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闽楠Phoebe bournei被列为国家二级保护濒危树种[1−2]，是“金丝楠木”的原植物种之一，天然分布于福建、浙江、江西、湖南、云南和广西等省[3]。闽楠木材纹理细致、结构紧密、香气浓郁、防虫耐腐、坚硬不易开裂，是制作高档家具、建筑和雕塑的优质木材。闽楠树体高大挺拔、冠型优美，现已成为中国南方地区珍贵造林与园林绿化树种。然而，干旱、低温等非生物胁迫显著影响闽楠的生长发育，极大限制了林分生产力。
转录因子作为一类与启动子顺式作用元件特异结合、调控功能基因表达的DNA结合蛋白，对植物多种生理生化过程起重要调控作用[4−5]。其中，碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是目前已知普遍存在、成员较多、功能复杂且高度保守的基因家族之一[6−7]。bZIP转录因子是按照其高度保守的结构域来命名的，保守结构域包括富含亮氨酸残基的拉链区域和N-X7-R/K碱性区域，由60~80个碱基组成，C端N-X7-R/K碱性区域由20个氨基酸构成，富含精氨酸和赖氨酸，可与DNA特异性结合；N端亮氨酸拉链区域富含亮氨酸，相邻7个氨基酸构成一段连续片段，且第7位碱基是亮氨酸，但亮氨酸拉链区域不完全保守，个别位点的亮氨酸可被甲硫氨酸、缬氨酸及异亮氨酸等疏水性氨基酸所取代[6]。
bZIP转录因子功能多样性，广泛参与调控脱落酸(ABA)、干旱、高盐及高温等多种非生物胁迫。例如，ABA、高盐和干旱胁迫下，ZmbZIP72在玉米Zea mays幼苗各器官上调表达，其异源过表达使拟南芥Arabidopsis thaliana显著改善叶片生理状态，通过减少失水和电解质渗漏来提高转基因株系的抗旱性和耐盐性[8]。高盐、干旱、高温、低温和ABA胁迫下，ZmbZIP4在玉米幼苗各器官被诱导表达，其异源过表达不仅增加拟南芥主根长和侧根数，还显著提高ABA合成，增强植株抵御非生物胁迫能力[9]。水稻Oryza sativa的OsbZIP42可正向调控ABA介导的信号通路，增强水稻过表达植株对干旱胁迫应答的敏感性[10]。bZIP还和ANAC096等转录因子互作，协同提高转基因植株抗旱性[11]。茶树Camellia sinensis的CsbZIP18是ABA信号和冷胁迫的负调控因子，异源过表达导致拟南芥对ABA信号敏感性下降、电解质渗漏升高以及光合效率下降，降低植株耐冻性[12]。bZIP还参与调控其他生物学过程，如组织器官发育[13−14]、盐胁迫[15]、激素和糖信号传递[16]、病虫害防御[17]、光反应和次生代谢物合成调控等[18−19]。
bZIP基因家族成员有进化多样性，成员数量在物种间存在显著差异，例如，拟南芥75个[20]、番茄Solanum lycopersicum 70个[21]、水稻89个[22]、玉米125个[23]、毛果杨Populus trichocarpa 214个[24]，而闽楠bZIP成员数量不详，极大限制了闽楠bZIP基因功能研究。因此，本研究对闽楠bZIP转录因子家族成员进行全基因组鉴定，分析其蛋白理化性质，比较进化关系以及ABA处理下的表达水平，为解析bZIP家族成员的基因功能及其在逆境胁迫的调控机制提供理论基础。
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从PFAM数据库(
https://pfam.xfam.org/ )获取包含保守结构域(PF00170、PF07716)的隐马尔科夫蛋白模型。运用HMMER软件在闽楠基因组[25]筛选bZIP同源序列。将初步获得的基因序列提交SMART数据库(https://smart.embl-heidelberg.de/ )和美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )确认结构域，手动去除冗余，获得PbbZIP基因成员。利用Protparam数据库(https://www.expasy.org/ )进一步分析PbbZIP蛋白理化性质，通过植物亚细胞定位(Plant-mPLoc)数据库(http://www.csbio.sjtu.edu.cn )进行亚细胞定位分析，通过Prabi数据库(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ )分析PbbZIP蛋白的二级结构。 -
运用Jaview软件对ClustalW输出的多序列比对结果进行美化，基因保守结构域用Tbtools[26]进行可视化，MEME suite数据库(
https://meme-suite.org/ )分析蛋白序列的保守基序，利用GSDS工具(http://gsds.gao-lab.org/ )在线绘制PbbZIP基因结构。 -
从Ensembl数据库(
http://plants.ensembl.org/species.html )获取拟南芥、番茄、毛果杨基因组数据，通过HMMER软件挑选出bZIP同源基因，构建最大似然进化树(Bootstrap: 1 000次)。通过Evolview网站(http://www.evolgenius.info/evolview )美化系统进化树。用TBtools的MCScanX工具分析PbbZIP基因的共线性关系。 -
在浙江农林大学苗圃地挑选长势健康的2年生闽楠半同胞家系WY8苗，选用2 mmol·L−1ABA均匀喷洒整株苗，使土壤表面湿润，吐温80 (Tween 80)为对照组(ck)。采用取样时间倒推法，分别在处理1、3、12、24、48和72 h取叶片和根，均在11:00取样，每个时间段包含15株闽楠苗，每5株混合作为1个生物学重复，3次重复，液氮速冻后储存于−80 ℃冰箱。
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从闽楠基因组[25]提取PbbZIP基因编码区(CDS)上游2 000 bp序列，提交至PlantCARE数据库(
https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ )分析启动子顺式作用元件，统计与逆境胁迫相关的作用元件，对ABA响应元件较多的PbbZIP基因进行实时荧光定量，并分析其响应表达模式。 -
用CTAB法提取高质量总RNA，经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测合格后用于后续研究。每份RNA取1 μg，按照Vazyme公司提供的HiScript® II Reverse Transcriptase试剂盒反转录合成高质量cDNA，用ddH2O稀释5倍待用。使用NCBI 设计PbbZIP基因特异性引物用于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)反应。使用RT-qPCR反应酶配成10.00 μL标准反应体系，包含1.00 μL cDNA、0.25 μL上下游引物、5.00 μL反应液和3.50 μL ddH2O。两步法RT-qPCR反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。闽楠ef1α基因(登录号：KX682032)作为内参基因，用2−ΔΔCt法计算各基因相对表达量[27]，并通过SPSS进行方差分析及多重比较。
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利用HMMER软件从闽楠基因组初步获得78条蛋白序列，经SMART和NCBI数据库验证结构域完整性，最终鉴定出63个PbbZIP成员，按染色体位置命名为PbbZIP01~PbbZIP63，并分析其蛋白特征和理化性质。PbbZIP蛋白长度介于110 (PbbZIP60)~835 (PbbZIP12)个氨基酸，相对分子量为13.05~88.65 kDa，平均为39.76 kDa。蛋白等电点为4.48 (PbbZIP02)~11.95 (PbbZIP32)，疏水性为−1.19 (PbbZIP58)~−0.19 (PbbZIP16)。亚细胞定位分析结果表明：59个成员定位于细胞核，而PbbZIP02定位于细胞质，PbbZIP05和PbbZIP12定位于内质网，PbbZIP16定位于线粒体。
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Motif分析结果表明：PbbZIP基因保守基序较丰富，且不同亚族差异明显。Motif 5和Motif 1在PbbZIP基因家族广泛存在(图1)，分别为碱性结构区域和亮氨酸拉链结构区域，碱性区域可以和DNA特异性结合，发挥调控活性(图2)。A亚族特有Motif 6、Motif 10和Motif 13；C亚族和S亚族特有Motif 11；D亚族的保守基序较丰富，特有基序包括Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 7、Motif 9和Motif 12；F亚族特有Motif 15；I亚族特有Motif 6；G亚家族特有Motif 8和Motif 14。其中，A、E、F、G、J亚族含有重复基序。
图 1 闽楠bZIP家族成员的保守基序
Figure 1. Conserved motifs of PbbZIP family members
图 2 闽楠bZIP家族成员的结构域
Figure 2. Domains of PbbZIP family members
PbbZIP家族的基因结构在内含子、外显子的数量和位置存在显著多样性和差异性(图3)。例如，S亚族外显子数量最少(1~4个)，且多数无内含子，这与拟南芥bZIP-S亚族结构相似；A亚族含有3~4个外显子，C亚族含有6~7个外显子，D亚族含有11~12个外显子；E亚族含有5~6个外显子，F亚族含有2~3个外显子，而G亚族内含子和外显子最多，为13~14个。
图 3 闽楠bZIP家族成员的基因结构
Figure 3. Gene structures of PbbZIP family members
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为研究bZIP基因的进化关系，选取拟南芥、番茄、毛果杨bZIP氨基酸序列与PbbZIP基因构建最大似然进化树(图4)。系统进化分析表明：63个PbbZIPs基因按序列同源性划分为4组12亚族，Ⅰ 组(G)、Ⅱ 组(J)、Ⅲ 组(B、H、E、I、F、K、A、D)和Ⅳ 组(C、S)，其中A亚族12个、B亚族1个、C亚族3个、D亚族11个、E亚族5个、F亚族3个、G亚族6个、H亚族4个、I亚族6个、J亚族1个、K亚族1个和S亚族10个。
图 4 闽楠、拟南芥、毛果杨和番茄bZIP家族系统进化分析
Figure 4. Phylogenetic analysis of bZIP family from P. bournei, P. trichocarpa, A. thaliana, and S. lycopersicum
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染色体定位结果表明：63个PbbZIPs基因不均匀分布于12条染色体(图5)，其中Chr 5基因数量最多，含11个PbbZIPs成员，占17.46%，而Chr 7和Chr 10最少，仅有2个PbbZIPs成员。为深入了解PbbZIP基因家族的扩张模式，对63个PbbZIPs基因进行共线性分析，结果表明：分布于12条染色体上的27对PbbZIPs基因存在片段复制，其中D亚族共线基因对最多(10对)，未检测到串联复制，表明片段复制是PbbZIP基因家族扩张的主要模式。不同物种间共线性结果表明(图6)：闽楠与拟南芥47个、毛果杨110个bZIPs基因对存在共线性关系，闽楠和毛果杨bZIP基因更保守，亲缘关系较近。
图 5 PbbZIP家族成员染色体定位
Figure 5. Chromosomal localization of PbbZIP family members
图 6 闽楠bZIP家族成员种间共线性分析
Figure 6. Interspecific collinear relationships of PbbZIP family members
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PbbZIP基因CDS区上游启动子顺式作用元件分析结果表明(图7)：共发现18种(745个)与胁迫相关的顺式作用元件，其中激素响应元件428个，包括ABA响应元件(ABRE) 129个，茉莉酸甲酯响应元件(TGACG-motif、CGTCA-motif) 146个，赤霉素响应元件(P-box、GARE-motif、TATC-box) 71个，水杨酸响应元件(SARE、TCA-element) 54个，生长素响应元件(TGA-element、TGA-box、AuxRR-core) 28个。此外，还发现多种非生物胁迫响应元件，如低温响应元件(LTR、DRE) 45个，干旱响应元件(MBS) 53个，缺氧厌氧元件(ARE、GC-motif) 182个，防御和胁迫响应元件(TC-rich repeats) 36个，伤害响应元件(WUN-motif) 1个。
图 7 PbbZIPs与逆境胁迫相关的顺式作用元件
Figure 7. Cis-acting elements associated with adversity stress in promoters of PbbZIPs
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PbbZIP基因启动子区域富含ABA响应元件，挑选含较多ABA响应元件的17个PbbZIPs成员进行ABA处理下的表达模式分析。首先，应用RT-qPCR分析ABA处理后叶中17个PbbZIPs的响应程度，表明叶中17个PbbZIPs对ABA信号有着不同程度的诱导响应(图8)。例如，PbbZIP01、PbbZIP11、PbbZIP29和PbbZIP54等4个基因在叶中不同处理时间均被显著诱导(P＜0.05)，相对表达倍数高于8倍；PbbZIP31、PbbZIP32、PbbZIP37、PbbZIP40、PbbZIP42、PbbZIP47和PbbZIP56等7个成员均被ABA诱导表达，但表达倍数增加幅度不高；PbbZIP44、PbbZIP48、PbbZIP57和PbbZIP59在ABA处理3 h或12 h时被显著抑制表达(P＜0.05)；PbbZIP02和PbbZIP38分别仅在ABA处理24 h和12 h强烈诱导表达，而其他处理时间段基本不被诱导。
图 8 叶中PbbZIP基因对脱落酸处理的表达响应
Figure 8. Response of PbbZIP genes to ABA treatment in leaves
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ABA处理1~72 h，17个PbbZIP基因在根中表现出不同趋势，且表达倍数较叶片低(图9)。PbbZIP01、PbbZIP11、PbbZIP29、PbbZIP31、PbbZIP32、PbbZIP37、PbbZIP38、PbbZIP40、PbbZIP42、PbbZIP47、PbbZIP48、PbbZIP56和PbbZIP59等表达水平先降低后升高，其中PbbZIP32、PbbZIP37、PbbZIP38、PbbZIP40、PbbZIP48和PbbZIP59等基因的表达量在ABA处理48 h后降低，而PbbZIP37、PbbZIP38、PbbZIP40和PbbZIP59表达水平在ABA处理72 h后显著升高(P＜0.05)。PbbZIP02、PbbZIP44和PbbZIP57表达水平受ABA影响较小；PbbZIP54在ABA处理3 h后显著诱导表达(P＜0.05)，且保持较高水平，可能参与ABA信号响应发挥重要调控功能。
图 9 根中PbbZIP基因对ABA处理的表达响应
Figure 9. Response of PbbZIP genes to ABA treatment in roots
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bZIP基因家族是成员和功能最复杂的转录因子家族之一，参与多种代谢过程，目前功能研究集中于拟南芥、毛果杨、水稻和番茄等物种。本研究从闽楠基因组鉴定出63个PbbZIP转录因子，该家族成员在蛋白理化性质、基因结构和保守结构域等方面与已报道物种(拟南芥[20]、毛果杨[24]、番茄[21]等)较相似，说明bZIP基因结构较保守。进一步将PbbZIP与拟南芥、番茄和毛果杨构建最大似然进化树，发现63个PbbZIP基因可进一步划分为12亚族，可能由4个以上不同功能的原始bZIP基因进化扩张产生[28]，而在其他物种中，bZIP转录因子被划分为不同亚族，如拟南芥10个[20]、毛果杨12个[29]、烟草Nicotiana tabacum 11个[30]。其中PbbZIP29基因结构高度分化，单独聚类在一个进化分支上，其功能是否分化有待后续深入研究。
通过启动子顺式作用元件分析发现：PbbZIP基因CDS上游启动子区域存在多种响应元件，推测PbbZIP基因可能受生物及非生物胁迫诱导表达。例如ABA、茉莉酸甲酯和生长素等激素响应元件在启动子区域数量较多，推测PbbZIP基因可能受到激素诱导。低温、干旱和缺氧厌氧诱导等非生物胁迫响应元件数目也较多，推测PbbZIP表达可能受非生物胁迫诱导，正向或负向调控次生代谢途径而参与植物生长发育进程。例如，猕猴桃Actinidia deliciosa bZIP12正向调控ABA介导的AchnKCS酶基因，促进果实创伤愈合，免受病原体侵害[31]。在ABA、干旱、盐胁迫下，辣椒Capsicum annuum叶片bZIP-D亚族中的CaDILZ1显著上调，它通过调节ABA含量、气孔开合度及抗旱基因表达水平来增强转基因植株的耐旱性[32]。
17个PbbZIP基因在叶和根有不同程度的诱导表达，随ABA诱导表现出不同表达趋势。处理1~72 h，叶中PbbZIP11等基因和根中PbbZIP44等基因表达量先升高后降低，而叶中PbbZIP37等基因以及根中PbbZIP56基因表达趋势与之相反，先下降后上升，烟草bZIP-A亚族基因经1 μmol·L−1ABA处理24 h后也有相同趋势[33]；武立伟等[34]研究发现：25和50 mg·L−1 ABA处理甘草Glycyrrhiza uralensis根，GubZIP1~GubZIP56响应趋势与本研究结果相似，表明PbbZIP基因可能参与ABA等非生物胁迫的响应；孙晓丽等[35]研究发现：拟南芥AtbZIP1与ABRE元件结合负向调节植株对ABA敏感性，AtbZIP1缺失提高了种子萌发率，增加了主根长和ABA响应基因的表达，推测PbbZIP基因可能有相似功能。叶中PbbZIP01、PbbZIP29、PbbZIP32、PbbZIP38和PbbZIP54等被ABA显著诱导，根中PbbZIP47和PbbZIP54被显著诱导，表达量较高，后续需进一步开展功能验证，阐明其生物学功能与调控机制。
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本研究通过对闽楠bZIP转录因子家族鉴定和表达分析，发现63个基因家族成员高度保守，不同亚家族在蛋白理化性质、基因结构、染色体定位、保守基序等方面表现出进化多样性和差异性。PbbZIP基因的表达随ABA诱导时间增加呈非同步变化的趋势，具有一定组织特异性，叶响应程度普遍高于根，这种表达特征与闽楠胁迫耐受性高度关联，存在复杂的调控网络，需进一步探索PbbZIP基因功能。
Identification and expression analysis of bZIP gene family under ABA treatment in Phoebe bournei
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摘要:
目的 对闽楠Phoebe bournei bZIP (PbbZIP)转录因子家族成员鉴定，分析其对脱落酸(ABA)信号的响应水平。 方法 基于生物信息学方法，对PbbZIP基因家族进行了全基因组鉴定，分析其蛋白理化特性、基因结构、进化关系、启动子顺式作用元件和ABA处理下的表达分析。 结果 从闽楠12条染色体共鉴定出63个PbbZIPs基因，分为12亚族，不同亚族基因结构和基序差异显著，但同亚族高度保守。PbbZIP基因多数定位在细胞核，其编码蛋白长度为110~835个氨基酸，等电点为4.48~11.95，疏水性为−1.19~−0.19。分布于12条染色体的27对PbbZIPs基因存在共线性关系，是PbbZIP基因家族扩张的主要模式。PbbZIP基因上游启动子区域存在多种与非生物胁迫相关的作用元件，其中ABA、水杨酸、茉莉酸甲酯的响应元件较多。基因表达分析结果表明：2 mmol·L−1ABA处理闽楠1~72 h，17个PbbZIPs基因在叶和根中被ABA信号不同程度地诱导表达，普遍上调，且根基因表达水平普遍低于叶片。 结论 63个PbbZIPs基因序列高度保守，不同亚族间基因结构、染色体定位和保守基序有进化多样性和差异性；叶和根中PbbZIP基因不同程度地响应ABA信号，参与调控其他非生物过程。图9参35 Abstract:Objective This study is aimed to identify the bZIP transcription factor family members from Phoebe bournei and investigate the response levels of its members to abscisic acid (ABA) treatment. Method A bioinformatic method was employed to identify the PbbZIPs family throughout the whole genome and to analyze its physicochemical properties, gene structure, evolutionary relationships, cis-acting elements in promoter, and the expression patterns under ABA treatment by RT-qPCR. Result A total of 63 PbbZIP genes were identified from 12 chromosomes in P. bournei, divided into 12 subfamilies with significantly different in gene structure and motifs, but highly conserved in the same subfamily. Most of the PbbZIPs were localized in the nucleus, and their encoded protein were 110 − 835 amino acid in length, −1.19 − −0.19 in hydrophobicity, and 4.48 − 11.95 in isoelectric point. The 27 pairs of PbbZIPs distributed on 12 chromosomes were featured with collinearity existence, which was the main pattern of PbbZIPs family expansion. A variety of abiotic stress-related action elements were found in the upstream promoter region of PbbZIPs, among which ABA, salicylic acid and methyl jasmonate were more abundant response elements and the genes expression of RT-qPCR revealed that 17 PbbZIPs were induced differentially by ABA signals and generally up-regulated in leaves and roots when P. bournei was treated with 2 mmol·L−1ABA for 1 − 72 h, with the relative expression of PbbZIPs in roots being generally lower than that in leaves. Conclusion The 63 PbbZIPs identified from the P. bournei genome were unevenly distributed across the 12 chromosomes and highly similar in gene sequences, whereas the chromosomal localization genetic structure and conserved motifs were evolutionarily diverse and different between subgroups. The PbbZIPs in leaves and roots responded differently to ABA treatment and got involved in the regulation of other abiotic processes. [Ch, 9 fig. 35 ref.] -
Key words:
- Phoebe bournei /
- bZIP family /
- systematic evolution /
- ABA /
- expression analysis
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植物病害是导致现代农林业减产的主要原因，及时准确的植物病害识别技术是实施有效防治的关键。在实际生产中，植物病害识别主要依靠人工肉眼观察及经验判断，需要人们在实地进行持续监测[1-2]。这种人工评估方法耗时费力且具有一定的主观性，阻碍了现代农林业的快速发展，因此，快速准确的植物病害自动识别成为了精准农业、高通量植物表型和智能温室等领域的研究热点[3-4]。基于图像处理的植物病害识别方法得到了广泛的研究和应用。早期的识别过程需要从图片中分割病斑，人工提取病斑特征，再利用机器学习算法对特征进行分类。HIARY等[5]提取病斑的纹理特征，采用k-means聚类算法和人工神经网络(artificial neural network，ANN)对5种植物病害进行识别，准确率达94%。TIAN等[6]提出用基于支持向量机(support vector machine，SVM)的多分类器识别小麦Triticum aestivum叶部病害。秦丰等[7]对4种苜蓿Medicago叶部病害进行识别研究，分析比较了多种分割方法、特征选择和分类方法。虽然以上方法在特定场景取得了较好效果，但仍无法实现病害的现场实时诊断。这些方法极大程度上基于阈值的病斑分割算法，对亮度、物体形态和遮挡程度都非常敏感[8−9]，都只适合背景单一且对比度高的扫描式图像。此外，特征提取和选择复杂耗时，仅局限于有限几种病害，难以处理复杂背景的大数据。近年来，深度学习在计算机视觉领域取得重大突破。深度卷积网络神经网络(convolutional neural network，CNN)可在大数据中自动端到端提取特征，避免了人工图像分割和特征工程[10]。MOHANTY等[11]针对PlantVillage数据集[11] 54 306张植物病害图像，使用AlexNet[12]和GoogLeNet[13]识别38种植物病害。孙俊等[14]在同样的数据集上，将AlexNet进行改进，提出一种批归一化与全局池化相结合的识别模型。龙满生等[15]采用参数精调的迁移学习方式训练AlexNet，用于油茶Camellia oleifera病害图像识别。张建华等[16]基于改进的VGG16模型，通过迁移学习实现自然条件下棉花Anemone vitifolia病害图像分类。DECHANT等[17]提出了集成多个CNN的方法，实现玉米Zea mays大斑病图像的高精度识别。PICON等[18]利用深度残差网络ResNet对3种早期小麦病害进行识别，改善了复杂背景下的病害识别率。通常深度学习模型部署在云平台，需要将拍摄图像上传至云平台进行识别。但这种方法严重依赖高速的4G/5G无线网络和强大的云平台，不仅无法覆盖广大偏远农田林地，长时间大范围的上传与识别还导致能耗、流量及云服务成本大幅上涨，限制了物联网的建设规模。然而，目前的监控设备借助低成本低功耗加速芯片，即可支持边缘计算，仅在发现病害时通过低功耗广覆盖的NB-IoT网络[19]上报，可显著降低网络及云服务成本，促进大规模的农林业物联网普及。但现有的CNN模型计算量和参数量过大，不适用于边缘部署。轻量级模型MobileNet[20]在速度和精度两者间达到了一个较好的均衡，但其目标平台是手机等高端嵌入式平台，参数量及运算量仍超过PaddlePi等廉价边缘设备的承受能力。近年来，学术界也提出了多种模型压缩方法。模型通道剪枝[21]剪裁掉模型一部分冗余或低权重的卷积核，减少模型的参数量。量化[22]将模型由32 bit浮点数转化为定点整数，减少模型参数占用的空间。然而上述压缩方法仅应用于ResNet等重量级模型，尚未对MobileNet等轻量级模型压缩进行优化，而且这些压缩方法彼此相互独立，未能联合使用实现模型的深度压缩。为解决上述问题，本研究提出了面向边缘计算的植物病害识别模型构建方法，主要贡献为：①首次针对轻量级模型MobileNet实现深度压缩。②通过联合通道剪枝、量化等多种模型压缩方法，得到了深度压缩的轻量级边缘端模型，可在廉价边缘节点运行。③将模拟学习方法[23]与量化相结合，实现模型压缩的同时，提升识别效果，最后得到的边缘端模型可达到与原模型相近的识别准确率。
1. 材料与方法
1.1 材料
本研究使用PlantVillage植物病害数据集。PlantVillage既包含单一背景下的植物叶片扫描式图像，也收录自然背景下的植物叶片图像，包括叶片重叠、阴影和土壤干扰等情形。截至目前已收集了87 280张图像，包括25种植物和29种病害组成的58类植物-病害组合(图1)。
图 1 PlantVillage数据集植物病害示例图Figure 1 Example of plant disease images from the PlantVillage dataset数据集按图1所示的编号将各种叶片归类并制作标签。随机抽取数据集中60%图像作为训练集，剩余的40%作为测试集。单一背景图像与自然背景图像使用相同的分割比例。由于PlantVillage数据集包含从不同角度对同一叶片拍摄的多张图像，因此相同叶片的图像仅存在于训练集或测试集中。
1.2 方法
选择轻量级卷积神经网络MobileNet[20]作为本研究的基准模型。MobileNet模型将传统的卷积分解为一个深度卷积(depthwise convolution，DC)和一个卷积核为1×1的逐点卷积(pointwise convolution，PC)，计算速度比传统卷积快8~9倍，主要面向智能手机等高端嵌入式系统。为深度压缩MobileNet，本研究提出了如图2所示的面向边缘计算的植物病害识别模型二阶段构建方法。
图 2 面向边缘计算的植物病害识别模型构建方法：通道剪枝和量化模拟学习Figure 2 Plant disease recognition model for edge computing building pipeline: channel pruning and quantized mimic learning第1阶段使用通道剪枝压缩迁移学习训练的MobileNet模型。与从头训练方法相比，迁移学习可以有效提升模型的识别准确率。迁移学习是用ImageNet数据集上预训练好的参数初始化模型，然后在PlantVillage数据集上通过标准多分类损失函数优化模型参数。最后使用基于L1范数的通道剪枝[21]精简低权值的卷积核，同时将该卷积核所有的输入输出连接从网络中删除，降低了模型计算量和存储空间。
第2阶段对剪枝后的模型通过量化方法进一步压缩，得到轻量级的边缘端模型。量化是将模型的权值和激活值由32 bit降低至8 bit，分为训练时量化和训练后量化。虽然训练时量化方法更适用于轻量级模型，但直接使用该方法压缩剪枝后的MobileNet模型仍会导致识别精度显著下降，因此第2阶段将模拟学习与训练时量化相结合，利用迁移学习的MobileNet监督剪枝后模型的量化训练过程，实现量化模拟学习，在模型压缩的同时提升识别准确率。
1.2.1 通道剪枝
模型通道剪枝采用均匀剪枝方法对MobileNet模型的分离卷积层进行通道剪枝，即每层都减掉同样比例的卷积核。依据需要减少模型的浮点运算数量(floating point operations, FLOPs)来确定每层的剪枝比例。计算各层中每个卷积核权值的绝对值和(即L1范数)，L1范数越大，代表该卷积核对模型的贡献越大，反之越小。每层按L1范数由高到低的顺序排序卷积核，优先剪枝L1范数低的卷积核。为实现模型的深度压缩，需进行较高比例的通道剪枝，分别对模型减掉70%、80%和90%的FLOPs。
1.2.2 量化模拟学习
通常训练时，量化的损失函数是标准的多分类损失函数。量化模拟学习是用模拟学习损失函数作为训练时量化的损失函数。模拟学习方法使剪枝量化后模型的输出特征尽量接近迁移学习训练的MobileNet输出特征。利用2个输出特征之间的L2范数作为模拟损失函数，即：
$$ {L_{L_2}}\left( {{W_{\rm{s}}},{W_{\rm{t}}}} \right) =|| F\left( {x;{W_{\rm{t}}}} \right) - F\left( {x;{W_{\rm{s}}}} \right)||_2^2{\text{。}} $$ (1) 式(1)中：Wt和Ws分别是迁移学习训练的MobileNet和剪枝量化后模型的权值矩阵，F (x; Wt)和F(x; Ws)分别表示这2个模型的输出特征值。
剪枝量化后模型的输出特征再经Softmax归一化得到预测类别概率，与分类标签比较后得到交叉熵，作为标准多分类损失函数Lclass(Ws)。模拟学习的完整损失函数就是分类损失函数与模拟损失函数的权重和：
$$ L\left( W \right) = {L_{\rm{class}}}\left( {{W_{\rm{s}}}} \right) + \alpha {L_{{L}_{{\rm}2}}}\left( {{W_{\rm{s}}},{W_{\rm{t}}}} \right){\text{。}} $$ (2) 式(2)中：α为平衡损失权重的超参数。相较于普通多分类问题的损失函数，模拟学习方法可提供额外的监督信息。
将训练时量化方法与模拟学习相结合，实现量化模拟学习具体的训练步骤为：①在训练的前向传播中，将模型的权值wf和激活值af进行量化得到定点值wq和aq，对于浮点数x具体的量化过程为：
$$ {x_{{\rm{int}}}} = {\rm{round}}\left( {\frac{x}{\varDelta }} \right);\; {x_{\rm{Q}}} = {\rm{clamp}}\left[ { - \left( {\frac{N}{2} - 1} \right),\frac{N}{2} - 1,{x_{{\rm{int}}}}} \right]{\text{。}} $$ (3) xQ即为得到的量化值。其中：clamp函数对于输入的变量a，b，c输出为：
$$\begin{aligned} {\rm{clamp}}(a,b,c) & = a\;\;\;\;x {\text{≤}} a \\ & = x\;\;\;a {\text{＜}} x {\text{≤}} b \\ & = b\;\;\;x {\text{＞}} b\text{。} \end{aligned}$$ (4) 也就是将浮点数除以缩放因子Δ，再最近邻取整，最后把范围限制到1个区间内。N与量化后整数类型占用的比特数有关。本研究采用有符号8 bit整数类型，N=256。对于权值，每层权值的最大绝对值作为缩放因子。对于激活值，计算各训练批次激活的最大绝对值的滑动平均值作为缩放因子。②计算剪枝量化后模型对迁移学习训练的MobileNet进行模拟学习的损失函数，即计算公式(2)，得到损失值L(wq)。③后向传播过程，利用步骤②得到的损失函数值对量化之后的权值求梯度，公式为
$ \dfrac{{{\rm{\partial}} L\left( {{w_q}} \right)}}{{{\rm{\partial}} {w_q}}}$ 。④用步骤③计算梯度去更新量化前的浮点值，也就是将模型的权值反量化回有误差的浮点类型。公式为$ {w_{\rm{f}}} = {w_{\rm{f}}} - v\dfrac{{{\rm{\partial}} L\left( {{w_q}} \right)}}{{{\rm{\partial}} {w_q}}}$ ，其中：ν为学习率。因此，模型的后向传播过程仍然是浮点数计算。⑤重复步骤①至步骤④，直至完成训练。最后再对模型按照步骤①量化，得到最终的边缘端模型。2. 结果与分析
模型实现和训练采用的软件环境为Ubuntu1 6.04操作系统和PaddlePaddle深度学习框架，硬件环境为GPU工作站，使用NVIDIA Titan X显卡(12 GB显存)和AMD Ryzen 7 1700X处理器(32 GB内存)。采用模型的平均识别准确率(accuracy)作为衡量模型精度的标准。同时为了更好地评价模型的鲁棒性，将每类病害样本分别进行测试，计算每个类别的查准率(precision)、查全率(recall)以及查全率与查准率的加权平均分数，并在所有类别上求平均。
2.1 MobileNet迁移学习训练试验
训练CNN模型需要对输入图片进行预处理。首先，利用数据增广技术对原图像进行变换，将训练图像变换为256×256大小，然后再随机剪枝成224×224，再进行随机水平翻转和随机垂直翻转。该过程极大扩充了训练数据集的多样性，可提升CNN模型的准确率，降低网络过拟合的风险。之后，计算训练集的红(R)、绿(G)、蓝(B)3个颜色通道的均值和方差，所有图像都减去该均值，除以方差，得到归一化后的数据作为CNN的输入，可加速训练过程收敛。对于测试集中的每一张图片，需要变换至224×224大小，减去训练集各通道均值，除以其方差进行归一化后就可以输入CNN模型进行识别。
利用迁移学习训练MobileNet，使用ImageNet数据集预训练的参数初始化模型，采用批量训练的方法将训练集分为多个批次(batch)，使用随机梯度下降算法来实现模型优化，批次大小为32，遍历1次训练集中的所有图片作为1个周期(epoch)，共迭代50个周期，初始学习率为0.005，动量值为0.9，之后每迭代20个周期就将学习率减小为原来的0.1倍。训练好的模型参数量为3.3 M，识别准确率为96.23%，查准率、查全率和加权平均分数分别为96.62%、95.46%和95.75%。
2.2 边缘端植物病害识别模型训练试验
研究不同压缩率下本研究方法的有效性，使用不同的剪枝率，分别对模型减掉不同比例的FLOPs。结果表明：当剪枝率低于60%时，即使使用无模拟训练方法重新训练模型，得到的识别准确率与原MobileNet模型差别很小，说明原模型在该数据集上具有较高的冗余性，只有当剪枝率高于70%时，才能体现不同压缩方法表现的差距。因此，设置剪枝率为70%、80%和90%，对应的模型参数量大小为0.91、0.58和0.23 M，模型的参数量压缩了3.6、5.7、14.3倍，量化又将精度由32 bit降低至8 bit，压缩率为4倍，得到的边缘端模型的整体压缩率分别为14.4、22.8和57.2倍。为快速恢复剪枝后模型精度，首先利用模拟学习损失函数进行30个周期的32 bit浮点模型训练，使用随机梯度下降算法优化模型，批次大小为32，初始学习率为0.005。之后，每迭代15个周期就将学习率减小为原来的0.1倍。公式(2)的α值设置为1。之后再进行20个周期的量化模拟学习，学习率为0.005，公式(2)的α值为0.1，其余超参数值不变。训练结果如表1所示。
表 1 边缘端模型植物病害识别结果Table 1 Plant disease recognition results of models on the edge剪枝率/% 参数量/M 剪枝压缩率/倍 量化压缩率/倍 整体压缩率/倍 准确率/% 查准率/% 查全率/% 加权平均分数/% 70 0.91 3.6 4 14.4 95.99 96.18 94.41 94.92 80 0.58 5.7 4 22.8 95.55 95.51 93.52 93.99 90 0.23 14.3 4 57.2 94.58 94.87 92.41 93.15 表1表明：整体压缩率分别为14.4、22.8和57.2倍的边缘端模型，识别准确率分别为95.99%、95.55%和94.58%，与迁移学习训练的MobileNet模型相比仅下降了0.24%、0.68%和1.65%。同时查准率、查全率和加权平均分数值也表明边缘端模型具有较高的鲁棒性。
不同压缩率的边缘端模型在测试集的混淆矩阵如图3所示。图3列出了58个类中的每类被正确分类的比例(对角线上的值)和被误识别为其他类的比例(非对角线上的值)。每类的编号与图1一致。可以看出：边缘端模型对不同植物的不同病害均具有较强的识别能力，但不同病害识别结果之间存在着较大的差异。58类病害中，这3个边缘端模型的识别准确率均超过90%的有43类，均超过80%的有51类，均超过70%的有55类。其中有11号哈密瓜健康叶、24号葫芦霜霉病、25号葡萄健康叶、39号树莓健康叶、46号草莓健康叶这5类的识别准确率在3个模型均达到了100%。识别效果最差，在3个模型上识别准确率几乎均低于70%的病害是12号木薯褐斑病(3个模型识别率分别为48.15%、58.33%、48.15%)，35号马铃薯健康叶(3个模型识别率分别为48.33%、33.33%、48.33%)，21号黄瓜健康叶(3个模型识别率分别为67.92%、66.04%、77.36%)。这些病害大多都被误识别为外形相似的其他病害，例如12号木薯褐斑病被误识别为13号木薯绿螨病，35号马铃薯健康叶被误识别为病斑较小的36号马铃薯晚疫病，21号黄瓜健康叶被误识别为11号哈密瓜健康叶。
2.3 边缘端植物病害识别模型对比试验
为进一步测试边缘端模型性能，分别在剪枝率70%、80%和90%的条件下，利用无模拟学习方法，即标准的多分类损失函数分别训练通道剪枝后模型和通道剪枝并量化模型，训练的超参数与本研究的训练超参数一致，与本研究模型进行对比实验。从表2可见：在不同的剪枝率的情况下，本研究模型与其他模型压缩方法相比均具有更高的模型压缩率和识别准确率，而且压缩率越高，识别准确率相比其他方法提升越明显，能更好识别植物病害类别并部署于边缘设备。
表 2 不同压缩方法边缘端模型植物病害识别结果Table 2 Plant disease recognition results of models on the edge compressed by different methods剪枝率/% 参数量/M 边缘端模型 精度/bit 压缩率/倍 准确率/% 70 0.91 剪枝+无模拟学习 32 3.6 95.48 剪枝+量化+无模拟学习 8 14.4 95.45 本研究模型 8 14.4 95.99 80 0.58 剪枝+无模拟学习 32 5.7 94.95 剪枝+量化+无模拟学习 8 22.8 94.92 本研究模型 8 22.8 95.55 90 0.23 剪枝+无模拟学习 32 14.3 93.40 剪枝+量化+无模拟学习 8 57.2 93.53 本研究模型 8 57.2 94.58 3. 结论
本研究针对边缘环境下计算资源的限制，在迁移学习训练的MobileNet模型基础上，联合使用2种压缩算法降低模型参数量和运算量，并结合模拟学习恢复识别精度，得到深度压缩的边缘端模型。在PlantVillage的实验结果表明：利用本研究方法对MobileNet进行不同程度的深度压缩，均能够大大减少网络计算量并保留原始识别能力。其中减少70%~90% FLOPs的模型，参数量压缩了3.6~14.3倍，再经过量化模拟学习后整体压缩率为14.4~57.2倍，准确率达到了95.99%~94.58%，较迁移学习训练的MobileNet模型仅降低0.24%~1.65%，同时还具有较高的鲁棒性，对不同植物的不同病害均具有较强的识别能力。实验结果证明了该压缩方法的可行性和有效性。
随着PlantVillage数据集的不断扩展，深度学习模型能更多更准地识别植物病害。本研究提出的模型构建方法可平衡识别的速度和精度，满足植物病害识别边缘部署的需求。
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图 4 闽楠、拟南芥、毛果杨和番茄bZIP家族系统进化分析
Figure 4 Phylogenetic analysis of bZIP family from P. bournei, P. trichocarpa, A. thaliana, and S. lycopersicum
图 6 闽楠bZIP家族成员种间共线性分析
Figure 6 Interspecific collinear relationships of PbbZIP family members
图 7 PbbZIPs与逆境胁迫相关的顺式作用元件
Figure 7 Cis-acting elements associated with adversity stress in promoters of PbbZIPs
图 8 叶中PbbZIP基因对脱落酸处理的表达响应
Figure 8 Response of PbbZIP genes to ABA treatment in leaves
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20230342
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