下载:
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磷(phosphorus，P)是植物中脂质、核酸、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)和糖类的重要组成元素，是含量仅次于氮的第二大限制性养分[1]，在植物生长发育过程中发挥着不可替代的作用。植物吸收磷素主要以可溶性的磷酸根离子(
${\rm{PO}}_4^{3 - } $ 、${\rm{HPO}}_4^{2 - } $ 、${{\rm{H}}_2}{\rm{PO}}_4^ - $ )形式为主[2]，虽然土壤中磷素含量很高，但是可供利用的无机磷素含量较少，是导致植物缺磷的主要原因之一[3]。植物磷转运蛋白(phosphate transporter，PHT)是植物从土壤中吸收无机磷酸盐并在体内进行再分配利用的载体。磷吸收动力学研究表明：植物在进化过程中形成了2类不同的磷吸收转运系统[4]，分别为高亲和力磷吸收转运系统(high-affinity P uptake system)和低亲和力磷吸收转运系统(low-affinity P uptake system)[5]。研究者最早在拟南芥Arabidopsis thaliana中克隆出了磷转运蛋白基因AtPHT1.1，随后通过基因组测序、同源序列分析等方法陆续在大豆Glycine max[6]、玉米Zea mays[7]、大麦Triticum aestivum[8]和番茄Lycopersicon esculentum[9]等植物中克隆出了磷转运蛋白基因。植物磷酸盐转运蛋白属于MFS超级家族(major facilitator superfamily)[10]，有12个疏水的跨膜区域，蛋白质结构高度相似，在氨基酸序列中存在保守特征序列GGDYPLSATIMSE，以及保守的磷酸化位点和糖基化位点。磷转运蛋白分为4个亚家族，分别为PHTⅠ、PHTⅡ、PHTⅢ、PHTⅣ[11]。拟南芥中，AtPHT1.1、AtPHT1.2和AtPHT1.3对拟南芥吸收磷的贡献非常大，而且AtPHT1.1在长距离运转磷的过程中具有重要作用[12]。研究表明：高磷环境中OsPHT1是水稻Oryza sativa吸收和转运磷素的关键PHTⅠ成员[13]。缺磷显著诱导OsPHT2、OsPHT4、OsPHT8、OsPHT9 和OsPHT10等的表达。OsPHT8几乎在水稻的各个器官中都强烈表达，是组成型磷转运子；OsPHT8下调会使新叶磷含量下降，老叶磷含量上升，处于灌浆期的胚乳和胚中的磷含量显著下降，说明水稻OsPHT8对磷素从源到库的再分配起到至关重要的作用[14]。大豆中，GmPHT7在根际成熟丛枝菌Arbuscular mycorrhiza (AM)根的根冠小柱细胞、皮层细胞和无菌根的侧根原基细胞中表达，在衰老叶片的维管束末端少数管胞中也有表达，主要负责向种子转运再活化的磷素[15]。此外，GmPHT10和GmPHT11也会受AM诱导表达[16]，即磷酸盐转运蛋白基因广泛存在于各种植物中。毛竹Phyllostachys edulis属于禾本科Gramineae刚竹属Phyllostachys，具有经济价值高、用途广泛、栽培面积大等特点[17]。影响毛竹生长发育的因素有很多，如林地养分、水分不足[18]，粗放的抚育管理和病虫害防治不及时等[19]，其中，磷元素是限制毛竹林生长的重要营养元素之一。因此，研究毛竹磷素转运和吸收的相关基因的表达具有重要意义[20]。由于土壤对磷素的化学固定作用，磷素利用率普遍较低[21]。磷酸盐转运蛋白是植物吸收和转运磷素的重要参与者。本研究利用生物信息学方法鉴定毛竹PHTⅠ家族成员，分析其基因启动子、蛋白质理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置以及基因的组织表达特异性等，以期为深入研究毛竹PHT基因功能，探索毛竹磷素利用机制提供参考。
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拟南芥和水稻PHT基因的CDS序列、基因序列以及氨基酸序列分别下载于Tair (
https://www.arabidopsis.org )和Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.mus.edu )。在毛竹基因组数据库Bamboo GDB (http://bamboo.bamboogdb.org/ )进行BlastP、BlastN (e-value=1e−10) 比对，获取毛竹PHTⅠ同源基因的候选序列。通过SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de )和PFAM数据库(http://pfam.xfam.org )确定获取的候选序列的保守结构域的准确性和完整性，保留具有编码完整保守结构域的候选序列，并进行基因命名(PePHTs)。 -
利用ProtParam (
http://web.expasy.org/prot-param/ )获取毛竹PHTⅠ基因编码蛋白质的基本理化特性，使用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/ )在线工具分析PePHTs的基因结构，通过MEME Version 5.3.2 (http://meme-suite.org/tools/meme )获取毛竹PHTⅠ的保守基序，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )在线分析平台对PePHTs所含作用元件进行分析，在Excel软件中整理Tab结果文件, 用TBtools软件的Basic BioSequence View工具展示顺式作用元件的分布[22]，使用Plant-mPLoc算法(http://www.csbio.sjtu.edu.cn )预测毛竹PHTⅠ的亚细胞位置。 -
使用Clustal X 1.8软件对毛竹、拟南芥、水稻等PHT基因的CDS序列进行多重比对，比对结果在MEGA 7.0软件中使用邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树，bootstrap试验重复1000次[23]，其他参数设置为默认值。利用在线工具Evolview (
https://www.evolgenius.info/evolview/ )进行树图编辑[24]。 -
利用在线软件MEME Version 5.3.2 (
http://meme-suite.org/tools/meme )对毛竹PHTⅠ的motif进行预测和分析，motif数量设置为10。使用TBtools软件的Gene Location Visualize from GTF/GFF工具展示基因在染色体上的位置。使用KaKs_Calculator软件计算毛竹PHTⅠ基因的CDS序列的选择压力值(ω)[25]。 -
根据毛竹和竹笋不同组织的转录组数据[26]，用PePHTs的RPKM (reads per kilo-bases per million reads)值表示基因的表达丰度，利用TBtools制作热图展示基因的表达丰度。
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通过比对分析毛竹基因组，鉴定并确定编码完整MFs_1的候选基因共20个。植物PHT一般都含有MFs_1保守结构域，候选基因编码的蛋白质都含有保守的跨膜结构域，与MFS超家族的PHT家族特征相同。根据PHT候选基因在毛竹Scaffold中的位置以及同源基因的名称依次命名为：PePHT1~PePHT20。
对20个PHTⅠ家族基因进行生物信息学分析，其理化性质结果(表1)显示：PePHTs编码的氨基酸序列长度，最长为696 个氨基酸 (PePHT1)，最短为432 个氨基酸(PePHT17)，理论等电点为6.84~9.30，除PePHT15外，其他均为碱性蛋白质，分子量为48.61~76.37 kDa。疏水性测试显示：所有蛋白质疏水性值(grand average hydropathicity，GRAVY)＞0，说明该家族蛋白质均为疏水性蛋白质。脂肪族氨基酸指数显示：PHTⅠ家族的蛋白质热稳定性为 83.79~105.07，热稳定性差异较大。亚细胞定位结果显示：PePHTs均定位于细胞膜中。
表 1 毛竹PHTⅠ家族基因编码蛋白序列的理化性质
Table 1. Physicochemical properties of proteins encoded by PHTⅠ gene family in Ph. edulis
基因名称 基因登录号 氨基酸/个 理论等电点 分子量/kDa 疏水性值 脂肪族氨基酸指数 亚细胞定位 PePHT1 PH02Gene03602 696 7.63 76.37 0.269 92.56 细胞膜 PePHT2 PH02Gene11006 531 9.10 57.69 0.538 98.91 细胞膜 PePHT3 PH02Gene14509 541 9.15 59.64 0.322 95.10 细胞膜 PePHT4 PH02Gene21291 532 8.45 58.05 0.371 89.40 细胞膜 PePHT5 PH02Gene24702 536 8.71 59.02 0.321 90.80 细胞膜 PePHT6 PH02Gene37931 547 8.31 58.97 0.412 92.32 细胞膜 PePHT7 PH02Gene39948 558 8.85 60.96 0.313 93.58 细胞膜 PePHT8 PH02Gene44007 536 8.03 58.49 0.408 91.27 细胞膜 PePHT9 PH02Gene44009 574 8.60 62.35 0.449 94.79 细胞膜 PePHT10 PH02Gene48053 507 8.01 55.77 0.259 87.59 细胞膜 PePHT11 PH02Gene48969 598 9.21 59.84 0.204 83.79 细胞膜 PePHT12 PH02Gene49859 567 8.99 61.45 0.376 92.31 细胞膜 PePHT13 PH02Gene50239 554 8.95 60.55 0.329 93.92 细胞膜 PePHT14 PH02Gene21248 518 8.02 57.42 0.494 105.04 细胞膜 PePHT15 PH02Gene21249 655 6.84 71.89 0.226 90.87 细胞膜 PePHT16 PH02Gene21250 505 9.30 55.46 0.473 105.07 细胞膜 PePHT17 PH02Gene21252 432 9.24 48.61 0.348 101.83 细胞膜 PePHT18 PH02Gene47590 520 8.67 58.31 0.324 90.25 细胞膜 PePHT19 PH02Gene47591 563 8.92 62.63 0.314 94.81 细胞膜 PePHT20 PH02Gene49564 527 8.04 58.50 0.391 97.53 细胞膜 -
由图1可知：毛竹PHTⅠ家族基因多数含1~2个内含子(intron)，在所有PePHTs中，PePHT14内含子区域最长，PePHT8和PePHT11内含子区域最短。保守基序分析显示：PePHTs含有7~10个保守基序，分别命名为motif1~motif10。其中有6个基序高度保守，分别是motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif8，其他基序在部分序列中缺失。9个PePHTs中含有10个motif，其他11个PePHTs缺失1~3个motif，PePHT1、PePHT10都缺少motif7，PePHT11缺少motif1，PePHT12缺少motif9、motif10，PePHT14、PePHT15、PePHT16、PePHT18、PePHT19、PePHT20都缺少motif10，PePHT17则缺少motif7、motif9、motif10。PePHTs高度保守基序的氨基酸数目也不尽相同，最长的motif由50个氨基酸组成，最短的motif由29个氨基酸组成。
图 1 毛竹PHTⅠ家族基因的结构
Figure 1. Structures analysis of PHTⅠ gene family in Ph. edulis
为探究PePHTs受内在调控因子调节的情况和对外界环境的响应，选取PePHTs距离起始密码子上游2 000 bp的序列，对其所含顺式作用元件和应答元件进行分析。如图2所示：所有启动子的顺式作用元件种类比较相似，包括MYB转录因子结合的顺式作用元件，生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸等激素响应元件以及低温、干旱、缺氧、光等非生物胁迫响应元件。由此表明：PePHTs的转录表达可能会受到非生物胁迫和激素的影响。
图 2 毛竹PHTⅠ家族基因启动子区顺式作用元件位置信息
Figure 2. Location information of cis-acting regulatory elements identified in the promoter region of PHTⅠ gene family in Ph. edulis
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为了解PePHTs的进化关系，预测基因潜在功能，本研究提取20个毛竹、18个拟南芥和25个水稻的PHT基因的CDS序列进行多重序列比对，并利用MEGA 7.0软件根据邻接法构建系统进化树。由图3显示：毛竹、拟南芥和水稻的PHT基因被聚类到4个亚家族中，来自毛竹的20个PePHTs均分布在第Ⅰ亚家族的5个分支上，1个分支中只有PePHTs基因，另4个分支和水稻聚类在一起。此外，第Ⅰ亚家族中还包含9个拟南芥和12个水稻的PHT基因。PHT亚家族中的基因在功能上存在一定差异，如大多数第Ⅰ亚家族成员主要在直接接触根际环境的根毛和表皮细胞中表达，参与根系对环境中磷元素的吸收过程[27-28]，定位在细胞膜上。相比拟南芥，毛竹PHT基因均优先与水稻PHT基因聚类，推测PePHTs在功能上可能与水稻同源基因更为相似。
图 3 毛竹、拟南芥和水稻PHT家族基因系统进化树
Figure 3. Phylogentic tree of PHT gene family from Ph. edulis, A. thaliana and O. sativa
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染色体定位显示：20个毛竹PHT基因位于10条染色体上，其中23号染色体上最多，有6个，分别是PePHT14、PePHT15、PePHT16、PePHT17、PePHT18、PePHT19；其次是24号染色体，有3个，分别是PePHT10、PePHT11、PePHT20，推测这2个基因簇中的基因可能分别编码催化2种新陈代谢途径中不同步骤的磷转运酶[29]。5号、14号以及15号染色体上各有2个基因，其余染色体各有1个(图4)。除数量分布不均匀外，各基因在染色体上的分布位置也不均匀，大多数基因位于染色体的中部，少量则位于顶部和底部。适应性分析结果表明：PePHT7的ω＞0，其他基因的ω＜0，表明PePHT7受到正选择压力，其他基因受到负选择压力[30]。
图 4 毛竹PHTⅠ基因在染色体上的位置
Figure 4. Chromosomal location of PHTⅠ genes from Ph. edulis
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根据毛竹6个不同部位的转录组表达谱数据[26]，对毛竹PHTⅠ家族基因进行组织特异性表达分析。由图5可知：毛竹不同组织中的PePHTs表达丰度差异较大，其中PePHT5、PePHT7、PePHT8、PePHT12、PePHT14、PePHT19在箨鞘中大量表达；PePHT2、PePHT3、PePHT6、PePHT13、PePHT15在根中表达丰度较高；PePHT18在叶中大量表达，PePHT10、PePHT20在叶鞘中大量表达，PePHT16、PePHT17在叶和叶鞘中也有少量表达。
图 5 PePHTs在毛竹6个部位的表达
Figure 5. Expression analysis of PePHTs in 6 parts of Ph. edulis
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植物从环境中吸收磷元素的过程中，磷酸盐转运蛋白起着至关重要的载体作用。植物PHTⅠ磷酸盐转运蛋白为膜蛋白，大多数属于高亲和力转运系统，并且具有相似的蛋白质序列和化学结构。在双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中分别发现了9个[31-32]和12个PHTⅠ家族成员[6]。VERSAW等[33]证实拟南芥AtPHT2.1除了参与植物对磷元素的吸收与转运，还可能参与茎部对磷的转运，其蛋白质定位于叶绿体内膜上。PHTⅡ磷酸盐转运蛋白也在拟南芥[34]、马铃薯Solanum tuberosum [35]、茄Solanum melongena [36]、菠菜Spinacia oleracea [37]、烟草Nicotiana tabacum [38]和小麦Triticum aestivum [39]等多种植物中被发现。PHTⅢ磷酸盐转运蛋白最初在拟南芥中被克隆得到的。研究表明：PHTⅢ 磷酸盐转运家族与 PHTⅠ家族一样，通过 P/H+同向转运和P/OH−反向转运方式参与细胞质间磷的交换[39-40]。随后水稻、玉米和大豆等其他植物也克隆得到了该蛋白[41]。但是PHTⅣ磷酸盐转运蛋白只在少数几种植物中发现[42]，研究报道很少。
植物磷转运蛋白是众多转运蛋白中的一类重要蛋白家族，它们在植物的根、茎、叶、花等器官都有分布，是磷元素吸收和运转的主要载体[1]。物种中均存在PHT基因，说明该基因具有重复性和多样性，这也是基因组重新排列和扩展的结果。本研究从毛竹基因组中鉴定出20个PHTⅠ家族基因，每个成员都含有Sugar_tr和MFs_1保守结构域，这是它们具有相似功能的基础。理化性质分析显示：PHT长度、理论等电点以及分子量区间跨度较大，这有可能是因为基因进行多次复制转录后进化的结果。本研究预测了毛竹PHTⅠ基因在细胞中的位置，发现毛竹PHTⅠ基因都分布在细胞膜上，与已有研究一致[3]，说明鉴定出的毛竹PHTⅠ亚家族中的基因符合磷酸盐转运蛋白基因的特性。在植物进化过程中，选择压力能很好地体现发挥重要功能的蛋白的变化。基因适应性进化分析显示：大多数PePHTs基因受到较强烈的负选择压力，说明毛竹磷转运蛋白相对趋于稳定，是其保持原有重要功能的原因；同时PePHT7基因受到正选择压力，提示该基因编码的蛋白可能会延伸出一些新的功能[30]。植物基因组织特异性表达与基因的功能关系密切，毛竹磷转运蛋白在箨鞘、根、叶和叶鞘都有1个及以上的基因大量表达，PePHT4、PePHT9、PePHT11等3个基因在任何组织中都没有检测到，还需深入研究；PePHT1在根和鞭芽中明显下调，说明基因在不同组织中表达丰度不一样且发挥着不同的作用。
系统进化分析发现：毛竹PHTⅠ基因聚类在第Ⅰ亚家族的5个分支上，同一支中的基因可能具有相似的功能。拟南芥的PHTⅠ亚家族中有9个成员，其中AtPHT1.6在花粉中表达，其余8个在根中表达[43]；当拟南芥缺磷时，AtPHT1.1和AtPHT1.4会大量表达，这2个磷酸盐转运蛋白提供了70%的磷酸盐转运活性[44]。水稻PHTⅠ亚家族中有12个成员[6]，其中OsPHT1主要功能是吸收磷素和体内磷酸盐的再分配[13]，OsPHT2主要在地上部分表达，也是水稻PHTⅠ亚家族中唯一一个低亲和力磷转运蛋白[45]。PHTⅠ家族在水稻和拟南芥吸收和转运磷的过程中具有重要作用[32, 45]，推测在毛竹对磷的吸收转运过程中也可能具有重要作用，但需要进一步的转录组数据进行验证。
Identification and expression pattern of phosphorus transporter Ⅰ family genes of Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 鉴定毛竹Phyllostachys edulis磷转运蛋白Ⅰ (phosphate transporter 1, PHTⅠ)家族基因，分析其表达模式。 方法 利用生物信息学方法，鉴定毛竹PHTⅠ家族成员，分析基因启动子调控元件、编码蛋白的理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置、组织表达特异性、基因适应性进化及系统进化等。 结果 毛竹中共鉴定出20个PHTⅠ家族基因 (PePHTs)，分布在10条染色体上，均定位于细胞膜。每个基因都含有1~2个内含子，PePHTs启动子序列中包含干旱、低温等非生物胁迫以及赤霉素等激素类响应元件。毛竹PHTⅠ大部分为碱性蛋白质，分子量为48.61~76.37 kDa，理论等电点为6.84~9.30，疏水性值均大于0，都属于疏水蛋白。基因适应性进化分析显示：大多数PePHTs的选择压力值小于0，说明多数基因受到负选择压力。转录组表达图谱表明：PePHTs在不同组织中的表达存在差异性，说明该基因家族在毛竹生长发育过程中发挥着不同的作用。系统进化树表明：PePHTs都聚类在第Ⅰ亚家族，并且优先和水稻Oryza sativa聚类在同一支上。 结论 PHTⅠ家族在植物吸收和转运磷的过程中扮演了重要作用。本研究结果为深入研究毛竹PHTⅠ家族基因的功能奠定了理论基础。图5表1参45 Abstract:Objective This study is aimed to investigate the family members of phosphorus transporter Ⅰ (PHTⅠ) protein of Moso bamboo (Phyllostachys edulis) and analyze their expression patterns. Method With the employment of the bioinformatics, the PHTⅠ family members of Moso bamboo were identified before an analysis was conducted of the regulatory elements of gene promoters, the physicochemical properties of coding proteins, gene structure, conserved motifs of amino acids, gene positions on chromosomes, tissue expression specificity, gene adaptive evolution and phylogeny. Result PHTⅠ family of Moso bamboo consisted of 20 members distributed on ten chromosomes in the cell membrane and each gene contained 1 to 2 introns while the PePHTs promoter sequence contained elements of abiotic stress such as drought and low temperature and hormone response elements such as Gibberellic acid. Most PHTⅠ from Ph.edulis were basic proteins with the range of molecular weight of PePHTs between 48.61 and 76.37 kDa and that of the theoretical isoelectric point between 6.84 and 9.30. The hydrophobicity value of all PePHTs was greater than zero, indicating that all the proteins in this family were hydrophobic. In terms of gene adaptive evolution, the ω value of most PePHTs genes were lower than zero, indicating that most genes were under negative selection pressure. PePHTs had different expressions in different tissues, which indicated that PePHTs played different roles in the growth and development of Moso bamboo. PePHTs were clustered in the first Ⅰ subfamily, preferentially in the same branch as rice (Oryza sativa). Conclusion PHTⅠ family plays an important role in the absorption and transport of phosphorus in plants and the results of this study have provided a favorable theoretical foundation for a further analysis of the functions of the PHTⅠ family genes in Moso bamboo. [Ch, 5 fig. 1 tab. 45 ref. ] -
野生蔬菜，简称野菜，是指自然生长、未经人工驯化栽培，整株或部分可食的野生植物[1]，也有把野生食用菌归入野菜中[2]，本研究仅指野生植物。野菜在中国具有悠久的使用历史，《诗经》《尔雅》等书中已有相关记载，明清时期的《救荒本草》《野菜谱》《养生八笺》等对野菜种类和功能进行了介绍。野菜在中国分布广泛，总体上呈南多北少的趋势，据不完全统计，约213科1 822种，其中可食用的400余种[3]。早期，野菜多作为饮食补充；随着研究的深入，野菜中的特殊营养物质和药用成分被逐步发掘出来，使其成为天然生物活性物质的重要来源，被用于预防和治疗各种疾病[4-5]。目前有关野菜资源分布、基本营养成分和生物活性物质测定等方面已有一些研究，本研究因此对野菜的功能性成分及其生物活性进行了综述，为进一步开展野菜活性成分研究以及食品工业原料、天然药物成分开发等提供理论基础。
1. 野菜营养与功能成分研究现状
1.1 矿质元素
研究发现野菜中含有丰富的矿质元素，如琉璃苣Borago officinalis、野生菊苣Cichorium intybus和花叶滇苦菜Sonchus asper中含有丰富的钾、铁和锌元素[6]，刺桐Erythrina variegata中也含有较高的钾、锌元素[7]。部分野菜中的某些矿质元素含量更高，如马齿苋Portulaca oleracea钙、镁含量是油菜Brassica napus的3.6和14.0倍、芥蓝Brassica oleracea的4.5和8.8倍[8]。此外，KAUR等[9]研究发现野生鹰嘴豆Cicer arietinum比栽培鹰嘴豆具有更高的钙、镁和锰含量；徐亚莉[10]分别在培养箱和大田环境下对野生和栽培马齿苋主要矿质成分以及微量元素含量进行了对比，发现野生型马齿苋的钙、镁和微量元素含量均高于栽培型马齿苋，其中大田中野生型马齿苋钙、镁和微量元素含量分别比栽培型马齿苋钙、镁和微量元素含量高出2.3%、13.0%和10.5%。
1.2 氨基酸
目前，有关野菜中氨基酸的组分和含量的研究已有不少报道，如曹利民等[11]发现赣产5种野菜：牛膝Achyranthes bidentata、白花败酱Patrinia villosa、鸭儿芹Cryptotaenia japonica、马兰Kalimeris indica、白花鬼针草Bidens pilosa均含有16种氨基酸，其必需氨基酸质量分数为36.2~74.5 g·kg−1；HUANG等[12]从不同品种的野生箭筈豌豆Vicia sativa中检测出18种氨基酸，其中一半为必需氨基酸，总氨基酸含量为173.00~286.05 g·kg−1；黄元河等[13]也从右江流域5种野菜：狗肝菜Dicliptera chinensis、铜锤玉带草Lobelia angulata 、野芋Colocasia gigantea、鸭儿芹和五指牛奶Ficus simplicissima中检测出14~18种游离氨基酸，除野芋外其他4种野菜中均含8种必需氨基酸。
1973年联合国粮农组织和世界卫生组织在Energy and Protein Requirement上发布了食物中氨基酸的配比标准，建议以此作为优质蛋白质来源的评价标准[14]。对照这个标准，一些野菜中的氨基酸不仅种类丰富，而且配比良好。黄元河等[13]研究发现狗肝菜、鸭儿芹和野芋叶柄的苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸—酪氨酸的含量配比接近标准值；包艳玲等[15]报道车前草Plantago major的必需氨基酸与总氨基酸的含量比值(EAA/TAA)为38.584%，必需氨基酸与非必需氨基酸的含量比值(EAA/NEAA)为61.416%，与WHO/FAO提出的理想蛋白模式 EAA/TAA(40%)和EAA/NEAA(60%)非常接近。此外，特定的氨基酸组分与野菜的风味存在关联，如野生马齿苋[16]等野菜中天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量远高于一些栽培蔬菜，使这些野菜更有鲜味。
1.3 维生素
已有研究表明：不少野菜含有抗坏血酸、胡萝卜素和生育酚等多种对人体健康特别重要的维生素[10, 17-18]。马兰[11]、蒲公英Taraxacum mongolicum[19]等植株中检测出多种B族维生素。研究也发现部分野菜中的维生素单位含量高于栽培蔬菜，如《中国野菜图谱》就记载了88种野菜的胡萝卜素含量高于胡萝卜Daucus carota[20]；刺苋Amaranthus spinosus的维生素C含量比普通生菜Lactuca sativa高出几十倍[8, 21]。此外，CECCANTI等[17]和MEDINA-LOZAND等[22]报道野生菊苣和一些野生莴苣Lactuca sativa品种的抗坏血酸含量高于栽培品种，这种情况的出现被认为可能是维生素C等一些营养物质在长期的作物驯化过程中出现了流失。
1.4 脂肪酸
不少野菜具有良好的脂肪酸组成，开发利用价值高。刘娜[23]在齿果酸模Rumex dentatus叶子中检测出9种脂肪酸，且主要都为不饱和脂肪酸；陈军等[24]和吴永祥等[25]分别在猫爪草Ranunculus ternatus和豆腐柴Premna microphylla叶中检测出亚油酸、棕榈酸、8-十八碳烯酸等有益脂肪酸。美国农业部还曾在《特定食品中omega-3脂肪酸和其他脂肪成分含量暂定表》中表明野生马齿苋是所有被检测的绿叶蔬菜中omega-3脂肪酸最丰富的作物[26]。可见野菜资源可以成为脂肪酸功能组分的重要来源，为人们日常饮食和功能食品的开发做出贡献。
1.5 多糖
从植物中提取有益多糖是近年来的研究热点。不同种类和地区野菜中的多糖质量分数不同，如郑奎玲等[27]对黔产8种野菜中的多糖质量分数进行了比较发现：8种野菜中蓝布正Geum japonicum的多糖质量分数最高(120.1 mg·g−1)；周新华等[28]对10个地区的野生夏枯草Prunella vulgaris研究发现：不同地区夏枯草多糖质量分数差异显著，多糖的质量分数为70.45~120.39 mg·g−1。多糖提取率不仅取决于野菜的生长环境，还与多糖的提取方法有关。如刘珊珊等[29]尝试双酶法从干燥蒲公英根中提取多糖，得率达32.97%；张志强等[30]和陈凌等[31]分别采用超声波辅助法和酶法提取马齿苋多糖，前者得率为13.55%，而后者仅为0.42%。
1.6 多酚类化合物
1.6.1 黄酮类化合物
黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，在野菜中分布广泛。如野生大豆Glycine max[32]和野萝卜Raphanus raphanistrum[33]中分别检测到了17和12种黄酮类化合物；AWOUAFACK等[34]从鸡头薯属Fabaceae eriosema的5个物种中总共分离出包括异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮醇和黄烷酮等52种黄酮类化合物；MARENGO等[35]从菊科Compositae飞廉Asteraceae carduus中提取出18种黄酮和7种黄酮醇，主要成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚和芹菜素-O-糖苷等。此外，不同野菜及品种间的黄酮类化合物质量分数存在差异，如15种野生鹰嘴豆中黄酮醇质量分数为79.4~242.0 mg·kg−1 [9]；苦苣菜Sonchus oleraceus、紫背天葵Begonia fimbristipula、紫苏Perilla frutescens和苦菊Cichorium endivia等10种野菜中总黄酮质量分数最高为苦苣菜(85.69 mg·g−1)，最低为苦菊(3.75 mg·g−1)[36]。
1.6.2 非黄酮类化合物
一些野菜含有丰富的酚酸类以及花色苷类等非黄酮类化合物。如野茭白Zizania latifolia中测出羟基苯甲酸、对香豆酸、香草醛、芥子酸等10种酚酸类物质[37]；DATTA等[38]研究发现蕹菜Ipomoea aquatica含有6种酚酸类物质，质量分数为0.33~18.27 mg·kg−1；GIAMBANELLI等[39]在13种野生菊科蔬菜中发现了7种羟基肉桂酸和3种花色苷，其中羟基肉桂酸的质量分数为1 388~53 076 mg·kg−1，占总酚质量分数的69%~98%；张瑞军等[40]对四川9种野生百合Lilium不同部位的花色苷质量分数进行比较，从高到低分别为花(8.73~26.33 mg·g−1)、叶(13.29~18.36 mg·g−1)、茎秆(2.21~6.75 mg·g−1)、鳞茎(1.33~4.26 mg·g−1)，器官间花色苷质量分数差异显著。
2. 生物活性研究进展
许多野菜中存在多酚类化合物、萜类化合物等生物活性物质(表1)，在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等方面表现出了良好功效[41-42]。
2.1 抗炎活性
野菜含有丰富萜类和生物碱类等化合物，这些物质具有抗炎活性。如马齿苋[43]中提取出的儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱可抑制炎性介质(TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2)的产生；WANG等[44]在掌叶蜂斗菜Petasites tatewakianus中分离出的13种倍半萜烯对LPS诱导的小鼠胶质BV-2细胞中NO产生较强的抑制作用。HAN等[45]首次报道了猴腿蹄盖蕨Athyrium multidentatum提取物的抗炎活性，发现其主要机制是通过促使IκB抗体高表达，进而抑制NO、前列腺素E2(PEG2)和促炎介质的产生，从而达到预防急性肺损伤的功效，并认为其抗炎活性可能与植物体中的高水平黄酮(36.09 mg·g−1)密切相关。
2.2 抗氧化活性
野菜中存在多种具有自由基清除能力的活性物质，如马齿苋的叶、茎和花中的抗坏血酸和β-胡萝卜素能够中和自由基，在清除DPPH自由基方面具有显著效果[46]；KYUNG等[47]发现夏枯草、蜂斗菜Petasites japonicas等5种野菜的总酚提取物具有较高的铁离子还原能力和DPPH自由基清除活性，其中夏枯草提取物铁还原抗氧化能力(FRAP)值达166.85 mmol·L−1；见霜黄Blumea lacera和刺桐的DPPH自由基清除活性分别达75.11%和89.27%，进一步研究后确认酚类化合物是这2种野菜中最主要的生物活性物质[7]。
此外，野菜的抗氧化活性还受发育阶段和组织部位的影响。如野茭白在发芽期具有更好的抗氧化能力[37]；吊帚兰Corema album不同部位显示出不同的抗氧化活性，叶片的DPPH清除能力(38.9 μmol·g−1)最好，其次为果实、花朵和种子，ABTS自由基清除和铁还原能力的试验结果与DPPH具有很强的正相关性，根据随后进行的核磁共振氢谱(1H NMR)实验数据判断，研究者们认为大部分抗氧化能力可能与酚酸，尤其是羟基肉桂酸有关[48]。
2.3 抗癌、抗肿瘤活性
已发现一些野菜的提取物具有良好的抗癌、抗肿瘤功效，如蒲公英中的黄酮、酚酸[49-50]、萜醇[51]，桔梗Platycodon grandiflorus中的皂苷[52]等均能较好地抑制肿瘤细胞的增殖；桔梗多糖和蕨Pteridium aquilinum多糖等在促进如宫颈癌、肝癌、肠癌等肿瘤细胞凋亡方面具有良好的功效[53-54]；BILUŠIĆ等[55]研究发现：野生芦笋Asparagus acutifolius中酚类化合物(槲皮素、异鼠李素-3-O-芸香糖苷)对膀胱癌细胞(T24)和肺癌细胞(A549)具有抗增殖和促凋亡能力；OLIVEIRA等[56]报道了吊帚兰中总叶蛋白对结肠癌(HT29)细胞中MMP-2和MMP-9有抑制活性；ABU等[57]发现野生蓟Gundelia tournefortii的甲醇和己烷提取物对HCT-116癌细胞具有显著的抗肿瘤活性，并通过气质谱联用技术(GC-MS)确定了提取物中谷甾醇、豆甾醇、羽扇豆醇、α-香豆素和青蒿素等活性物质的存在；野洋葱Allium cepa甲醇提取物也在抑制人肝癌(HepG2)和肺癌(A549)细胞的增殖方面有较好的能力，并能保护正常人成纤维细胞(MRC-5)免受阿霉素(Dox)细胞毒性的影响，其作用可能归因于槲皮素和异鼠李素[58]。
2.4 抗菌活性
有研究发现苦苣菜提取物(总酚、类黄酮)对大肠埃希菌Escherichia coli，肠道沙门氏菌Salmonella enteritidis、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等有较好的抑制作用，且其抗菌活性与黄酮含量呈正相关[59]；JOSHI等[60]报道了大叶火筒树Leea macrophylla乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、弗氏志贺菌Shigella flexneri和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的抑菌效果突出，这种抗微生物活性可能与在植物化学物的积累有关，这些物质会对微生物细胞膜造成损害，从而导致其死亡；PETROPOULOS等[61]研究发现：9种菊科Asteraceae野菜提取物对抗蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium和青霉菌Penicillium有显著的抗菌活性；高宁[62]研究发现：老山芹Heracleum dissectum黄酮能够有效抑制多种菌的生长特别是革兰氏阳性菌(枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和金黄色葡萄球菌)，原因可能为革兰氏阳性菌的细胞壁结构简单，而黄酮类化合物对菌体的细胞壁及细胞膜的破坏更有效。
2.5 抗病毒活性
野菜中含有的酚类、萜类和生物碱类等多种化合物对抗病毒的研究具有重大意义。有报道金银花Lonicera japonica水提物在抑制小鼠感染登革热病毒(DENV)[63]和预防石斑鱼虹膜病毒(SGIV-Gx)感染等方面具有良好的效果[64]；鱼腥草Houttuynia cordata多糖对肠道病毒71型(EV71)、呼吸道合胞病毒(RSV)和柯萨奇病毒B3(CV-B3)等多种病毒具有一定的体外抗病毒活性，且抑制效果与多糖纯度呈正相关[65]；SONG等[66]发现甘草Glycyrrhiza uralensis根中的齐墩果烷型三萜皂苷类物质在浓度为100 μmol·L−1时对H1N1病毒有抑制活性，抑制率为47.5%~82.5%，其中甘草次酸还表现为抑制艾滋病病毒(HIV)活性的能力；YOU等[67]研究发现：香椿叶水提物可以通过下调黏附分子和趋化因子(VCAM-1, ICAM-1, E-selectin, IL-8和fractalkine)抑制病毒附着在对H1N1病毒的替代治疗和预防上可能起到重要作用。
2.6 其他活性
野菜中的活性物质对降血糖、调节免疫等也具有良好的功效。如马齿苋水提取物可诱导血清肿瘤坏死因子(TNF-α)和多效性细胞因子(IL-6)水平降低，从而促使小鼠血糖水平显著下降[68]；ZHAO等[69]报道桔梗多糖能够提高淋巴细胞增殖活性，进而增强免疫功能。
表 1 野菜生物活性成分及其功效Table 1 Bioactive components of wild edible vegetables and their efficacy功效 物质成分 野菜种类 部位 参考文献 化合物 主要物质 抗炎 萜类化合物 倍半萜烯 掌叶蜂斗菜Petasites tatewakianus 叶 [44] 生物碱类物质 儿茶酚型四氢异喹喹啉类 马齿苋Portulaca oleracea 全株 [43] 酚酸类物质 总黄酮 猴腿蹄盖蕨Athyrium multidentatum [45] 抗氧化 有机酸 抗坏血酸 马齿苋 [46] 酚酸类物质 总酚、总黄酮 见霜黄Blumea lacera、刺桐、夏枯草等 叶 [7，47] 对香豆酸、香草酸、阿魏酸和芥子酸等 野茭白Zizania latifolia 发芽种子 [37] 其他 β-胡萝卜素 马齿苋 [46] 抗癌、抗肿瘤 总蛋白提取物 吊帚兰Corema album 叶 [56] 多糖 桔梗Platycodon grandiflorus、蕨Pteridium aquilinum [53−54] 萜类化合物 萜醇 蒲公英 [51] 谷甾醇、豆甾醇和羽扇豆醇等 蓟Gundelia tournefortii [57] 酚酸类物质 槲皮素和异鼠李素-3-O-芸香糖苷等 野生芦笋Asparagus acutifolius 整株 [55] 抗菌 酚酸类物质 总酚 苦苣菜 叶 [59] 单宁、绿原酸 大叶火筒树Leea macrophylla 块根 [60] 抗病毒 多糖 鱼腥草Houttuynia cordata 整株 [65] 萜类化合物 甘草酸及其衍生物 甘草Glycyrrhiza uralensis 根 [66] 酚酸类物质 没食子酸、槲皮素和芦丁等 香椿Toona sinensis 叶 [67] 降血糖 酚酸类物质 儿茶素、绿原素、水杨酸和迷迭香酸等 马齿苋 地上部 [68] 调节免疫 多糖 桔梗 [69] 3. 常见检测分析方法与技术
如表2所示：目前野菜矿质元素测定的常见方法主要有原子吸收分光光度法、电感耦合等离子体光谱法(ICP-OES)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，其中ICP-OES和ICP-MS在微量元素或极低浓度元素的检测方面有较多应用[70-72]；脂肪酸一般通过GC-MS进行分析[24]；氨基酸组分分析和生育酚则多采用高效液相色谱法(HPLC)[11, 72]；紫外-可见分光光度法是总酚、总黄酮、多糖和类胡萝卜素等化合物常用的定量方法，但在涉及化合物结构鉴定或特定化合物分析时则一般采用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法[30, 73]；抗坏血酸的测定方法较多，其中国外发表的研究报道中以超高效液相色谱法(UPLC)和分光光度法较为多见[7, 21, 22]，国内则更多使用国标中的分光光度法和2, 6-二氯靛酚滴定法[62]；此外，有机酸基本采用UPLC和HPLC法进行分析[72, 74]。野菜中物质成分的分析和鉴定对其活性成分研究非常关键，相关的检测分析方法与技术在某种程度上限制了该领域研究的发展。总体上，相关分析方法正在往快速、痕量和精准化发展，色谱技术和光谱技术以及联用技术在未来或会得到更广泛的应用。
表 2 常见野菜营养及活性成分测定方法和技术Table 2 Methods and techniques for determination of nutrition and active components in common wild edible vegetables成分 方法和技术 野菜种类 参考文献 矿质元素 ICP-MS、ICP-OES 菊花脑Dendranthema indicum、香椿、蒲公英、马兰Kalimeris indica等 [70] 原子吸收分光光度法 皱果苋Amaranthus viridis和马齿苋等 [71，72] 脂肪酸 GC-MS 猫爪草Ranunculus ternatus [24] 氨基酸 HPLC 牛膝Achyranthes bidentata、白花败酱Patrinia villosa、鸭儿芹Cryptotaenia
japonica、马兰、白花鬼针草Bidens pilosa和马齿苋等[11，72] 总酚，类胡萝卜素，
总黄酮，多糖紫外分光光度法，
HPLC马齿苋 [30，73] 抗坏血酸 UPLC 野生莴苣Lactuca sativa [22] 分光光度法 见霜黄、印度田菁Sesbania sesban和刺苋Amaranthus spinosus等 [7，21] 2, 6-二氯靛酚滴定法 老山芹Heracleum dissectum [62] 生育酚 HPLC 马齿苋和脐景天Umbilicus rupestris等 [72，74] 有机酸 UPLC、HPLC 脐景天等 [72，74] 4. 展望
野菜作为风味独特的野生或半野生植物，由于其本身活性成分丰富，具有食用、药用和工业等开发利用价值，已逐渐成为市场的热点。野菜不仅是人们日常饮食的重要补充，亦是重要的种质资源，其多样的形态、丰富的物质组分及含量是宝贵的资源库，在蔬菜种质资源创新和育种等方面具有重要意义。中国具有丰富的野菜资源，目前研究较多的科属仅限菊科、豆科Leguminosae、禾本科Gramineae等少数，存在研究对象少、研究领域深度不足等问题，未来需要加大野菜开发范围，尤其是深加工工艺和产品开发。野菜往往具有特殊的风味和口感，其所含的氨基酸种类和脂类等与栽培蔬菜具有差异，许多野菜含有多种酚类、萜类化合物等具有抗氧化、抗炎症及抗肿瘤等功能的生物活性物质，在预防疾病、药物开发等方面具有较大潜力。但当前对野菜生物活性的研究局限在常见的代谢物质，对于一些构成野菜特殊风味的萜烯类等挥发性成分的研究还有待深入，未来需要进一步开展对野菜特殊风味形成、安全性评价和抗炎症等生物活性的研究。随着生物学研究技术和检测技术的快速发展，如物质分离提取技术和代谢组等技术应用，后续可加强对野菜中单一物质成分的分离、提取工艺和功能鉴定研究，明确其活性功能机制，筛选主要食药用成分并进行产业化开发利用，促进产业发展。
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图 2 毛竹PHTⅠ家族基因启动子区顺式作用元件位置信息
Figure 2 Location information of cis-acting regulatory elements identified in the promoter region of PHTⅠ gene family in Ph. edulis
图 3 毛竹、拟南芥和水稻PHT家族基因系统进化树
Figure 3 Phylogentic tree of PHT gene family from Ph. edulis, A. thaliana and O. sativa
表 1 毛竹PHTⅠ家族基因编码蛋白序列的理化性质
Table 1. Physicochemical properties of proteins encoded by PHTⅠ gene family in Ph. edulis
基因名称 基因登录号 氨基酸/个 理论等电点 分子量/kDa 疏水性值 脂肪族氨基酸指数 亚细胞定位 PePHT1 PH02Gene03602 696 7.63 76.37 0.269 92.56 细胞膜 PePHT2 PH02Gene11006 531 9.10 57.69 0.538 98.91 细胞膜 PePHT3 PH02Gene14509 541 9.15 59.64 0.322 95.10 细胞膜 PePHT4 PH02Gene21291 532 8.45 58.05 0.371 89.40 细胞膜 PePHT5 PH02Gene24702 536 8.71 59.02 0.321 90.80 细胞膜 PePHT6 PH02Gene37931 547 8.31 58.97 0.412 92.32 细胞膜 PePHT7 PH02Gene39948 558 8.85 60.96 0.313 93.58 细胞膜 PePHT8 PH02Gene44007 536 8.03 58.49 0.408 91.27 细胞膜 PePHT9 PH02Gene44009 574 8.60 62.35 0.449 94.79 细胞膜 PePHT10 PH02Gene48053 507 8.01 55.77 0.259 87.59 细胞膜 PePHT11 PH02Gene48969 598 9.21 59.84 0.204 83.79 细胞膜 PePHT12 PH02Gene49859 567 8.99 61.45 0.376 92.31 细胞膜 PePHT13 PH02Gene50239 554 8.95 60.55 0.329 93.92 细胞膜 PePHT14 PH02Gene21248 518 8.02 57.42 0.494 105.04 细胞膜 PePHT15 PH02Gene21249 655 6.84 71.89 0.226 90.87 细胞膜 PePHT16 PH02Gene21250 505 9.30 55.46 0.473 105.07 细胞膜 PePHT17 PH02Gene21252 432 9.24 48.61 0.348 101.83 细胞膜 PePHT18 PH02Gene47590 520 8.67 58.31 0.324 90.25 细胞膜 PePHT19 PH02Gene47591 563 8.92 62.63 0.314 94.81 细胞膜 PePHT20 PH02Gene49564 527 8.04 58.50 0.391 97.53 细胞膜 
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