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森林植被退化改变了森林结构，导致林地土壤质量下降，引发林地水土流失[1−2]。南方红壤区由于降水丰沛且季节分明，产流率高，退化林地土壤侵蚀严重[3]，森林生态系统功能被严重削弱。在森林生态系统中，土壤作为植物生长的基质和环境，其质量是影响森林可持续发展的重要因素。酶作为土壤中最活跃的成分之一，可活化各种养分[4−5]，其高低可衡量土壤肥力水平[6]，同时对土壤养分的循环过程也有敏感的响应。因此，监测植被恢复中的土壤养分及酶活性，可以更深入地了解土壤退化和恢复程度[7]。
目前，针对退化林地修复过程中土壤养分与酶活性关系的研究集中于人工林恢复措施，普遍认为植被恢复可提高土壤养分含量和酶活性。如张国微等[8]对比了喀斯特山地滇柏Cupressus duclouxiana纯林、刺槐Robinia pseudoacacia纯林和滇柏-刺槐混交林3种人工林与未造林地的差异，发现人工林土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷含量及酶活性均显著高于未造林地，土壤全氮、全磷能解释酶活性变异的60.7%；李欢等[9]对元谋干热河谷沟蚀区域植被恢复前后土壤理化性质与酶活性的关系进行研究，发现植被恢复后土壤酶活性化学计量显著提高，且与土壤碳含量显著正相关；梁燕芳等[10]研究发现：间伐均能提高杂交松人工林土壤养分含量及酶活性，中等强度的间伐对土壤质量的改善效果最明显。
等高反坡阶整地属于人工微地形带状整地措施，能有效拦蓄径流及表土携带的养分[11]，提高水分入渗[12]等，进而维持土壤原有组分和理化状态，已成为坡耕地水土保持的重要措施。等高反坡阶整地因工程量小、扰动小、实施简单等特点，也可用作坡面植被恢复的辅助措施[13]，可优化林地生长环境，加快植被恢复过程中林木的生长速率，并丰富植物群落结构[14]。此外，在云南松Pinus yunnanensis坡林地生态系统碳储量及分配格局的研究中发现：等高反坡阶整地显著提高云南松林生态系统生物量55.56%，碳增量达29.68%[15]。目前，关于坡林地等高反坡阶整地多围绕植被恢复效果[16]、乔木层及林下碳储量及碳增量[17]等方面开展研究，而就其如何影响植被恢复过程中土壤养分和酶活性的研究鲜有报道。因此，本研究以昆明市松华坝水源区迤者小流域的退化云南松坡林地为对象，研究等高反坡阶整地对土壤养分质量分数和酶活性的影响，揭示该措施退化林地土壤修复机制，为滇中地区红壤坡面退化林地修复提供理论依据。
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研究区位于云南省昆明市松华坝水源区迤者小流域(24°14′~25°12′N，102°44′~102°48′E)，平均海拔为2 220 m，属于典型低纬度高原山地季风气候，年均气温≥10 ℃，年均降水量为785 mm。地带性植被是以云南松为优势种的暖温性针叶林，灌草为云南杨梅Myrica nana、扭黄茅Heteropogon contortus、金丝草Pogonatherum crinitum等。流域受河流迂回切割影响，形成丘陵剥蚀地貌及土壤中轻度流失区，原坡地云南松林因过度砍伐、放牧等人为因素被毁严重，在1985年区域森林覆盖率降至27%[18]。
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选取林分、林龄、植被密度、立地条件(海拔为2 100 m，坡度为15°，坡向为东北向)、土壤类型(红壤)等条件一致的云南松次生林，设置5 m×20 m样地，样地仅实施等高反坡阶整地，未采取人工造林措施。2022年5月中旬开展研究，设置等高反坡阶整地10 a样地(2009年6月开展研究)和等高反坡阶整地1 a样地(2021年6月开展研究)，以相应原状坡面为对照(ck)，每类样地均设置3块。2009年布设样地时，云南松林龄为11 a，植被密度为(3 891±49) 株·hm−2。等高反坡阶即沿等高方向从上向下里切外垫，修成一反坡台面，宽为1.2 m，反坡角为5°，以蓄水保土为目的。每个样地共布设3条等高反坡阶，每2个反坡阶之间的坡面水平距离为4 m，反坡阶面积约占样地总面积的18.0%，如图1所示。
图 1 等高反坡阶布设示意图
Figure 1. Sketch map of contour reverse-slop terrace setting
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于2022年5月中旬，用土壤剖面法采集各样地不同土层(0~10、10~20、20~30和30~40 cm)样品，其中0~10 cm定义为表层。为反映反坡阶的作用，在样地内中间反坡阶的阶上1.0 m和阶下1.0 m位置采样，同时采集ck样地的相应位置，每个位置布设3个采样点(图1)，分别将同一位置3个采样点同一土层样品混匀后，装入无菌自封袋中；取部分样品用冰袋迅速运回实验室，放入4 ℃冰箱保存，用于土壤酶活性测定，其余土样运回后在室内阴凉处自然干燥，磨碎并过筛用于土壤养分测定。
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土壤养分测定主要参照《土壤农化分析》[19]。土壤有机质采用重铬酸钾容量法-外加热测定；全氮采用浓硫酸-过氧化氢消煮、凯氏定氮仪测定；全磷采用浓硫酸-过氧化氢消煮、ICP-OES测定；碱解氮采用扩散吸收法；速效磷采用盐酸-氟化铵浸提、紫外可见分光光度计比色法测定；速效钾采用1 mol·L−1中性醋酸铵浸提、火焰光度计测定；pH采用电位法测定。
土壤酶活性测定主要参照《土壤酶及其研究法》[20]。脲酶活性、蔗糖酶活性和酸性磷酸酶活性分别采用苯酚-次氯酸钠、3,5-二硝基水杨酸、磷酸苯二钠紫外可见分光光度计比色法测定；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定。
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运用SPSS 26进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平为0.05；采用Origin 2021进行Pearson相关性分析；采用Canoco 5进行冗余分析(RDA)。
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如表1所示：研究区土壤pH为4.4~5.2，呈酸性。等高反坡阶整地实施后，阶上和阶下的土壤全氮、全磷、碱解氮、有机质和速效钾质量分数均显著高于ck相应位置(P＜0.05)，且10 a＞1 a＞ck。1和10 a表层土壤养分质量分数阶下均显著高于阶上(P＜0.05)，而ck阶上和阶下的相应位置土壤养分质量分数差异不显著(P＞0.05)。随着土层深度的增加，1和10 a阶上和阶下土壤养分质量分数呈先增大后减小的趋势，ck变化不显著(P＞0.05)。可见，等高反坡阶整地实施后显著提高了坡林地阶上和阶下的土壤养分质量分数，改变了原状坡面养分分布规律。
表 1 等高反坡阶整地下土壤养分空间分布
Table 1. Spatial distribution of soil nutrients under contour reverse-slope terrace measures
取样
位置土层/
cm实施
措施pH 有机质/
(g·kg−1)全氮/
(g·kg−1)碱解氮/
(mg·kg−1)全磷/
(g·kg−1)速效磷/
(mg·kg−1)速效钾/
(mg·kg−1)阶上 0~10 ck 4.5±0.0 Ca 23.3±0.3 Ca 5.7±0.0 Ca 78.1±1.0 Ba 0.3±0.0 Ba 16.8±0.4 Ba 45.4±0.4 Ba 1 a 4.7±0.0 Ba 34.2±1.5 Ba 8.9±0.1 Ba 104.7±2.5 Aa 0.3±0.0 Ba 16.8±0.4 Ba 53.8±2.2 Aa 10 a 4.9±0.0 Aa 55.6±0.3 Aa 11.9±0.1 Aa 109.2±2.4 Aa 0.7±0.1 Aa 18.7±0.3 Aa 62.2±1.7 Aa 10~20 ck 4.3±0.0 Ca 18.3±0.8 Bb 4.7±0.1 Bab 41.4±0.7 Bb 0.3±0.0 Ba 14.8±0.6 ABb 43.2±0.4 Bb 1 a 4.6±0.1 Bab 18.4±1.5 Bb 5.7±0.2 Bb − 0.3±0.0 Bb 12.8±0.5 Bb 46.4±1.7 ABab 10 a 4.8±0.0 Aa 47.9±0.7 Ab 8.1±0.1 Ab 89.0±0.8 Ab 0.4±0.1 Ab 17.6±1.4 Aa 52.2±0.4 Ab 20~30 ck 4.4±0.0 Ba 13.4±0.8 Bc 3.4±0.2 Cb − 0.3±0.0 Ba 12.1±0.4 Ac 40.6±0.4 Cc 1 a 4.5±0.1 Bb 15.3±1.4 Bbc 5.2±0.2 Bb − 0.3±0.0 Bb 10.9±0.6 Abc 44.2±1.2 Bab 10 a 4.7±0.0 Aa 34.0±0.5 Ac 6.5±0.4 Ac 64.7±2.0 Ac 0.3±0.0 Ab 12.4±0.1 Ab 51.7±0.1 Ab 30~40 ck 4.4±0.1 Aa 8.0±1.3 Bd 2.9±0.1 Bb − 0.2±0.0 Ab 9.9±0.2 Ad 39.6±0.5 Bc 1 a 4.5±0.1 Ab 11.7±0.7 Bc 3.3±0.2 Bc − 0.2±0.0 Ab 10.5±0.7 Ac 43.6±0.8 Bb 10 a 4.9±0.2 Aa 26.0±1.4 Ad 4.4±0.2 Ad 59.6±2.8 Ac 0.3±0.0 Ab 11.2±0.1 Ab 49.7±1.8 Ab 阶下 0~10 ck 4.5±0.0 Ca 20.9±2.1 Ca 6.1±0.2 Ba 84.6±1.8 Ba 0.3±0.0 Ca 17.1±0.2 Ba 45.8±0.2 Ba 1 a 5.1±0.0 Ba 39.4±0.7 Ba 11.8±0.1 Aa 138.9±2.4 Ba 0.5±0.0 Ba 16.0±1.0 Ba 60.6±0.5 Aa 10 a 4.8±0.0 Aa 63.0±0.2 Aa 13.2±0.3 Aa 155.8±4.2 Aa 1.3±0.1 Aa 30.6±0.7 Aa 67.5±0.4 Aa 10~20 ck 4.5±0.0 Ca 16.7±0.6 Cab 5.3±0.2 Ca 56.2±5.0 Bb 0.3±0.0 Ca 15.5±0.3 Bb 44.6±0.5 Ba 1 a 4.9±0.0 Bab 25.8±0.9 Bb 9.2±0.1 Bb 79.0±16.0 Bb 0.4±0.0 Ba 14.8±0.8 Bb 51.6±0.8 Ab 10 a 4.7±0.0Aab 53.0±1.4 Ab 11.5±0.0 Ab 142.0±12.3 Aa 1.0±0.0 Ab 25.9±0.5 Ab 56.8±0.6 Ab 20~30 ck 4.4±0.1 Ba 15.0±0.8 Cb 3.8±0.1 Bb 38.6±5.8 Bc 0.3±0.0 Bab 12.9±0.2 Bc 44.5±0.6 Ba 1 a 4.8±0.1 Abc 21.9±0.8 Bc 6.4±0.5 Ac 50.2±10.4 Bbc 0.3±0.0 Bb 12.0±0.6 Bbc 44.3±0.7 Bb 10 a 4.6±0.0 Ab 39.4±0.9 AC 7.7±0.2 Ac 86.5±0.4 Ab 0.7±0.0 Ac 17.6±0.1 Ac 51.3±0.8 Ac 30~40 ck 4.5±0.0 Aa 10.6±0.7 Bc 3.1±0.3 Bb − 0.2±0.0 Bb 11.7±0.4 Bd 41.7±0.2 Ba 1 a 4.7±0.1 Ac 12.0±1.1 Bd 4.1±0.4 Ad 28.6±4.4 Bc 0.3±0.0 Bb 10.5±0.9 Bc 41.9±0.7 Bb 10 a 4.6±0.1 Ab 26.4±1.3 Ad 5.0±0.0 Ad 63.8±6.3 Ab 0.6±0.0 Ac 16.4±0.8 Ac 50.2±0.3 Ac 说明：ck表示无整地措施；1 a表示实施1 a的等高反坡阶整地；10 a表示实施10 a的等高反坡阶整地；−表示未检出。不同大写字母表示同一土层不同整地措施间差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一整地措施不同土层间差异显著(P＜0.05)。 -
如图2所示：等高反坡阶整地阶上和阶下的土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶的活性比ck相应位置均显著提高(P＜0.05)，且10 a＞1 a＞ck，10 a等高反坡阶样地的土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性阶下比阶上分别高出24.2%、41.2%、16.9%和2.9%，1 a等高反坡阶样地分别高出19.2%、14.4%、16.1%和4.0%，ck阶上阶下差异不显著(P＞0.05)。随着土层深度的增加，阶上与阶下的土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性的差异程度明显增加，而酸性磷酸酶活性则呈先增加后降低的趋势。
图 2 等高反坡阶整地下土壤酶活性分布特征
Figure 2. Distribution of soil enzyme activities under contour reverse-slope terrace measures
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从图3可以看出：ck、1 和10 a样地土壤养分对酶活性的解释率分别为68.0%、88.0%和92.7%。ck和1 a样地的速效磷和全氮对土壤酶活性的解释率达显著水平(P＜0.05)，解释率分别为65.9%和88.0%；10 a样地的碱解氮、全氮和全磷对土壤酶活性的解释率达显著水平(P＜0.05)，解释率分别为88.7%、4.9%和2.5%。表明等高反坡阶整地提高了土壤养分指标对酶活性的解释程度，10 a样地的解释率达显著水平的指标最多。
图 3 等高反坡阶整地下土壤养分与酶活性冗余分析
Figure 3. Redundancy analysis of soil nutrients and soil enzyme activities under contour reverse-slope terrace measures
如图4所示：土壤养分与酶活性形成的两两组合中，ck和1 a样地达到显著水平的正相关关系分别有14组和34组(P＜0.05)，其中均有1组达到极显著水平(P＜0.01)，相关系数变化范围分别为0.26~0.99和0.53~0.99。10 a样地中，除pH外，其余养分与对应转化功能酶的活性均为正相关，相关系数为0.78~1.00，达极显著水平的组合有15组。等高反坡阶整地提高了土壤养分与具有对应转化功能土壤酶活性间的正相关关系，却降低了pH对土壤养分与酶活性的影响。
图 4 等高反坡阶措施下土壤养分特征与酶活性间的相关性分析
Figure 4. Correlation analysis between soil nutrient characteristics and soil enzyme activities under contour reverse-slope terrace measures
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土壤养分可直接衡量土壤质量和林木生长所需土壤养分元素的潜在供应能力[21−22]。本研究表明：相较于ck，1和10 a样地的土壤养分质量分数在同一土层深度显著提高，说明等高反坡阶整地可促进土壤养分积累。同时，等高反坡阶措施可促进云南松凋落物的蓄积[13]，增加土壤储水能力，提高凋落物的分解转化，提高土壤养分质量分数[17]。本研究还发现：土壤养分质量分数阶下显著高于阶上，这与等高反坡阶措施拦截径流、阻拦泥沙、增加养分入渗的作用有关。有研究表明：等高反坡阶对坡耕地径流和泥沙的削减率分别可达65.3%和80.7%[11−14]，导致土壤养分质量分数显著提高，其中全氮质量分数增加达1.09倍[23]。与原状坡面相比，等高反坡阶有效阻断了坡面径流的形成，且样地中坡位的土壤同时受到上部阶面截流保护及下部阶面营养富集效应的影响，出现土壤养分阶下高于阶上的结果，且10 a样地的提升效果高于1 a[13]。并且，阶下与阶上土壤养分的差异随着土层深度的增加而减小，即等高反坡阶整地对表层养分质量分数的提升效果更好，这与人工林植被恢复的研究现象相似[24−25]。表明土壤养分具有表聚性[24]，林地凋落物分布于土壤表层，通过分解转化可为土壤有机质等养分提供补充[25]，随着土层深度的增加，该补充作用逐渐减弱，再加上等高反坡阶整地表层土壤中植物根系的生长更集中，进而呈现出表层提升效果更明显的状况[26]。
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酶作为土壤生态系统中生化反应的重要催化剂，对土壤质量有指示作用，土壤质量越好，脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性越高。本研究10 a的样地中，土壤中蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性显著提高，这与相关的研究结果相似[27]。有研究表明：等高反坡阶整地对坡耕地根际土壤酶活性有显著提高作用，脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性比对照提高9.58%~92.92%[27]。等高反坡阶整地阻止了土壤养分和水分流失，这类似于植被恢复中的凋落物积累，植被恢复中，水分和土壤温度等环境因子得以改善，土壤动物、微生物的种类和数量、含氧量均为表层土壤高于深层[28−29]，本研究的等高反坡阶整地使阶下和表层土壤养分表聚和转化，促进了土壤微生物多样性形成，丰富的碳源及其他养分为酶促反应提供底物，利于胞外酶的产生，进而利于酶的催化反应，酶活性显著提高[30]。同时，本研究土壤酶活性表现出与养分相似的空间分布规律，进一步证明养分积累促进了土壤酶活性。
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在造林植被恢复、人工藻结皮覆盖相关研究中，养分和酶参与土壤物质能量转化过程时并非独立作用，而是彼此配合[31−32]。土壤养分质量分数与酶活性间存在相互促进的作用机制，酶促反应中，养分作为底物可激发酶活性，酶活性的提高反过来促进养分循环[33]。人工藻结皮覆盖通过提高盐碱地土壤养分质量分数及酶活性有效改善盐碱地土壤质量[31]，不同林龄杉木Cunninghamia lanceolata -红豆杉Taxus chinensis混交林改变了土壤养分状态，间接提高了土壤酶活性[32]。本研究的等高反坡阶整地具有提高退化坡林地土壤养分与酶活性正相关关系的作用，10 a样地的效果更明显。其原因在于等高反坡阶整地一方面通过阻断径流，增加入渗，为养分蓄积提供条件，在反应底物逐渐充足的过程中，土壤养分转化的相关酶活性被激活[14]；另一方面，养分蓄积刺激植物生长，其根系向土壤分泌更多的酶，可进一步提升土壤养分的转化和循环速率。在参与土壤生理生化反应过程中，土壤养分与酶的配合程度提升[34]，最终形成了土壤-植物-养分-酶的稳定复合体系，全面改善土壤质量。土壤养分质量分数和酶活性与pH的相关关系，由ck和1 a样地的正相关变为10 a样地的负相关，说明等高反坡阶整地实施一定时间后，改变了云南松坡林地酸性土壤对养分和酶活性的限制作用，在其他类型林地中也发现了类似的现象[35]。
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实施等高反坡阶整地后，云南松坡林地的土壤养分质量分数与酶活性显著增加，反坡阶的阶下提高程度高于阶上，且对表层土壤养分和酶活性的提高程度高于下层土壤。等高反坡阶整地显著提高了土壤养分与酶活性的正相关关系，同时改变了土壤pH对养分与酶活性的限制作用，整地10 a的效果尤为明显。因此，等高反坡阶整地可作为退化坡林地恢复的辅助措施，通过提升土壤养分与酶活性间的关联性，改善土壤质量并加快退化林地的恢复进程。
Response of soil nutrients and enzyme activities to contour reverse-slope land preparation in slope forest land of central Yunnan Province
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摘要:
目的 通过分析等高反坡阶整地对退化坡林地恢复过程中土壤养分与酶活性的影响，揭示该措施生态修复的作用机制。 方法 以昆明市松华坝水源区迤者小流域的退化云南松Pinus yunnanensis坡林地为对象，设置等高反坡阶整地1 a样地(1 a)和10 a样地(10 a)，以原状坡面(ck)为对照，比较土壤养分质量分数和酶活性在反坡阶的阶上和阶下及不同土层深度(0~10、10~20、20~30和30~40 cm)的分布差异。 结果 ①等高反坡阶整地显著提高土壤养分质量分数(P＜0.05)，碳、氮、磷等养分提升达15.3%~236.2%，阶下高于阶上，表层土壤(0~10 cm)增加最明显。②土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性均表现为10 a样地显著高于ck (P＜0.05)，4种酶活性提升范围在3.7%~587.5%，阶下仍高于阶上，表层土壤酶活性提升显著(P＜0.05)。③冗余分析显示：等高反坡阶整地后土壤养分对酶活性的累积解释贡献率升高，ck、1和10 a样地分别为68.0%、88.0%和92.7%；反坡阶整地后土壤养分与酶活性的正相关关系提高，相关系数范围和达极显著性组数(P＜0.01)由ck的0.26~0.99和1组，增至10 a样地的0.78~1.00和15组。 结论 退化坡林地实施等高反坡阶整地后，可促进土壤养分蓄积，激发土壤酶活性，增加两者在土壤生理生化反应过程中的配合度，最终改善土壤质量。图4表1参35 Abstract:Objective The aim is to reveal the mechanism of ecological restoration by analyzing the effects of contour reverse-slope terrace on soil nutrients and enzyme activities during the restoration of degraded slope forest . Method The degraded Pinus yunnanensis slope forest land in Yizhe minor watershed of Songhuaba water source area in Kunming City was taken as the research object. 1-year and 10-year contour reverse-slope terrace preparation trials were set up, with the original slope as a control (ck). Soil nutrients contents and enzyme activities above and below the terrace, as well as those at different soil depths (0 − 10, 10 − 20, 20 − 30, and 30 − 40 cm) were systematically compared. Result (1) Contour reverse-slope terraces displayed a significant increase in soil nutrient contents (P＜0.05), and the nutrients such as carbon, nitrogen, and phosphorus increased by 15.3% − 236.2%. The nutrient levels below the terrace were higher than those above the terrace, and the increase in surface soil (0 − 10 cm) was the most significant. (2) The activities of soil urease, sucrase, acid phosphatase, and catalase in 10-year plots were significantly higher than those in ck (P＜0.05), and the 4 enzyme activities increased by 3.7% − 587.5%. Soil enzyme activities below the terrace were still higher than those above the terrace. The increase in enzyme activity in the surface soil was significant (P＜0.05). (3) Redundancy analysis showed that soil enzyme activities were better interpreted by soil nutrient indicators after soil preparation of contour reverse-slope terrace measures, with ck, 1-year plots, and 10-year plots accounting for 68.0%, 88.0%, and 92.7%, respectively. The positive correlation between soil nutrients contents and enzyme activities increased after soil preparation of contour reverse-slope terrace measures, and the range of correlation coefficients and the number of highly significant groups (P＜0.01) increased from 0.26 − 0.99 and 1 group in ck to 0.78 − 1.00 and 15 groups in 10-year plots, respectively. Conclusion The implementation of contour reverse-slope terrace soil preparation in degraded slope forest can increase the accumulation of soil nutrient, stimulate soil enzyme activity, increase the coordination between the two in soil physiological and biochemical reaction, and ultimately improve soil quality. [Ch, 4 fig. 1 tab. 35 ref.] -
山麦冬Liriope spicata为百合科Liliaceae多年生草本植物，在园林绿化中多栽培于林下或林缘半阴处，掩饰裸露土壤，起到补充绿地改善不良景观的作用。山麦冬属Liriope植物只有8种，中国栽培6种，其中包含3个特有种，但山麦冬属植物分布广泛，除极寒地区及高海拔地区外，中国各省均有分布，其地理分布受人为栽培引种因素影响很大，没有特定的地理分布规律[1]。山麦冬成熟时果实表皮由绿转黑，9月结果后观果时期可长达整个冬季，且其花葶较长多矗立于叶子的上方，易于观察，具有很高的园林应用价值。目前，针对山麦冬成熟过程中呈色物质及调控基因尚未报道，但花青素合成途径在植物中是保守的，合成途径中上游合成基因是决定植物组织能否积累花青素的关键[2]，而下游修饰基因的表达常与花青素的积累一致，是加深果色花色的关键基因[3-5]。此外，花青素的积累还受转录因子的调控，其中以MYB转录因子与bHLH转录因子最为常见[6]。
用于基因表达定量分析的方法比较多，其中实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于定量准确、成本低且高通量，被广泛应用于基因表达水平研究。但其结果常受RNA质量、反转录效率、引物特异性、初始样品量及扩增效率等因素的影响[7-8]，需要引入1个或多个表达稳定的内参基因(reference genes, RGs)来评估目的基因的相对表达[9]。在植物学研究中，曾以肌动蛋白(actin，ACT)[10-12]、组蛋白(histone)[11]、蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP2A)[13]、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)[12]、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)[14-15]以及18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S)[16]等基因作为内参基因。但是常见的内参基因也并非适用于任何研究，且目前还未见山麦冬内参基因的报道。鉴于此，本研究基于山麦冬转录组数据，对山麦冬果实发育中稳定表达的内参基因进行研究，为提高果色转变关键基因RT-qPCR分析的准确性提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学资源圃，选取生长环境相同，且植株生长状况良好、长势整齐的山麦冬，随机均匀采集15~20株山麦冬植株的各一簇花葶的上、中、下部分果实，基于山麦冬果实生长特性，采集山麦冬幼果期(2020年9月)及成熟期(2020年11月) 2个时期样品，果实从花葶中取下后立即存于−80 ℃冰箱备用。设置3次生物学重复。
1.2 总RNA提取及cDNA合成
使用天根离心柱型RNA试剂盒(天根生物科技有限公司)从每个时期样本中提取总RNA。采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。总RNA的纯度和质量浓度采用NanoDrop ONE微量核酸蛋白浓度测定仪(Therm，美国)测定。总RNA样本质量浓度均高于4×10−5 ng·L−1以上，总RNA纯度[D(260)/D(280)]为1.9~2.1。cDNA的合成使用PrimerScript™ RT Master Mix cDNA (Perfect Real Time)反转录试剂盒，所有样本总RNA加入量按照3×10−5 ng·L−1稀释至同一质量浓度，cDNA置于−20 ℃冰箱保存。
1.3 候选内参基因的筛选及RT-qRCR
基于已获得的山麦冬转录组数据及京都基因与基因组百科全书(KEGG)注释，筛选了多条通路的基因作为内参基因参考库，包括参与山麦冬果实运输和分解代谢的基因(SLC36等)，参与代谢过程的基因(PP2C、MGL、PDP、G6PD等)，参与信号传导与转运的基因(AUX、GPR107、CNNM等)，参与细胞过程的基因(CFL等)，参与植物免疫的基因(Trx等)，参与遗传信息处理的基因(UGT、PP2A、EF1-α等)共1 648个，参考前人对内参基因的筛选阈值稍作修改后[11-13]，以每千个碱基转录每百万映射读取的片段(FPKM)高于5的基因(低表达的难以检测)、变异系数＜0.1、变化倍数＜0.2为筛选条件，得到前15个候选内参基因(表1)。
表 1 山麦冬15个候选的内参基因Table 1 15 candidate reference genes of L. spicata基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数SLC36 solute carrier family 36 0.003 0.001 CFL cofilin 0.061 0.178 PP2C protein phosphatase 2C 0.007 0.019 UGT UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase 0.064 0.184 Trx-1 thioredoxin 0.037 0.107 PP2A protein phosphatase 2A 0.064 0.185 MGL monoacylglycerol Lipase 0.043 0.123 EF1-α elongation factor 1-alpha 0.067 0.193 AUX auxin influx carrier 0.050 0.144 G6PD-1 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.068 0.197 GPR107 G protein-coupled receptor 107 0.056 0.161 G6PD-2 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.045 0.130 PDP pyruvate dehydrogenase phosphatase 0.058 0.169 Trx-2 thioredoxin 1 0.065 0.186 CNNM cation transport mediators 0.061 0.177 根据转录组获得的核酸序列信息，利用primer 5软件设计引物，并交由杭州有康生物技术有限公司合成(表2)。利用TB Green染料(Takara)预反应，体积20 μL，并使用LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)进行RT-qPCR。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火延伸30 s，40个循环。实验设置3次生物学重复。扩增效率(cDNA稀释浓度梯度为5−1、5−2、5−3、5−4、5−5)计算公式为E=[10(−1/K)–1]×100%，其中：E为扩增效率，K为斜率。15个候选内参基因的扩增效率为91.7%~108.0%(表2)。
表 2 15个候选内参基因的引物序列和扩增子特征Table 2 Primer sequences and amplicon characteristics of 15 candidate reference genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 SLC36 GTAAGTTTCGCCGAGTGCTT ACTGCAGTAGCAGACCAGTT 148 91.7 0.982 PP2C TGGGCCATGATGTTCCAGAT AGTACACGCAGTCTTCACCT 77 94.8 0.999 Trx-1 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 72 102.0 0.999 MGL AATGCCTTCACTGGAACAGC GCCGCCAAGTGAGTAAACAA 138 101.0 0.994 AUX TGCAGAGAAACCACCCTTCT CCGAATCCAAATCCGACCAC 99 91.7 0.949 GPR107 ACAGGTGATTGCGAACATCG CTTCGACGTCTCCTTCAACG 166 105.0 0.906 PDP GACGGAGGTCGGTTGGATTT CTGCACATGCATCATCACGA 124 96.2 0.976 CNNM GCTGCACTAACTCCAGCTTC GGCACAACTGTGGTCAACAT 86 96.8 0.999 CFL CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GTTGGATCGGTCGCTTGTAG 153 107.0 0.992 UGT TGGAAGCATCCTCACTTGACT TGTCTTCAAATTAGGGTTAGCGA 83 93.5 0.994 PP2A GAGTCGGAGAGGTCGAAGAG GCGGAGCAATTCCTACCATC 121 99.2 0.975 EF1-α CAAGCGTCCCACTGACAAG CCAGGCTTGAGGATACCAGT 111 101.0 0.998 G6PD-1 GATGCAACAGGCCAGAAGAG AGTGCAAACAGTGCAGGAAA 104 97.9 0.996 G6PD-2 ATAACGTTGCCCTCTCCACA ATCCAACTGCAATCCAAGCC 107 108.0 0.999 Trx-2 GTGGTGCACCGTCAGTAAAC CGCTGTGGTTGATGTCTCTG 113 96.0 0.992 1.4 内参基因的稳定性分析及验证
通过4种方法分析内参基因的稳定性：ΔCt值法[17]、geNorm[18]、NormFinder[19]和BestKeeper[20]。利用Excel 2010计算4种方法对候选内参基因几何平均数的排名，综合筛选最适的内参基因。同时根据前期转录组数据筛选了10种目的基因，涵盖花青素合成通路上下游基因以及调控基因。这10种基因在转录组数据加权共表达分析中属于中枢基因，表达量高、与花青素相关性强，且在果实成熟过程中显著上调。目的基因包括C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH，上述基因引物序列及扩增子特征见表3，最后利用SPSS 19.0与Graphpad Prism 8.0分析及作图。
表 3 10个目的基因的引物序列和扩增子特征Table 3 Primer sequences and amplicon characteristics of 10 target genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 C4H TCTTTGATCACGGCTTGCAG ATGAGATCGACACCGTCCTC 88 109.0 0.992 CHS-1 TGCATTGCACCAGTAGTAGC GCCCTCCTGATCTCCTCAAC 122 104.0 0.995 CHS-2 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 82 91.7 0.997 MT CCACCGAGAGCAAGAACAAC GGGTACACACTGGTCTCCAA 112 96.2 0.999 UFGT-1 AGCAAGGTGTTGAAGGAGGA AAATTCCGAACCGAGCTTCC 110 91.7 0.935 UFGT-2 CGACGGATCCCATTCGACTA CGCCGCTCCTCCTATTAAC 57 92.9 0.996 MYB-1 GCAAGATCAGGTCCTCCTCA CAAAGTACGTGGCGAAGGAG 162 107.0 0.975 MYB-2 ATGGGAAGATGGTGGCCTTT GAAGGGTGCACAGCTTCAG 70 91.7 0.986 MYB-3 CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GGTGCTTGTTGAGAGAGCTG 172 105.0 0.996 bHLH TGCTTAGCAATGGCAACAGG GGCTGCTGACCAGAAGATTG 123 101.0 0.998 2. 结果与分析
2.1 山麦冬候选内参基因的表达量分析
15个候选内参基因的溶解曲线均为单一峰(图1)，琼脂糖凝胶电泳检测后出现与预期大小一致的单一条带(图2)。该结果表明引物具有良好的特异性。
图 2 15个候选内参基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Figure 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of the fifteen reference genes根据原始循环阈值(Ct)分布发现：所有候选内参基因的Ct为15.53~28.81，Ct越高，基因的表达量越低，反之表达量越高。本研究中，EF1-α基因表达量最高，PP2C基因表达量最低，其余基因表达量介于两者之间。此外，由箱线图(图3)跨度可初步判定内参基因的稳定性。PP2C、Trx-1、AUX、PP2A、PDP基因的Ct跨度广，不稳定，而GPR107、CNNM、EF1-α、G6PD-2、Trx-2基因最为稳定，其中GPR107、CNNM、G6PD-2基因的Ct中位数与平均数接近，即上述基因相对表达量离散程度低，表达更稳定。然而对原始Ct分析内参基因稳定性的不足，还需引入其他的方法。
2.2 内参基因的稳定性分析
利用ΔCt法、geNorm、NormFider和BestKeeper对15个候选内参基因的稳定性进行分析(表4)。
表 4 4种方法评价15个候选内参基因表达的稳定性Table 4 Expression stability of 15 candidate reference genes evaluated by 4 methods内参基因 ΔCt geNrom NormFinder Beatkeeper 标准差 基因平均表达值 基因稳定值 标准差 变异系数 相关系数 SLC36 2.632 0.854 0.173 0.569 2.523 0.671 PP2C 2.321 0.927 0.416 0.828 3.070 0.824 Trx-1 2.663 1.130 0.510 0.852 3.964 0.832 MGL 2.673 1.007 0.493 0.885 3.918 0.918 AUX 2.652 1.094 0.598 1.063 4.430 0.882 GPR107 2.617 0.817 0.167 0.489 2.253 0.728 PDP 2.737 1.390 0.831 0.642 2.571 0.462 CNNM 2.615 0.847 0.157 0.468 2.015 0.721 CFL 2.274 1.094 0.346 0.532 3.038 0.781 UGT 2.613 0.923 0.237 0.517 2.418 0.651 PP2A 2.693 1.054 0.568 1.057 4.671 0.511 EF1-α 2.127 0.895 0.286 0.393 2.347 0.687 G6PD-1 2.763 1.204 0.692 0.469 2.065 0.009 G6PD-2 2.636 0.880 0.334 0.290 1.323 0.750 Trx-2 2.663 0.989 0.465 0.417 1.790 0.487 ΔCt法是在原始Ct值的基础上，计算每个基因所有样本与其他基因的Ct值之差，并计算其标准差。一般平均标准差越低，基因稳定性越高。该方法中，EF1-α、PP2C、CFL、CNNM是山麦冬果实发育阶段最稳定的内参基因；PDP、G6PD-1、PP2A是最不稳定的内参基因。
geNorm软件通过平均表达值来描述候选内参基因的稳定性，同时还能计算归一化因子之间的两两变异(Vn/n+1，其中n为可使RT-qPCR结果准确的最少基因数目)。该方法中，所有基因的平均表达值都在1.5以下(稳定内参基因的临界值)，即该方法判定下的所有基因都可作为内参基因，其中GPR107(0.817)与CNNM(0.847)基因的平均表达值最低，说明最稳定。同时PDP、G6PD-1基因的平均表达值最高，分别为1.390、1.204，最不稳定，这与ΔCt法判定结果一致。此外，利用geNorm计算2个归一化基因的Vn/n+1，确定适合量化果实生长过程的最优内参基因数目。geNorm首先计算2个最稳定的候选内参基因的归一化因子值，然后将剩余候选内参基因按其表达稳定性下降的顺序依次相加。如果基因之间的Vn/n+1大于或等于0.15，则进行RT-qPCR分析时应该再添加1个基因才能达到可靠的结果，一旦Vn/n+1低于0.15，就不需要添加额外的基因[21]。由图4可见：从V4/5开始Vn/n+1小于0.15，即需要使用4个内参基因才能得到可靠的RT-qPCR结果。
图 4 精确归一化的最佳内参基因数量Figure 4 Optimal number of control genes for accurate normalizationNormFinder软件可分析候选内参基因的两两变异性，其中稳定值越小，候选内参基因越稳定。CNNM与GPR107基因的稳定值最小，分别为0.157、0.167，即CNNM与GPR107基因最稳定，这与geNorm分析结果一致；此外，对最差的内参基因评价也与上述2种方法一致：PDP、G6PD-1、AUX是量化果实发育阶段最不适合的内参基因。
Bestkeeper与geNorm、NormFinder软件不同，需导入原始Ct值平均数，计算候选内参基因在所有样品中的标准差、变异系数、相关系数。一般地，稳定的内参基因拥有低的标准差、变异系数及高的相关系数。在Bestkeeper评价中，与geNorm、NormFinder分析结果一致，CNNM与PDP基因分别还是最稳定与最不稳定的内参基因。除此之外，还发现G6PD-2为该方法中最稳定的内参基因，其标准差与变异系数最低，分别为0.290、1.323，相关系数为0.750。
最后通过几何平均数对这4种方法的分析结果进行综合性排序(表5)。根据表5的排名与geNorm推荐的内参基因数目，筛选CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为标准化山麦冬果实RT-qPCR的最优内参组合，PDP为最差内参基因，通过4种算法得出的结果也与最初候选内参基因原始Ct值分布箱线图分析结果一致。
表 5 15个候选内参基因的综合排名Table 5 Comprehensive ranking of reference genes for normalization基因名 几何平均数 排名 基因名 几何平均数 排名 CNNM 2.340 1 PP2C 6.557 9 GPR107 2.913 2 MGL 8.572 10 EF1-α 3.162 3 AUX 10.602 11 G6PD-2 3.722 4 Trx-1 11.199 12 SLC36 5.350 5 G6PD-1 11.977 13 UGT 5.826 6 PP2A 12.368 14 CFL 5.925 7 PDP 14.491 15 Trx-2 6.160 8 2.3 内参基因稳定性的验证
为验证内参基因的有效性，选择10种花青素合成结构基因与调控基因作为目的基因。用单一内参基因：最优内参(CNNM)、最差内参(PDP)，及2种内参组合：排名前2位的内参基因(CNNM、GPR107)和排名前4位的内参基因(CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2)进行归一化。从图5可见：在山麦冬果实花青素合成过程中，使用4种内参方式归一化时，所有的目的基因都上调表达，但变化倍数稍有不同。在山麦冬果实成熟期，使用PDP基因作为内参时，所有目的基因相对表达量均显著高于其他3类，特别是对转录因子bHLH基因的量化时产生严重偏差，使用PDP基因与CNNM+GPR107+EF1-α+G6PD-2基因组合作为内参，bHLH基因的相对表达量分别为6.28与15.70，两者差异高达2.5倍。然而，当使用最优内参基因CNNM进行标准化时，除UFGT基因外，CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2内参组合无显著差异，使用CNNM基因标准化时，UFGT相较幼果期上调表达50.71倍，使用4种内参组合时，UFGT上调72.49倍。此外，本研究还分析了候选内参排名前2位的基因(CNNM、GPR107)作为目的基因的表达量，发现选用2种内参基因与geNorm软件推荐使用4种内参基因，在10个目的基因中均无显著差异。
图 5 不同内参基因归一化后10个目的基因的相对表达量Figure 5 Relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes从图6可见：利用最差内参PDP得到的目的基因表达量与4种内参基因组合得到的目的基因表达量相关系数为0.868 6 (P＜0.01)，当使用最优基因CNNM作为内参时，与4种内参组合相关系数可达0.991 6 (P＜0.01)。对2种内参组合与geNorm推荐的4个数目内参组合比较发现：通过这2种方法标准化得到的目的基因相关性可达0.999 9 (P＜0.01)，即仅使用CNNM、GPR107基因作为双内参也可达到geNorm软件推荐的4个内参数目组合的效果。
图 6 不同内参基因标准化后10种目的基因表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis for relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes3. 讨论
山麦冬作为一种优良的地被园林植物及药用植物，研究多集中于提高栽培技术及块茎产量，而针对园林观赏应用的研究较少。在本研究之前没有山麦冬内参的研究报道，作为沿阶草族植物，其近源种也仅有麦冬Ophiopogon japonicus抗逆性研究中曾以微管蛋白基因(tubulin)[22]及Actin [23]作为参考基因。但这2类基因在前期转录组筛选中由于变异系数及变化倍数在候选内参中就已经被排除。本研究根据几何平均数的综合排名，推荐使用内参基因CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为研究山麦冬花青素合成的最优内参组合。EF1-α、G6PD-2属于常见的内参基因，在植物生长发育、抗逆反应、代谢合成中已被广泛应用[24-25]。基于前期转录组数据，新型内参基因CNNM、GPR107也可作为RT-qPCR分析的内参基因，CNNM编码过渡金属转运蛋白，可参与多种金属吸收、排除及区分化[26]，GPR107编码G蛋白偶联受体107，广泛存在于细胞表面的膜蛋白，可参与植物体多种细胞信号转导及调控机制保守[27]。上述2种基因在山麦冬果实中表达稳定，其相对表达量平均值与中位数相近，离散程度低，且表达量适中，符合内参基因的标准。在观赏植物中，由于新型内参基因稳定性强于传统内参基因，常被选用标准化目的基因的表达。例如，在异型花柱连翘Forsythia suspensa中，转录组中变化微小的未知基因是研究花开放最适合的内参基因[28]；太行花Taihangia rupestris花器官有复杂的性别决定机制，鉴定两性花与雄性花的内参基因是编码铁硫簇组装蛋白、3-巯基丙酮酸硫转移酶与跨膜蛋白50的新型内参基因[11]。SmDnaJ基因在旱柳Salix matsudana各种非生物胁迫下表达最为稳定[29]。bHLH在观赏百合Lilium oriental×Trumpet hybrid体胚诱导、体胚发育中表达最稳定[30]，但bHLH是植物颜色育种中的重要靶基因，并不适合作为本研究的内参基因候选，这也证实了不同目标性状需采用不同的内参基因，没有一种内参基因是普适的。
花青素合成路径在植物中是保守的，其中MYB转录因子与bHLH转录因子可形成二元复合体，激活花青素合成酶基因[31-32]。大量研究表明：MYB、bHLH转录因子基因与花青素合成酶基因在紫色系植物组织发育过程中协同上调[3, 33-34]。为验证内参基因的结果，挑选了10个在山麦冬花青素合成调控网络的中枢基因(相关性强且表达量高)作为验证，其中包括转录因子与结构基因(C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH)，这10种基因在4种归一化方法下表达模式均显著上调，但趋势稍有不同，选用较差内参PDP标准化结果偏差最大，在山麦冬成熟黑果中所有基因都显著高于其他基因。尽管最优内参基因CNNM对目的基因的归一化可以达到与4种内参组合很高的相关系数，但对UFGT基因的量化存在显著差异，而UFGT基因作为花青素合成通路的下游修饰，对花青素积累至关重要，特别是在山麦冬这类组织颜色深即富含花青素的类型[2, 35]，例如在葡萄Vitis vinifera果皮[36]、玫瑰Rosa rugosa [37]、紫皮石刁柏Asparagus officinalis[33]中UFGT都被验证为关键基因，因此仅选用单一基因作为研究山麦冬果皮花青素积累的内参是不合适的，继而在CNNM基因基础上又引入GPR107来规避单内参基因的误差，该内参组合与geNorm推荐的内参组合相关系数最高，在10种目的基因的验证结果中与4种内参组合均无显著差异，且选用双内参组合比4种内参组合可操作性强，因此判定使用CNNM、GPR107作为双内参即可得到可靠的RT-qPCR结果。双内参组合联合使用可以减少实验因素对基因表达的影响，且结果更为准确。暴露于UV-B辐射下的番茄Lycopersicon esculentum幼苗不同组织都应选用特定的内参组合，例如叶中选用肌动蛋白基因与微管蛋白基因，而根中选用微管蛋白与UV-B抗性位点基因更加适合[38]；UBQ和EF1-α基因由于表达稳定，可作为内参基因用于鹅掌草Anemone flaccida各器官的不同发育阶段[39]。
4. 结论
本研究基于转录组数据筛选了15个候选内参基因，分析其在山麦冬果实不同时期的表达稳定性。经过10种目的基因验证后，表明以CNNM、GPR107基因作为组合是山麦冬果实花青素生物合成研究的最佳内参基因，而常用的内参基因却并不适用于本研究，这为筛选新型内参基因提供了新思路。
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图 2 等高反坡阶整地下土壤酶活性分布特征
Figure 2 Distribution of soil enzyme activities under contour reverse-slope terrace measures
图 3 等高反坡阶整地下土壤养分与酶活性冗余分析
Figure 3 Redundancy analysis of soil nutrients and soil enzyme activities under contour reverse-slope terrace measures
图 4 等高反坡阶措施下土壤养分特征与酶活性间的相关性分析
Figure 4 Correlation analysis between soil nutrient characteristics and soil enzyme activities under contour reverse-slope terrace measures
表 1 等高反坡阶整地下土壤养分空间分布
Table 1. Spatial distribution of soil nutrients under contour reverse-slope terrace measures
取样
位置土层/
cm实施
措施pH 有机质/
(g·kg−1)全氮/
(g·kg−1)碱解氮/
(mg·kg−1)全磷/
(g·kg−1)速效磷/
(mg·kg−1)速效钾/
(mg·kg−1)阶上 0~10 ck 4.5±0.0 Ca 23.3±0.3 Ca 5.7±0.0 Ca 78.1±1.0 Ba 0.3±0.0 Ba 16.8±0.4 Ba 45.4±0.4 Ba 1 a 4.7±0.0 Ba 34.2±1.5 Ba 8.9±0.1 Ba 104.7±2.5 Aa 0.3±0.0 Ba 16.8±0.4 Ba 53.8±2.2 Aa 10 a 4.9±0.0 Aa 55.6±0.3 Aa 11.9±0.1 Aa 109.2±2.4 Aa 0.7±0.1 Aa 18.7±0.3 Aa 62.2±1.7 Aa 10~20 ck 4.3±0.0 Ca 18.3±0.8 Bb 4.7±0.1 Bab 41.4±0.7 Bb 0.3±0.0 Ba 14.8±0.6 ABb 43.2±0.4 Bb 1 a 4.6±0.1 Bab 18.4±1.5 Bb 5.7±0.2 Bb − 0.3±0.0 Bb 12.8±0.5 Bb 46.4±1.7 ABab 10 a 4.8±0.0 Aa 47.9±0.7 Ab 8.1±0.1 Ab 89.0±0.8 Ab 0.4±0.1 Ab 17.6±1.4 Aa 52.2±0.4 Ab 20~30 ck 4.4±0.0 Ba 13.4±0.8 Bc 3.4±0.2 Cb − 0.3±0.0 Ba 12.1±0.4 Ac 40.6±0.4 Cc 1 a 4.5±0.1 Bb 15.3±1.4 Bbc 5.2±0.2 Bb − 0.3±0.0 Bb 10.9±0.6 Abc 44.2±1.2 Bab 10 a 4.7±0.0 Aa 34.0±0.5 Ac 6.5±0.4 Ac 64.7±2.0 Ac 0.3±0.0 Ab 12.4±0.1 Ab 51.7±0.1 Ab 30~40 ck 4.4±0.1 Aa 8.0±1.3 Bd 2.9±0.1 Bb − 0.2±0.0 Ab 9.9±0.2 Ad 39.6±0.5 Bc 1 a 4.5±0.1 Ab 11.7±0.7 Bc 3.3±0.2 Bc − 0.2±0.0 Ab 10.5±0.7 Ac 43.6±0.8 Bb 10 a 4.9±0.2 Aa 26.0±1.4 Ad 4.4±0.2 Ad 59.6±2.8 Ac 0.3±0.0 Ab 11.2±0.1 Ab 49.7±1.8 Ab 阶下 0~10 ck 4.5±0.0 Ca 20.9±2.1 Ca 6.1±0.2 Ba 84.6±1.8 Ba 0.3±0.0 Ca 17.1±0.2 Ba 45.8±0.2 Ba 1 a 5.1±0.0 Ba 39.4±0.7 Ba 11.8±0.1 Aa 138.9±2.4 Ba 0.5±0.0 Ba 16.0±1.0 Ba 60.6±0.5 Aa 10 a 4.8±0.0 Aa 63.0±0.2 Aa 13.2±0.3 Aa 155.8±4.2 Aa 1.3±0.1 Aa 30.6±0.7 Aa 67.5±0.4 Aa 10~20 ck 4.5±0.0 Ca 16.7±0.6 Cab 5.3±0.2 Ca 56.2±5.0 Bb 0.3±0.0 Ca 15.5±0.3 Bb 44.6±0.5 Ba 1 a 4.9±0.0 Bab 25.8±0.9 Bb 9.2±0.1 Bb 79.0±16.0 Bb 0.4±0.0 Ba 14.8±0.8 Bb 51.6±0.8 Ab 10 a 4.7±0.0Aab 53.0±1.4 Ab 11.5±0.0 Ab 142.0±12.3 Aa 1.0±0.0 Ab 25.9±0.5 Ab 56.8±0.6 Ab 20~30 ck 4.4±0.1 Ba 15.0±0.8 Cb 3.8±0.1 Bb 38.6±5.8 Bc 0.3±0.0 Bab 12.9±0.2 Bc 44.5±0.6 Ba 1 a 4.8±0.1 Abc 21.9±0.8 Bc 6.4±0.5 Ac 50.2±10.4 Bbc 0.3±0.0 Bb 12.0±0.6 Bbc 44.3±0.7 Bb 10 a 4.6±0.0 Ab 39.4±0.9 AC 7.7±0.2 Ac 86.5±0.4 Ab 0.7±0.0 Ac 17.6±0.1 Ac 51.3±0.8 Ac 30~40 ck 4.5±0.0 Aa 10.6±0.7 Bc 3.1±0.3 Bb − 0.2±0.0 Bb 11.7±0.4 Bd 41.7±0.2 Ba 1 a 4.7±0.1 Ac 12.0±1.1 Bd 4.1±0.4 Ad 28.6±4.4 Bc 0.3±0.0 Bb 10.5±0.9 Bc 41.9±0.7 Bb 10 a 4.6±0.1 Ab 26.4±1.3 Ad 5.0±0.0 Ad 63.8±6.3 Ab 0.6±0.0 Ac 16.4±0.8 Ac 50.2±0.3 Ac 说明：ck表示无整地措施；1 a表示实施1 a的等高反坡阶整地；10 a表示实施10 a的等高反坡阶整地；−表示未检出。不同大写字母表示同一土层不同整地措施间差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一整地措施不同土层间差异显著(P＜0.05)。 
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