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LBD转录因子是一类在其蛋白质N端具有侧生器官边界(LOB)蛋白质结构域的植物特有转录因子[1]。SHUAI等[2]首次发现了LBD基因，发现它在植物侧生器官的边界细胞中表达并且参与侧生器官的发育形成。根据侧生器官边界(LOB)域的结构，拟南芥Arabidopsis thaliana中的LBD转录因子家族通常可被分为2类。类1(Group 1)具有1个完整的高度保守的CX2CX6CX3C锌指结构，通常能够结合特定DNA序列。同时类1的LBD基因具有高度保守的甘氨酸GAS结构和亮氨酸拉链(zipper-like)结构(LX6LX3LX6L)，它们之间会形成卷曲-螺旋结构的蛋白质并相互作用。而类2(Group 2)只含有1个保守的CX2CX6CX3C锌指结构[1-4]。大多数的LBD转录因子基因从属于类1。类2的LBD蛋白质往往保存有1个可能不具有功能的残缺的亮氨酸拉链结构，它会形成1个盘绕-线圈结构[4]。最近，CHEN等[5]通过研究小麦Triticum aestivum LBD蛋白质中LOB结构域的蛋白质结晶学，揭示了之前提到的CX2CX6CX3C锌指结构实际是C4型锌指结构。C4锌指结构常常与GAS结构以及α4和α5之间的垂直构象共同作用，从而精确识别DNA，并能对结合位点的空间构型进行定位。最初的一些LBD基因功能研究表明：LBD基因通常在侧生器官底部的边界新生细胞中表达，在器官分化和侧生器官发育中具有潜在功能[1]。同时，LBD基因还能够参与植物花青素、氮元素代谢和器官再生等关键过程[6]。类1的LBD基因大多数参与植物发育过程[4, 7]和由生长素信号转导级联反应介导的侧根形成过程。相反，类2基因往往作为花青素合成的阻遏物和有效性信号参与了新陈代谢过程[8]。在拟南芥LBD转录因子的表达模式研究中，病原体几乎诱导了类2的所有LBD基因的表达，这表明LBD基因能够在植物病原防御反应中发挥作用[9]。LBD基因参与到拟南芥许多组织发育过程中，比如叶片发育[10]、根部侧生器官发育[11-13]、细胞分裂素信号转导[14]和赤霉素途径[15]。值得一提的是，拟南芥中的AthLBD16基因会促进侧根的起始发育[16]，AthLBD29则能够抑制拟南芥茎纤维壁增厚的生长素信号转导过程[17]。在尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum中AtLBD20作为易感基因似乎能够调节茉莉酸(JA)信号传导和激活尖孢镰刀菌中JA信号转导过程依赖的反应[18]。除拟南芥之外LBD基因功能在许多物种中同样被研究过，如OsIG1基因会参与配子发生过程并影响水稻Oryza sativa的花器官数量[19]；MdLBD13蛋白质则可以抑制苹果Malus × domestica中的花色苷合成和氮吸收[20]。与此同时，在许多物种中也开展了利用基因组数据资源对LBD基因家族鉴定和分析的研究，如茶树Camellia sinensis[21]、马铃薯Solanum tuberosum[22]、桉树Eucalyptus robusta[23]、芸薹Brassica campestris[24]、葡萄Vitis vinifera[25]、大豆Glycine max[26]。但是目前薄壳山核桃Carya illinoensis中的LBD基因研究却鲜有报道。在薄壳山核桃全基因组测序组装完成后LBD基因家族仍然没有进行系统的研究[27]。本研究通过生物信息学手段鉴定了薄壳山核桃全基因组内的LBD基因，分析其基因结构、基序(motif)分布、转录组表达模式并构建系统进化树，预测LBD基因家族在薄壳山核桃中可能的功能，并为进一步研究提供理论基础。
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薄壳山核桃、山核桃Carya cathayensis、核桃Juglans reiga的全基因组蛋白质序列来源于胡桃科Juglandaceae数据库(http://www.juglandaceae.net/)[28]。银杏Ginkgo biloba、无油樟Amborella trichopoda、蓝星睡莲Nymphaea coloratar、大豆、葡萄、水稻的全基因组蛋白质序列来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI)。拟南芥的全基因组蛋白质序列来源于拟南芥信息资源库(TAIR，https://www.arabidopsis.org/)。
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以LBD为关键词，搜索获取LBD在拟南芥中的10条核酸编码序列(CDS)，并下载这10条基因的FASTA格式的核酸序列。将获得的10条拟南芥编码序列通过本地NCBI-BLAST 2.9.0软件的BLASTX程序与1.1中获得的全基因组蛋白质序列进行同源比对，在Pfam数据库[29]中下载LOB结构域的种子文件，得到的候选LBD蛋白质序列用HMMER软件[30]使用隐马尔科夫模型算法筛选出LBD基因，利用ExPASy蛋白质在线分析网站对蛋白质序列进行理化性质的鉴定和分析。
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通过MCSCAN软件[31]，将薄壳山核桃全基因组核酸编码序列CDS文件和基因组注释GFF文件输入执行Pairwise Synteny Search程序，得到的Anchor Pairwise结果以30个基因为阈值过滤小片段block。在最后的gene block中寻找1.2中鉴定到的LBD基因。
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利用ENSEMBL的CLUSTALW软件[32]对获取的52条薄壳山核桃LBD基因进行多重序列比对，将比对后的ALN文件输入至ENDscript网站进行多序列比对的可视化。
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利用MUSCLE v3.8.31软件[33]分别对获取的52条薄壳山核桃和547条多物种LBD基因的蛋白质序列进行多序列比对。获得的多序列比对结果文件使用FastTree V2.1.11软件[34]的JTT+CAT算法[35]构建最大似然树，获得的树文件通过Evolview在线网站[36]可视化。在胡桃科数据库下载薄壳山核桃基因组结构注释GFF文件，并利用Gene Structure Display Server 2.0在线网站[37]可视化LBD基因结构图。在MEME网站上传52条薄壳山核桃蛋白质序列分析基序。
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转录组原始测序数据从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) PRJNA435846下的SRA数据库获取：SRR6793964、SRR6793963、SRR6793962、SRR6793961、SRR6793960、SRR6793959、SRR6793958、SRR6793957、SRR6793956、SRR6793955。从GIGADB (http://gigadb.org/)获取薄壳山核桃全基因组序列和基因组注释GFF文件，利用fastp软件进行质控和过滤，STAR软件进行序列比对，RSEM软件对基因进行定量分析，计算TPM值并生成基因表达数据框。得到的表达数据通过R软件将表达值进行对数转换后利用pheatmap包绘制表达热图。
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通过BLASTX初筛出LBD的同源基因，经HMM-SEARCH程序[29]分析和筛选，供试的10个物种中共获得551条LBD基因(表1)。其中大豆中LBD基因的数量是无油樟的4.46倍、核桃的1.61倍，推测这可能和大豆是由古四倍体演化而来的二倍体有关[38]。根据薄壳山核桃基因组GFF注释文件，发现有pecanLBD50、pecanLBD51和pecanLBD52等3个基因是位于scaffold123681的短串联重复基因。
表 1 多物种LBD基因鉴定结果
Table 1. Identify result of LBD genes in multi-species
鉴定程序 基因数量/个 银杏 无油樟 蓝星睡莲 水稻 拟南芥 葡萄 大豆 核桃 山核桃 薄壳山核桃 BLASTX 90 45 51 61 91 98 153 87 89 80 HMMER 50 26 35 29 58 57 116 72 56 52 MCSCAN分析显示：薄壳山核桃基因组共有211个共线性的区块。在这些共线性的区块中找到了13对在可能全基因组加倍事件中发生重复的同源LBD基因对：pecanLBD1和pecanLBD25、pecanLBD4和pecanLBD17、pecanLBD5和pecanLBD16、pecanLBD11和pecanLBD33、pecanLBD11和pecanLBD32、pecanLBD12和pecanLBD33、pecanLBD12和pecanLBD32、pecanLBD14和pecanLBD43、pecanLBD14和pecanLBD42、pecanLBD19和pecanLBD26、pecanLBD20和pecanLBD29、pecanLBD21和pecanLBD36、pecanLBD34和pecanLBD41。共线性分析共得到基因23个，占所有LBD基因的44.2%，这说明了全基因组加倍事件使LBD基因家族得到了扩张。
通过理化性质分析(表2)：在氨基酸数量、分子量、等电点、不稳定系数和脂肪系数等方面存在差异。氨基酸数量为 92~326个，大部分为 170~300个；等电点为4.48~9.85，＞7.5的有24个，多在碱性范围内；不稳定系数＜40的有51个，为稳定蛋白质；＞40仅1个，为不稳定蛋白质；蛋白质的脂肪系数大多＜100，为疏水性蛋白质，仅有pecanLBD50脂肪系数＞100，为亲水性蛋白质。
表 2 薄壳山核桃LBD转录因子家族蛋白质理化性质
Table 2. Physicochemical properties of LBD transcription factor family protein in C. illinoensis
蛋白质 氨基酸残基数/个 分子量/kD 理论等电点 酸性氨基酸/个 碱性氨基酸/个 不稳定系数 脂肪系数 总平均亲水性 pecanLBD1 210 23 309.19 8.24 17 19 47.65 73.52 −0.485 pecanLBD2 208 22 353.77 7.55 20 21 58.32 88.65 0 pecanLBD3 288 31 617.01 8.99 29 35 61.92 76.88 −0.326 pecanLBD4 223 24 069.37 7.69 17 18 73.89 77.89 −0.171 pecanLBD5 188 20 808.56 7.63 17 18 67.24 69.15 −0.490 pecanLBD6 260 28 451.22 8.23 31 34 52.55 69.38 −0.501 pecanLBD7 156 17 540.20 9.03 12 18 55.87 78.91 −0.235 pecanLBD8 172 18 611.24 8.59 14 17 61.24 70.35 −0.238 pecanLBD9 276 30 985.11 8.55 28 32 30.84 76.96 −0.522 pecanLBD10 326 36 029.86 6.91 23 22 64.45 77.58 −0.472 pecanLBD11 204 22 376.57 7.53 18 19 60.78 77.99 −0.233 pecanLBD12 232 25 857.68 5.90 21 14 50.52 65.22 −0.425 pecanLBD13 170 18 808.03 6.42 18 17 65.04 57.47 −0.607 pecanLBD14 202 21 823.68 8.59 14 17 57.41 80.20 −0.175 pecanLBD15 203 23 706.08 8.15 27 29 52.00 77.39 −0.556 pecanLBD16 191 20 998.77 6.08 19 17 70.05 72.04 −0.423 pecanLBD17 230 25 054.58 9.22 17 23 78.94 70.04 −0.284 pecanLBD18 172 18 626.23 8.82 14 18 67.64 73.14 −0.296 pecanLBD19 306 33 113.72 7.95 33 35 46.03 81.54 −0.280 pecanLBD20 162 18 029.72 6.70 14 14 51.76 88.52 −0.133 pecanLBD21 127 14 182.02 4.48 14 7 36.18 92.20 −0.246 pecanLBD22 176 19 971.98 5.17 25 18 44.88 80.34 −0.186 pecanLBD23 130 15 042.74 9.84 10 25 45.43 77.23 −0.541 pecanLBD24 162 18 285.75 8.23 13 15 57.65 78.40 −0.337 pecanLBD25 214 23 771.70 8.25 17 19 49.42 74.44 −0.472 pecanLBD26 310 33 384.03 8.22 34 37 47.44 80.87 −0.302 pecanLBD27 168 18 892.28 6.28 17 13 72.86 63.87 −0.476 pecanLBD28 215 23 539.68 5.33 18 14 75.47 70.88 −0.272 pecanLBD29 167 18 504.18 6.94 15 15 59.00 81.80 −0.217 pecanLBD30 176 19 230.73 6.50 18 17 69.15 73.75 −0.242 pecanLBD31 169 18 881.58 6.49 17 16 51.28 79.59 −0.219 pecanLBD32 236 26 157.91 5.74 22 13 46.73 65.76 −0.405 pecanLBD33 213 23 405.50 7.06 19 19 65.23 67.37 −0.380 pecanLBD34 326 37 266.20 5.47 54 35 49.05 74.29 −0.813 pecanLBD35 251 27 236.49 6.44 24 22 59.55 80.08 −0.322 pecanLBD36 228 24 949.42 6.29 17 16 83.40 71.05 −0.271 pecanLBD37 228 24 709.22 8.06 22 24 59.20 76.14 −0.244 pecanLBD38 216 23 449.53 6.03 17 13 64.11 75.05 −0.227 pecanLBD39 158 17 663.15 6.27 15 13 53.44 80.25 −0.243 pecanLBD40 221 24 171.04 4.97 21 12 58.45 78.60 −0.143 pecanLBD41 265 30 244.09 6.42 33 29 46.86 77.66 −0.594 pecanLBD42 237 24 801.38 8.20 13 15 69.07 79.87 −0.065 pecanLBD43 213 23 452.55 6.74 19 18 56.45 80.61 −0.203 pecanLBD44 224 24 373.77 8.93 17 22 69.41 73.62 −0.276 pecanLBD45 202 21 927.15 8.56 19 23 54.66 83.47 −0.159 pecanLBD46 221 24 114.37 9.01 18 23 73.18 66.29 −0.421 pecanLBD47 289 32 466.21 5.27 29 21 67.19 65.92 −0.600 pecanLBD48 176 19 971.98 5.17 25 18 44.88 80.34 −0.186 pecanLBD49 170 18 770.95 6.19 19 17 60.44 55.18 −0.615 pecanLBD50 92 10 319.08 6.26 11 10 39.17 115.65 0.018 pecanLBD51 313 34 650.03 7.29 20 20 64.34 73.07 −0.490 pecanLBD52 320 35 091.25 6.83 23 21 66.59 67.53 −0.593 -
如图1所示：52个薄壳山核桃LBD基因聚成3类：GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ。其中，GroupⅠ含有最多的33个LBD基因，它们可能承担了LBD基因促进侧生器官发育的主要功能。GroupⅠ中有1对蛋白质序列完全相同的基因pecanLBD22和pecanLBD48，导致它们在进化树上没有显示变异，而pecanLBD41的进化枝长度达到3.7346，是GroupⅠ中相对于其他LBD基因变异程度最大的。GroupⅡ细分为3支基因簇，其中 Sub groupⅠ和Sub groupⅢ的进化枝相对较短，因此序列和功能变异不大；而Sub groupⅡ有明显的进化变异，其中pecanLBD6的枝长为6.2748，是Sub groupⅡ中变异最大的基因，它可能已经出现了功能上的分化变异。GroupⅢ是3类中最保守的一支，其中的pecanLBD9基因的枝长在所有52个LBD基因中最长，达6.764 2。
图 1 薄壳山核桃LBD基因家族系统进化树
Figure 1. Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software
如图2中52个薄壳山核桃LBD基因基序分析结果所示：共发现了10个基序并命名为Motif1~Motif10。对LBD转录因子家族较重要的有3个基序：Motif1含GAS(Gly-Ala-Ser)甘氨酸保守结构；Motif 2拥有完整的高度保守的CX2CX6CX3C锌指结构，通常具有结合特定DNA序列的能力；Motif 3 为亮氨酸拉链结构(LX6LX3LX6L)。Motif1和Motif3往往会形成卷曲-螺旋结构的蛋白质并相互作用。52个薄壳山核桃LBD基因中的39个具有完整的Motif1、Motif2和Motif3的顺序基序结构；而pecanLBD34、pecanLBD41和pecanLBD9在进化过程中丢失了Motif1的GAS甘氨酸保守结构；pecanLBD6、pecanLBD19、pecanLBD26、pecanLBD45、pecanLBD37、pecanLBD2和pecanLBD3丢失了Motif3亮氨酸zipper-like结构(LX6LX3LX6L)，尽管它们仍具有GAS结构但已经丧失了和Motif1结合生成卷曲-螺旋蛋白质结构的功能；pecanLBD50则丢失了所有的基序，可能丧失了LBD基因的基本功能。
图 2 薄壳山核桃LBD转录因子家族系统发育树和保守蛋白质基序结构
Figure 2. Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software
基因结构分析显示：薄壳山核桃LBD基因一般具有1~3个外显子。其中pecanLBD41~pecanLBD52都只具有1个外显子(除pecanLBD47有2个外显子除外)，并且都属于GroupⅠ；具有3个外显子的基因只有pecanLBD3、pecanLBD34和pecanLBD9，在每类都有部分；剩余的LBD基因都为2个外显子，占所有薄壳山核桃LBD基因的67.3%。因此，薄壳山核桃LBD转录因子家族的大多数基因较为保守，有着相似的基序、基因结构，执行并发挥LBD的主要功能，而其发生变异的小部分可能已经丢失了原来的基因功能或者特化出新的功能。
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对52个薄壳山核桃LBD转录因子基因的LOB蛋白质结构域多序列比对(图3)发现：LOB蛋白质结构域主要由3个保守序列模式组成：长度为16个氨基酸的CX2CX6CX3C锌指结构、长度为50个氨基酸的甘氨酸GAS结构和LX6LX3LX6L亮氨酸拉链结构。其中pecanLBD50和pecanLBD21完全缺失了锌指结构和部分的甘氨酸GAS结构，而其他的LBD的锌指结构则全部保存下来没有发生缺失或者突变，较为保守。甘氨酸GAS结构相对锌指结构变异程度较大，GroupⅠ中pecanLBD23~pecanLBD47、pecanLBD10、pecanLBD51发生了1~2个氨基酸的变异，GroupⅡ中pecanLBD6、pecanLBD19、pecanLBD26、pecanLBD45、pecanLBD37、pecanLBD2、pecanLBD3等7个转录因子GAS中的丙氨酸突变为精氨酸、丝氨酸突变为丙氨酸，52个LBD转录因子中有12个发生了突变，2个缺失了GAS结构。LX6LX3LX6L亮氨酸拉链结构中，上述7个转录因子的第1个亮氨酸位置都突变为甘氨酸，第3个亮氨酸位置突变为甘氨酸或苏氨酸，有5个转录因子的第2个亮氨酸位置发生了突变，由此可见上述7个LBD转录因子与进化模式(图1)一致，已经发生了较大程度的变异，可能已经分化出新的功能。pecanLBD15、pecanLBD47、pecanLBD10、pecanLBD51、 pecanLBD52、pecanLBD7和pecanLBD24的第2个亮氨酸位置发生了突变，第3个亮氨酸位置只有pecanLBD40、pecanLBD23和pecanLBD10发生了突变，相对保守。
图 3 薄壳山核桃LBD 转录因子家族LOB蛋白质结构域多序列比对
Figure 3. Multiple sequence alignment of LOB domain in C. illinoensis transcription factor family
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由图4可见：与薄壳山核桃LBD系统发育树相似，图4中各物种LBD转录因子可以聚为3类：GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ。其中GroupⅠ有314个LBD基因，为总数的57.0%，占比最多；GroupⅡ有166个LBD基因，占总数的30.1%；而GroupⅢ的基因数量最少，只有71个，占总数的12.9%。从表1鉴定到的LBD转录因子的数量来看，裸子植物银杏的数量是早期被子植物类群的2倍，这与银杏最近一次特异性的WGD事件有关[39]；早期被子植物类群和单子叶植物水稻的LBD基因数量接近；而双子叶植物的LBD基因数量明显又发生了1次倍增。从分布来看，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ中每个植物类群都存在LBD基因，因此LBD转录因子家族可能在裸子植物和被子植物未分化前已经分为3类，分化后3类LBD继续各自进化。从变异程度看GroupⅠ和GroupⅡ相对较为保守，而GroupⅢ内的所有LBD基因共享一支较长的分支，说明它们已发生了较大的变异，可能已经分化出新的功能。
图 4 利用从裸子植物银杏到高等植物551个LBD基因全长蛋白质序列构建系统发育树
Figure 4. Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of 551 LBD genes from gymnosperm ginkgo to higher angiosperms
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为了探究LBD转录因子家族在胚发育的关键过程中的作用，从NCBI网站的SRA原始测序数据库中下载了薄壳山核桃胚成熟过程中3个关键时期的原始测序数据：子叶伸展早期(early extended stage of cotyledon development)、子叶完全伸展期(fully extended stage of cotyledon development)、胚完全成熟期(fully matured stage of embryo)，并进行分析和绘制聚类热图(图5)。不同LBD基因和不同发育阶段之间的表达模式有显著差异。基因表达量可以聚为4类：①pecanLBD2、pecanLBD19和pecanLBD26在3个阶段的表达量比较高；②pecanLBD30、pecanLBD3和pecanLBD37在子叶伸展早期和子叶完全伸展期表达；③pecanLBD11、pecanLBD18、pecanLBD8、pecanLBD25、pecanLBD6、pecanLBD42、pecanLBD13、pecanLBD52、pecanLBD17、pecanLBD35、pecanLBD1、pecanLBD43、pecanLBD29和pecanLBD44仅在子叶伸展早期有表达；④其余的LBD基因在3个阶段都不表达。从2.2中系统发育分析的结果来看：③类表达的14个LBD基因(78.6%)，属于较为保守的Group I，因此它们在胚发育过程中主要参与经典的器官分化过程，加快子叶边界新生的细胞分化。而①类表达的基因都是进化枝较长、变异程度较大的GroupⅡ中Sub GroupⅡ的成员，可见GroupⅡ中Sub Group Ⅱ的LBD成员已经发生了较大程度的变异，它们参与到胚发育的全程，可能与胚中营养物质的积累过程和胚组织分生发育的过程密切相关。②类中pecanLBD30和pecanLBD3属于GroupⅡ， pecanLBD 37属于GroupⅠ，它们在功能上可能介于①类和③类，即既参与了器官分化、细胞分裂的过程调控，又和胚中营养物质积累的过程相关。总体上，薄壳山核桃胚发育过程中LBD基因功能较为保守，主要参与新生细胞分裂分化、子叶形态建成等，但GroupⅡLBD基因的变异程度较大，可能进化出新的功能，在胚发育过程中发挥更加关键的作用。
图 5 薄壳山核桃LBD 转录因子家族胚发育表达模式
Figure 5. Transcriptome expression profile of LBD gene family in embryo development
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本研究分别在银杏、无油樟、蓝星睡莲、水稻、拟南芥、葡萄、大豆、核桃、山核桃和薄壳山核桃全基因组蛋白质序列中系统鉴定了551个LBD基因。这些LBD基因包含典型的LOB结构域，即1个含有DNA结合活性所需的 (CX2CX6CX3C)锌指结构、1个Gly-Ala-Ser(GAS)结构和1个负责蛋白质二聚体化的亮氨酸拉链 (LX6LX3LX6L)结构。根据LOB结构域的组成模式和系统发育学分析结果。薄壳山核桃52个LBD基因可分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ 3类。33个LBD基因被划分为GroupⅠ，15个被划分为GroupⅡ，4个为GroupⅢ。根据进化枝的长度，GroupⅠ是数量较多同时也比较保守的一支，而GroupⅡ和 GroupⅢ都发生了一定程度的变异。
新基因功能产生或分化的一大动力是基因重复，基因重复对物种提高环境适应性至关重要[40]。在进化过程中，重复的基因可能会经历功能分化、亚功能分化或功能丢失等多种过程[41]。基因重复通常会导致基因家族扩张[42]。为了揭示薄壳山核桃LBD基因家族的复制机制，利用MCScanX对薄壳山核桃的基因组共线性区块内成对的LBD基因进行筛选。根据目前的基因组内LBD基因位置分析结果，薄壳山核桃基因组内只存在1个连续3个LBD基因的串联重复事件，但是存在13对23个由全基因组加倍产生的LBD基因共线性基因对。这说明全基因组加倍在LBD基因家族进化中起到了主导性的推动作用。
本研究构建了以裸子植物(银杏)、早期被子植物(无油樟、睡莲)、单子叶植物(水稻)、双子叶植物(拟南芥、葡萄、大豆)、近缘种植物(核桃、山核桃)和薄壳山核桃为显花植物中主要类群的LBD基因系统发育树。显花植物LBD系统发育树与与薄壳山核桃LBD相似，同样可以聚为3类。从分布来看，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ中每个植物都存在LBD基因，因此LBD转录因子家族可能在裸子植物和被子植物未分化前已经分化为3类。从变异程度看，GroupⅠ和GroupⅡ相对较为保守，而GroupⅢ内的所有LBD基因共享一支较长的分支，说明已发生了较大的变异，可能已经分化出新的功能。
LBD蛋白质协调了很多植物发育过程，并对环境刺激作出反应，特别是在调控侧根器官发育和代谢过程中起着至关重要的作用。例如LBD18通过抑制LBD18 DNA-结合活性控制侧根发育[43]。一般来说，主根受到侧根过度生长的影响，会降低植物提取水分和养分的能力。在土壤中蔓延的侧根过多，将增加被病原体攻击的可能性。以前的一些工作已经证明了这些预测。如LBD1通过抑制主根生长和维持侧根萌发来控制盐胁迫下的根结构[44]。LBD基因由于其对一系列下游基因的转录调控，成为植物病原体入侵的关键分子靶基因[7]。
在薄壳山核桃研究中胚的发育是非常重要的阶段[45]，特别是胚内蛋白质、不饱和脂肪酸、淀粉等重要营养物质累积过程是薄壳山核桃研究的热点[46-47]。本研究分析LBD转录因子家族在薄壳山核桃子叶伸展早期、子叶完全伸展期和胚完全成熟期3个时期的转录数据发现：薄壳山核桃LBD基因存在4种表达模式。可见LBD基因具有参与调控胚发育过程的功能，通常基于在侧生器官底部的边界新生的细胞中调控细胞分裂分化来控制子叶的发育和形态建成。薄壳山核桃LBD基因中有在整个胚发育过程中都高表达的一簇基因，这些基因在胚发育过程中发挥了更加重要的作用，因此有必要对这一簇LBD基因进行更为深入的基因功能研究，可为进一步改良薄壳山核桃遗传性状提供基础。
Genome-wide identification and bioinformatics analysis of LBD family of transcription factors in Carya illinoensis
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摘要:
目的 研究薄壳山核桃Carya illinoensis LBD基因家族结构特征、进化模式和在胚发育过程中的表达模式。 方法 运用生物信息学手段鉴定薄壳山核桃LBD基因，分析该基因结构特征、系统发生学关系、显花植物中的进化历史和在胚发育过程中3个关键阶段的表达模式。 结果 薄壳山核桃全基因组中一共鉴定到52个候选LBD基因。根据基因结构、系统发生学最大似然树和Motif分析可分为3类：GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ。多序列比对分析中，52个LBD基因LOB结构域中鉴定出3个重要的结构：CX2CX6CX3C锌指结构、高度保守的甘氨酸GAS结构和亮氨酸拉链(zipper-like)结构，并且在3类内都分别发生了特异性的的变异或者缺失。根据代表性显花植物LBD基因家族的系统发生学分析，从变异程度看GroupⅠ和GroupⅡ相对较为保守，而GroupⅢ内的所有LBD基因共享1支较长的分支，它们已发生了较大的变异，可能已经分化出新的功能。表达分析结果显示：LBD基因家族参与调控胚发育过程，通常控制子叶的发育和形态建成。薄壳山核桃LBD基因中又有在整个胚发育过程中都高表达的一簇基因，这些基因可能在胚发育过程中发挥了更加重要的作用。 结论 薄壳山核桃全基因组中共获得LBD基因52个，共可分为3个亚家族，不同的亚家族具有不同的基因结构、蛋白质结构、进化模式和表达模式，转录组表达分析显示：不同亚家族之间在胚发育不同阶段具有差异性表达，它们共同参与调控薄壳山核桃胚发育过程。图5表2参47 Abstract:Objective This study is aimed to investigate the structural features and the evolutionary patterns of the LBD transcription factor family as well as their expression patterns throughout the embryonic development in Carya illinoensis. Method With bioinformatic software employed, efforts were made to identify the LBD gene and analyze its gene structure characteristics, phylogeny relationships and evolutionary history in flower plants, as well as their expression patterns at the three key stages througout the embryonic development. Result Within the whole genome in C. illinoensis there were a total of 52 candidate LBD genes which, in terms of gene structure, maximum likelihood phylogenetic tree and motif analysis, could be classified into 3 categories: Group Ⅰ, Group Ⅱ and Group Ⅲ. After the multiple sequences alignment analysis three important structures in the LOB domains of 52 LBD genes were identified, namely the CX2CX6CX3C zinc finger structure, the highly conserved glycine GAS structure and the leucine zipper-like structure with the occurrence of specific mutations or deletions in each of them. According to the LBD gene family phylogenetic analysis of representative flowering plants, Group Ⅰ and Group Ⅱ are relatively conservative, while all LBD genes in Group Ⅲ share a longer branch which indicates that they have undergone greater variation and new functions have been differentiated. The expression analysis showed that the LBD gene family participates in the function of regulating the development of embryos, usually with control over the development and morphogenesis of cotyledons and there is a cluster of genes in the LBD gene of hickory pecans that are highly expressed during the entire embryo development process playing a highly significant role. Conclusion A total of 52 LBD genes were obtained in the whole genome of C. illinoensis, which can be divided into three different subfamilies with different gene structures, protein structures, evolutionary patterns, and expression patterns, and these subfamilies, according to the transcriptome expression analysis, are differentially expressed at different stages of embryonic development, and involved in the regulation of C. illinoensis embryo development collectively. [Ch, 5 fig. 2 tab. 47 ref.] -
Key words:
- Carya illinoensis /
- LBD /
- transcription factor /
- phylogenetics /
- gene function
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植物种群的空间分布格局是指种群在水平空间上的配置和分布状况[1]，除了种群自身特性和环境条件因素与其形成密切相关外[2]，种间关系也是促使其形成的主要动力之一[3]，在判断植物种间关系时，生态学家们通常会运用种间联结性分析来探究物种之间的内在联系[4]。此外，生态位的重叠程度在一定程度上能够反映物种联结关系以及空间配置关系[5-6]。对植物种间关系及空间分布格局的研究，有助于认识种群与生境的相互关系、空间资源获取能力与生态适应对策，预测群落消长动态，是深入了解维持树木物种共存机制，并了解产生空间格局的过程的重要手段[7-9]，对于正确认识群落的组成、功能及演替规律具有重要意义。次生林是中国森林资源的主体，它既保持着原始森林的物种组成成分与生境，又与原始森林在结构组成、林木生长、生产力、林分环境和生态功能等诸多方面有着显著的不同，原始林退化导致的次生林面积扩大将引起森林生态系统中生物多样性的下降[10]。如何恢复和保护次生林群落的物种多样性成为生态学家面临的重要问题。而对森林木本植物的空间分布格局及种间关系的研究有助于揭示群落结构的形成机制与潜在的生态学过程，对次生林的经营抚育具有一定指导意义[11]。以松林、松阔混交林和常绿阔叶林中幼龄林为主体的天然次生林是浙江省建德市的森林资源主体，主要由被过度干扰破坏的天然林地逐渐恢复、演替而来[12]。次生林中仍保有原始森林的部分物种，但不同类型次生林在群落结构、林木年龄组成、植物生产力及生境等方面都存在显著差异[13]。本研究对浙江建德的次生林群落进行每木调查，分析主要树种间的相互关系及空间分布格局特征，以增强对该区域次生林群落结构特征和空间分布格局的认识，促进区域生物多样性保护与木本植物资源的可持续利用，预测群落的演替方向并探索其驱动力来源，进而为该区域次生林群落的恢复、改造及抚育经营提供依据，更好发挥其生态社会效益。
1. 研究区概况
研究区位于浙江省建德市新安江林场(29°29′N，119°16′E)，属亚热带北缘季风气候，温暖湿润，四季分明，年平均气温为16.9 ℃，最冷月平均气温为4.7 ℃，最热月平均气温为29.2 ℃，年均降水量为1 504.0 mm。据《中国植被》区划，该地区森林植被属亚热带常绿阔叶林北部亚地带，地带性植被为常绿阔叶林。主要森林植被类型有常绿阔叶林、落叶阔叶林、常绿落叶阔叶混交林、针阔混交林等[14]。
2. 研究方法
2.1 样地设置及调查
在实地踏查的基础上，在浙江建德典型常绿阔叶林、松阔混交林和松林群落中分别设置面积为100 m×100 m的样地(表1)，用木桩、塑料带进行围封标记。将每块样地划分为25小块(20 m×20 m)，并以此为基本单位对乔木层进行每木调查。记录样地群落类型、海拔、坡度、坡向、土壤等环境因子；记录样方中胸径≥5 cm的木本植物的基础数据，包括种名、树高、胸径、冠幅及其相对应的坐标[15-16]。
表 1 样地基本信息Table 1 Basic information of sample plots样地类型 海拔/m 纬度(N) 经度(E) 坡度/(°) 坡向 土壤类型 地点 常绿阔叶林 172 29°40′ 119°23′ 44 西 红壤 杨村桥镇徐坑村 松阔混交林 165 29°28′ 119°12′ 38 南 红壤 新安江林场朱家埠林区 松林 90 29°21′ 119°09′ 33 东 红壤 新安江林场朱家埠林区 2.2 重要值
重要值(IV)计算[17]：IV=(相对多度+相对显著度+相对频度)/3×100%。
2.3 生态位重叠
采用Pianka重叠指数计算物种间的生态位重叠系数，公式[18]如下：
$${O_{ik}}{\rm{ = }}\mathop \sum \limits_{j = 1}^w \left( {{P_{i\!j}}{P_{k\!j}}} \right) \div \sqrt {{{\left( {\mathop \sum \limits_{j = 1}^w {P_{i\!j}}} \right)}^2}{{\left( {\mathop \sum \limits_{j = 1}^w {P_{k\!j}}} \right)}^2}} \text{。}$$ 其中：Oik为种i和种k的生态位重叠系数[1]；w为划分的资源位总数；Pij和Pkj分别是种i和种k在资源位j中的重要值占该物种在整个资源中总重要值的比例。Oik的值域为[0，1]，当2个种对群落中所有的资源都不存在共享状态时，该种对之间生态位完全不重叠，其值为0；当2个种对群落中所有资源利用完全重叠时，该种对的生态位重叠程度为1，达到最大状态。
2.4 空间分布格局
2.4.1 种内空间分布格局
Ripley’s K(r)函数是进行种内空间分布格局分析的基础函数，公式如下[19]：
$$ K\left( r \right) = \frac{A}{{{n^2}}}\sum\limits_{p = 1}^n {\sum\limits_q^n {e_{pq}^{ - 1}} } {I_r}{\rm{(}}{u_{pq}}{\rm{)}}\text{。} $$ 其中：r为分析的空间尺度(m)，A为样方面积(m2)，n为植物种个体数，upq表示点p和点q之间的距离(m)；Ir(upq)为指示函数，当upq≤r时，Ir(upq)=1，当upq＞r时，Ir(upq)=0；epq为权重值，用于边缘校正。为了更直观地解释实际的空间格局，通常用Ripley’s L(r)函数表示：
$$L\left( r \right) = \sqrt {\frac{{K\left( r \right)}}{\text{π} }} {\rm{ - }}r\text{。}$$ 当L(r)=0，种群分布类型为随机分布，对种群的聚集分布研究基于随机分布的基础，以样地中的任意一点为圆心，r为半径画圆，如果在圆中出现的个体数多于随机状态下的个体数，那么表示该种群呈现聚集分布；当圆中出现的个体数少于随机分布状态下的个体数时，该种群呈现均匀分布[20-22]。采用Monte-Carlo模拟99%置信区间，进行结果偏离随机状态的显著性检验。若L(r)值位于置信区间之上，种群呈聚集分布，L(r)值位于置信区间之下，种群呈均匀分布，L(r)值位于置信区间之内，种群呈随机分布[23]。
2.4.2 种间空间分布格局
种间空间分布格局基础函数计算公式[24]如下：
$${K_{12}}\left( r \right) = \frac{A}{{{n_1}{n_2}}}\sum\limits_{g = 1}^n {\sum\limits_f^n {w_{gf}^{ - 1}} } {I_r}({u_{gf}})\text{。}$$ 其中：n1和n2分别为种1和种2的个体数，f和g分别代表种1和种2的个体。同样，用L12(r)取代K12(r)，公式为：
$${L_{12}}\left( r \right) = \sqrt {\frac{{{K_{12}}\left( r \right)}}{\text{π} }} {\rm{ - }}r\text{。}$$ 当L12(r)=0，表明2个种在r尺度下无关联；当L12(r)＞0，表明两者为空间正关联；当L12(r)＜0，表明两者为空间负相关。采用Monte-Carlo模拟99%置信区间，进行结果偏离随机状态的显著性检验。当L12(r)值位于置信区间之上，2个变量显著正相关；L12(r)值位于置信区间之下，2个变量显著负相关；L12(r)值位于置信区间之内，2个变量相互独立[23]。本研究根据实际样地面积，在参考同类研究及毗邻地区森林群落空间格局研究的基础上[25-26]，将格局分析的尺度限定为0~25.0 m。
2.5 种间联结
2.5.1 总体联结性检验
采用方差比率法来测定各类型次生林群落中主要树种间的总体联结性，并利用统计量W来检验总体联结是否显著，计算公式[27]如下：
$${V_{\rm{R}}} = \frac{{\dfrac{1}{N}\displaystyle\sum\limits_{z = 1}^N {{{({T_z} - t)}^2}} }}{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^S {(1 - {P_i})} }}\text{。}$$ 其中：VR为方差比率，N为样方总数，
$ T_z $ 为样方$ z $ 内出现的目标物种总数；t为样方中物种的平均数，S为总物种数，Pi为物种i的频度。以VR作为不同类型次生林中主要树种总体联结性指数，在独立性零假设条件下，VR期望值为1，即当VR=1时认为种间无联结；若VR＜1则表示物种间存在正联结；若VR＜1则表示物种间存在负联结。对于VR偏离1的显著程度采用统计量W来验证，W=VRN，若$W{\text{＜}}$ ${\textit{χ}}_{0.95}^2\left( N \right)$ 或$W{\text{＞}}{\textit{χ}} _{0.05}^2\left( N \right)$ 则说明种间总体联结性性显著，若${\textit{χ}} _{0.05}^2\left( N \right) {\text{＞}}W {\text{＞}} {\textit{χ}}_{0.95}^2\left( N \right)$ 则说明种间总体联结性不显著[28]。2.5.2 种间联结性分析
采用经Yates连续校正系数纠正的χ2统计量对种间联结性进行定性研究。公式[18]如下：
$${\textit{χ} ^2} = \frac{{N{{[ad - bc - 0.5N]}^2}}}{{(a + b)(b + d)(a + c)(c + d)}}\text{。}$$ 其中，N为取样总数，
$ a $ 为2物种均出现的样方数，b、c分别为2个种单独出现的样方数，d为2物种均不出现的样方数。当$ ad-bc=0 $ 时，2个种相互独立；$ ad-bc{\text{＞}}0 $ 时，2个种之间呈正联结；$ ad- $ bc＜0时，2个种之间呈负联结。${\textit{χ}}^{2}$ ＜3.841时，表示种间联结性不显著；当3.841＜${\textit{χ}}^{2}$ ＜6.635时，表示种间联结性显著；当${\textit{χ}}^{2}$ ＞6.635时，表示种间联结性极显著[17]。为避免出现分母为0无法计算分析的状况，把a、b、c、d凡是为0的都加权为1[29-30]。2.5.3 种间相关性测定
本研究以多度作为Spearman秩相关系数的数量指标，对种对间的线性关系做定量分析，计算公式[31]如下：
$$r\left( {i,k} \right) = 1 - \frac{{6\displaystyle\sum\limits_{z = 1}^N {{{\left( {{x_{iz}} - {{\bar x}_i}} \right)}^2}} {{\left( {{x_{kz}} - {{\bar x}_k}} \right)}^2}}}{{{N^3} - N}}\text{。}$$ 其中，
$ r\left(i,k\right) $ 是种$ i $ 和种$ k $ 在样方$ z $ 中的Spearman秩相关系数；$ N $ 为样方总数；$ {x}_{iz} $ 和$ {x}_{kz} $ 分别是种$ i $ 和种$ k $ 在样方$ z $ 中的秩；$ {\bar{x}}_{i} $ 和$ {\bar{x}}_{k} $ 分别是种$ i $ 和种$ k $ 在所有样方中多度的平均值。$ r\left(i,\;k\right) $ 的值域为[−1, 1]，正值表示正相关，负值表示负相关。3. 结果与分析
3.1 重要值
根据重要值大于5%选出各植被类型主要树种。常绿阔叶林中主要树种是青冈Cyclobalanopsis glauca、石栎Lithocarpus glaber、苦槠Castanopsis sclerophylla及木荷Schima superba等4种；松阔混交林的主要树种分别是马尾松Pinus massoniana、苦槠、杉木Cunninghamia lanceolata、檵木Loropetalum chinense、石栎等5种；松林的主要树种分别是马尾松、杉木、苦槠、化香Platycarya strobilacea、枫香Liquidambar formosana等5种。
3.2 生态位重叠
从表2可以看出：在常绿阔叶林中，主要树种之间生态位重叠程度最高的是木荷-石栎(0.861 4)、其次是苦槠-青冈(0.615 4)，最低的是苦槠-木荷(0.377 2)；在松阔混交林中，重叠程度最高的是檵木-苦槠(0.801 8)，其次是马尾松-石栎(0.753 1)，最低的是石栎-杉木(0.340 9)；在松林中，重叠程度最高的是枫香-化香(0.757 5)，其次是枫香-苦槠(0.720 1)，最低的是苦槠-马尾松(0.442 7)。
表 2 不同森林类型主要树种生态位重叠数值矩阵Table 2 Niche overlap of dominant tree species of different forest types常绿阔叶林 松阔混交林 松林 树种 苦槠 木荷 青冈 树种 檵木 苦槠 马尾松 石栎 树种 枫香 化香树 苦槠 马尾松 木荷 0.377 2 苦槠 0.801 8 化香 0.757 5 青冈 0.615 4 0.518 2 马尾松 0.631 2 0.632 4 苦槠 0.720 1 0.625 8 石栎 0.421 9 0.861 4 0.473 3 石栎 0.451 3 0.458 4 0.753 1 马尾松 0.676 9 0.567 6 0.442 7 杉木 0.393 7 0.521 8 0.646 2 0.340 9 杉木 0.466 2 0.470 7 0.600 1 0.567 5 3.3 空间分布格局
3.3.1 种内空间分布格局
在所有研究样地中，主要树种在0~25.0 m的尺度内均表现为显著的聚集分布(P＜0.05)(图1~3)。
图 1 常绿阔叶林主要树种空间分布格局Figure 1 Spatial distribution pattern of dominant tree species in evergreen broad-leaved forest
图 2 松阔混交林主要树种空间分布格局Figure 2 Spatial distribution pattern of dominant tree species in mason pine and broad-leaved mixed forest
图 3 松林主要树种空间分布格局Figure 3 Spatial distribution pattern of dominant tree species in mason pine forest3.3.2 种间空间分布格局
常绿阔叶林主要树种空间分布格局特征如下(图4)：青冈-石栎在0~25.0 m尺度上均呈现负相关，其中6.0~10.0 m、15.0~17.0 m尺度上负相关达到显著(P＜0.05)；青冈-木荷在0~25.0 m尺度上均为负相关，其中8.0~14.0 m尺度范围内达到显著(P＜0.05)；石栎-木荷在0~25.0 m尺度上均呈现显著的正相关(P＜0.05)。其他种对的空间关联性则以不显著相关为主。
图 4 常绿阔叶林主要树种间空间分布格局图Figure 4 Spatial distribution pattern of dominant tree species in evergreen broad-leaved forest松阔混交林主要树种空间分布格局特征如下(图5)：马尾松-石栎在0~25.0 m尺度上呈现正相关，10.0~25.0 m尺度内达到显著(P＜0.05)；苦槠-石栎在0~20.0 m尺度范围内为正相关，其中7.0~8.0 m尺度上达到显著(P＜0.05)，而在20.0~25.0 m尺度范围内呈现不显著负相关。其他种对的空间关联性以不显著相关或无关联为主。
图 5 松阔混交林主要树种间空间分布格局图Figure 5 Spatial distribution pattern of dominant tree species in mason pine and broad-leaved mixed forest松林主要树种间空间分布格局特征如下(图6)：马尾松-化香在0~25.0 m尺度上为负相关，其中4.0 m时达到显著(P＜0.05)；杉木-苦槠在0~25.0 m尺度范围内为正相关，其中15.0~25.0 m尺度上达到显著(P＜0.05)；杉木-化香在0~25.0 m尺度范围内为负相关，其中7.5~17.0 m尺度上达到显著(P＜0.05)；化香-枫香在0~25.0 m尺度范围内表现为正相关，其中12.0~13.0 m尺度上达到显著(P＜0.05)。除此之外其他种对的空间关联性表现为不显著相关或无关联。
图 6 松林主要树种间空间分布格局图Figure 6 Spatial distribution pattern of dominant tree species in mason pine forest3.4 种间联结
3.4.1 总体联结性
各类型次生林的方差比率(表3)结果表明：3种类型次生林主要树种的总体关联性均为不显著正关联。
表 3 不同森林类型主要树种的总体关联性Table 3 Overall interspecific associations among dominant tree species of different forest types样地类型 方差比率 W ${\; \textit{χ}^{2}_{0.95}(N)} $，${ \; \textit{χ}^{2}_{0.05}(N)} $ 结果 常绿阔叶林 1.389 34.722 14.611, 37.652 不显著正关联 松阔混交林 1.397 34.930 14.611, 37.652 不显著正关联 松林 1.199 29.966 14.611, 37.652 不显著正关联 3.4.2 种间联结性检验
χ2检验结果表明(表4)：样地中所有类型次生林的主要树种种对均呈不显著的正联结(χ2＜3.841，
$ ad-bc $ ＞0)。表 4 不同森林类型的种间联结χ2统计量矩阵Table 4 Value of χ2 of different forest types常绿阔叶林 松阔混交林 松林 树种 苦槠 木荷 青冈 树种 檵木 苦槠 马尾松 杉木 树种 枫香 化香 马尾松 杉木 木荷 0.001 苦槠 1.223 化香 0.179 青冈 0.230 0.092 马尾松 1.103 1.103 马尾松 0.230 1.103 石栎 0.039 0.001 0.230 杉木 0.001 0.001 0.010 杉木 0.020 0.179 0.230 石栎 0.089 0.089 0.069 0.110 苦槠 2.214 0.069 0.038 0.368 3.4.3 种间相关性分析
据图7可知：在常绿阔叶林中，呈负相关的种对有苦槠-木荷、木荷-青冈和青冈-石栎等3对，其中木荷-青冈和青冈-石栎种对的负相关达极显著(P＜0.01)；呈正相关的有苦槠-青冈、苦槠-石栎和木荷-石栎等3对，其中木荷-石栎种对的正相关达到极显著(P＜0.01)。在松阔混交林中，呈现负相关的种对有檵木-杉木、檵木-石栎2对；其余8对均呈正相关，其中马尾松-石栎的正相关达极显著(P＜0.01)。在松林中，呈现负相关的种对有枫香-杉木、化香-马尾松、化香-杉木、化香-苦槠和马尾松-苦槠等5对，其中化香-杉木的负相关达显著(P＜0.05)；其余5对呈正相关，其中枫香-苦槠的正相关达显著(P＜0.05)。
图 7 不同森林类型种间Spearman秩相关半矩阵图Figure 7 Semi-matrix of Spearman’s rank correlation coefficients of dominant tree species of different forest types4. 讨论
森林在向顶级群落演替的过程中，植物种内空间分布格局一般会由聚集分布渐渐过渡为随机分布[12]，而在本研究中，0~25.0 m尺度上不同类型次生林的主要树种均呈显著(P＜0.05)聚集分布，这说明样地群落还未进入演替成熟期。物种自身的生物学特性是造成群落演替过程中物种聚集分布的主要原因，即相同物种对环境等条件有着相似的需求[32]。样地群落种间生态位重叠程度也能佐证其所处的演替阶段，顶级群落中树种间的生态位重叠程度一般处在较低的水平，即树种间的竞争并不活跃，这是因为经过长时间演替后，群落趋于稳定，内部树种间达到了一种相对平衡的状态[33-34]，主要树种间的生态位重叠程度仍普遍较高，群落整体呈正关联，正相关种对仍有较高占比。这反映了群落中的主要树种具有相似的环境需求和生态适应性，由此造成了样地中主要树种的聚集分布。此外，种子的扩散限制和生境异质性也被认为是影响物种分布的主要因素[20]，样地中主要树种的种子传播方式以重力传播为主，种子传播距离有限，多聚集在母树周围，离母树越远种子越少，这也导致了树种的聚集分布。在松林中，马尾松和杉木作为建群早期先锋种最先入侵林地，在光竞争中占据优势，对光的有效利用是形成林分空间格局的主要决定因素[35]，因而马尾松和杉木与群落中其他优势树种多呈负空间关联。枫香幼树稍耐荫，所以与群落中其他优势树种多呈正空间关联。在松阔混交林中，主要树种间空间关联显著程度较低，这或许与群落中的针叶树种同群落中其他较晚发育起来的常绿阔叶树种产生了垂直分层现象有关，这种垂直分层现象能够减轻群落内的光竞争，进而影响群落内的树种空间分布格局。马尾松和杉木作为早期先锋树种入侵林地后，逐渐改善了立地条件，为其他树种进入群落创造了条件，使得松林能够向松阔混交林方向演替。随后由于马尾松和杉木生物学特性在垂直结构上与其他树种产生了分层现象，加之密度制约和扩散限制等因素[12]共同作用，群落中的常绿阔叶树种逐渐获得更多的环境资源并对针叶树种和落叶阔叶树种的幼苗更新产生负作用，松阔混交林逐渐向常绿阔叶林演替。这种演替机制与XIANG等[9]的研究结果一致，即在不发生干扰的情况下，次生林群落中的不耐荫落叶树种将逐渐被耐荫的常绿阔叶树种所取代。
通过比较不同森林类型主要树种组成可以发现：3类森林群落的主要树种组成存在差异，落叶阔叶树种枫香和化香仅出现在松林主要树种中，而松阔混交林中已经没有落叶树种，但出现了常绿阔叶树种石栎和檵木。在常绿阔叶林中，主要树种则由木荷及青冈、石栎和苦槠等3种壳斗科Fagaceae树种组成。树种组成的变化是群落演替的结果，森林经营管理可根据此对松林和松阔混交林进行适当抚育，伐除部分针叶树种及清理林内枯立木，改善林分内的光照条件，促进常绿阔叶树种的生长。在常绿阔叶林中，则可通过修枝来改善林内光照条件，也可通过为森林土壤施加养分来改善目标树种的营养状况，通过人为栽种苗木等手段来加快木荷、石栎等目标树种的更新、生长和郁闭，促进森林群落向顶级群落发展并促进生物多样性的恢复。
本研究通过方差比率法、χ2检验和Spearman秩相关系数检验，对不同类型次生林群落种间的联结性和相关性进行了分析。其中，χ2检验结果是由种对的二元数据转换计算而来，反映的是物种能否共存和共存的概率，不能表达低显著度种对的内在相关性情况和强度。Spearman秩相关系数属定量检验方法，能够在一定程度上检验种对数量关系上的变化，对种对间的相关性及其显著性水平更为敏感。Spearman秩相关系数属定量检验与定性的方差比率法、χ2检验结合使用能够更全面地反映物种的种间关系[36]。
5. 结论
通过测度常绿阔叶林、松阔混交林和松林群落中主要树种的生态位重叠程度、空间分布格局和种间联结分析可以发现：本研究各群落乔木层主要树种在空间分布格局中独立性相对较强，物种间虽存在比较相似的环境资源需求，但种间联结关系比较松散，群落演替尚未进入成熟期。此外也可以看出：树种间的空间分布格局、联结性与种群的生态位重叠之间存在密切关联。一般情况下，群落内优势树种种间正联结性越强，其生态位重叠程度越高，种间负联结性越强，生态位重叠程度越低[37]。样地群落的总体关联性检验结果显示：各群落种间总体关联性呈不显著的正相关。χ2检验发现：多数种对都呈不显著的正联结，这与各群落物种生态位重叠程度的分析结果基本吻合。各群落主要树种间的Spearman秩相关分析结果与种间空间关联性结果也有比较一致的表现，这也说明植物种间关系对植物种群空间分布格局的形成有重要意义。本研究可为进一步揭示物种自身生物特性、环境条件及种间关系等综合作用下的种群空间分布格局形成机制提供依据，但群落中植物种间关系及空间分布格局是处在动态变化过程中的，本研究结果仅反映某一特定时间节点的群落状态，有待长期的群落动态监测研究。
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图 1 薄壳山核桃LBD基因家族系统进化树
Figure 1 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software
图 2 薄壳山核桃LBD转录因子家族系统发育树和保守蛋白质基序结构
Figure 2 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software
图 3 薄壳山核桃LBD 转录因子家族LOB蛋白质结构域多序列比对
Figure 3 Multiple sequence alignment of LOB domain in C. illinoensis transcription factor family
图 4 利用从裸子植物银杏到高等植物551个LBD基因全长蛋白质序列构建系统发育树
Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of 551 LBD genes from gymnosperm ginkgo to higher angiosperms
图 5 薄壳山核桃LBD 转录因子家族胚发育表达模式
Figure 5 Transcriptome expression profile of LBD gene family in embryo development
表 1 多物种LBD基因鉴定结果
Table 1. Identify result of LBD genes in multi-species
鉴定程序 基因数量/个 银杏 无油樟 蓝星睡莲 水稻 拟南芥 葡萄 大豆 核桃 山核桃 薄壳山核桃 BLASTX 90 45 51 61 91 98 153 87 89 80 HMMER 50 26 35 29 58 57 116 72 56 52 
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表 2 薄壳山核桃LBD转录因子家族蛋白质理化性质
Table 2. Physicochemical properties of LBD transcription factor family protein in C. illinoensis
蛋白质 氨基酸残基数/个 分子量/kD 理论等电点 酸性氨基酸/个 碱性氨基酸/个 不稳定系数 脂肪系数 总平均亲水性 pecanLBD1 210 23 309.19 8.24 17 19 47.65 73.52 −0.485 pecanLBD2 208 22 353.77 7.55 20 21 58.32 88.65 0 pecanLBD3 288 31 617.01 8.99 29 35 61.92 76.88 −0.326 pecanLBD4 223 24 069.37 7.69 17 18 73.89 77.89 −0.171 pecanLBD5 188 20 808.56 7.63 17 18 67.24 69.15 −0.490 pecanLBD6 260 28 451.22 8.23 31 34 52.55 69.38 −0.501 pecanLBD7 156 17 540.20 9.03 12 18 55.87 78.91 −0.235 pecanLBD8 172 18 611.24 8.59 14 17 61.24 70.35 −0.238 pecanLBD9 276 30 985.11 8.55 28 32 30.84 76.96 −0.522 pecanLBD10 326 36 029.86 6.91 23 22 64.45 77.58 −0.472 pecanLBD11 204 22 376.57 7.53 18 19 60.78 77.99 −0.233 pecanLBD12 232 25 857.68 5.90 21 14 50.52 65.22 −0.425 pecanLBD13 170 18 808.03 6.42 18 17 65.04 57.47 −0.607 pecanLBD14 202 21 823.68 8.59 14 17 57.41 80.20 −0.175 pecanLBD15 203 23 706.08 8.15 27 29 52.00 77.39 −0.556 pecanLBD16 191 20 998.77 6.08 19 17 70.05 72.04 −0.423 pecanLBD17 230 25 054.58 9.22 17 23 78.94 70.04 −0.284 pecanLBD18 172 18 626.23 8.82 14 18 67.64 73.14 −0.296 pecanLBD19 306 33 113.72 7.95 33 35 46.03 81.54 −0.280 pecanLBD20 162 18 029.72 6.70 14 14 51.76 88.52 −0.133 pecanLBD21 127 14 182.02 4.48 14 7 36.18 92.20 −0.246 pecanLBD22 176 19 971.98 5.17 25 18 44.88 80.34 −0.186 pecanLBD23 130 15 042.74 9.84 10 25 45.43 77.23 −0.541 pecanLBD24 162 18 285.75 8.23 13 15 57.65 78.40 −0.337 pecanLBD25 214 23 771.70 8.25 17 19 49.42 74.44 −0.472 pecanLBD26 310 33 384.03 8.22 34 37 47.44 80.87 −0.302 pecanLBD27 168 18 892.28 6.28 17 13 72.86 63.87 −0.476 pecanLBD28 215 23 539.68 5.33 18 14 75.47 70.88 −0.272 pecanLBD29 167 18 504.18 6.94 15 15 59.00 81.80 −0.217 pecanLBD30 176 19 230.73 6.50 18 17 69.15 73.75 −0.242 pecanLBD31 169 18 881.58 6.49 17 16 51.28 79.59 −0.219 pecanLBD32 236 26 157.91 5.74 22 13 46.73 65.76 −0.405 pecanLBD33 213 23 405.50 7.06 19 19 65.23 67.37 −0.380 pecanLBD34 326 37 266.20 5.47 54 35 49.05 74.29 −0.813 pecanLBD35 251 27 236.49 6.44 24 22 59.55 80.08 −0.322 pecanLBD36 228 24 949.42 6.29 17 16 83.40 71.05 −0.271 pecanLBD37 228 24 709.22 8.06 22 24 59.20 76.14 −0.244 pecanLBD38 216 23 449.53 6.03 17 13 64.11 75.05 −0.227 pecanLBD39 158 17 663.15 6.27 15 13 53.44 80.25 −0.243 pecanLBD40 221 24 171.04 4.97 21 12 58.45 78.60 −0.143 pecanLBD41 265 30 244.09 6.42 33 29 46.86 77.66 −0.594 pecanLBD42 237 24 801.38 8.20 13 15 69.07 79.87 −0.065 pecanLBD43 213 23 452.55 6.74 19 18 56.45 80.61 −0.203 pecanLBD44 224 24 373.77 8.93 17 22 69.41 73.62 −0.276 pecanLBD45 202 21 927.15 8.56 19 23 54.66 83.47 −0.159 pecanLBD46 221 24 114.37 9.01 18 23 73.18 66.29 −0.421 pecanLBD47 289 32 466.21 5.27 29 21 67.19 65.92 −0.600 pecanLBD48 176 19 971.98 5.17 25 18 44.88 80.34 −0.186 pecanLBD49 170 18 770.95 6.19 19 17 60.44 55.18 −0.615 pecanLBD50 92 10 319.08 6.26 11 10 39.17 115.65 0.018 pecanLBD51 313 34 650.03 7.29 20 20 64.34 73.07 −0.490 pecanLBD52 320 35 091.25 6.83 23 21 66.59 67.53 −0.593
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