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土壤盐碱化已成为全球性生态问题，目前全球盐碱地总面积约9.56亿hm2，其中中国占10.4%[1]。玫瑰Rosa rugosa兼具观赏及经济价值，在“上山下滩”的非粮化战略背景下，培育耐盐玫瑰新品种具有重要意义。目前，栽培玫瑰品种仅约60个，以山东平阴为代表的地区培育了紫枝玫瑰R. rugosa ‘Zizhi’、重瓣玫瑰R. rugosa ‘Plena’，以及花白色且精油含量较高的重瓣白玫瑰R. rugosa ‘Alba Plena’等24个品种[2−4]，但仍缺乏出油率高、抗性强和花期长的优良种质。野生玫瑰具有较强的耐盐特性，其耐盐性显著优于重瓣白玫瑰等栽培品种[5−7]。野生玫瑰具有丰富的遗传资源，如优异的抗逆基因，因此可以通过杂交获得优良的栽培品种[8]。然而，玫瑰作为木本植物，童期较长，实生苗开花约需3 a，导致传统育种周期长、效率低，严重制约了育种进展，亟需引入高效育种手段。
目前，分子标记辅助选择是提高育种效率的有效手段[9]。其中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)标记因具高通量、高稳定性等优点，在植物遗传育种中广泛应用。例如，乔东亚等[10]基于简化基因组测序结果，在紫薇Lagerstroemia indica中开发出21个SNP标记，成功对85份种质进行群体划分。本研究以耐盐性强的野生玫瑰与耐盐性较弱的重瓣白玫瑰为亲本构建杂交群体，通过对杂交一代(F1)进行耐盐性评价和筛选，结合重测序与高分辨率熔解(high-resolution melting，HRM)基因分型技术开发耐盐相关的SNP标记，以期为玫瑰耐盐育种提供亲本选配策略与分子标记资源，助力玫瑰耐盐育种效率的提升。
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杂交试验于2023年4—5月在山东省平阴玫瑰研究所玫瑰种质资源圃(36.29°N，116.46°E)内进行。母本为野生玫瑰，父本为重瓣白玫瑰，所选植株生长强壮、无病虫害。杂交操作参考欧哲等[11]的方法。2023年10月上旬采收成熟杂交果实，置于阴凉通风处自然干燥1~2周，剥出种子并于4 ℃冰箱中沙藏。2024年1月，将露白种子播种于穴盘，至3月幼苗长出3~4片复叶时移除穴盘盖。生长期间每3~5 d浇1次水，每2周浇1次营养液。待幼苗长至10 cm时移栽至口径15.5 cm、高14.0 cm的花盆中培养，定期清除杂草，保障植株正常生长。
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植物在盐胁迫下的表型会随时间而发生改变，其变化程度可反映植物耐盐性强弱。因此，盐害指数(h)可以作为评价耐盐性的可靠指标。2024年9月，对所有野生玫瑰与重瓣白玫瑰F1幼苗1次性浇灌300 mL的NaCl溶液(2 g·L−1)，并分别于第3、18、21天补浇100 mL相同质量浓度的NaCl溶液。处理25 d后，观测并记录所有植物叶片的盐害程度。参考王涛等[12]的方法，按盐害表型将F1幼苗分为5级：0级，叶片绿色，正常无黄化；1级，叶片焦黄面积约25%；2级，叶片焦黄面积约50%；3级，叶片焦黄面积约75%；4级，叶片焦枯严重，焦黄面积达90%以上甚至死亡。盐害指数计算公式为：盐害指数=Σ(盐害等级×该等级叶片数)/(总叶片数×最高盐害等级)。盐害指数越低，耐盐性越好。
根据盐害指数(h)将幼苗耐盐性划分为5级：强耐盐h为0~0.069 9；中度耐盐h为0.070 0~0.159 9；轻度耐盐h为0.160 0~0.249 9；敏盐h为0.250 0~0.499 9；极度敏盐h为0.500 0~1.000 0。
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提取母本野生玫瑰、父本重瓣白玫瑰及其F1群体各单株的基因组DNA。建库质检合格后，采用Illumina HiSeq 4000平台进行测序。使用BWA-MEM v0.7.17，采用默认参数，将测得的高质量数据与野生玫瑰参考基因[13]比对，获得基因组比对文件。通过Picard v2.27.2 (
https://github.com/broadinstitute/picard )的Mark Duplicate工具去除重复，再使用GATK v4.5.0.0 (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us )中的HaplotypeCaller进行变异检测[14]，以单个样本为单位，采用默认参数运行，并生成基因组VCF (variant call format)文件。最后，采用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的HighMap软件，对变异检测结果进行过滤与基因分型质量评估[15]。本研究相关结果数据已保存于生命大数据平台的序列归档系统(CNSA)，项目编号为CNP0007945。 -
首先，使用GATK-4.5.0.进行SNP检测，经过滤后得到最终的SNP位点集，再通过GATK的hard filter工具进一步筛选，保留覆盖至少70%样本的SNP位点，其中参数设置具体为：MQ＜40.0、QUAL＜50.0、DP＜5.0、DQ＜2.0、FS＞60.0、MQRankSum＜−12.5、ReadPosRankSum＜−8.0。利用SnpEff v5.0 (
http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.html )对SNP进行注释及功能预测(默认参数)，分析采用该软件的默认参数。结合野生玫瑰基因组的基因位置信息，明确变异所在基因组区域及其效应(同义、非同义突变等)。其次，基于拟南芥Arabidopsis thaliana中已报道的54个耐盐性相关基因(包括HKT1、ANKT1、SOS2、NHX1等)[16−17]，通过序列比对筛选玫瑰的高度同源基因。结合重测序数据，在上述基因的编码区、启动子区域及其他潜在调控区域(如内含子、非翻译区等)内识别SNP位点。为获得可用于耐盐表型鉴定的分子标记，优先选择在耐盐与敏盐单株间基因型差异显著、分型清晰的SNP位点，并要求侧翼200 bp内无其他密集突变，以确保分型特异性和准确性。将筛选出的SNP位点列为耐盐关联位点，用于后续验证。使用Primer3Plus设计候选SNP位点的特异性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。以父母本DNA为模板，采用诺唯赞公司生产的2 × KeyPo Master Mix(Dye Plus)进行PCR扩增，反应体系按照说明书配制。扩增产物使用20 g·L−1的琼脂糖凝胶电泳检测。
对PCR扩增特异性良好的引物，随机选取强耐盐和敏盐各4个单株，进行HRM基因分型分析。然后，选择分型效果较好的SNP位点，并采用对应引物对F1群体所有单株进行HRM基因分型分析。
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使用Excel整理数据，采用SPSS 27进行统计分析。F1盐害指数的差异显著性采用独立样本t检验，显著性水平为0.05。使用Levene检验验证方差齐性，使用Origin 2022进行绘图。
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共获得野生玫瑰与重瓣白玫瑰F1幼苗83株。如图1所示：耐盐等级越强的植株盐害症状越轻、长势越好。经盐胁迫处理后，除4株死亡外，其余植株的平均盐害指数为0.207 2 ± 0.203 3。其中，仅5株幼苗的盐害指数低于0.040 0，最低为0.032 3；3株幼苗的盐害指数超过0.400 0，最高达0.500 0。F1幼苗个体间盐害指数存在极显著差异(P＜0.001)，F1幼苗盐害指数的变异系数为98.11%，表明群体具有较高的遗传多样性。83株F1幼苗的盐害指数共分为5个耐盐等级(表1)。其中，强耐盐的幼苗共有12株(占比14.5%)，中度耐盐的幼苗最多，共30株(占比36.1%)；轻度耐盐的幼苗有20株(占比24.1%)。由此可见，中度及以上耐盐植株占总体的50%以上。
图 1 不同耐盐等级植株的生长状态及叶片盐害情况
Figure 1. Phenotypic performance and leaf salt injury symptoms of plants with different salinity tolerance levels
表 1 83株F1幼苗耐盐等级划分
Table 1. Classification of salt tolerance grades of 83 F1 generations
盐害指数 耐盐等级 对应单株
数量/株占总F1幼苗
比例/%0~0.069 9 强耐盐 12 14.5 0.070 0~0.159 9 中度耐盐 30 36.1 0.160 0~0.249 9 轻度耐盐 20 24.1 0.250 0~0.499 9 敏盐 17 20.5 0.500 0~1.000 0 死亡 4 4.8 -
对亲本及83株F1幼苗叶片的重测序结果(表2)显示：所有样本均获得高质量序列，Q30碱基(即测序错误率≤0.1%的碱基)均不低于97.95%。母本(野生玫瑰)和父本(重瓣白玫瑰)的测序深度分别达36.74×和36.63×，与参考基因组的比对率均高于98.50%；F1群体平均每株获得5.57 Gb有效数据(clean data)，平均测序深度为12.16×，平均比对率为99.02%。亲本及子代材料中4×和10×碱基覆盖率均处于较高水平，这表明测序质量可靠、覆盖均匀，可用于后续变异检测与遗传分析。
表 2 样品重测序及其与参考基因组比对数据统计
Table 2. Statistics of sample resequencing data and its comparison with the reference genome
组别 重测序 与基因组比对 读段(reads)
数量碱基数
量/GbQ20/% Q30/% GC/% 读段(reads)
数量碱基数
量/Gb比对率/% 平均测序
深度4×碱基
覆盖率/%10×碱基
覆盖率/%野生玫瑰 ♀ 56 372 513 16.87 99.66 98.26 38.43 112 745 026 11.27 98.68 36.74× 93.88 88.85 重瓣白玫瑰 ♂ 55 952 390 16.74 99.60 97.95 38.46 111 904 780 11.19 99.16 36.63× 94.75 89.46 F1个体平均 18 627 223 5.57 99.66 98.26 38.83 37 254 447 3.73 99.02 12.16× 83.10 53.00 说明：Q20表示碱基的测序错误率≤1%；Q30表示碱基的测序错误率≤0.1%。 -
SNP在染色体上的分布统计结果(表3)表明：共检测出11 412 504个SNP位点，其在7条染色体上分布较为均匀，在各染色体上的分布比例为11.06%~19.00%。其中，SNP数量在Chr 7上最少(11.06%)，在Chr 5上最多(19.00%)。
表 3 单核苷酸多态性(SNP)染色体分布统计
Table 3. Single nucleotide polymorphisms (SNP) chromosome distribution statistics
染色体 SNP数量/个 百分比/% Chr 1 1 647 427 14.44 Chr 2 1 641 102 14.38 Chr 3 1 268 168 11.11 Chr 4 1 687 647 14.79 Chr 5 2 168 035 19.00 Chr 6 1 738 000 15.23 Chr 7 1 262 125 11.06 合计 11 412 504 100.00 进一步分析SNP在染色体上的分布密度可知：Chr 1的SNP分布密度总体较高，但在该染色42~58 Mb区段(除47 Mb处外)均低于30 000 个·Mb−1。Chr 2大部分区域SNP分布密度较小，低于27 000个·Mb−1。Chr 3大部分区域SNP分布密度较高，大于27 000个·Mb−1；Chr 4和Chr 6末端区域的SNP数量较少，分布密度低于24 000个·Mb−1。Chr 5的SNP分布密度较为均匀，平均约21 000个·Mb−1；Chr 7的SNP分布密度整体较低，绝大多数区域低于27 000个·Mb−1(图2)。
图 2 单核苷酸多态性(SNP)在染色体上的密度分布
Figure 2. Density distribution of single nucleotide polymorphisms (SNP) on chromosomes
-
由图3A可见：SNP变异类型最多的是胞嘧啶(C)＞胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)＞腺嘌呤(A)(转换型)，均超过200万个；其次为A＞G和T＞C类型，数量超过了150万个。而C＞G和G＞C类型(均为颠换型)的SNP数量最少，不足40万个。SNP总数转换型为205 895 725个，颠换型为115 865 531个，转换与颠换的比率为1.78。就分布位置而言，基因间区SNP数量最多，占总数的34.46%，其次是基因的上游(24.94%)和基因的下游(23.61%)区域；剪切位点区SNP数量最少，仅占0.25%(图3B)。
图 3 单核苷酸多态性(SNP)变异类型(A)及分布区域(B)数量统计
Figure 3. Statistics of the number of single nucleotide polymorphisms (SNP) for different mutation types (A) and locations (B)
-
针对初步筛选的65个SNP位点设计特异性引物(
https://zlxb.zafu.edu.cn/fileZJNLDXXB/journal/article/file/8cecd486-d712-4e8b-9ac4-6ea810861562.pdf )，并通过PCR扩增检验其扩增效果与特异性(图4)。结果显示(表4)：SNP01、SNP02等33个位点扩增条带大小正确；SNP10、SNP14等11个位点出现引物二聚体；SNP11、SNP12等19个位点出现非特异性条带；SNP15及SNP52位点未扩增出任何条带。将33个条带大小符合预期的PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序验证。结果证实这些条带与预期大小一致，因此后续研究仅保留这33个SNP位点及对应引物。
图 4 65个单核苷酸多态性(SNP)位点引物PCR扩增特异性电泳检测结果
Figure 4. Electrophoresis analysis of PCR amplification specificity for primers of 65 single nucleotide polymorphisms (SNP) loci
表 4 各单核苷酸多态性(SNP)位点突变类型及引物PCR扩增情况
Table 4. Single nucleotide polymorphisms (SNP) mutation types and primer PCR amplification
位点
名称SNP突
变类型PCR扩
增结果位点
名称SNP突
变类型PCR扩
增结果位点
名称SNP突
变类型PCR扩
增结果SNP01 T＞C 正确 SNP23 T＞A 多条带 SNP45 T＞C 正确 SNP02 A＞G 正确 SNP24 G＞T 正确 SNP46 A＞G 多条带 SNP03 G＞T 正确 SNP25 C＞T 正确 SNP47 T＞C 多条带 SNP04 A＞G 正确 SNP26 C＞T 多条带 SNP48 A＞T 多条带 SNP05 T＞G 正确 SNP27 G＞A 正确 SNP49 A＞T 引物二聚体 SNP06 C＞A 正确 SNP28 G＞T 正确 SNP50 C＞T 多条带 SNP07 C＞T 正确 SNP29 C＞G 正确 SNP51 A＞C 引物二聚体 SNP08 T＞G 正确 SNP30 C＞T 多条带 SNP52 T＞A 无条带 SNP09 G＞C 正确 SNP31 G＞A 引物二聚体 SNP53 T＞A 多条带 SNP10 C＞T 引物二聚体 SNP32 A＞T 正确 SNP54 T＞A 正确 SNP11 A＞G 多条带 SNP33 C＞T 正确 SNP55 G＞A 多条带 SNP12 A＞T 多条带 SNP34 A＞G 引物二聚体 SNP56 A＞C 多条带 SNP13 T＞C 正确 SNP35 A＞C 多条带 SNP57 T＞C 引物二聚体 SNP14 G＞A 引物二聚体 SNP36 G＞C 正确 SNP58 C＞T 多条带 SNP15 G＞C 无条带 SNP37 T＞A 多条带 SNP59 C＞T 正确 SNP16 C＞G 正确 SNP38 G＞A 正确 SNP60 C＞T 引物二聚体 SNP17 G＞C 引物二聚体 SNP39 C＞T 正确 SNP61 C＞T、G＞C 正确 SNP18 T＞C 多条带 SNP40 T＞A 正确 SNP62 T＞C、A＞T 多条带 SNP19 C＞G 多条带 SNP41 G＞C 正确 SNP63 A＞G、A＞C 正确 SNP20 G＞A 正确 SNP42 A＞G 多条带 SNP64 C＞G 正确 SNP21 C＞A 正确 SNP43 G＞A 引物二聚体 SNP65 A＞C、T＞A 正确 SNP22 T＞C 引物二聚体 SNP44 T＞C 正确 -
从PCR扩增特异性良好的引物中，随机选取4株强耐盐和4株敏盐单株进行HRM基因分型分析。选择分型清晰、稳定的SNP位点，将其基因型与植株盐害指数进行比对分析，从而筛选能够有效区分耐盐与敏盐植株的SNP位点。最终筛选5个候选耐盐相关标记的位点，分别为SNP54、SNP61、SNP63、SNP64、SNP65。其中，SNP54位于Chr 6的AKT1基因外显子区(53 946 206 bp)；SNP61为双碱基突变，均位于Chr 1的BZIP24基因外显子区(分别为5 370 601和5 370 616 bp)；SNP63也为双碱基突变，均位于Chr 1的SOS3基因内含子区(分别为55 569 563和55 569 553 bp)；SNP64位于Chr 5的ABC1K10A基因外显子区(3 642 238 bp)；SNP65为双碱基突变，横跨SOS3基因的外显子(55 570 406 bp)和内含子区(55 570 455 bp)。采用各SNP位点特异性引物，对F1群体进行HRM分型，5对引物均表现出良好的多态性。其中，SNP54与SNP64分别分出3种基因型，SNP63分出4种，SNP61和SNP65各分出5种基因型(图5)。
图 5 单核苷酸多态性(SNP)位点高分辨率熔解(HRM)分型分析
Figure 5. High-resolution melting (HRM) typing analysis of Single nucleotide polymorphisms (SNP)
对比强耐盐与敏盐植株在各SNP位点的HRM分型结果(表5)发现：SNP54、SNP61、SNP64和SNP65对耐盐性状的区分效果较差，但SNP63的分型效果较好，其Ⅰ型在强耐盐植株中占63.6%，在敏盐植株中仅占18.7%。因此，SNP63的Ⅰ型可用于淘汰大部分敏盐单株。
表 5 高分辨率熔解(HRM)基因分型结果统计
Table 5. Statistics of high-resolution melting (HRM) genotyping results
位点
名称耐盐等级 不同基因分型植株占比/% Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型 SNP54 强耐盐 50.0 30.0 20.0 0 0 敏盐 69.2 23.1 7.7 0 0 SNP61 强耐盐 70.0 10.0 10.0 0 10.0 敏盐 50.0 6.3 25.0 6.3 12.5 SNP63 强耐盐 63.6 9.1 18.2 9.1 0 敏盐 18.7 31.3 31.3 18.7 0 SNP64 强耐盐 63.6 9.1 27.3 0 0 敏盐 50.0 25.0 25.0 0 0 SNP65 强耐盐 36.4 18.1 36.4 9.1 0 敏盐 31.2 6.3 25.0 31.2 6.3 -
本研究表明：F1植株的盐害指数差异极显著，变异系数高达98.11%，表明耐盐性在杂交后代中具有丰富的遗传多样性。耐盐等级划分结果显示：50%以上植株具有中度以上的耐盐性(强耐盐植株占14.5%，中度耐盐植株占36.1%)，表明野生玫瑰具有较好的耐盐遗传潜力[18]。在经过盐胁迫处理后，F1群体中12个强耐盐株系的耐盐性可能优于已报道的野生玫瑰[7]，后续需要进一步培育这些优良单株的无性系，并与亲本开展同期的对照试验，以便更直接衡量其是否超越亲本的耐盐性。盐害指数分布范围较广，说明耐盐性可能由多个微效基因共同作用，而非单一主效基因控制[19]。耐盐性多为数量性状，受SOS、NHX、HKT等多基因家族控制，F1变异可能源于亲本等位基因重组[17]。此外，4株植株因盐胁迫死亡可能与极端盐敏感基因型或环境互作有关。
玫瑰为童期较长的木本灌木，前期辅助选择对其优良种质的选育较为重要。SNP数量丰富，是植物基因组DNA序列上广泛存在的最基本的变异形式[20]。本研究在亲本及杂交后代中检测到SNP在7条染色体上分布均匀，但Chr 1的分布密度较高，可能与该区域功能基因密集或重组热点有关，而Chr 7的分布密度低，可能反映其较高的序列保守性[21]。C＞T和G＞A(转换型)的SNP占比最高，与文雁成等[22]的研究结果一致，可能与C、G中胞嘧啶甲基化后自发的脱氨成为胸腺嘧啶有关。SNP在基因间区分布最多(34.46%)，提示这些SNP可能通过调控基因表达影响耐盐性。
随机选取耐盐与敏盐单株进行分型，发现共有5对引物的HRM基因分型效果较好。全群体分析表明：SNP63可以有效区分耐盐与敏盐单株，说明它可能与耐盐主效基因或调控元件有关，具备作为耐盐辅助选择分子标记的潜力[23]。该标记可在幼苗期应用，提前淘汰耐盐性差的种质，显著缩短育种周期及成本。然而，单个SNP标记的效率易受到群体特异性遗传结构或上位性效应的影响[24]，尽管SNP63标记在本研究群体中展现了较可靠的辅助选择，但在其他玫瑰遗传背景(如不同栽培品种或育种品系)中的普适性仍需验证。此外，玫瑰亲本的高度杂合性为遗传分析提供了丰富的多态性基础，致使杂交后代群体中出现大量分离的SNP位点。本研究鉴定的SNP63位点虽与耐盐性存在关联，但未必为因果变异，可能仅与功能位点紧密连锁。今后需采用精细作图策略，例如通过构建更大的次级分离群体(如F2群体)进行高分辨率数量性状位点定位[25]，结合转录组、基因编辑等功能基因组学手段，深入解析其候选基因及耐盐机制。
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在野生玫瑰与重瓣白玫瑰杂交F1群体中，中度及以上耐盐植株占比达50.6%，其中强耐盐植株12株(占14.5%)。群体重测序共检测到11 412 504个SNP位点，均匀分布于7条染色体上，SNP数量Chr 5最多(19.00%)，Chr 7最少(11.06%)。SNP变异类型以C＞T和G＞A为主，数量均超200万个。HRM基因分型筛选获得5个多态性SNP位点，其中SNP63的Ⅰ型可有效区分耐盐与敏盐单株，表明它具备作为玫瑰耐盐性辅助选择分子标记的潜力。
Evaluation of salt tolerance and screening of salt-tolerant SNP markers in F1 generation derived from wild Rosa rugosa × R. rugosa ‘Alba Plena’
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摘要:
目的 培育强耐盐的玫瑰Rosa rugosa新种质，可为玫瑰育种提供亲本选配策略，以提升耐盐育种效率。 方法 首先通过野生玫瑰与重瓣白玫瑰R. rugosa‘Alba Plena’获得杂交一代(F1)幼苗，然后通过盐胁迫处理评价幼苗耐盐性，最后使用重测序和高分辨率熔解(high-resolution melting，HRM)基因分型技术，进行玫瑰耐盐性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)筛选与验证。 结果 83株F1幼苗中，中度以上耐盐占比超过了50%，其中12株属于强耐盐性植株。对所有杂交后代进行重测序及SNP分析，共检测出11 412 504个SNP位点，其中胞嘧啶(C)＞胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)＞腺嘌呤(A)的变异类型最多。SNP布区域最多的为基因间区，占比约34.46%。此外，共筛选出5个分型良好的SNP位点及引物，其中SNP63位点的Ⅰ型可以较好地筛选掉敏盐的单株，可用于玫瑰耐盐性分子标记辅助选择。 结论 获得耐盐性强于亲本的玫瑰F112株，并筛选出了1个与玫瑰耐盐性显著相关的SNP标记(SNP63)。图5表5参25 -
关键词:
- 玫瑰 /
- 杂交一代(F1) /
- 耐盐性 /
- 单核苷酸多态性(SNP)
Abstract:Objective This study aims to provide a parental selection strategy for salt-tolerant breeding of Rosa rugosa, with the goal of enhancing breeding efficiency. Method F1 generation seedlings were first obtained by crossing wild R. rugosa with R. rugosa ‘Alba Plena’. The salt tolerance of these seedlings was then evaluated under salt stress conditions. Resequencing and high-resolution melting (HRM) genotyping were employed to screen and validate single nucleotide polymorphisms (SNP) associated with salt tolerance. Result Among the 83 F1 seedlings, more than 50% exhibited moderate or higher salt tolerance, with 12 individuals showing strong salt tolerance. Resequencing and SNP analysis of all hybrid progenies detected a total of 11 412 504 SNP loci, among which cytosine (C)＞thymine (T) and guanine (G)＞adenine (A) were the most frequent mutation types. The largest proportion of SNP (approximately 34.46%) were located in intergenic regions. Furthermore, 5 well-genotyped SNP loci and their corresponding primers were screened. Among them, type Ⅰ of SNP63 could effectively eliminate salt-sensitive individuals, demonstrating its potential for marker-assisted selection in breeding for salt tolerance in R. rugosa. Conclusion The 12 salt-tolerant R. rugosa F1 generation exhibiting stronger salt tolerance than their parent lines were obtained, and a significantly salt tolerance-associated SNP marker (SNP63) was preliminarily identified, which will significantly enhance breeding efficiency. [Ch, 5 fig. 5 tab. 25 ref.] -
Key words:
- R. rugosa /
- F1 generation /
- salt tolerance /
- single nucleotide polymorphisms (SNP)
-
图 1 不同耐盐等级植株的生长状态及叶片盐害情况
Figure 1 Phenotypic performance and leaf salt injury symptoms of plants with different salinity tolerance levels
图 2 单核苷酸多态性(SNP)在染色体上的密度分布
Figure 2 Density distribution of single nucleotide polymorphisms (SNP) on chromosomes
图 3 单核苷酸多态性(SNP)变异类型(A)及分布区域(B)数量统计
Figure 3 Statistics of the number of single nucleotide polymorphisms (SNP) for different mutation types (A) and locations (B)
图 4 65个单核苷酸多态性(SNP)位点引物PCR扩增特异性电泳检测结果
Figure 4 Electrophoresis analysis of PCR amplification specificity for primers of 65 single nucleotide polymorphisms (SNP) loci
图 5 单核苷酸多态性(SNP)位点高分辨率熔解(HRM)分型分析
Figure 5 High-resolution melting (HRM) typing analysis of Single nucleotide polymorphisms (SNP)
表 1 83株F1幼苗耐盐等级划分
Table 1. Classification of salt tolerance grades of 83 F1 generations
盐害指数 耐盐等级 对应单株
数量/株占总F1幼苗
比例/%0~0.069 9 强耐盐 12 14.5 0.070 0~0.159 9 中度耐盐 30 36.1 0.160 0~0.249 9 轻度耐盐 20 24.1 0.250 0~0.499 9 敏盐 17 20.5 0.500 0~1.000 0 死亡 4 4.8 
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表 2 样品重测序及其与参考基因组比对数据统计
Table 2. Statistics of sample resequencing data and its comparison with the reference genome
组别 重测序 与基因组比对 读段(reads)
数量碱基数
量/GbQ20/% Q30/% GC/% 读段(reads)
数量碱基数
量/Gb比对率/% 平均测序
深度4×碱基
覆盖率/%10×碱基
覆盖率/%野生玫瑰 ♀ 56 372 513 16.87 99.66 98.26 38.43 112 745 026 11.27 98.68 36.74× 93.88 88.85 重瓣白玫瑰 ♂ 55 952 390 16.74 99.60 97.95 38.46 111 904 780 11.19 99.16 36.63× 94.75 89.46 F1个体平均 18 627 223 5.57 99.66 98.26 38.83 37 254 447 3.73 99.02 12.16× 83.10 53.00 说明：Q20表示碱基的测序错误率≤1%；Q30表示碱基的测序错误率≤0.1%。
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表 3 单核苷酸多态性(SNP)染色体分布统计
Table 3. Single nucleotide polymorphisms (SNP) chromosome distribution statistics
染色体 SNP数量/个 百分比/% Chr 1 1 647 427 14.44 Chr 2 1 641 102 14.38 Chr 3 1 268 168 11.11 Chr 4 1 687 647 14.79 Chr 5 2 168 035 19.00 Chr 6 1 738 000 15.23 Chr 7 1 262 125 11.06 合计 11 412 504 100.00
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表 4 各单核苷酸多态性(SNP)位点突变类型及引物PCR扩增情况
Table 4. Single nucleotide polymorphisms (SNP) mutation types and primer PCR amplification
位点
名称SNP突
变类型PCR扩
增结果位点
名称SNP突
变类型PCR扩
增结果位点
名称SNP突
变类型PCR扩
增结果SNP01 T＞C 正确 SNP23 T＞A 多条带 SNP45 T＞C 正确 SNP02 A＞G 正确 SNP24 G＞T 正确 SNP46 A＞G 多条带 SNP03 G＞T 正确 SNP25 C＞T 正确 SNP47 T＞C 多条带 SNP04 A＞G 正确 SNP26 C＞T 多条带 SNP48 A＞T 多条带 SNP05 T＞G 正确 SNP27 G＞A 正确 SNP49 A＞T 引物二聚体 SNP06 C＞A 正确 SNP28 G＞T 正确 SNP50 C＞T 多条带 SNP07 C＞T 正确 SNP29 C＞G 正确 SNP51 A＞C 引物二聚体 SNP08 T＞G 正确 SNP30 C＞T 多条带 SNP52 T＞A 无条带 SNP09 G＞C 正确 SNP31 G＞A 引物二聚体 SNP53 T＞A 多条带 SNP10 C＞T 引物二聚体 SNP32 A＞T 正确 SNP54 T＞A 正确 SNP11 A＞G 多条带 SNP33 C＞T 正确 SNP55 G＞A 多条带 SNP12 A＞T 多条带 SNP34 A＞G 引物二聚体 SNP56 A＞C 多条带 SNP13 T＞C 正确 SNP35 A＞C 多条带 SNP57 T＞C 引物二聚体 SNP14 G＞A 引物二聚体 SNP36 G＞C 正确 SNP58 C＞T 多条带 SNP15 G＞C 无条带 SNP37 T＞A 多条带 SNP59 C＞T 正确 SNP16 C＞G 正确 SNP38 G＞A 正确 SNP60 C＞T 引物二聚体 SNP17 G＞C 引物二聚体 SNP39 C＞T 正确 SNP61 C＞T、G＞C 正确 SNP18 T＞C 多条带 SNP40 T＞A 正确 SNP62 T＞C、A＞T 多条带 SNP19 C＞G 多条带 SNP41 G＞C 正确 SNP63 A＞G、A＞C 正确 SNP20 G＞A 正确 SNP42 A＞G 多条带 SNP64 C＞G 正确 SNP21 C＞A 正确 SNP43 G＞A 引物二聚体 SNP65 A＞C、T＞A 正确 SNP22 T＞C 引物二聚体 SNP44 T＞C 正确
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表 5 高分辨率熔解(HRM)基因分型结果统计
Table 5. Statistics of high-resolution melting (HRM) genotyping results
位点
名称耐盐等级 不同基因分型植株占比/% Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型 SNP54 强耐盐 50.0 30.0 20.0 0 0 敏盐 69.2 23.1 7.7 0 0 SNP61 强耐盐 70.0 10.0 10.0 0 10.0 敏盐 50.0 6.3 25.0 6.3 12.5 SNP63 强耐盐 63.6 9.1 18.2 9.1 0 敏盐 18.7 31.3 31.3 18.7 0 SNP64 强耐盐 63.6 9.1 27.3 0 0 敏盐 50.0 25.0 25.0 0 0 SNP65 强耐盐 36.4 18.1 36.4 9.1 0 敏盐 31.2 6.3 25.0 31.2 6.3
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[1] SHABALA S, WU Honghong, BOSE J. Salt stress sensing and early signalling events in plant roots: current knowledge and hypothesis [J]. Plant Science, 2015, 241: 109−119. [2] 杨明, 赵兰勇. 山东平阴玫瑰种质资源调查研究及类型划分[J]. 中国园林, 2003, 19(7): 61−63. YANG Ming, ZHAO Lanyong. Research and classification on the germplasm resources of the Pingyin rugose rose in Shandong Province [J]. Journal of Chinese Landscape Architecture, 2003, 19(7): 61−63. [3] 徐勇, 马远潇, 梁悦, 等. 玫瑰花瓣表皮分泌细胞的显微观察及其与精油含量的关系[J]. 江苏农业科学, 2024, 52(24): 148−155. XU Yong, MA Yuanxiao, LIANG Yue, et al. Microscopic observation of epidermal secretory cells of Rosa rugosapetals and their relationship with essential oil content [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2024, 52(24): 148−155. [4] WANG Jianwen, LIANG Yue, CHU Yadong, et al. BOX38, a DNA marker for selection of essential oil yield of Rosa × rugosa[J/OL]. Biomolecules, 2023, 13(3): 439[2025-08-01]. DOI: 10.3390/biom13030439. [5] XU Yong, SHI Yuqing, ZHANG Weijie, et al. C2H2 zinc finger protein family analysis of Rosa rugosa identified a salt-tolerance regulator, RrC2H2-8[J/OL]. Plants, 2024, 13(24): 3580[2025-08-01]. DOI: 10.3390/plants13243580. [6] 杨志莹, 赵兰勇, 徐宗大. 盐胁迫对玫瑰生长和生理特性的影响[J]. 应用生态学报, 2011, 22(8): 1993−1998. YANG Zhiying, ZHAO Lanyong, XU Zongda. Impacts of salt stress on the growth and physiological characteristics of Rosa rugosa [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2011, 22(8): 1993−1998. [7] 李雪剑. 玫瑰种质耐盐性评价及响应盐胁迫的关键基因筛选[D]. 泰安: 山东农业大学, 2022. LI Xuejian. Salt Tolerance Evaluation of Rosa rugosa Germplasm and Key Genes Screening in Response to Salt Stress[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2022. [8] 牛若宇, 高瞻, 熊显鹏, 等. 棉花野生种质资源的育种应用研究与前景[J]. 生物技术通报, 2025, 41(4): 21−32. NIU Ruoyu, GAO Zhan, XIONG Xianpeng, et al. Breeding applications and prospects of wild cotton germplasm resources [J]. Biotechnology Bulletin, 2025, 41(4): 21−32. [9] ZENDA T, LIU Songtao, DONG Anyi, et al. Omics-facilitated crop improvement for climate resilience and superior nutritive value[J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2021, 12: 774994[2025-08-01]. DOI: 10.3389/fpls.2021.774994. [10] 乔东亚, 王鹏, 王淑安, 等. 基于SNP标记的紫薇遗传多样性分析[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2020, 44(4): 21−28. QIAO Dongya, WANG Peng, WANG Shu’an, et al. Genetic diversity analysis of Lagerstroemia germplasm resources based on SNP markers [J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition), 2020, 44(4): 21−28. [11] 欧哲, 杨宇, 冯策婷, 等. 单叶蔷薇远缘杂交中花粉管生长的荧光显微观察[J]. 东北农业大学学报, 2022, 53(10): 18−26. OU Zhe, YANG Yu, FENG Ceting, et al. Fluorescent microscope observation on growth of pollen tube on distant hybridization in Rosa persica [J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2022, 53(10): 18−26. [12] 王涛, 蒙仲举, 张佳鹏, 等. NaCl胁迫对紫穗槐幼苗生长及生理特性的影响[J]. 西北林学院学报, 2021, 36(1): 25−30. WANG Tao, MENG Zhongju, ZHANG Jiapeng, et al. Effects of NaCl stress on the growth and physiological characteristics of Amorpha fruticosa seedlings [J]. Journal of Northwest Forestry University, 2021, 36(1): 25−30. [13] LIU Dan, LIU Kun, TONG Boqiang, et al. Telomere-to-telomere, gap-free assembly of the Rosa rugosa reference genome[J/OL]. Horticultural Plant Journal, 2024[2025-08-01]. DOI: 10.1016/j.hpj.2024.06.005. [14] ZHOU Yong, KATHIRESAN N, YU Zhichao, et al. A high-performance computational workflow to accelerate GATK SNP detection across a 25-genome dataset[J/OL]. BMC Biology, 2024, 22(1): 13[2025-08-01]. DOI: 10.1186/s12915-024-01820-5. [15] LI Heng, DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform [J]. Bioinformatics, 2009, 25(14): 1754−1760. [16] van ZELM E, ZHANG Yanxia, TESTERINK C. Salt tolerance mechanisms of plants [J]. Annual Review of Plant Biology, 2020, 71: 403−433. [17] ZHU Yanchun, LI Mengxia, WANG Tao, et al. Research advances of salt exclusion, salt sequestration, salt secretion, and salt signaling regulation in plants[J/OL]. Plant Stress, 2025, 17: 100952[2025-08-01]. DOI: 10.1016/j.stress.2025.100952. [18] LIU Citao, MAO Bigang, ZHANG Yanxia, et al. The OsWRKY72-OsAAT30/OsGSTU26 module mediates reactive oxygen species scavenging to drive heterosis for salt tolerance in hybrid rice [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2024, 66(4): 709−730. [19] 朱庆林, 王紫阳, 於朝广, 等. 盐胁迫下(落羽杉×墨西哥落羽杉)×墨西哥落羽杉回交子代根尖分生区Na+、K+流特征及QTL定位[J]. 植物资源与环境学报, 2025, 34(4): 1−8, 22. ZHU Qinlin, WANG Ziyang, YU Chaoguang, et al. Characteristics and QTL mapping of Na+ and K+ flows in root apical meristem of backcross generations of (Taxodium distichum × T. mucronatum) × T. mucronatum under salt stress [J]. Journal of Plant Resources and Environment, 2025, 34(4): 1−8, 22. [20] 洪森荣, 曾清华, 谭鑫, 等. 上饶早梨‘六月雪’和‘黄皮消’全基因组重测序分析[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(2): 227−235. HONG Senrong, ZENG Qinghua, TAN Xin, et al. Whole genome re-sequencing analysis of two cultivars ( ‘Liuyuexue’ and ‘Huangpixiao’) of Pyrus pyrifolia in Shangrao [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(2): 227−235. [21] MI Xiaozeng, QIAO Dahe, AN Yanlin, et al. Genome-wide association study of tea plant based on SLAF-seq revealed SNP variations regulating timing of bud flush[J/OL]. Plant Gene, 2025, 42: 100511[2025-08-01]. DOI: 10.1016/j.plgene.2025.100511. [22] 文雁成, 何俊平, 蔡东芳, 等. 基于全基因组重测序技术的甘蓝型油菜光叶突变体基因定位[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2023, 49(4): 497−506. WEN Yancheng, HE Junping, CAI Dongfang, et al. Gene mapping of a novel glossy mutant in Brassica napus L. based on whole genome resequencing technology [J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences), 2023, 49(4): 497−506. [23] CHENG Yuanhang, WANG Tao, WEN Yeying, et al. Genetic variation and assessment of seven salt-tolerance genes in an indica/Xian rice population[J/OL]. Agronomy, 2025, 15(3): 570[2025-08-01]. DOI: 10.3390/agronomy15030570. [24] MCCARTHY M I, ABECASIS G R, CARDON L R, et al. Genome-wide association studies for complex traits: consensus, uncertainty and challenges [J]. Nature Reviews. Genetics, 2008, 9(5): 356−369. [25] 刘飞, 黄娟, 杜千禧, 等. 苦荞重组自交系的RS和GABA的QTL定位及候选基因分析[J]. 浙江农林大学学报, 2025, 42(4): 703−713. LIU Fei, HUANG Juan, DU Qianxi, et al. QTL mapping and candidate gene analysis of RS and GABA based on the recombinant inbred lines(RILs) of Fagopyrum tataricum [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2025, 42(4): 703−713. -
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