不同浓度CaCl2处理对盐胁迫下2个株系小麦幼苗抗氧化酶活性的缓解效应不同,对株系DH70的缓解作用要强于株系DH106,说明早衰型小麦受到的缓解作用比延迟衰老型小麦强。植物体中MDA质量摩尔浓度的高低可以反映细胞膜受损的程度即植物在逆境胁迫下受到的伤害程度。本研究中,盐胁迫显著提高了小麦幼苗中的MDA质量摩尔浓度,说明在盐胁迫下小麦细胞膜受到了明显的伤害,且株系DH70的MDA质量摩尔浓度上升幅度显著大于株系DH106,表明早衰型小麦的抗盐性低于延迟衰老型小麦。CaCl2处理显著缓解了盐胁迫对细胞膜的伤害,且表现为早衰型小麦DH70的响应强于延迟衰老型小麦DH106,CaCl2浓度为40 mmol·L−1时缓解效果最佳。在本研究中,CaCl2浓度达60 mmol·L−1时,其缓解能力下降,说明过高浓度的CaCl2处理抑制植物生长,这可能是由于细胞质中维持了过多的钙离子从而伤害了细胞质活性。
本研究结果表明:施加外源CaCl2浓度为40 mmol·L−1时,对盐胁迫的缓解效果最佳,这与闫振等[23]对蔷薇Hulthemia berberifolia的最适缓解浓度为10 mmol·L−1有所不同,推测CaCl2对盐胁迫下不同植物的缓解效果不同,因此研究所得的最适调控浓度也不同;与侯颖等[24]研究所得的对盐胁迫下小麦的最适调控浓度为6 mmol·L−1也不相同,说明即使研究材料同为小麦,若基因型不同,受到CaCl2的缓解效果也不尽相同。
综上所述,2个基因型的小麦株系在300 mmol·L−1盐胁迫下生长受到了明显的抑制,且表现出早衰型小麦DH70受到盐胁迫的伤害大于延迟衰老型小麦DH106。不同浓度的CaCl2处理均增强了小麦幼苗的抗氧化酶活性,提高了小麦幼苗的耐盐性,减轻了小麦所受盐害,且各浓度的CaCl2处理对盐胁迫的缓解效果存在差异,以40 mmol·L−1的浓度缓解效果最佳。
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表 1 RT-qPCR所用引物
Table 1. Primers for fluorescence RT-qPCR
引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明:引物参考文献[16]。 -
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