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番茄Lycopersicon esculentum青枯病是由病原菌青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum (简称青枯菌)引起的病害，该菌被公认为最具侵染力和破坏力的土传病害之一[1−2]。侵染后引起植株维管束堵塞，严重时导致植物枯萎死亡。据估算，由青枯病造成的农业经济损失高达30万元·hm−2，山东、新疆、河北、河南、云南、江苏等地都是番茄青枯病的重灾区[3]。目前，对于番茄青枯病的防控措施主要有：抗病品种筛选，如BHN466和FL7514[4-5]，但其果实普遍比正常果实小[6]，且筛选抗病品种周期长；采用嫁接方式，虽能增强植物抗病能力，但经济成本较大，目前中国在栽培番茄上采用嫁接技术比例不足2%[7]；化学农药喷施，易促进病源菌产生抗病性和造成土壤污染[8]。尚未有单一的物理化学防治方法能完全有效地抑制番茄青枯病[9]。
目前，关于利用生防菌进行生物防治研究集中在以根际促生菌作为拮抗微生物防治病源菌侵染[10]。其中芽孢杆菌Bacillus、青霉菌Penicillium、木霉菌Trichoderma等常用来作为生防菌应用于植物病害防治研究中。研究发现：芽孢杆菌中解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens Am1和枯草芽孢杆菌B. subtilis PTS-394对番茄青枯病抑制率分别达88.98%[11]和80.00%[12]。木霉菌主要通过竞争作用、诱导宿主抗性、重寄生作用、抗生作用等机制抑制目标病原菌的生长繁殖[13]，其中棘孢木霉T. asperellum是目前开发应用最多的菌种之一。平板对峙试验发现：棘孢木霉F2通过空间位置和营养竞争有效抑制三七Panax notoginseng灰霉病病菌Botrytis cinerea，其抑制率高达90%[14]；棘孢木霉GDFS1009对秸秆腐烂病的抑制率达60%[15]。青霉菌对植物病原菌的抑制效果研究比木霉少，KOMAI等[16]从青霉菌P. simplicissimum IFM53375中分得的Penicillide(1-4)类化合物及其衍生物、嘌呤活性蛋白等具有抗真菌活性作用；夏汉祥等[17]发现淡紫拟青霉P. lilacinus产生的类植物生长素有防治病虫害、促进植物生长的作用；淡紫拟青霉能在香蕉Musa nana根际稳定定殖，对香蕉枯萎病有很强的防控效果。草酸青霉P. oxalicum通过营养竞争、重寄生等多种方式抑制尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum生长发育，它对苹果Malus pumila连作土壤中常见的4种有害镰孢菌有抑制作用[18]。
木霉菌和青霉菌是有潜力的生防菌，但作为青枯菌的生防菌研究鲜见报道。本研究利用筛选获得的棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8等2株生防菌探究对青枯菌的防治效果。
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青枯劳尔氏菌 QL-RS 1115，GenBank: GU390462 (简称青枯菌)由南京农业大学资源与环境学院提供，从出现严重青枯病病症的番茄根际分离，经过科赫法则(Koch’ spostulates)[19]证实具有强致病性。棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8由浙江农林大学浙江省森林生态系统碳循环与固碳减排重点实验室从衢州退化植被恢复试验区土壤中分离获得，经过ITS序列克隆测序、美国国家生物信息中心(NCBI)数据库比对鉴定，用甘油保存法−80 ℃保存[20]。
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包括：①马铃薯葡萄糖培养基(PDA)；②NA培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，牛肉膏3 g，1 L蒸馏水；③NB培养基：NB培养基基础上加20 g琼脂；④SMSA培养基：1 L NA培养基中加入质量浓度3%多黏菌素3 mL，质量浓度3%放线菌酮3 mL，质量浓度1%氯霉素450 μL，质量浓度为1%青霉素450 μL，质量浓度为1%结晶紫450 μL，质量浓度为1% TTC 4.5 mL，质量浓度为1%杆菌肽2.25 mL，于倒平板前加入到三角瓶中[17]；⑤青霉选择培养基：孟加拉红(虎红)培养基；⑥木霉选择培养基：每升孟加拉红(虎红)培养基中加入氯霉素0.25 g，质量浓度为1%链霉素9 mL，于倒平板前加入到三角瓶中[21]。
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参照严无瑕等[22]方法，用两点法进行平板对峙试验，以不接种生防菌为对照，每个处理设置3个重复。将青枯菌和棘孢木霉QZ2菌株分别接种于PDA固体培养基中，(28±1) ℃黑暗培养4 d后，用无菌枪头挑取棘孢木霉QZ2和青枯菌单菌落，接种于100 mL的PDA液体培养基中，28 ℃，170 r·min−1转速震荡培养14 h，得到棘孢木霉QZ2与青枯菌的种子液，取100 μL接种于PDA固体培养基，(28±1) ℃黑暗培养4 d，待平板长满后，用直径9 mm的打孔器获得青枯菌的菌饼，接种于平板中央，用同样方法得到棘孢木霉QZ2菌饼接种青枯菌左右间距40 mm位置。以只在中央接种青枯菌的平板作为对照，每个处理设置3个重复。接种后置于(28±1) ℃黑暗条件下培养，分别于培养4、6、8、10 d时测量青枯菌菌落直径。用同样方法进行草酸青霉QZ8两点法平板对峙试验。青枯菌生长抑制率=(对照菌落直径−处理的菌落直径)/对照菌落直径×100%。
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生防菌发酵液的制备参照程敏等[23]的方法，生防菌种子液的配置参照1.2.1，将种子液按照体积分数为3%的接种量接种至500 mL的PDA液体培养基中，28 ℃、170 r·min−1震荡培养48 h，得到棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8的发酵液。以6 000 r·min−1离心5 min发酵液后，收集上清液，分别与PDA液体培养基按照1∶1的体积比均匀混合，并加入质量浓度为20%的琼脂粉，115 ℃高压灭菌30 min，制成PDA与棘孢木霉QZ2发酵液的混合培养基。用直径9 mm的打孔器获取青枯菌菌饼，接种至棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8的混合培养基的中央，用无菌水代替发酵液的PDA培养基平板作为对照，每个处理设置3个重复。分别于培养4、6、8、10 d时测量青枯菌菌落的直径，抑菌率计算公式同1.2.1。
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生防菌发酵液灭菌后一些活性物质可能会失活，通过活性发酵液的液培试验进一步研究生防菌抑菌机制。液培试验参照谭军等[24]的方法，棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8的初次发酵液制备参照1.2.1，然后通过无菌滤膜过滤，分别取100 mL棘孢木霉QZ2和青霉QZ8无菌发酵液，与NA液体培养基按照1∶1体积比混合均匀，制成含有棘孢木霉QZ2或草酸青霉QZ8发酵液的NA液体培养基。青枯菌种子液制备：用无菌枪头挑取青枯菌单菌落，接种至装有20 mL的NA液体培养基的三角瓶中，28 ℃、170 r·min−1摇床培养12 h，得到青枯菌种子液。取6 mL接种至生防菌发酵液NA混合培养基中，28 ℃、170 r·min−1摇床培养60 h。用灭菌的PDA代替发酵液与NA液体培养基混合均匀作为对照，每个处理3个重复。每隔6 h取样，测定各培养时间菌液的D(600)，共计10次。通过D(600)比较不同环境中青枯菌的含量，并绘制青枯菌的生长曲线。
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鉴于土壤中微生物丰富多样，本研究开展土培试验验证生防菌的生防效果。青枯菌菌液制备参照熊汉琴[25]的方法，青枯菌种子液的制备参照1.2.1，吸取2 mL青枯菌接种于200 mL NB液体培养基，28 ℃，170 r·min−1摇床培养36 h制作青枯菌的菌液，随后将青枯菌菌液分装于50 mL无菌离心管中，6 000 r·min−1离心5 min，去上清液，加无菌水，重复2次，最后加无菌水调整菌液含量，通过分光光度计测D(600)，使其含量达1011 CFU·L−1。2株生防菌孢子液制备方法参考文献[26]，首先分别将2种生防菌接种于PDA固体培养基中，在(28±1) ℃、黑暗条件下培养至孢子长满整个平板，将5 mL无菌水注射在平板上，用涂布棒刮下孢子溶解于无菌水中，用4层纱布过滤后得到孢子悬液，最后将孢子液稀释到1010 CFU·L−1。
采集无青枯菌污染的森林土，土壤pH 6.0~7.0，设置青枯菌+棘孢木霉(QZ2)、青枯菌+草酸青霉(QZ8)、青枯菌+无菌水(对照)3个处理，每处理9个重复，每个重复用100 g土。QZ2和QZ8处理分别将青枯菌菌液与棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8孢子液按体积比1∶1混合后加入土中，每100 g土加13 mL混合液，置于(28±1) ℃的气候培养箱培养。分别在3、7、14、20、28 d，用SMSA培养基，采用稀释涂布平板法计数所有土壤中青枯菌菌落数量[25]。由于群体效应，孢子在土壤中数量达到峰值需要一定时间，因此从处理7 d开始用孟加拉红(虎红)培养基和木霉选择性培养基，采用稀释涂布平板法，获得棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8菌落数量。
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用Excel 2010统计数据，结果以平均值±标准差表示；用SPSS 22.0处理工作平台进行单因素方差分析，显著性水平取0.05；用Origin Pro 2019b绘图。
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平板对峙结果(图1和表1)表明：棘孢木霉QZ2对青枯菌有显著的抑制效果(P＜0.05)，棘孢木霉QZ2的菌丝生长速度明显快于青枯菌生长速度，与对照相比，青枯菌的生长明显受到棘孢木霉QZ2抑制，对峙培养4 d时棘孢木霉QZ2菌丝布满了整个培养皿，包围了青枯菌，抑制率为45.5%，之后青枯菌停止扩大，对照青枯菌则持续生长，10 d对照青枯菌也停止扩大，此时棘孢木霉QZ2对青枯菌的抑制率达80.9%。草酸青霉QZ8对青枯菌也有显著抑制效果，对峙培养4 d时草酸青霉QZ8对青枯菌抑制率为30.5%，之后草酸青霉QZ8继续生长，10 d时草酸青霉QZ8与青枯菌菌落直径都不再扩大，此时草酸青霉QZ8对青枯菌生长抑制率达到45.9%。
图 1 平板对峙试验样本结果
Figure 1. Result of plate confrontation experiment
表 1 平板对峙中棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌的抑制率
Table 1. Inhibition rate of T. asperellum QZ2 and P. oxalicum QZ8 against R. solanacearum in plate confrontation
培养时
间/d对照
菌落直
径/cmQZ2 QZ8 菌落直
径/cm抑制
率/%菌落直
径/cm抑制
率/%4 4.15±0.07 a 2.10±0.04 b 45.5 2.88±0.83 b 30.5 6 5.50±0.00 a 2.30±0.00 b 80.8 3.35±1.00 b 39.1 8 6.70±0.00 a 2.50±0.11 b 79.7 3.62±1.15 b 46.0 10 6.90±0.14 a 2.50±0.04 b 80.9 3.73±1.26 b 45.9 说明：数据代表平均值±标准差，同行数据后小写字母表示 不同处理间差异显著(P＜0.05) -
由图2和表2可见：2株生防菌制成的灭菌发酵液均对青枯菌产生显著的抑制效果(P＜0.05)。棘孢木霉QZ2灭菌发酵液平板中的青枯菌菌落生长速度明显比对照慢，3个处理的青枯菌菌落均在培养10 d时停止扩大，故以10 d为试验结果的统计时间。2株生防菌发酵液的抑制率随着培养时间的增加而增加，4 d时棘孢木霉QZ2发酵液对青枯菌抑制率仅为9.6%，10 d时最大抑制率达33.3%。草酸青霉QZ8发酵液对青枯菌抑制作用与棘孢木霉QZ2相似，10 d时最大抑制率为34.8%，抑制率略高于棘孢木霉QZ2发酵液，差异不显著。
图 2 生防菌灭菌发酵液平板培养结果
Figure 2. Inhibitory effect of supernatant of sterilized fermentation broth incubated for 10 days
表 2 棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8灭菌发酵液对青枯菌的抑制情况
Table 2. Inhibition effect of sterilized fermentation supernatant of biocontrol broth on the growth of R. solanacearum
天数/d 对照菌落
直径/cmQZ2 QZ8 菌落直
径/cm抑制
率/%菌落直
径/cm抑制
率/%4 4.15±0.07 a 3.8±0.10 b 9.6 3.40±0.02 b 18.1 6 5.50±0.00 a 4.6±0.60 b 16.4 4.50±0.00 b 29.1 8 6.70±0.00 a 4.6±0.60 b 31.3 4.50±0.01 b 32.8 10 6.90±0.14 a 4.6±0.60 b 33.3 4.50±0.01 b 34.8 说明：数据代表平均值±标准差，同行数据后小写字母表示不 同处理间差异显著(P＜0.05) -
由图3可见：2株生防菌制成的活性发酵液均对青枯菌有显著的抑制效果(P＜0.05)。对照培养6~18 h时青枯菌呈指数生长，18~24 h时逐渐趋向稳定，其生长曲线与大部分细菌相似。但棘孢木霉QZ2处理在30和36 h时青枯菌D(600)下降，而草酸青霉QZ8处理则在24 h青枯菌D(600)达到峰值后呈缓慢下降，青枯菌较早进入衰亡期。差异检验结果表明：24 h以后，2株生防菌活性发酵液处理的青枯菌D(600)均显著低于对照(P＜0.05)，其中草酸青霉QZ8处理的 D(600)低于棘孢木霉QZ2；60 h时，三者之间的D(600)差异均显著(P＜0.05)。
图 3 生防菌活性发酵液对青枯菌数量变化的影响
Figure 3. Effect of efermination broth on number of soil R. solanacearum
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图4表明：棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8在土壤中均能抑制番茄青枯菌的生长繁殖，其在4个测定时间的青枯菌数量均小于对照土壤；抑制效果最好的是7 d，QZ2与QZ8处理土壤中青枯菌数量均显著低于对照(P＜0.05)，分别下降了51.3%和64.7%；28 d，QZ2与QZ8处理青枯菌数量比对照显著下降了38.9%和34.1%(P＜0.05)；除20 d外，QZ8处理的青枯菌数量均显著低于对照(P＜0.05)；前期(7、14 d)的抑制效果是QZ8好于QZ2，而后期(20、28 d)则相反。
图 4 不同处理土壤青枯菌数量变化
Figure 4. Number of R. solanacearum in soil under different treatments
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图5表明：棘孢木霉QZ2数量在处理7 d时处于低位，14 d达峰值，随后逐渐开始下降。草酸青霉QZ8数量在处理14 d时达到峰值，且明显多于棘孢木霉QZ2，但之后急剧下降，20 d时与棘孢木霉QZ2相近，28 d时反而少于棘孢木霉QZ2。
图 5 土壤中棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8的数量变化
Figure 5. Quantitative changes of T. asperellum QZ2 and P. oxalicum QZ8 in soil
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木霉菌的拮抗机制包括营养和空间竞争、重寄生、分泌有活性代谢产物、诱导宿主植物抗性等[27]。通过平板对峙试验发现：棘孢木霉QZ2生长速度明显快于青枯菌，8 d时已将青枯菌包围，10 d时占领整个生存空间和营养空间，对青枯菌抑制率达80.9%。黄远迪等[28]研究发现：棘孢木霉菌株GX004对尖孢镰刀菌在平板上的抑制率达85.2%；张晓梦等[29]发现棘孢木霉发酵11 d时的无菌滤液对枸杞炭疽病菌Collectotrichum gloeosporioides的抑制率达85.3%。可见棘孢木霉抑制效果良好。平板对峙培养过程中草酸青霉QZ8的生长速度与青枯菌基本一致，也没有发现明显的抑制带，可以推测草酸青霉QZ8能分泌某些代谢产物，从而抑制青枯菌生长。培养10 d时草酸青霉QZ8对青枯菌抑制率为45.9%，抑制效果较好。张先富[30]研究发现：草酸青霉A1对尖孢镰刀菌抑制率为47.1%，且草酸青霉A1与尖孢镰刀菌菌落交界处会产生抑菌带。说明草酸青霉具有较好的生防效果。
本研究结果表明：2株生防菌高温灭菌发酵液和无菌过滤发酵液均对青枯菌有显著的抑制作用。高温灭菌发酵液平板试验中，棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8在混合培养基上培养10 d时最大抑制率分别为33.3%和34.8%。无菌过滤发酵液液培试验中，草酸青霉QZ8对青枯菌的抑制效果显著好于棘孢木霉QZ2。前人研究发现：木霉和青霉均能产生丰富的代谢产物，其中具有抑菌作用的有聚酮类、生物碱、萜类、大环内酯、纤维素酶和几丁质酶等物质[31-32]。棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8灭菌发酵液对青枯菌的抑制效果差别不大，说明均存在耐高温的抑菌物质，而未灭菌发酵液青霉QZ8抑制作用明显强于木霉QZ2，说明草酸青霉QZ8发酵液中的某些不耐高温活性物质如生物碱、酶类化合物，对青枯菌的生长起到较强的抑制作用。
棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8在土壤中的抑菌效果显著，在处理28 d时青枯菌数量显著下降，对照土壤中青枯菌数量始终高于2株生防菌处理的土壤中青枯菌数量。草酸青霉QZ8在处理7、14 d时的抑制效果好于棘孢木霉QZ2，后期则相反，这与土壤中草酸青霉QZ8和棘孢木霉QZ2数量的动态变化规律一致，说明草酸青霉QZ8比棘孢木霉QZ2能更快地在土壤中萌发、定殖，并发挥生防作用。
本研究的2株生防菌对青枯菌均有较好的抑制效果，抑制机制为营养和空间竞争、分泌有活性代谢产物等，其中棘孢木霉QZ2以营养和空间竞争作用为主，而草酸青霉QZ8则以代谢产物的抑制作用为主。两者均是防治番茄青枯病的潜在生防菌，它们在土壤以及番茄体内定殖情况需进一步研究。
Biocontrol effect of Penicillium oxalicum and Trichoderma asperellum on Ralstonia solanacearum
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摘要:
目的 探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。 方法 以青枯菌作为靶标菌，通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用；通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。 结果 平板对峙培养试验发现：棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05)，抑制率分别达80.9%和45.9%；棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌，同样呈显著的抑制作用(P＜0.05)，抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明：其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05)，且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示：2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。 结论 棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果，可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32 Abstract:Objective This study aims to investigate the effect of two biocontrol strains Trichoderma asperellum QZ2 and Penicillium oxalicum QZ8 on Ralstonia solanacearum (bacterial blight for short) With the help of T. asperellum QZ2 and P. oxalicum QZ8 screened by our laboratory, the effect of two biocontrol strains on R. solanacearum was investigated. Hereinafter referred to as the biocontrol effect of bacterial blight. Method Using bacterial blight as the target, The the inhibition effect of biocontrol bacteria and their fermentation broth on the growth of bacterial bacterial blight was determined by plate culture method and growth curve method. Soil culture test and dilution coating method were used to determine the inhibitory effect of biocontrol bacteria on bacterial blight in soil. Result In plate confrontation culture experiment, test showed that QZ2 and QZ8 had significant inhibitory effects on bacterial blight (P＜0.05), with inhibition rates of 80.9% and 45.9%, respectively. The plate culture with high temperature sterilized fermentation broth of QZ2 and QZ8 two biocontrol strains also showed significant inhibition effect on bacterial blight in plate culture (P＜0.05), and the inhibition rates of QZ2 and QZ8 on bacterial blight reached were 33.3% and 34.8%, respectively. The fermentation broth on the growth of bacterial blight results showed that the D(600) value of the treatment was significantly lower than that of the control (P＜0.05), and the inhibition effect of QZ2 was better than that of QZ8. Soil culture test results showed that the number of viable bacteria of R solanacearum in soil treated by with two biocontrol strains was significantly lower than that of ck (P＜0.05). Conclusion The biocontrol strains of QZ2 and QZ8, which were extracted independently, had have significant inhibitory effects on bacterial blight wilt, and could can be positioned identified as potential biocontrol bacteria of tomato bacterial wilt. [Ch, 5 fig. 2 tab. 32 ref.] -
农田杂草与作物竞争，影响作物生长发育，导致作物产量下降，是农业生产面临的主要危害之一[1]。中国每年的杂草发生面积超过
9000 万hm2，造成的主粮作物损失超过300万t[2]。传统的杂草管理方式，如物理拔除和化学除草剂等，并不能彻底解决农田中的杂草问题，且存在诸多弊端[3]。因此，农作物栽培等领域可以结合生态学理论(如作物-杂草竞争、物种共存等方向)进行学科交叉研究，寻找可持续的综合性杂草管理策略。例如，通过施肥[4]、调控种植密度[5]和杂草种类[6]来调控作物-杂草群落的结构和群落内植物的功能性状，进而影响杂草与作物的资源竞争，从而达到提升作物产量的目的[7−8]。小麦 Triticum aestivum是支撑全球粮食产量的主要作物之一，中国小麦种植面积约2 400万 hm2，占全球总产量的17%[9]，麦田杂草主要以禾本科Poaceae植物为主，造成的小麦产量损失每年超过15%，高达150万 t[10]。麦田杂草约200多种，以安徽巢湖农业示范基地小麦田为例，其优势杂草主要为野燕麦Avena fatua和稗草Echinochloa crus-galli，共占杂草总丰度的86%[11]。野燕麦是常见的恶性杂草。稗草原本是水稻Oryza sativa田中的典型杂草[12]，偏好温暖阴湿的生长环境，但随着多地区推广稻麦轮作耕作制度，稗草也开始在水分充足的稻茬麦田中出现[11]。
合理的种植密度和施肥是调节作物生长发育的重要栽培措施之一，直接关系到作物的表型和产量[13−14]。适宜的种植密度和施肥可以提高资源利用率，形成优良的农田群落结构[14]。此外，杂草密度和类型也是影响作物产量的主要因素之一[15]。通过改变作物和杂草密度、比例和类型，使群落内出现多种低竞争能力的杂草，进而提升作物产量[7−8]。
植物的功能性状决定了植物对资源的竞争能力[16]，是植物适应环境变化的关键生态策略，反映了植物在特定环境中生存和繁衍的能力[17]。其中，株高和叶片性状是光合活动的重要指标[18−19]，这些性状不仅与植物的生物量积累和光资源的吸收利用有关，还能够揭示植物的养分供应状态和生存策略[20]。而根系作为植物吸收水分和矿质元素的主要器官，其形态特征与植物吸收利用、生长发育和籽粒产量密切相关。如更高的株高、更大的叶、根面积和体积等，均有助于作物获取光、水、氮等资源并提高利用效率，进而促进生物量的积累[21]。但目前针对小麦-杂草体系中种植密度、比例和施肥对小麦功能性状影响的研究相对较少。因此，本研究以冬小麦为目标作物，研究优势杂草野燕麦和稗草在不同密度和施肥条件下对小麦的生物量和功能性状的影响，旨在为小麦杂草管理和生产提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料选取与培养
本研究选择在安徽省合肥市庐阳区大杨镇的合肥高新技术农业园内(31°55′28.17″N，117°12′12.85″E)的温室大棚中进行。研究区属于亚热带湿润季风气候，年平均气温为14~22 ℃，全年降水充沛且多集中在夏季，光照充足。供试小麦品种为‘烟农19’‘Yannong 19’，野燕麦和稗草种子采集于合肥高新技术农业园内。挑选均匀饱满、无虫眼和霉坏的小麦、野燕麦和稗草种子，清洗消毒后置于培养皿中，在25 ℃光照培养箱内育苗，待幼苗长至2~4 cm，选取长势基本一致的幼苗移栽进行盆栽试验。
1.2 试验设置
冬小麦于2021年11月13日播种，2022年5月开始收割。所用花盆上口直径为24.5 cm，下口直径为18.5 cm，高为25.0 cm。设置3种种植方式(表1)：小麦单播(W)、小麦与野燕麦混播(W-O)、小麦与稗草混播(W-B)。氮肥施用量为小麦田常规施肥量(210.000 kg·hm−2)，对应每盆施加2.182 g尿素，在移栽前作为基肥溶于水后一次性施入盆栽土壤中[11]。植物栽种参考响应曲面法，在设置密度梯度的同时，嵌套小麦和杂草的种植比例详见表1。盆栽总计128盆，采取随机区组设计摆放，降低光照和温度等环境差异对植株生长的影响。在移栽后的2周内对盆栽中死亡的幼苗进行替补移栽，并去除来自于土壤库中的植株幼苗。
表 1 小麦和杂草的种植方式Table 1 Planting pattern for wheat and weeds种植方式 种植密度
(株·盆−1)种植比例(小麦∶杂草) 施肥处理 盆数 小麦单播(W) 4、8、12、16 100%∶0 未施肥 16盆(4种种植密度各4盆) 施肥 16盆(4种种植密度各4盆) 小麦-稗草混播(W-B) 4、8、12、16 25%∶75%、50%∶50%、75%∶25% 未施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 小麦-野燕麦混播(W-O) 4、8、12、16 25%∶75%、50%∶50%、75%∶25% 未施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 1.3 指标测定
将植株从土壤中完整采集，分为地上和地下部分，用蒸馏水冲洗干净后置于65 ℃烘箱内48 h至恒量，利用天平(精度
0.0001 g)称取植株生物量。对于地上性状，收样前使用直尺测量植物地上部分的最大拉伸高度，记为最大株高；从每株植物中随机选择不少于总数四分之一的健康完整叶片测量叶片性状，包括叶片鲜质量、叶面积和叶片干质量。叶面积使用Digimizer统计软件测量，叶片质量由天平称量。利用叶面积/叶片干质量计算比叶面积，叶片干质量/叶片鲜质量计算叶片干物质相对含量。对于地下性状，利用根系扫描仪(Expression 12000XL, EPSON) 和WinRHIZO根系分析软件测量植株根长、根表面积和根体积。利用根表面积/根干质量计算比根面积，根长/根干质量计算比根长，根体积/根干质量计算比根体积，根干质量/根体积计算根组织密度。1.4 数据分析
所有数据采用R 4.2.3软件进行分析和绘图。利用ggplot2包绘图[22]；将原始数据进行以10为底的对数转化以使数据总体符合正态分布，进而利用stats包对取对数后的数据进行线性回归、方差分析及多重比较，分析种植密度、种植比例、施肥对小麦生物量和功能性状的影响；利用vegan包对原始数据进行冗余分析[23]。
2. 结果与分析
2.1 种植密度和施肥对单播小麦生长特征的影响
在单播小麦条件下，无论是否施肥，随着种植密度增大，小麦生物量显著降低(P＜0.05)；施肥显著增加了生物量，种植密度为8株·盆−1时增幅最大，达58.8% (图1A，P＜0.05)。在功能性状方面，对于地上性状，小麦的最大株高在种植密度为4株·盆−1时最大，施肥对最大株高无显著影响(图1B)。小麦叶面积在未施肥时随着种植密度增大逐渐降低，而施肥显著增加叶面积，且在种植密度为8株·盆−1时增幅最大，达143.4% (图1C，P＜0.05)。小麦的比叶面积在种植密度改变时并未发生显著变化，与未施肥相比，种植密度为8株·盆−1时，施肥仅显著增加了比叶面积，从111.90 cm2·g−1增大至168.60 cm2·g−1 (图1D，P＜0.05)。小麦叶片干物质相对含量在未施肥时随着种植密度增大呈驼峰形变化趋势，而在施肥情况下随着种植密度增大呈U形的变化趋势(图1E)。对于根性状，施肥和种植密度均未改变根长、根表面积、比根体积和根组织密度(图1F~K)。整体而言，种植密度和施肥会影响单播小麦的生物量和地上性状，而对根性状作用不明显。
图 1 种植密度和施肥对单播小麦生长特征的影响Figure 1 Changes of wheat biomass and functional traits with N addition and planting density treatments in monoculture单株小麦的生物量、最大株高和叶面积之间呈正相关，它们与叶片干物质相对含量呈负相关(图2A)；单株小麦的根长与根表面积呈正相关，比根面积和比根长呈正相关，两类根性状呈负相关，比根体积与其余4个性状相关性较小(图2B)。
图 2 种植密度和施肥与小麦生长特征之间的相关性分析Figure 2 Redundancy analysis between wheat biomass and functional traits with N addition and planting density treatments in monoculture2.2 与野燕麦混播时不同处理对小麦生长特征的影响
当小麦与野燕麦混播时，无论小麦种植比例如何，随着种植密度增大，小麦生物量显著降低(P＜0.05)；当种植密度相同时，随着小麦种植比例增大，生物量整体呈下降趋势；当种植密度为8株·盆−1，且小麦与野燕麦种植比例为25%∶75%时，施肥仅显著增加了生物量，未施肥时为4.23 g，施肥时为15.65 g，增加了270.3% (图3A，P＜0.05)。在功能性状方面，当小麦与野燕麦种植比例为25%∶75%和50%∶50%时，施肥、种植密度和小麦种植比例均未改变最大株高；当小麦与野燕麦种植比例为75%∶25%时，未施肥时最大株高随种植密度增大显著降低(P＜0.05)，从密度为4株·盆−1时的最大值(59.41 cm)降低至密度为16株·盆−1时的最小值(39.56 cm)；施肥时株高的密度依赖性消失(图3B)。对于叶片性状，施肥、种植密度和小麦种植比例均未改变小麦平均叶面积、比叶面积和叶片干物质相对含量(图3C~E，P＞0.05)。对于根性状，施肥、种植密度和种植比例均未改变根长、根表面积、比根长、比根体积和根组织密度(图3F~K，P＞0.05)。
图 3 与野燕麦混播时不同处理下小麦生长特征的变化Figure 3 Changes of wheat biomass and functional traits of wheat in W-O mixture with N addition, planting density and proportion2.3 与稗草混播时不同处理对小麦生长特征的影响
从图4可见：当小麦与稗草混播时，无论小麦种植比例如何，随着种植密度增大，小麦生物量显著降低(P＜0.05)；当种植密度相同时，随着小麦种植比例增大，生物量整体呈下降趋势；施肥并未改变小麦生物量。在功能性状方面，施肥、种植密度和种植比例均未改变小麦地上性状和根性状。施肥、种植密度和种植比例的交互作用会改变根长和根表面积。在未施肥时，当种植密度为4株·盆−1，且小麦与稗草种植比例为25%∶75%时，小麦根长和根表面积最大，而当种植密度为16株·盆−1，且小麦与杂草种植比例为75%∶25%时，小麦根长和根表面积最小。
图 4 与稗草混播时不同处理下小麦生长特征的影响Figure 4 Changes of biomass and functional traits of wheat in W-B mixture with N addition, planting density and proportion3. 讨论
3.1 种植密度对小麦生长的影响
本研究中，无论是单播还是混播，小麦的单株生物量随着种植密度的增大而显著下降，不依赖于小麦邻体杂草的物种类型。这与以往的研究结果一致，这是因为在高种植密度下，个体可用资源减少[24]。当小麦与野燕麦混播种植比例为75%∶25%，且未施肥时，小麦的最大株高随种植密度增大而显著降低，而此时小麦与稗草混播中的小麦最大株高无明显变化。这表明在相同种植密度和种植比例下，小麦与野燕麦共存时承受着更为激烈的光竞争压力。这可能是因为冬季和早春气温较低，导致原本在温暖潮湿地区常见的稗草发芽和生长较慢[25−26]。相比之下，野燕麦耐旱耐冷、适应性强，拔节后生长迅速，能对小麦构成更大的竞争。此外，野燕麦种子成熟时间较早，这也增大了其对土壤资源的占据[27]，体现了杂草生长过程中的权衡策略[28]，即通过缩短生育期来获取在资源竞争中的优势[29]。
3.2 施肥对小麦生长的影响
施肥是提高土壤肥力的常用手段[30−31]。本研究发现：在小麦单播时，施肥可以增大单株小麦的生物量和叶面积，表明施肥能通过缓解氮受限来增强光合作用和呼吸作用，从而促进生物量的积累[32]。然而，在混播系统中，施肥与否对小麦的生长并无显著改变，这可能是因为当前施肥量对小麦生长的增益不足以弥补种植密度对小麦生长的制约[32]，也可能是因为邻体杂草的竞争作用抵消了施肥对小麦生长的促进[33]。
3.3 种植密度、种植比例和施肥的交互作用对混播小麦生长的影响
当小麦与野燕麦混播时，施肥显著增加了种植密度为8株·盆−1，种植比例为25%∶75%时的单株小麦生物量。这可能是因为施肥后土壤中的可利用氮素增加，在一定程度上缓解了对小麦株高和根系生长的密度制约效应，从而有利于小麦生物量的积累。同时，土壤中可利用氮素的增加也会促进杂草的生长[34]，而野燕麦的生长能力和养分吸收能力优于小麦[35]，因此施肥处理可能会加剧野燕麦对小麦产量的密度制约效应。而当小麦与稗草混播时，施肥对其影响相对较小。这表明种植密度、种植比例和施肥的交互作用对小麦与杂草混播时单株小麦生长的影响可能具有杂草依赖性。种植密度和施肥的交互作用对根长和根表面积的影响较大，即在低密度施肥时最高而高密度未施肥时最低，而对株高和叶片性状的影响较小。这可能是因为与大田环境相比，盆栽不同植株获得光资源的差异较小，而土壤资源和空间受限，使得小麦根系需要发生比地上性状更大的表型可塑性以获取养分和生长。
本研究采用容易获得的形态性状进行分析，并未对叶片光合作用、根呼吸和根系分泌物特征等生理性状进行研究，这些性状能更准确地反映植物对不同环境因子的响应[36]，但难以快速大量测量[37−38]，所以相关研究仍然较少。为了能进一步揭示植物地上、地下性状的权衡机制并将其运用到农业生产和杂草管理之中，应在不同作物、不同耕作方式和不同的田间配置条件下进行有关植物生理属性的研究，并平衡多个功能性状间的权衡关系提高作物适合度。
4. 结论
种植密度、种植比例和施肥的交互作用对小麦与杂草混播系统中小麦的生物量、根长和根表面积产生较大影响，而对株高和叶片性状的影响相对较小。在相同的种植条件下，野燕麦对小麦生长的不利影响超过稗草。施肥则根据混播的杂草种类而表现出不同的效果。因此，在农业生产实践中，应合理调控种植密度、杂草比例和施肥量。同时，在进行杂草管理时应选择合适的杂草种类，以发挥作物和杂草多样性在调控产量中的潜在价值。
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图 2 生防菌灭菌发酵液平板培养结果
Figure 2 Inhibitory effect of supernatant of sterilized fermentation broth incubated for 10 days
图 3 生防菌活性发酵液对青枯菌数量变化的影响
Figure 3 Effect of efermination broth on number of soil R. solanacearum
图 4 不同处理土壤青枯菌数量变化
Figure 4 Number of R. solanacearum in soil under different treatments
图 5 土壤中棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8的数量变化
Figure 5 Quantitative changes of T. asperellum QZ2 and P. oxalicum QZ8 in soil
表 1 平板对峙中棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌的抑制率
Table 1. Inhibition rate of T. asperellum QZ2 and P. oxalicum QZ8 against R. solanacearum in plate confrontation
培养时
间/d对照
菌落直
径/cmQZ2 QZ8 菌落直
径/cm抑制
率/%菌落直
径/cm抑制
率/%4 4.15±0.07 a 2.10±0.04 b 45.5 2.88±0.83 b 30.5 6 5.50±0.00 a 2.30±0.00 b 80.8 3.35±1.00 b 39.1 8 6.70±0.00 a 2.50±0.11 b 79.7 3.62±1.15 b 46.0 10 6.90±0.14 a 2.50±0.04 b 80.9 3.73±1.26 b 45.9 说明：数据代表平均值±标准差，同行数据后小写字母表示 不同处理间差异显著(P＜0.05) 
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表 2 棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8灭菌发酵液对青枯菌的抑制情况
Table 2. Inhibition effect of sterilized fermentation supernatant of biocontrol broth on the growth of R. solanacearum
天数/d 对照菌落
直径/cmQZ2 QZ8 菌落直
径/cm抑制
率/%菌落直
径/cm抑制
率/%4 4.15±0.07 a 3.8±0.10 b 9.6 3.40±0.02 b 18.1 6 5.50±0.00 a 4.6±0.60 b 16.4 4.50±0.00 b 29.1 8 6.70±0.00 a 4.6±0.60 b 31.3 4.50±0.01 b 32.8 10 6.90±0.14 a 4.6±0.60 b 33.3 4.50±0.01 b 34.8 说明：数据代表平均值±标准差，同行数据后小写字母表示不 同处理间差异显著(P＜0.05)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210525
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