下载:
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磷(phosphorus，P)是植物中脂质、核酸、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)和糖类的重要组成元素，是含量仅次于氮的第二大限制性养分[1]，在植物生长发育过程中发挥着不可替代的作用。植物吸收磷素主要以可溶性的磷酸根离子(
${\rm{PO}}_4^{3 - } $ 、${\rm{HPO}}_4^{2 - } $ 、${{\rm{H}}_2}{\rm{PO}}_4^ - $ )形式为主[2]，虽然土壤中磷素含量很高，但是可供利用的无机磷素含量较少，是导致植物缺磷的主要原因之一[3]。植物磷转运蛋白(phosphate transporter，PHT)是植物从土壤中吸收无机磷酸盐并在体内进行再分配利用的载体。磷吸收动力学研究表明：植物在进化过程中形成了2类不同的磷吸收转运系统[4]，分别为高亲和力磷吸收转运系统(high-affinity P uptake system)和低亲和力磷吸收转运系统(low-affinity P uptake system)[5]。研究者最早在拟南芥Arabidopsis thaliana中克隆出了磷转运蛋白基因AtPHT1.1，随后通过基因组测序、同源序列分析等方法陆续在大豆Glycine max[6]、玉米Zea mays[7]、大麦Triticum aestivum[8]和番茄Lycopersicon esculentum[9]等植物中克隆出了磷转运蛋白基因。植物磷酸盐转运蛋白属于MFS超级家族(major facilitator superfamily)[10]，有12个疏水的跨膜区域，蛋白质结构高度相似，在氨基酸序列中存在保守特征序列GGDYPLSATIMSE，以及保守的磷酸化位点和糖基化位点。磷转运蛋白分为4个亚家族，分别为PHTⅠ、PHTⅡ、PHTⅢ、PHTⅣ[11]。拟南芥中，AtPHT1.1、AtPHT1.2和AtPHT1.3对拟南芥吸收磷的贡献非常大，而且AtPHT1.1在长距离运转磷的过程中具有重要作用[12]。研究表明：高磷环境中OsPHT1是水稻Oryza sativa吸收和转运磷素的关键PHTⅠ成员[13]。缺磷显著诱导OsPHT2、OsPHT4、OsPHT8、OsPHT9 和OsPHT10等的表达。OsPHT8几乎在水稻的各个器官中都强烈表达，是组成型磷转运子；OsPHT8下调会使新叶磷含量下降，老叶磷含量上升，处于灌浆期的胚乳和胚中的磷含量显著下降，说明水稻OsPHT8对磷素从源到库的再分配起到至关重要的作用[14]。大豆中，GmPHT7在根际成熟丛枝菌Arbuscular mycorrhiza (AM)根的根冠小柱细胞、皮层细胞和无菌根的侧根原基细胞中表达，在衰老叶片的维管束末端少数管胞中也有表达，主要负责向种子转运再活化的磷素[15]。此外，GmPHT10和GmPHT11也会受AM诱导表达[16]，即磷酸盐转运蛋白基因广泛存在于各种植物中。毛竹Phyllostachys edulis属于禾本科Gramineae刚竹属Phyllostachys，具有经济价值高、用途广泛、栽培面积大等特点[17]。影响毛竹生长发育的因素有很多，如林地养分、水分不足[18]，粗放的抚育管理和病虫害防治不及时等[19]，其中，磷元素是限制毛竹林生长的重要营养元素之一。因此，研究毛竹磷素转运和吸收的相关基因的表达具有重要意义[20]。由于土壤对磷素的化学固定作用，磷素利用率普遍较低[21]。磷酸盐转运蛋白是植物吸收和转运磷素的重要参与者。本研究利用生物信息学方法鉴定毛竹PHTⅠ家族成员，分析其基因启动子、蛋白质理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置以及基因的组织表达特异性等，以期为深入研究毛竹PHT基因功能，探索毛竹磷素利用机制提供参考。
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拟南芥和水稻PHT基因的CDS序列、基因序列以及氨基酸序列分别下载于Tair (
https://www.arabidopsis.org )和Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.mus.edu )。在毛竹基因组数据库Bamboo GDB (http://bamboo.bamboogdb.org/ )进行BlastP、BlastN (e-value=1e−10) 比对，获取毛竹PHTⅠ同源基因的候选序列。通过SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de )和PFAM数据库(http://pfam.xfam.org )确定获取的候选序列的保守结构域的准确性和完整性，保留具有编码完整保守结构域的候选序列，并进行基因命名(PePHTs)。 -
利用ProtParam (
http://web.expasy.org/prot-param/ )获取毛竹PHTⅠ基因编码蛋白质的基本理化特性，使用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/ )在线工具分析PePHTs的基因结构，通过MEME Version 5.3.2 (http://meme-suite.org/tools/meme )获取毛竹PHTⅠ的保守基序，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )在线分析平台对PePHTs所含作用元件进行分析，在Excel软件中整理Tab结果文件, 用TBtools软件的Basic BioSequence View工具展示顺式作用元件的分布[22]，使用Plant-mPLoc算法(http://www.csbio.sjtu.edu.cn )预测毛竹PHTⅠ的亚细胞位置。 -
使用Clustal X 1.8软件对毛竹、拟南芥、水稻等PHT基因的CDS序列进行多重比对，比对结果在MEGA 7.0软件中使用邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树，bootstrap试验重复1000次[23]，其他参数设置为默认值。利用在线工具Evolview (
https://www.evolgenius.info/evolview/ )进行树图编辑[24]。 -
利用在线软件MEME Version 5.3.2 (
http://meme-suite.org/tools/meme )对毛竹PHTⅠ的motif进行预测和分析，motif数量设置为10。使用TBtools软件的Gene Location Visualize from GTF/GFF工具展示基因在染色体上的位置。使用KaKs_Calculator软件计算毛竹PHTⅠ基因的CDS序列的选择压力值(ω)[25]。 -
根据毛竹和竹笋不同组织的转录组数据[26]，用PePHTs的RPKM (reads per kilo-bases per million reads)值表示基因的表达丰度，利用TBtools制作热图展示基因的表达丰度。
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通过比对分析毛竹基因组，鉴定并确定编码完整MFs_1的候选基因共20个。植物PHT一般都含有MFs_1保守结构域，候选基因编码的蛋白质都含有保守的跨膜结构域，与MFS超家族的PHT家族特征相同。根据PHT候选基因在毛竹Scaffold中的位置以及同源基因的名称依次命名为：PePHT1~PePHT20。
对20个PHTⅠ家族基因进行生物信息学分析，其理化性质结果(表1)显示：PePHTs编码的氨基酸序列长度，最长为696 个氨基酸 (PePHT1)，最短为432 个氨基酸(PePHT17)，理论等电点为6.84~9.30，除PePHT15外，其他均为碱性蛋白质，分子量为48.61~76.37 kDa。疏水性测试显示：所有蛋白质疏水性值(grand average hydropathicity，GRAVY)＞0，说明该家族蛋白质均为疏水性蛋白质。脂肪族氨基酸指数显示：PHTⅠ家族的蛋白质热稳定性为 83.79~105.07，热稳定性差异较大。亚细胞定位结果显示：PePHTs均定位于细胞膜中。
表 1 毛竹PHTⅠ家族基因编码蛋白序列的理化性质
Table 1. Physicochemical properties of proteins encoded by PHTⅠ gene family in Ph. edulis
基因名称 基因登录号 氨基酸/个 理论等电点 分子量/kDa 疏水性值 脂肪族氨基酸指数 亚细胞定位 PePHT1 PH02Gene03602 696 7.63 76.37 0.269 92.56 细胞膜 PePHT2 PH02Gene11006 531 9.10 57.69 0.538 98.91 细胞膜 PePHT3 PH02Gene14509 541 9.15 59.64 0.322 95.10 细胞膜 PePHT4 PH02Gene21291 532 8.45 58.05 0.371 89.40 细胞膜 PePHT5 PH02Gene24702 536 8.71 59.02 0.321 90.80 细胞膜 PePHT6 PH02Gene37931 547 8.31 58.97 0.412 92.32 细胞膜 PePHT7 PH02Gene39948 558 8.85 60.96 0.313 93.58 细胞膜 PePHT8 PH02Gene44007 536 8.03 58.49 0.408 91.27 细胞膜 PePHT9 PH02Gene44009 574 8.60 62.35 0.449 94.79 细胞膜 PePHT10 PH02Gene48053 507 8.01 55.77 0.259 87.59 细胞膜 PePHT11 PH02Gene48969 598 9.21 59.84 0.204 83.79 细胞膜 PePHT12 PH02Gene49859 567 8.99 61.45 0.376 92.31 细胞膜 PePHT13 PH02Gene50239 554 8.95 60.55 0.329 93.92 细胞膜 PePHT14 PH02Gene21248 518 8.02 57.42 0.494 105.04 细胞膜 PePHT15 PH02Gene21249 655 6.84 71.89 0.226 90.87 细胞膜 PePHT16 PH02Gene21250 505 9.30 55.46 0.473 105.07 细胞膜 PePHT17 PH02Gene21252 432 9.24 48.61 0.348 101.83 细胞膜 PePHT18 PH02Gene47590 520 8.67 58.31 0.324 90.25 细胞膜 PePHT19 PH02Gene47591 563 8.92 62.63 0.314 94.81 细胞膜 PePHT20 PH02Gene49564 527 8.04 58.50 0.391 97.53 细胞膜 -
由图1可知：毛竹PHTⅠ家族基因多数含1~2个内含子(intron)，在所有PePHTs中，PePHT14内含子区域最长，PePHT8和PePHT11内含子区域最短。保守基序分析显示：PePHTs含有7~10个保守基序，分别命名为motif1~motif10。其中有6个基序高度保守，分别是motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif8，其他基序在部分序列中缺失。9个PePHTs中含有10个motif，其他11个PePHTs缺失1~3个motif，PePHT1、PePHT10都缺少motif7，PePHT11缺少motif1，PePHT12缺少motif9、motif10，PePHT14、PePHT15、PePHT16、PePHT18、PePHT19、PePHT20都缺少motif10，PePHT17则缺少motif7、motif9、motif10。PePHTs高度保守基序的氨基酸数目也不尽相同，最长的motif由50个氨基酸组成，最短的motif由29个氨基酸组成。
图 1 毛竹PHTⅠ家族基因的结构
Figure 1. Structures analysis of PHTⅠ gene family in Ph. edulis
为探究PePHTs受内在调控因子调节的情况和对外界环境的响应，选取PePHTs距离起始密码子上游2 000 bp的序列，对其所含顺式作用元件和应答元件进行分析。如图2所示：所有启动子的顺式作用元件种类比较相似，包括MYB转录因子结合的顺式作用元件，生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸等激素响应元件以及低温、干旱、缺氧、光等非生物胁迫响应元件。由此表明：PePHTs的转录表达可能会受到非生物胁迫和激素的影响。
图 2 毛竹PHTⅠ家族基因启动子区顺式作用元件位置信息
Figure 2. Location information of cis-acting regulatory elements identified in the promoter region of PHTⅠ gene family in Ph. edulis
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为了解PePHTs的进化关系，预测基因潜在功能，本研究提取20个毛竹、18个拟南芥和25个水稻的PHT基因的CDS序列进行多重序列比对，并利用MEGA 7.0软件根据邻接法构建系统进化树。由图3显示：毛竹、拟南芥和水稻的PHT基因被聚类到4个亚家族中，来自毛竹的20个PePHTs均分布在第Ⅰ亚家族的5个分支上，1个分支中只有PePHTs基因，另4个分支和水稻聚类在一起。此外，第Ⅰ亚家族中还包含9个拟南芥和12个水稻的PHT基因。PHT亚家族中的基因在功能上存在一定差异，如大多数第Ⅰ亚家族成员主要在直接接触根际环境的根毛和表皮细胞中表达，参与根系对环境中磷元素的吸收过程[27-28]，定位在细胞膜上。相比拟南芥，毛竹PHT基因均优先与水稻PHT基因聚类，推测PePHTs在功能上可能与水稻同源基因更为相似。
图 3 毛竹、拟南芥和水稻PHT家族基因系统进化树
Figure 3. Phylogentic tree of PHT gene family from Ph. edulis, A. thaliana and O. sativa
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染色体定位显示：20个毛竹PHT基因位于10条染色体上，其中23号染色体上最多，有6个，分别是PePHT14、PePHT15、PePHT16、PePHT17、PePHT18、PePHT19；其次是24号染色体，有3个，分别是PePHT10、PePHT11、PePHT20，推测这2个基因簇中的基因可能分别编码催化2种新陈代谢途径中不同步骤的磷转运酶[29]。5号、14号以及15号染色体上各有2个基因，其余染色体各有1个(图4)。除数量分布不均匀外，各基因在染色体上的分布位置也不均匀，大多数基因位于染色体的中部，少量则位于顶部和底部。适应性分析结果表明：PePHT7的ω＞0，其他基因的ω＜0，表明PePHT7受到正选择压力，其他基因受到负选择压力[30]。
图 4 毛竹PHTⅠ基因在染色体上的位置
Figure 4. Chromosomal location of PHTⅠ genes from Ph. edulis
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根据毛竹6个不同部位的转录组表达谱数据[26]，对毛竹PHTⅠ家族基因进行组织特异性表达分析。由图5可知：毛竹不同组织中的PePHTs表达丰度差异较大，其中PePHT5、PePHT7、PePHT8、PePHT12、PePHT14、PePHT19在箨鞘中大量表达；PePHT2、PePHT3、PePHT6、PePHT13、PePHT15在根中表达丰度较高；PePHT18在叶中大量表达，PePHT10、PePHT20在叶鞘中大量表达，PePHT16、PePHT17在叶和叶鞘中也有少量表达。
图 5 PePHTs在毛竹6个部位的表达
Figure 5. Expression analysis of PePHTs in 6 parts of Ph. edulis
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植物从环境中吸收磷元素的过程中，磷酸盐转运蛋白起着至关重要的载体作用。植物PHTⅠ磷酸盐转运蛋白为膜蛋白，大多数属于高亲和力转运系统，并且具有相似的蛋白质序列和化学结构。在双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中分别发现了9个[31-32]和12个PHTⅠ家族成员[6]。VERSAW等[33]证实拟南芥AtPHT2.1除了参与植物对磷元素的吸收与转运，还可能参与茎部对磷的转运，其蛋白质定位于叶绿体内膜上。PHTⅡ磷酸盐转运蛋白也在拟南芥[34]、马铃薯Solanum tuberosum [35]、茄Solanum melongena [36]、菠菜Spinacia oleracea [37]、烟草Nicotiana tabacum [38]和小麦Triticum aestivum [39]等多种植物中被发现。PHTⅢ磷酸盐转运蛋白最初在拟南芥中被克隆得到的。研究表明：PHTⅢ 磷酸盐转运家族与 PHTⅠ家族一样，通过 P/H+同向转运和P/OH−反向转运方式参与细胞质间磷的交换[39-40]。随后水稻、玉米和大豆等其他植物也克隆得到了该蛋白[41]。但是PHTⅣ磷酸盐转运蛋白只在少数几种植物中发现[42]，研究报道很少。
植物磷转运蛋白是众多转运蛋白中的一类重要蛋白家族，它们在植物的根、茎、叶、花等器官都有分布，是磷元素吸收和运转的主要载体[1]。物种中均存在PHT基因，说明该基因具有重复性和多样性，这也是基因组重新排列和扩展的结果。本研究从毛竹基因组中鉴定出20个PHTⅠ家族基因，每个成员都含有Sugar_tr和MFs_1保守结构域，这是它们具有相似功能的基础。理化性质分析显示：PHT长度、理论等电点以及分子量区间跨度较大，这有可能是因为基因进行多次复制转录后进化的结果。本研究预测了毛竹PHTⅠ基因在细胞中的位置，发现毛竹PHTⅠ基因都分布在细胞膜上，与已有研究一致[3]，说明鉴定出的毛竹PHTⅠ亚家族中的基因符合磷酸盐转运蛋白基因的特性。在植物进化过程中，选择压力能很好地体现发挥重要功能的蛋白的变化。基因适应性进化分析显示：大多数PePHTs基因受到较强烈的负选择压力，说明毛竹磷转运蛋白相对趋于稳定，是其保持原有重要功能的原因；同时PePHT7基因受到正选择压力，提示该基因编码的蛋白可能会延伸出一些新的功能[30]。植物基因组织特异性表达与基因的功能关系密切，毛竹磷转运蛋白在箨鞘、根、叶和叶鞘都有1个及以上的基因大量表达，PePHT4、PePHT9、PePHT11等3个基因在任何组织中都没有检测到，还需深入研究；PePHT1在根和鞭芽中明显下调，说明基因在不同组织中表达丰度不一样且发挥着不同的作用。
系统进化分析发现：毛竹PHTⅠ基因聚类在第Ⅰ亚家族的5个分支上，同一支中的基因可能具有相似的功能。拟南芥的PHTⅠ亚家族中有9个成员，其中AtPHT1.6在花粉中表达，其余8个在根中表达[43]；当拟南芥缺磷时，AtPHT1.1和AtPHT1.4会大量表达，这2个磷酸盐转运蛋白提供了70%的磷酸盐转运活性[44]。水稻PHTⅠ亚家族中有12个成员[6]，其中OsPHT1主要功能是吸收磷素和体内磷酸盐的再分配[13]，OsPHT2主要在地上部分表达，也是水稻PHTⅠ亚家族中唯一一个低亲和力磷转运蛋白[45]。PHTⅠ家族在水稻和拟南芥吸收和转运磷的过程中具有重要作用[32, 45]，推测在毛竹对磷的吸收转运过程中也可能具有重要作用，但需要进一步的转录组数据进行验证。
Identification and expression pattern of phosphorus transporter Ⅰ family genes of Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 鉴定毛竹Phyllostachys edulis磷转运蛋白Ⅰ (phosphate transporter 1, PHTⅠ)家族基因，分析其表达模式。 方法 利用生物信息学方法，鉴定毛竹PHTⅠ家族成员，分析基因启动子调控元件、编码蛋白的理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置、组织表达特异性、基因适应性进化及系统进化等。 结果 毛竹中共鉴定出20个PHTⅠ家族基因 (PePHTs)，分布在10条染色体上，均定位于细胞膜。每个基因都含有1~2个内含子，PePHTs启动子序列中包含干旱、低温等非生物胁迫以及赤霉素等激素类响应元件。毛竹PHTⅠ大部分为碱性蛋白质，分子量为48.61~76.37 kDa，理论等电点为6.84~9.30，疏水性值均大于0，都属于疏水蛋白。基因适应性进化分析显示：大多数PePHTs的选择压力值小于0，说明多数基因受到负选择压力。转录组表达图谱表明：PePHTs在不同组织中的表达存在差异性，说明该基因家族在毛竹生长发育过程中发挥着不同的作用。系统进化树表明：PePHTs都聚类在第Ⅰ亚家族，并且优先和水稻Oryza sativa聚类在同一支上。 结论 PHTⅠ家族在植物吸收和转运磷的过程中扮演了重要作用。本研究结果为深入研究毛竹PHTⅠ家族基因的功能奠定了理论基础。图5表1参45 Abstract:Objective This study is aimed to investigate the family members of phosphorus transporter Ⅰ (PHTⅠ) protein of Moso bamboo (Phyllostachys edulis) and analyze their expression patterns. Method With the employment of the bioinformatics, the PHTⅠ family members of Moso bamboo were identified before an analysis was conducted of the regulatory elements of gene promoters, the physicochemical properties of coding proteins, gene structure, conserved motifs of amino acids, gene positions on chromosomes, tissue expression specificity, gene adaptive evolution and phylogeny. Result PHTⅠ family of Moso bamboo consisted of 20 members distributed on ten chromosomes in the cell membrane and each gene contained 1 to 2 introns while the PePHTs promoter sequence contained elements of abiotic stress such as drought and low temperature and hormone response elements such as Gibberellic acid. Most PHTⅠ from Ph.edulis were basic proteins with the range of molecular weight of PePHTs between 48.61 and 76.37 kDa and that of the theoretical isoelectric point between 6.84 and 9.30. The hydrophobicity value of all PePHTs was greater than zero, indicating that all the proteins in this family were hydrophobic. In terms of gene adaptive evolution, the ω value of most PePHTs genes were lower than zero, indicating that most genes were under negative selection pressure. PePHTs had different expressions in different tissues, which indicated that PePHTs played different roles in the growth and development of Moso bamboo. PePHTs were clustered in the first Ⅰ subfamily, preferentially in the same branch as rice (Oryza sativa). Conclusion PHTⅠ family plays an important role in the absorption and transport of phosphorus in plants and the results of this study have provided a favorable theoretical foundation for a further analysis of the functions of the PHTⅠ family genes in Moso bamboo. [Ch, 5 fig. 1 tab. 45 ref. ] -
密码子承担着生物体内遗传信息传递的重要功能，是DNA转录与翻译、蛋白质合成与表达过程中的关键单元。在生物体共用的一套密码子中，终止密码子不编码氨基酸，甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)分别由1种密码子编码。其余59个密码子具有简并性，即1种氨基酸可由2~6个密码子对应编码，编码相同氨基酸的密码子即为同义密码子[1]。基因并非完全随机地使用同义密码子，而是存在一定的偏好性。特定的密码子偏好性是生物体长期适应性进化的结果，能够反映生物对环境的分子适应机制[2]。分析密码子偏好性及其影响因素，对生物遗传育种、进化基因组学以及系统发育学研究具有深远的意义。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco酶)是植物叶绿体基质中参与光合作用的关键酶，约占可溶性蛋白质总量的50%[3]。Rubisco酶具有催化1,5-二磷酸核酮糖(Ribulose-1,5-disphosphate, RuBP)与二氧化碳(CO2)羧化反应和光呼吸中RuBP与氧气(O2)加氧反应的双重活性，对净光合率有决定性影响[4]。Rubisco酶由8个大亚基(催化亚基)和8个小亚基(调节亚基)组成，前者是固定CO2的活性位点和催化位点，由叶绿体基因组大单拷贝区的rbcL基因编码[5-6]。环境的变化会导致rbcL基因产生适应性进化，从而影响植物光合效率[7]。因此，研究rbcL基因的密码子使用模式有利于理解高等植物对环境的适应机制。千屈菜科Lythraceae包括许多重要的园林植物，具有重要的观赏价值和经济价值[8]。目前，rbcL基因在千屈菜科中的研究应用仅局限于系统发育[9-10]，对于该科密码子使用偏好性的相关研究尚未见报道。本研究选取了千屈菜科具有代表性的10属20种植物，分析rbcL基因的碱基组成、密码子使用偏好性及其影响因素，并与模式物种进行比较，为该科物种rbcL基因异源高效表达提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 基因序列和密码子使用频率数据获取
20条rbcL基因全长编码区序列(CDS)数据来源于美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，详见表1。
表 1 20种千屈菜科植物rbcL基因信息Table 1 Information of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 GenBank登录号 CDS位置 物种 GenBank登录号 CDS位置 萼距花 Cuphea hyssopifolia MN833211 58955~60382 南洋紫薇 Lagerstroemia siamica MK881628 55129~56556 八宝树 Duabanga grandiflora MK881638 56823~58250 绒毛紫薇 Lagerstroemia tomentosa MK881632 54873~56300 黄薇 Heimia myrtifolia MG921615 58612~60039 西双紫薇 Lagerstroemia venusta MK881630 55159~56586 副萼紫薇 Lagerstroemia calyculata MK881636 54873~56300 散沫花 Lawsonia inermis MK881631 58836~60263 川黔紫薇 Lagerstroemia excelsa MK881635 54910~56337 千屈菜 Lythrum salicaria MK881629 59099~60526 屋久岛紫薇 Lagerstroemia fauriei NC_029808 54810~56237 石榴 Punica granatum NC_035240 59017~60444 多花紫薇 Lagerstroemia floribunda NC_031825 54776~56203 圆叶节节菜 Rotala rotundifolia MK881626 58835~60262 桂林紫薇 Lagerstroemia guilinensis NC_029885 54697~56124 细果野菱 Trapa maximowiczii NC_037023 58322~59770 云南紫薇 Lagerstroemia intermedia NC_034662 54948~56375 欧菱 Trapa natans MK881634 58387~59814 福建紫薇 Lagerstroemia limii MK881627 54830~56257 虾子花 Woodfordia fruticosa MK881637 59444~60871 1.2 CDS碱基组成和密码子使用偏好性参数统计
通过CodonW 1.4.4软件和在线工具EMBOSS explorer(http://emboss.toulouse.inra.fr./)中的CUSP和CHIPS程序，统计rbcL基因密码子末端各类型碱基含量(A3s、T3s、C3s和T3s)、GC总含量(GC)、密码子各位点GC含量(GC1s、GC2s和GC3s)、有效密码子数(ENC)和密码子适应指数(CAI)。利用SPSS 22.0软件，选用皮尔森相关系数评估碱基组成和密码子偏好性相关显著水平[11]。
1.3 同义密码子相对使用度统计与分析
同义密码子相对使用度(RSCU)是同义密码子的实际使用频次与无使用偏好性时期望频次的比率，去除了碱基成分对密码子使用产生的影响。RSCU＞1，表示该密码子在同义密码子中使用相对较多；RSCU=1，表示该密码子在同义密码子中使用无偏好性；RSCU＜1表示该密码子在同义密码子中使用相对较少[12]。通过CodonW 1.4.4软件计算千屈菜科植物的RSCU，并利用TBtools 0.6软件绘图。
1.4 ENC绘图分析
以GC3s和ENC为横、纵坐标，通过Origin 9.1绘制ENC-GC3s散点图。标准曲线为ENC期望值，即NENC=2+MGC3s+29/[MGC3s2+(1−MGC3s)2]，其中NENC表示有效密码子数，MGC3s表示密码子第3位碱基平均GC含量，该公式的成立表示密码子的偏好性仅受突变压力约束[13]，此条件下，散点应位于标准曲线上部或紧贴标准曲线下部；当散点分布于曲线下方较远距离的区域时，表明除突变压力作用外，选择压力对偏好性产生主要影响。
1.5 中性绘图分析
以GC3s为横坐标，密码子第1、2位点GC含量平均值(GC12)为纵坐标，利用Origin 9.1绘制散点图并做线性回归分析，分析密码子不同位点碱基组成差异性[14]。当回归曲线斜率趋近1时，密码子各位点碱基成分差异不大，偏好性主要受到突变的影响；当斜率趋近0时，密码子第3位点和第1、2位点碱基变异模式差异较大，偏好性主要受到选择压力影响。
1.6 奇偶偏差(PR2)分析
奇偶偏差分析可评估密码子第3位点嘌呤和嘧啶组成偏差对密码子使用偏好性的影响[15]。以G3s/(G3s+C3s)和A3s/(A3s+T3s)为横、纵坐标，利用Origin 9.1绘制奇偶偏差图，交点(0.50, 0.50)表示无碱基突变和选择压力下，A=T且G=C。
1.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
参照巫伟峰等[16]方法，以59个密码子(去除AUG、UGG和3个终止密码子UAA、UAG、UGA)的RSCU为变量，20条CDS为个体，通过SPSS进行系统聚类，类间距离为组内联接法，基因间距离为平方欧式距离。分别利用DAMBE 5.2.73和MEGA-X软件对CDS进行碱基替换饱和度检测和总体平均距离(d)计算，同时满足替换饱和度指数(Iss)小于饱和度标准指数(Iss.c)，即Iss＜Iss.c，表明碱基替换未饱和，且P=0.000和0＜d＜1后，通过MEGA-X软件邻接法(NJ)构建系统发生树，重复1 000次。
1.8 密码子使用频率比较分析
密码子相对使用频率比值是评估不同生物密码子使用偏好性差异程度的重要参数。当比值为0.5~2.0时，认为物种密码子偏好性差异较小[17]。拟南芥Arabidopsis thaliana、烟草Nicotiana tabacum、番茄Solanum lycopersicum、大肠埃希菌Escherichia coli和酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组密码子使用频率来源于密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。千屈菜科物种整体密码子平均使用频率通过EMBOSS explorer中CUSP计算获得[18]。利用Origin 9.1进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 rbcL基因碱基组成和密码子使用偏好性
从表2可见：GC含量为0.425~0.437，平均为0.431。结合密码子各位点GC含量(GC1s为0.567~0.582，平均0.573；GC2s为0.429~0.437，平均0.432；GC3s为0.275~0.300，平均0.288)，表明rbcL基因CDS在组成上更倾向于使用A/T碱基。第3位点各类型碱基含量从大到小依次为T3s、A3s、C3s、G3s，表明rbcL基因更偏向于使用A/T碱基结尾的密码子。
表 2 20种千屈菜科植物rbcL基因碱基组成和密码子使用特性Table 2 Base composition and codon usage characteristics of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 A3s T3s G3s C3s GC GC1s GC2s GC3s CAI ENC 萼距花 0.376 0.531 0.157 0.173 0.435 0.582 0.437 0.286 0.276 45.392 八宝树 0.380 0.526 0.152 0.180 0.431 0.571 0.433 0.288 0.278 45.942 黄薇 0.390 0.508 0.145 0.194 0.434 0.571 0.433 0.296 0.283 46.540 副萼紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 川黔紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 屋久岛紫薇 0.379 0.529 0.146 0.184 0.431 0.571 0.431 0.290 0.272 45.659 多花紫薇 0.378 0.526 0.148 0.184 0.432 0.576 0.429 0.292 0.276 45.625 桂林紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 云南紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 福建紫薇 0.379 0.531 0.142 0.184 0.430 0.571 0.431 0.288 0.274 45.564 南洋紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 绒毛紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 西双紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 散沫花 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 千屈菜 0.389 0.535 0.138 0.173 0.428 0.576 0.433 0.275 0.285 45.007 石榴 0.381 0.518 0.153 0.184 0.436 0.578 0.437 0.294 0.275 46.153 圆叶节节菜 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 细果野菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.425 0.567 0.431 0.277 0.274 44.181 欧菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.426 0.569 0.431 0.277 0.274 44.029 虾子花 0.376 0.516 0.163 0.184 0.437 0.576 0.435 0.300 0.270 46.458 ENC和CAI是衡量密码子使用偏好性程度的主要指标。ENC从20(氨基酸只由1种同义密码子编码)至61(同义密码子的使用没有偏好性)，越接近20偏好性越强。一般认为，ENC＜35表示密码子的使用偏好性较强[19]。20种千屈菜科植物ENC为44.029~46.540，平均45.493，分布范围较小且均远大于35，表明rbcL基因整体偏好性不强。CAI取值0~1，越接近1密码子偏好性越强[20]。20种植物CAI为0.270~0.285，平均0.276，同样说明偏好性强度不大。一般情况下，基因的密码子使用偏好性越强，在生物体内的表达水平越高[21]，可推测rbcL基因在千屈菜科植物中表达水平较低。
2.2 rbcL基因同义密码子相对使用度分析
图1显示：在25个高频密码子(RSCU＞1)中，23个以A/U结尾，仅2个由C(AUC和AGC)结尾。其中RSCU最高的5个密码子(RSCU＞2)末尾均为U碱基，表明rbcL基因CDS对于末端A/U(T)密码子具有的使用偏好性。
2.3 密码子碱基组成和使用偏好相关分析
相关分析(表3)表明：ENC和GC、GC3s在0.01水平上显著相关(Pearson相关系数分别为0.855和0.856)，表明碱基组成，尤其是密码子第3位点碱基类型对千屈菜科rbcL基因的密码子偏好性有明显影响。GC3s和GC12相关不显著，说明不同位点组成上关联不大，碱基变异模式存在差异，rbcL基因较保守，突变偏性较小。
表 3 碱基组成与密码子使用偏好相关性Table 3 Correlation between base composition and codon usage bias参数 CAI ENC GC GC1s GC2s GC3s ENC 0.062 GC − 0.136 0.855** GC1s 0.138 0.403 0.712** GC2s 0.029 0.229 0.348 0.314 GC3s − 0.264 0.856** 0.846** 0.324 − 0.074 GC12 0.112 0.403 0.684** 0.869** 0.743** 0.190 说明：**表示在0.01水平上显著相关(双尾) 2.4 ENC绘图分析
图2显示了rbcL基因ENC和GC3s的关系。所有散点分布在标准曲线下方一定距离处，表明千屈菜科植物rbcL基因的密码子偏好性除了受到碱基突变压力外，更主要受自然选择压力的约束；散点集中分布在较小范围内说明自然选择压力强度相近。
2.5 中性绘图分析
中性分析结果(图3)显示：所有散点均落在直线y=x(GC12)上方。GC3s与GC12的回归曲线(斜率为0.069 4，R2=0.036 1)近似平行于X轴，表明千屈菜科植物rbcL基因密码子第1、2位点与第3位点碱基类型相差较大。结合表3，GC3s与GC12相关性较低(Pearson相关系数为0.190)，说明碱基突变对于密码子第3位点的作用比第1、2位点弱，密码子偏好性主要受自然选择压力的作用，受突变压力的影响则较小。
2.6 奇偶偏差(PR2)分析
图4显示：当密码子偏好性只受碱基突变影响时，密码子第3位点上嘌呤和嘧啶含量应相同，即A3s=T3s或C3s=G3s[22]。所有散点均明显偏离交点(0.50, 0.50)，且都分布在左下象限[G3s/(G3s+C3s)＜0.5，A3s/(A3s+T3s)＜0.5]，密码子第3位点上嘧啶含量高于嘌呤[(A3s+G3s)＜(T3s+C3s)]。4种碱基在密码子第3位点上分布不均匀，说明相较于碱基突变压力，自然选择压力对rbcL密码子偏好性有更强的影响。
2.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
20条CDS碱基替换未饱和(Iss=0.025 3，Iss.c=0.785 2，P=0.000)，总体平均遗传距离为0.2。系统聚类树状图和邻接树均将20种千屈菜科植物聚成了4~5个支系(图5)，说明不同支系的植物密码子使用特性存在一定区别。虽然两者在部分支系的内部结构上存在较大矛盾，但在支系水平(属)上，两者对10个紫薇属Lagerstroemia植物、散沫花和圆叶节节菜以及2个菱属Trapa植物之间的聚类结果相对一致，说明基于密码子RSCU的系统聚类能在某种程度上反映千屈菜科植物属间水平的亲缘关系，即不同植物密码子的使用偏好性与亲缘关系存在局部对应。
图 5 基于rbcL基因CDS的邻接树(左)和基于59个密码子RSCU的聚类树状图(右)Figure 5 NJ tree based on CDS of rbcL genes (left) and cluster dendrogram based on RSCU of 59 codons (right)2.8 千屈菜科植物与模式物种密码子使用频率比较分析
从图6可以看出：与千屈菜科植物rbcL基因密码子平均使用频率相比，大肠埃希菌有28个密码子相差较大，最大值5.76(AGA)；酵母有26个密码子相差较大，最大值4.33(CGU)，说明酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因异源表达的受体。拟南芥、烟草和番茄分别存在20、19和17个使用频率相差较大的密码子，且最大值均出现在CGU，初步说明相较于拟南芥和烟草，番茄更适合作为千屈菜科植物rbcL基因遗传转化的受体。
图 6 千屈菜科植物与模式生物密码子使用频率比值Figure 6 Ratios of codon usage frequency of Lythraceae species to model organisms3. 结论与讨论
特定的密码子使用偏好性是生物对环境变化适应性的体现，不同物种、不同功能基因的密码子偏好性存在明显差异。大部分双子叶植物密码子偏好A/T碱基结尾，单子叶植物则偏好G/C结尾[23]，与本研究中千屈菜科植物rbcL基因密码子A3s+T3s远远大于G3s+C3s的偏好性结果一致。李国灵等[13]对红藻门Rhodophyta植物rbcL基因密码子偏好性研究也得到了类似结果，虽然红藻科和千屈菜科植物生活型、生理特性等相差较大，但千屈菜科也包括许多水生或湿生植物。两者研究结果显示：植物从水生向陆生过渡过程中，rbcL基因密码子使用偏好性的变化可能较为稳定，这也许是rbcL基因受到强烈自然选择作用的结果。生物体内高表达的基因，其密码子偏好性也相对较强，反之亦然[24]。千屈菜科植物rbcL基因ENC较高，CAI较低，说明千屈菜科植物rbcL基因整体的密码子使用偏好性不强，在植物体内表达水平也不高。但仍存在CGU、CCU、ACU等13个偏好性相对较强的密码子(RSCU＞1.5)，其在氨基酸中残基含量也相对丰富。
密码子使用偏好性的影响因素包括碱基组成、突变、自然选择、漂变、基因长度、tRNA丰度以及基因表达水平的高低等，但最主要的压力来自于突变和自然选择[25]。本研究中，千屈菜科植物rbcL基因GC3s和GC、ENC的相关性显著，表明密码子偏好性在一定程度上受到了碱基组成的影响，之前的研究也证明GC3s和GC含量之间存在明显的线性关系[26]。但GC3s与GC12相关程度较低，且GC3s集中分布在0.275~0.300内，KAWABE等[23]研究表明：密码子使用偏好性主要受自然选择的影响，而碱基突变的影响则较小，ENC分析、中性分析、奇偶偏差分析也得出相同的结论。这可能是由于rbcL基因本身为叶绿体基因，分子进化速率相较于核基因更慢，且编码的二磷酸核酮糖羧化酶是参与光合作用的关键蛋白，相对比较保守，所以突变压力对其密码子使用偏好性的作用相对较弱；而正选择、协同进化等作用在陆生植物的rbcL基因中被证明广泛存在，也表明rbcL基因密码子使用偏好性可能广泛受到选择约束[27-28]。
与RSCU聚类分析结果相比，基于CDS的邻接树在理论上更接近真实的物种系统发育关系。两者相对一致的部分说明千屈菜科植物rbcL基因密码子使用特性与属间亲缘关系存在一定程度的对应；两者之间较为矛盾的分支可能是系统聚类仅选取单一RSCU数据分析导致的，结合密码子偏好性的其他参数，或许能获得更加一致的结果。由于单基因建树也可能会受到旁系同源基因干扰、水平基因转移等多种因素影响产生误差[29]，因此基于密码子偏好性的聚类分析也可对系统发生的研究内容进行一定补充。
转基因过程中，选择密码子使用偏好性相近的物种作为异源表达受体，有利于外源基因的高效表达[30]。千屈菜科植物多数都是木本植物，遗传转化体系尚未成熟，由于受限于同源物种生活史长、生长速度慢等因素，其基因功能研究十分依赖模式物种。通过与模式物种密码子使用频率的初步比较，酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因的异源表达受体；与拟南芥、烟草相比，番茄的密码子使用频率与千屈菜科植物rbcL基因差异性最小，更适合作为rbcL基因功能验证的理想受体材料。但相对于番茄，拟南芥和烟草遗传转化体系建立相对较早，发展较为完善，已实现了多种木本植物叶绿体基因的遗传转化，积累的技术经验较多，遗传转化的难度也相对较小[31]。在观赏植物研究中，番茄更多作为植物呈色相关基因的遗传转化受体，验证其在色素积累与代谢中的调控作用[32]。因此，密码子使用频率的比较结果仅能为千屈菜科植物rbcL基因异源表达受体选择提供初步的预测，受限于该科木本植物当前采样难度较大，且遗传转化体系尚未成熟建立等因素，最适的异源表达受体仍须在进一步的实验中进行深入研究和严格筛选。
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图 2 毛竹PHTⅠ家族基因启动子区顺式作用元件位置信息
Figure 2 Location information of cis-acting regulatory elements identified in the promoter region of PHTⅠ gene family in Ph. edulis
图 3 毛竹、拟南芥和水稻PHT家族基因系统进化树
Figure 3 Phylogentic tree of PHT gene family from Ph. edulis, A. thaliana and O. sativa
表 1 毛竹PHTⅠ家族基因编码蛋白序列的理化性质
Table 1. Physicochemical properties of proteins encoded by PHTⅠ gene family in Ph. edulis
基因名称 基因登录号 氨基酸/个 理论等电点 分子量/kDa 疏水性值 脂肪族氨基酸指数 亚细胞定位 PePHT1 PH02Gene03602 696 7.63 76.37 0.269 92.56 细胞膜 PePHT2 PH02Gene11006 531 9.10 57.69 0.538 98.91 细胞膜 PePHT3 PH02Gene14509 541 9.15 59.64 0.322 95.10 细胞膜 PePHT4 PH02Gene21291 532 8.45 58.05 0.371 89.40 细胞膜 PePHT5 PH02Gene24702 536 8.71 59.02 0.321 90.80 细胞膜 PePHT6 PH02Gene37931 547 8.31 58.97 0.412 92.32 细胞膜 PePHT7 PH02Gene39948 558 8.85 60.96 0.313 93.58 细胞膜 PePHT8 PH02Gene44007 536 8.03 58.49 0.408 91.27 细胞膜 PePHT9 PH02Gene44009 574 8.60 62.35 0.449 94.79 细胞膜 PePHT10 PH02Gene48053 507 8.01 55.77 0.259 87.59 细胞膜 PePHT11 PH02Gene48969 598 9.21 59.84 0.204 83.79 细胞膜 PePHT12 PH02Gene49859 567 8.99 61.45 0.376 92.31 细胞膜 PePHT13 PH02Gene50239 554 8.95 60.55 0.329 93.92 细胞膜 PePHT14 PH02Gene21248 518 8.02 57.42 0.494 105.04 细胞膜 PePHT15 PH02Gene21249 655 6.84 71.89 0.226 90.87 细胞膜 PePHT16 PH02Gene21250 505 9.30 55.46 0.473 105.07 细胞膜 PePHT17 PH02Gene21252 432 9.24 48.61 0.348 101.83 细胞膜 PePHT18 PH02Gene47590 520 8.67 58.31 0.324 90.25 细胞膜 PePHT19 PH02Gene47591 563 8.92 62.63 0.314 94.81 细胞膜 PePHT20 PH02Gene49564 527 8.04 58.50 0.391 97.53 细胞膜 
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