下载:
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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉，春初出叶，叶片为带状，宽约1.0 cm，长约30.0 cm，叶顶钝圆；秋初开花，花茎高约60.0 cm，伞形花序4~6朵，6片倒披针形花瓣，长约4.5 cm，宽约1.0 cm；花多淡紫红色，花被顶端蓝色，花色花型丰富，是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前，换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主，分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术，以换锦花为母本，中国石蒜L. chinensis为父本，选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans；张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源，表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长，在自然状态下授粉率低且结实少，种子萌发率低，制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷，不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径，主要由结构基因和调控基因共同调控，花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响，植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7]，花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明：R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子，常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因，周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列，为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络，本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析，通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能，结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
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2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣，取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B)，液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
图 1 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系盛花期(B)
Figure 1. Different stages of flower development (A) and peak flowering stage in different clonal plants (B)
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采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15]，参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
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根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F：CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R：AGAACAGCACTACTAAAGGT，参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列，PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸90 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照；采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA，于−20 ℃保存备用。
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参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞；在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜，挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中，37 ℃振荡培养，PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序；采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA，于−20 ℃保存。
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采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1)，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法，于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL)：cDNA(＜100 ng) 1.6 uL，正反引物各0.8 uL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL，RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以LsGADPH为内参基因[15]，2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量，重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物
Table 1. Primers for fluorescence RT-qPCR
引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明：引物参考文献[16]。 -
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g，加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液，振荡混匀；20 ℃超声提取30 min；12 000 r·min−1，离心15 min，取上清液；0.45 μm滤膜过滤；梯度洗脱：流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B)，0~20 min(A体积分数从5%升至60%)，20~25 min(A体积分数从60%升至100%)，25~30 min(A体积分数保持100%)，流速1 mL·min−1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 uL；以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
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采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580，再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上，并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选，挑选阳性克隆进行菌液PCR检测，成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体，采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA；聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体，用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
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采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7：利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R：GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG；用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列，T4 DNA连接酶连接载体与目的序列，转化大肠埃希菌DH5α，并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选，提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
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采用微量注射法转化换锦花花苞[12]，将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中，28 ℃，220 r·min−1振荡培养12~14 h；4 000 r·min−1, 离心10 min，去上清液；加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2，pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0；将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀，室温黑暗静置4~6 h；使用1 mL注射器，吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞，在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液，充分侵染换锦花花苞，侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
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采用Excel 2020 统计和整理数据，采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析，采用Graphpad 8.0作图。
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以换锦花花瓣的cDNA为模板，采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF)，编码274个氨基酸，分子量为6.84 kD，蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258，理论等电点(pI)为5.04，不稳定系数为43.43，总体亲水性(GRAVY)为0.936。
图 2 全长序列克隆结果
Figure 2. Full length of RT-qPCR
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通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对，发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3)，属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%，其中，与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%，其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%)，与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%，且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域，而C端的同源性较低。
图 3 LsMYB7与其他植物的R2R3-MYB氨基酸同源序列比对
Figure 3. Comparison of R2R3-MYB amino acid homologous sequences between LsMYB7 and other plants, R2R3-MYB
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从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19]，LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类，由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程，响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应，同一亚族基因的功能相似，结合花色基因表达分析，推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
图 4 LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB蛋白系统进化树
Figure 4. Phylogenetic tree between LsMYB7 and R2R3-MYB from A. thaliana
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利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B)，结果表明：换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素，含有少量的天竺葵素和飞燕草素，说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育，花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势，小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍，说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A)；在浅色换锦花无性系H4和H5中，矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此，从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看，矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大，矢车菊素质量浓度越高，换锦花花瓣的颜色就越深。
图 5 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系(B)花瓣的花色苷质量浓度
Figure 5. Anthocyanin contents in petals of different stages of flower development (A) and different clones (B) of L. sprengeri
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利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析，结果(图6)表明：LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势，LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达，LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达，盛花期开始大量表达，而在败花期表达量开始下降；LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
图 6 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同花发育时期的表达
Figure 6. Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower development stages
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LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反，而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致，这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此，LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
图 7 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同无性系中的表达
Figure 7. Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower clones
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通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7，转化烟草原生质体，于激光共聚焦荧光显微镜观察，LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8)，说明LsMYB7基因为转录因子基因，在细胞核中起转录调控的作用。
图 8 LsMYB7的亚细胞定位
Figure 8. Subcellular localization of LsMYB7
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构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7，通过微量注射法转化换锦花花苞，LsMYB7 基因沉默后，换锦花同朵花中一半花瓣明显变短，且颜色变深(图9A)；对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C)，与ck (空载)相比，LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降，同时，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P＜0.01)，而LsF3H基因的表达量反而上升，LsC4H基因表达变化不大，说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育，且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用，而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
图 9 LsMYB7基因沉默后表型变化及花色苷形成相关基因的表达
Figure 9. Phenotype and relative expression levels of LsMYB7 and genes related to anthocyanin biosynthesis after LsMYB7 silenced
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植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同，拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族，其中，拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22]，换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明，LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应，其中，AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下，ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗，获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明：LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3，属R2R3-MYB类转录因子，且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源，系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类，推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中，LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致，推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族，未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26]，而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性，其中，花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明：干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达，通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降，说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累，而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类，由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月，此时多为高温和干旱季节，因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达，大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似，因此，植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累，进而提高抗旱能力。
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本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列，开放阅读框(ORF) 825 bp，编码274个氨基酸，LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族，定位于细胞核，与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类；LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达，与花色苷合成相关基因的表达趋势一致；LsMYB7基因沉默后，换锦花部分花瓣明显变短，颜色变深，LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调，因此，LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育，且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外，LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累，进而提高换锦花的抗旱能力，LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
Cloning and function analysis of LsMYB7 gene in Lycoris sprengeri
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摘要:
目的 研究转录因子LsMYB7基因对换锦花Lycoris sprengeri花色苷积累的调控作用。 方法 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法从换锦花花瓣中克隆获得花色苷形成相关R2R3-MYB转录因子LsMYB7基因，并进行生物信息学分析，再通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究LsMYB7基因对花色苷积累的调控作用。 结果 克隆到1条长951 bp的 LsMYB7基因cDNA序列，开放阅读框(ORF)为825 bp，编码274个氨基酸，LsMYB7蛋白含有2个R2和R3结构域，属R2R3-MYB转录因子家族；系统进化分析表明LsMYB7与拟南芥Arabidopsis thaliana S22亚族基因聚为一类；LsMYB7亚细胞定位于细胞核，在不同花发育阶段和不同花色无性系中，LsMYB7基因表达与花色苷合成相关基因的表达趋势一致，主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达；LsMYB7基因沉默后，换锦花花瓣明显变短，颜色变深，且LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调。 结论 LsMYB7属R2R3-MYB转录因子家族S22亚族，通过正向调控LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷生物合成相关基因的表达促进花色苷积累。图9表1参31 -
关键词:
- 换锦花 /
- R2R3-MYB转录因子 /
- 花色苷积累 /
- 病毒介导的基因沉默 /
- 调控作用
Abstract:Objective The purpose is to study the regulatory effect of LsMYB7 gene on the accumulation of anthocyanins in Lycoris sprengeri. Method R2R3-MYB transcription factor LsMYB7 was screened from petals of L. sprengeri. The expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosynthesis was analyzed by real-time quantitative PCR technology (RT-qPCR). The function of LsMYB7 on anthocyanin accumulation was studied by virus-induced gene silencing (VIGS) technology. Result A 951 bp LsMYB7 gene cDNA sequence was cloned from petals in L. srprengei, containing 825 bp open reading frame (ORF) which encoded 274 amino acids. LsMYB7 protein contained two R2 and R3 domain, and belonged to R2R3-MYB transcription factor family. Phylogenetic analysis showed that LsMYB7 was clustered one group with Arabidopsis thaliana S22 subfamily genes, involved in regulating responses to abiotic stress such as drought and high temperature. LsMYB7 was localized in the nucleus. The expression trend of LsMYB7 gene was consistent with genes related to anthocyanin biosynthesis in different flower development stages and different flower color clones, and mainly expressed in petals of H1 clones with high anthocyanin content and last flowering period. The petals of L. sprengeri became significantly shorter and darker in color, and the expression of genes related to anthocyanin biosynthesis, such as LsCHS, LsF3'H, LsANS, LsUFGT1, and LsUFGT2, was significantly downregulated after LsMYB7 gene being silenced. Conclusion LsMYB7 belongs to S22 subfamily of the R2R3-MYB transcription factor family, and gets involved in regulating the expression of genes (like LsCHS, LsF3'H, LsANS, LsUFGT1 and LsUFGT2) related to anthocyanin biosynthesis and promoting anthocyanin accumulation. [Ch, 9 fig. 1 tab. 31 ref.] -
小麦Triticum aestivum是世界范围内种植面积最广、产量最多的粮食作物之一。随着自然进化与人类科技进步，世界农业育种已经历了驯化育种、传统育种和分子育种3个时代[1]。目前，仅依靠常规育种技术，包括小麦在内的主要作物的产量已经达到了相当高的水平，但仍然不能满足未来需求[2]。小麦传统育种以杂交育种为中心，选育出了许多高产、稳产、高抗的优异品种。但传统育种周期长、效率低和遗传背景狭窄等问题日益突出[3]。基因组学、系统生物学、合成生物学和人工智能等前沿学科的交叉融合，催生了融合遗传学、细胞生物学、现代生物工程技术和信息技术等现代生物育种技术[4−5]。
文献计量学是以文献或文献相关媒介为研究对象，采用数学、统计学等计量方法，研究文献和文献工作系统的数量关系和规律，以及探讨科学技术动态特征的一门学科[6]。在小麦研究领域，王瑞[7]、GIRALDO等[8]和孟静等[9]分别对2018年以前发表的小麦相关学术文献或专利开展了文献计量学分析，并探索了小麦研究的不同研究主题和研究前沿。2014年国际小麦研究联盟发表了首个小麦基因组草图，2018年发布了第2版小麦基因组序列[10]。此后，人工智能、自动表型、基因组育种等现代生物技术得到了广泛应用，小麦生物育种进入了快速发展的时代[11]。因此，了解这个阶段小麦生物育种的发展过程和特点，有助于预测小麦生物育种的未来研究方向，对保障粮食安全至关重要。近年来，随着人工智能的发展，利用机器学习方法处理大量文字信息，建立文本模型的自然语言处理(NLP)被应用到医学研究和社会科学等领域[12−13]，然而该方法在农业生物领域应用较少。
为全面了解小麦生物育种的发展态势和研究趋势，本研究基于Web of Science核心合集数据库检索小麦生物育种相关文献，结合文献计量学和机器学习方法，分析了国内外小麦生物育种相关的学术文献，包括发文的年代分布特点、主要发文国家、发文机构、研究热点与前沿、研究主题等，旨在揭示小麦生物育种领域的学术研究态势，为小麦育种的理论研究和学科发展提供参考。
1. 材料与方法
1.1 数据来源
本研究文献数据来源于Web of Science核心合集数据库，引文索引数据库包括科学引文索引(SCIE)、社会科学引文索引(SSCI)、会议论文引文索引(CPCI-S、CPCI-SSH)和化学信息数据库(IC、CCR)。通过文献调研、专家咨询和多次试检索，本研究以转基因、基因组育种、基因编辑、合成生物学等生物育种关键技术在小麦中的应用为检索策略，检索年限为2013—2024，检索得到的16 151篇文献作为本研究的数据来源。检索日期为2024年8月31日。
1.2 数据分析
分析国家、研究机构、作者的发文量和影响力时，使用WoS数据库平台中自带的分析功能，并结合Excel软件进行分析。由于本研究数据来源截止到2024年8月31日，数据库中2024年的相关文献仍在更新中，所有年度趋势仅显示2013—2023的分析结果。使用VOSviewer 1.6.20构建知识图谱。在进行国家合作网络分析时，国家最少发文数量设为35篇。在对作者关键词进行共现网络分析时，关键词最小频次设为30次，分析前对关键词进行清洗，合并同义关键词。
潜在狄利克雷分配(LDA)用于确定每篇文章中的研究主题[14]。LDA模型是一种非监督机器学习的文本挖掘方法，能够从大规模的文档集中识别出潜藏的主题信息。LDA算法的主题网络分析突出了相互关联的主题集群共同出现的区域，并将相似的主题进行聚类，突出主题之间的关系。通过分析所有索引文章的摘要来对主题进行建模，并将确定的主题数量设置为50。根据算法计算出每个主题的概率，最终确定每篇文章所属的主题，并进行手动检查来命名每个主题。通过计算每个文档中不同主题同时出现的次数，建立1个主题互作网络，明确主题之间的联系。所有R和Python代码参考文献[14]。
2. 结果与分析
2.1 年度发文分布
2013—2024年小麦生物育种领域发表的16 151篇文献的年度发文量显示(表1)：从2013年开始每年发文量均在900篇以上，且呈逐年上升趋势，在2022年达到了1 931篇，2023年发文量略有下降。从每年的发文量增量来看，2014—2018年以每年33~107篇的速度稳步增加，2019年发文量出现跳跃式增长，比2018年增加了223篇。2019年后小麦生物育种发文量的快速增长可能与2018年发布第2版小麦基因组序列有关。虽然2023年后小麦生物育种发文量出现下降趋势，但小麦生物育种仍处于快速发展的重要阶段，是近年来的热门研究领域。
表 1 小麦生物育种领域2013—2023年度发文量Table 1 Annual publications of wheat bio-breeding during 2013－2023出版年份 发文量/篇 出版年份 发文量/篇 出版年份 发文量/篇 出版年份 发文量/篇 2013 906 2016 1 113 2019 1 520 2022 1 931 2014 1 013 2017 1 217 2020 1 671 2023 1 681 2015 1 080 2018 1 297 2021 1 760 2.2 主要发文国家
小麦是世界三大粮食作物之一。共有123个国家参与了小麦生物育种研究(图1)，说明小麦生物育种研究是全球广泛关注的学科领域。在所有国家中，中国发文量最多(5 389篇)，随后是美国(2 695篇)、澳大利亚(1 489篇)和印度(1 398篇)。中国发文量明显高于其他国家，在全球小麦生物育种研究领域具有竞争优势。在文献影响力方面，中国的总被引频次最高，美国次之，随后是澳大利亚、英国和德国。在篇均被引频次方面，挪威、瑞士、英国、德国、法国、荷兰等发达国家普遍高于发展中国家。中国发表论文数量远远超过其他国家，但篇均被引仅为20.5次，说明中国小麦生物育种研究在提高科研产出数量的同时，还需要进一步提高科研影响力。
图 1 小麦生物育种全球发文情况和被引频次Figure 1 Worldwide scientific production and citations in the research field of wheat bio-breeding本研究使用VOSviewer软件对小麦生物育种的主要发文国家进行合作网络分析(图2)。由图2可见：发文量较多的58个国家形成了5个不同合作集群，分别以中国和美国(紫色)、英国和德国(绿色)、土耳其和伊朗(红色)、巴基斯坦和埃及(蓝色)、澳大利亚和印度(黄色)为代表。其中，中国是发文最多的国家，但美国是国际合作最多的国家(链接数为58个，总链接强度为2 855)。与中国合作最多的5个国家是美国(链接强度为536)、澳大利亚(链接强度为375)、巴基斯坦(链接强度为271)、加拿大(链接强度为135)和墨西哥(链接强度为129)。国际合作不仅能促进了中国小麦生物育种科研产出的数量，也能提高论文的国际影响力。
2.3 主要发文机构
从机构发文量来看，在小麦生物育种领域发文较多的机构有美国农业部、中国农业科学院、国际农业研究磋商组织、西北农林科技大学、国际玉米小麦改良中心等(表2)。西北农林科技大学是发文量进入前5位的高等学校，在此领域的科研实力较强。在学术影响力方面，英国生物技术与生物科学研究理事会(BBSRC)、英国研究与创新署(UKRI)、法国国家农业食品与环境研究院(INRAE)、英联邦科学与工业研究组织(CSIRO)、堪萨斯州立大学具有较高的篇均被引频次。中国在小麦生物育种领域的主要研究机构是中国农业科学院、西北农林科技大学、中国科学院等，在世界上处于第一梯队。
表 2 小麦生物育种领域的主要发文机构Table 2 Most publishing institutions in the research field of wheat bio-breeding机构 发文量/
篇总被引
频次/次篇均被引
频次/次机构 发文量/
篇总被引
频次/次篇均被引
频次/次美国农业部 1 145 29 407 25.7 堪萨斯州立大学 498 20 780 41.7 中国农业科学院 1 115 25 663 23.0 四川农业大学 432 6 742 15.6 国际农业研究磋商组织 970 29 080 30.0 英联邦科学与工业研究组织 428 17 861 41.7 西北农林科技大学 861 17 803 20.7 法国国家农业食品与环境研究院 388 18 639 48.0 国际玉米小麦改良中心 818 26 104 31.9 埃及知识库 383 7 608 19.9 印度农业研究理事会 732 12 926 17.7 华盛顿州立大学 381 9 639 25.3 中国科学院 702 21 794 31.0 中国农业大学 377 9 910 26.3 中国农业与农村部 605 11 806 19.5 河南农业大学 371 7 505 20.2 英国研究与创新署 504 24 995 49.6 加拿大农业与农业食品部 348 10 435 30.0 生物技术与生物科学研究理事会 503 24 980 49.7 南京农业大学 328 6 900 21.0 2.4 研究热点和趋势
为了探索小麦生物育种的研究热点和趋势，利用VOSviewer对小麦生物育种领域发表文献的关键词进行共现和演化分析，生成关键词共现标签视图(图3A)。可以看出：在频次大于30的关键词中，产量(yield)这一关键词的节点最大，说明产量是小麦生物育种的重点，其次是数量性状位点 (QTL)、硬粒小麦(durum wheat)、全基因组关联分析(GWAS)、干旱(drought)、 基因表达(gene expression)、育种(breeding)、单核苷酸多态性(SNP)和分子标记(molecular markers)。
图 3 小麦生物育种研究关键词共现图谱(A)和新兴关键词年度分布(B)Figure 3 Co-occurrence overlay visualization of author keyword (A) and yearly trends of newly emerging keywords (B) in the research field of wheat bio-breeding由图3A可见小麦生物育种领域研究热点的演变。代表性的蓝色节点有简单序列重复 (SSR)、小麦叶锈菌Puccinia triticina、RNA干扰(RNAi)等。这些技术或领域在较早的时期就被大量研究，而近年来的研究进展缓慢或有下降趋势，说明小麦生物育种中的相关研究已经相当成熟或有新的技术方法得到应用。代表性的绿色节点，如yield、breeding、QTL、durum wheat、drought等关键词增长平缓。黄色节点的关键词在近几年的研究中较为活跃，可能代表新兴的研究方向，代表性的关键词包括GWAS、竞争性等位基因特异性PCR (KASP)、候选基因 (candidate genes)、基因组编辑 (genome editing)、转录组 (transcriptome)、 机器学习(machine learning)等，说明这些技术或领域是近年来的研究热点，科研产出上升较快。
为了清楚地了解这些词的变化趋势，选取了平均出版年数值大于2020(即关键词所在文献的平均出版年在2020年之后)，并且出现频次较高的前30个关键词，对其年度分布进行了分析(图3B)。可以看出：GWAS相关的年度产出要明显高于其他关键词。GWAS在2017前发文还较少(出现频次低于10次)，2017年后迅速增长，2022年已成为小麦生物育种研究中最大的热点(出现频次高于同年其他关键词)。有些关键词在2017年以前没有或只有少量相关研究，2017年后逐渐兴起，如KASP、CRISPR、 高通量表型分析(high-throughput phenotyping)、基因组编辑、无人机 (UAV)、机器学习等。这与近年来组学、生物技术、高通量表型和人工智能等现代生物育种技术的发展和广泛应用相关。
2.5 LDA研究主题分析
本研究提取了16 151篇文献的摘要，进行LDA分析，建立语言模型，识别研究主题，最终将所有文献归为50个研究主题。进一步根据Luovian聚类将50个主题分为了5个主题网络集群，以5种不同的颜色显示(图4A)。
图 4 小麦生物育种研究LDA主题网络聚类分析(A)和年度发文量分析(B)Figure 4 Topic cluster network by LDA (A) and yearly trends of different research topics (B) in the research field of wheat bio-breeding在以遗传定位为代表的主题网络集群(绿色区域)中，研究较多的主题是QTL、GWAS、遗传多样性(genetic diversity)、基因标记(gene marker)、表型分析(phenotyping)、模型预测(model prediction)等。其中GWAS、基因标记、基因组测序和QTL之间联系紧密，而表型分析、模型预测和遗传选择(genetic selection)之间联系紧密，表明现代小麦遗传育种涉及了表型、基因组、基因定位和育种模型的联合分析以及重要基因的遗传定位。在以基因组和育种研究为代表的主题网络集群(紫色区域)中，包括小麦基因组(wheat genomes)、染色体易位(chromosome translocation)、硬粒小麦、地方品种(landraces)、突变体(mutants)、淀粉(starch)、开花(flowering)、株高(height)等研究主题。在以生物逆境为代表的主题集群(红色区域)中，包括锈病抗性(rust resistance)、赤霉病(fusarium head blight, FHB)、病原菌(pathogens)、叶片光合作用(leaf photosynthesis)等研究主题，其中锈病抗性相关研究发表文章最多。在以非生物逆境为代表的主题集群(蓝色区域)中，研究较多的主题是盐胁迫(salt stress)、高温胁迫(heat stress)、干旱胁迫(drought stress)、氮效率(nitrogen efficiency)、根系生长(root growth)等。在以产量形成为代表的主题网络集群(橙色区域)中，主要包括产量、产量稳定性(yield stability)、灌浆(grain filling)、基因型与环境互作(genotype-environment interaction)等研究主题。对每个主题的年度发文量进行分析，发现锈病抗性相关的研究近年来发文量持续增多，在2022年达到了207篇，是小麦生物育种的热点研究主题，其次是QTL、面粉品质(flour quality)、干旱胁迫(drought stress)、病原菌、脱落酸、GWAS等相关主题(图4B)。2022年GWAS相关文章发表124篇，与2013年相比增长了接近10倍，是论文数量增长最快的主题，该结果与关键词共现和演化分析结果一致。
3. 讨论
本研究利用文献计量学和机器学习的方法对小麦生物育种的现状、前沿热点和发展趋势进行分析总结。过去10 a是小麦生物育种迅速发展时期。然而，对于国内外小麦生育物育种研究论文的文献计量学分析还停留在2018年以前[7−9]，无法反映小麦生物育种研究的现状和趋势。本研究从Web of Science (WoS)核心合集数据库中检索2013—2024年发表的小麦生物育种相关文献，共计16 151篇。结果显示：2013年以来，全球小麦生物育种研究的科研产出大幅增加，全球123个国家参与小麦生物育种研究，全球小麦生物育种研究正处于快速发展阶段，是近年来的热门研究领域。中国是发表小麦生物育种相关论文最多的国家，还拥有最多的一流大学和研究院所，对小麦研究的重视程度高。
对2018年前发表的小麦研究相关文献分析显示：小麦遗传育种关键词主要集中在产量、品质、品种、遗传多样性、数量性状位点和分子标记等传统育种和分子育种相关词汇[7−9]。本研究的关键词共现分析表明：产量、数量性状位点、全基因组关联分析、干旱、基因表达、单核苷酸多态性等关键词出现的频率最高。随着测序技术的发展，数量性状位点和全基因组关联分析相关研究迅速增多。目前在小麦中已鉴定超过27 500个数量性状位点，其中大部分的数量性状位点是近10 a间鉴定的[15]。近年来还出现了高通量表型分析、无人机、机器学习、深度学习、基因组编辑、规律间隔成簇短回文重复序列等现代生物技术相关的关键词。多篇文章整合表型组、基因组、代谢组、机器学习和基因编辑等技术对小麦重要性状进行遗传解析[16−20]。该结果说明，现代生物育种和信息技术已经开始应用到小麦育种[21−22]。也需要注意的是，这些新兴关键词出现的频率还不高，说明小麦生物育种研究未来需要进一步加强现代生物技术的应用。另外，LDA主题词汇分析表明：锈病、数量性状位点、面粉品质、干旱、全基因组关联分析等相关研究的发文量增长较快。这些主题成为近年来的热点研究领域，可能是由于小麦基因组序列的发布和小麦遗传转化技术的突破。比较而言，分子标记、育种选择等主题增长缓慢或停滞。叶锈病是研究最多的主题，有超过80个叶锈病抗性基因应用于小麦抗病育种[23]。随着全球气候变化加剧，干旱和盐胁迫越来越受到重视，多基因聚合和转基因技术被用来改良综合抗性，实现多性状协同的目标[24−25]。这些结果说明小麦生物育种研究更加关注抗性与产量的协同提升。
4. 结论
在过去10 a间，小麦基因组测序的完成和现代生物技术的应用极大地推动了小麦生物育种的发展。然而还存在几点不足：高影响力和高水平基础研究占比小；关于基因编辑技术开发、基因组选择算法、转基因技术的基本机制的研究很少；对代谢物营养品质、抗病和抗逆机理研究不足；关键基因在育种中的应用研究很少。未来还需要充分利用包括组学、自动表型、人工智能、基因编辑、基因组育种等现代生物技术，发掘和利用重要基因，开展多基因聚合育种，大幅提高小麦产量的同时，改良综合抗性和适应性，实现多性状协同提升。
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图 1 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系盛花期(B)
Figure 1 Different stages of flower development (A) and peak flowering stage in different clonal plants (B)
图 3 LsMYB7与其他植物的R2R3-MYB氨基酸同源序列比对
Figure 3 Comparison of R2R3-MYB amino acid homologous sequences between LsMYB7 and other plants, R2R3-MYB
图 4 LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB蛋白系统进化树
Figure 4 Phylogenetic tree between LsMYB7 and R2R3-MYB from A. thaliana
图 5 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系(B)花瓣的花色苷质量浓度
Figure 5 Anthocyanin contents in petals of different stages of flower development (A) and different clones (B) of L. sprengeri
图 6 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同花发育时期的表达
Figure 6 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower development stages
图 7 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同无性系中的表达
Figure 7 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower clones
图 9 LsMYB7基因沉默后表型变化及花色苷形成相关基因的表达
A.表型变化；B. LsMYB7基因的表达；C. 花色苷形成相关基因的表达**表示差异极显著(P＜0.01)
Figure 9 Phenotype and relative expression levels of LsMYB7 and genes related to anthocyanin biosynthesis after LsMYB7 silenced
表 1 RT-qPCR所用引物
Table 1. Primers for fluorescence RT-qPCR
引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明：引物参考文献[16]。 
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