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板栗Castanea mollissima是著名的木本粮食和干果树种[1]，果实风味独特，营养物质丰富[2−3]，不与粮食作物争耕地，有“千果之王”和“铁杆庄稼”之誉[4]。板栗适应性强，是中国重要的经济林树种[5]，中国板栗栽培总面积与产量稳居世界第一[6]。板栗花为风媒花，雌雄花同株[7]，自花授粉结实率低，空苞率高[8−9]，不同品种间授粉的亲和力也存在较大差异[10−11]。分别以河北迁西[12−13]、河北燕山[14]、广西隆安[15]、云南峨山和永仁[16]的板栗品种为试材，根据花期相遇情况，开展品种授粉配置试验，测定各组合的结实率和果实综合性状，筛选出了一批优良的授粉组合。湖北罗田县作为中国板栗的源生地，也是中国南方板栗主产区的中心[17−18]，尚没有明确的品种授粉配置，单一品种种植和品种随意混植，严重影响了罗田县板栗良种的经济效益。因此，本研究以湖北省罗田县栽培的6个板栗品种为研究对象，根据品种间和品种内的花期相遇情况，选配授粉组合，开展授粉试验，对不同授粉组合的授粉结实性和果实性状进行测定分析，筛选高产优质的授粉组合，创新板栗良种的授粉配置栽培，以期为板栗良种的优质丰产栽培提供科学依据。
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本研究在罗田县国家板栗良种基地进行。该基地位于湖北省罗田县骆驼坳镇赵家湾村，海拔150 m，年均气温为16.4 ℃，无霜期为240 d，日照时数为2 047 h，年降水量为1 230~1 600 mm。板栗林的株行距为5 m×5 m，树高4~7 m，树体健壮，长势良好，处于盛产期，进行常规管理。
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共6个品种。其中，‘浅刺大板栗’‘Qiancidabanli’引自湖北省京山市，‘桂花香’‘Guihuaxiang’、‘八月红’‘Bayuehong’、‘六月暴’‘Liuyuebao’、‘乌壳栗’‘Wukeli’和‘玫瑰红’‘Meiguihong’为罗田县本地品种。分别用浅、桂、八、六、乌、玫代表这6个品种。
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授粉组合见表1。根据品种间的雌、雄花花期相遇情况设计授粉组合，开展授粉试验，即选择授粉品种的雄花盛花期与被授粉品种的雌花盛花期相遇天数≥3 d的授粉组合，并设置品种内自交作为对照。授粉试验于2022年5月中下旬进行，采取人工授粉方式，进行品种内自交和品种间异交授粉。每个组合授粉150朵花，3次重复，每重复50朵。其中，品种间异交16个组合2 400朵花；品种内自交6个组合900朵花。共22个组合3 300朵花。
表 1 授粉组合设计
Table 1. Design of pollination combination
母本
(♀)父本(♂) 桂 八 六 乌 玫 浅 桂 √ √ √ − − − 八 √ √ √ − − − 六 √ √ √ − − − 乌 √ √ √ √ √ √ 玫 − − − √ √ √ 浅 √ − − √ √ √ 说明：√表示雌雄花盛花期相遇天数≥3 d，进行授粉实验；−表示雌雄花盛花期相遇天数＜3 d，不进行授粉试验。 -
在雌花柱头分叉前，将雌花附近的雄花序去除干净，用硫酸纸袋套住雌花，金属丝扎紧套袋口，防止外来花粉干扰；收集新鲜花粉，在雌花柱头分叉为30°~45°时，去掉套袋，将充分干燥的花粉涂在雌花的柱头上，轻轻涂抹3~4次，之后立即套袋。待所有板栗品种的雄花落尽后，解除套袋。
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2022年9月上中旬，板栗果实成熟时，采集所有刺苞，统计不同授粉组合的结实率、空苞率和成果率。计算公式如下：结实率=座苞数/授粉雌花数×100%；空苞率=无坚果刺苞数/座苞数×100%；成果率=有坚果刺苞数/授粉雌花数×100%。
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①刺苞性状：每个授粉组合随机取30个实蓬的刺苞，用游标卡尺测定刺苞的横径、纵径和高度。用电子天平称量刺苞质量和每个刺苞内的坚果总质量，记录每个刺苞中的坚果个数。按以下公式计算出籽率：出籽率=每个刺苞内的坚果总质量/刺苞质量×100%。②坚果性状：每个授粉组合随机取30个坚果，用电子天平测定坚果质量和种仁质量。依据以下公式计算出仁率：出仁率=种仁质量/坚果质量×100%。③种仁营养物质：采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》第一法测定蛋白质；采用GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第一法测定脂肪；采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉。各组合每个指标3个重复。
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应用 Excel 和 SPSS 进行数据统计分析。其中，百分数进行方差分析时，先进行反正弦转换；多重比较分析采用 Duncan 检验。
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由图1可见：自交结实率较低，异交显著提高了结实率。以‘桂花香’为母本的3个组合结实率为60.40%~70.16%，其中，‘八月红’为父本授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)；以‘八月红’为母本的3个组合结实率为70.67%~78.02%，其中，‘六月暴’为父本授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)；以‘六月暴’为母本的3个组合的结实率为55.78%~70.62%，其中，‘八月红’为父本授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本的6个组合的结实率为61.33%~82.26%，其中‘玫瑰红’授粉最高，‘八月红’授粉最低；‘玫瑰红’为母本的3个组合的结实率为60.70%~71.48%，‘浅刺大板栗’授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)，相差10.78%；‘浅刺大板栗’为母本的4个组合的结实率在58.03%~77.63%，‘桂花香’授粉最高，‘玫瑰红’授粉最低，两者差异显著(P＜0.05)，相差19.60%。
图 1 不同组合的结实率
Figure 1. Fruiting rates of different pollination combinations
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由图2可见：自交空苞率较高，除‘乌壳栗’外，各品种的自交空苞率均高于异交。‘桂花香’为母本的3个组合空苞率为24.33%~39.72%，‘八月红’授粉最低，自交最高；‘八月红’为母本的3个组合空苞率为18.71%~32.09%，‘六月暴’授粉显著降低了空苞率；‘六月暴’为母本的3个组合空苞率为33.11%~45.72%，异交显著降低了空苞率(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本的6个授粉组合空苞率为10.30%~36.71%，‘六月暴’授粉显著降低了空苞率(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本的3个授粉组合空苞率为17.73%~37.25%，异交显著降低了空苞率(P＜0.05)；‘浅刺大板栗’为母本的4个授粉组合空苞率为10.38%~18.00%，‘桂花香’授粉显著降低了空苞率(P＜0.05)。
图 2 不同组合的空苞率
Figure 2. Empty bract rates of different pollination combinations
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自交成果率较低，除‘乌壳栗’外，各品种的自交成果率均低于50.00%。异交显著提高了成果率(P＜0.05)。各组合的成果率详见图3。‘桂花香’为母本的3个组合成果率为36.21%~53.09%，‘八月红’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)；‘八月红’为母本的3个组合成果率为48.14%~63.48%，‘六月暴’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)；‘六月暴’为母本的3个授粉组合成果率为30.42%~47.28%，异交显著提高了成果率(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本的6个授粉组合成果率为51.34%~70.76%，‘六月暴’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本的3个授粉组合成果率为38.11%~58.89%，‘浅刺大板栗’授粉的成果率最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)，相差20.78%；‘浅刺大板栗’为母本的4个授粉组合成果率为48.54%~69.56%，‘桂花香’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)。
图 3 不同组合的成果率
Figure 3. Final fruit rates of different pollination combinations
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由表2可知：授粉品种对同母本的刺苞质量、刺苞横径、刺苞纵径、刺苞高、每刺苞坚果数、出籽率等性状具有显著影响(P＜0.05)。‘桂花香’为母本时，异交显著提高了刺苞横径、每刺苞坚果数和出籽率(P＜0.05)，‘六月暴’授粉显著提高了刺苞质量(P＜0.05)；‘八月红’为母本时，‘桂花香’授粉的每刺苞坚果数显著大于自交，刺苞质量显著小于自交(P＜0.05)；‘六月暴’为母本时，自交的刺苞质量和每刺苞坚果数显著大于异交(P＜0.05)，‘八月红’授粉显著降低了出籽率(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本时，‘桂花香’授粉的每刺苞坚果数显著大于自交(P＜0.05)，‘六月暴’和‘玫瑰红’授粉的出籽率显著低于自交(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本时，异交显著提高了每刺苞坚果数和刺苞横径(P＜0.05)，‘乌壳栗’授粉的刺苞质量显著大于自交(P＜0.05)；‘浅刺大板栗’为母本时，‘玫瑰红’授粉的刺苞质量显著大于自交(P＜0.05)。
表 2 不同授粉组合的主要刺苞性状
Table 2. Main bracts characters of different pollination combinations
母本(♀) 父本(♂) 质量/g 横径/mm 纵径/mm 高/mm 每刺苞坚果数 出籽率/% 桂 桂 44.03±1.79 b 68.71±1.24 c 61.23±0.95 b 57.64±0.70 a 1.17±0.07 c 31.84±0.40 c 八 47.67±1.40 b 75.68±0.72 b 63.65±1.22 b 54.26±0.65 b 2.37±0.03 a 43.44±0.46 a 六 59.72±0.98 a 79.34±0.58 a 67.89±0.76 a 59.54±0.32 a 1.93±0.03 b 36.48±1.80 b 八 桂 56.65±0.78 b 81.62±0.45 a 71.39±0.62 a 65.47±0.97 a 2.26±0.20 a 39.27±1.51 a 八 66.59±0.91 a 84.00±0.93 a 73.35±0.41 a 64.44±0.27 a 1.65±0.04 b 41.35±0.18 a 六 58.28±2.12 ab 81.78±1.03 a 71.05±1.40 a 65.90±1.37 a 2.18±0.16 ab 38.17±1.65 a 六 桂 73.32±2.60 b 92.63±1.35 ab 77.13±1.61 a 69.47±1.16 a 1.66±0.04 b 33.74±0.77 a 八 62.74±1.28 c 88.75±1.09 b 74.06±1.00 a 63.83±1.07 b 1.46±0.05 c 28.55±1.07 b 六 80.21±0.75 a 93.70±1.08 a 77.70±1.24 a 66.98±0.66 ab 1.91±0.04 a 35.73±1.51 a 乌 桂 70.66±0.93 a 85.53±0.47 a 70.84±0.36 a 62.32±0.67 a 2.82±0.04 a 37.61±0.69 abc 八 58.61±2.45 bc 78.13±1.13 c 68.25±1.43 a 60.23±0.73 ab 2.59±0.14 ab 41.70±0.77 a 六 61.00±4.99 abc 69.81±1.67 b 57.46±1.76 b 57.26±1.46 abc 2.16±0.04 c 33.72±0.17 c 乌 62.82±2.98 abc 81.4±2.39 ab 70.31±1.89 a 60.79±1.24 ab 2.33±0.13 bc 39.39±1.96 ab 玫 66.19±2.00 ab 70.59±1.46 c 58.16±2.52 b 55.34±1.82 bc 2.31±0.12 bc 34.85±1.70 c 浅 52.74±3.17 c 65.19±2.12 c 57.94±2.43 b 53.32±2.65 c 2.38±0.08 bc 36.46±1.39 bc 玫 乌 65.42±1.55 a 82.72±1.04 a 70.89±1.85 a 60.92±0.17 a 2.61±0.09 a 43.83±0.75 a 玫 56.21±1.77 b 79.12±0.20 b 66.37±0.73 a 60.15±0.77 a 2.27±0.12 b 44.85±0.36 a 浅 62.15±2.54 ab 83.99±0.97 a 70.79±0.92 a 61.49±0.53 a 2.60±0.10 a 44.51±0.33 a 浅 桂 54.56±2.29 ab 75.14±2.17 a 65.00±1.03 a 64.23±1.11 a 1.67±0.10 a 43.62±1.27 a 乌 59.96±2.86 ab 78.38±0.76 a 65.08±0.68 a 64.82±1.45 a 1.95±0.28 a 48.86±2.45 a 玫 62.29±2.77 a 76.85±0.32 a 63.81±1.04 a 62.16±0.75 a 2.06±0.06 a 51.10±3.19 a 浅 51.94±1.69 b 76.58±0.70 a 63.86±0.23 a 62.93±0.25 a 2.05±0.15 a 50.62±2.12 a 说明：数值为均值±标准误。不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 -
由表3可知：授粉品种对同母本的坚果质量、仁质量、出仁率具有显著影响(P＜0.05)。‘桂花香’为母本时，‘八月红’授粉的仁质量显著小于自交(P＜0.05)，相差2.54 g；‘八月红’为母本时，‘桂花香’授粉显著减小了坚果质量和仁质量(P＜0.05)；‘六月暴’为母本时，‘八月红’授粉显著减小了坚果质量(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本时，‘六月暴’和‘玫瑰红’授粉的坚果质量显著大于‘浅刺大板栗’授粉，‘六月暴’授粉的仁质量显著大于‘浅刺大板栗’授粉(P＜0.05)，‘桂花香’和‘八月红’授粉的出仁率显著大于‘玫瑰红’授粉(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本时，‘乌壳栗’授粉的坚果质量显著大于‘浅刺大板栗’授粉，‘浅刺大板栗’授粉显著降低了仁质量和出仁率(P＜0.05)；‘浅刺大板栗’为母本时，‘乌壳栗’和‘玫瑰红’授粉的坚果质量显著大于自交，异交显著提高了仁质量(P＜0.05)。
表 3 不同授粉组合的主要坚果性状和种仁营养物质质量分数
Table 3. Main nuts characters and nutrient contents in kernel of different pollination combinations
母本(♀) 父本(♂) 坚果质量/g 仁质量/g 出仁率/％ 蛋白质质量
分数/%可溶性糖质量
分数/%淀粉质量
分数/%脂肪质量
分数/%桂 桂 11.71±0.19 a 9.82±0.22 a 83.67±0.67 a 6.52±0.02 ab 10.84±0.48 a 65.50±1.24 ab 2.18±0.07 a 八 9.58±0.88 a 7.28±0.16 b 81.00±1.16 a 6.60±0.18 a 12.53±0.49 a 64.32±0.45 b 2.33±0.07 a 六 9.87±0.67 a 8.91±0.42 a 81.69±0.15 a 6.12±0.12 b 10.69±0.68 a 69.57±1.52 a 2.17±0.15 a 八 桂 10.34±0.52 b 8.61±0.31 b 83.38±1.34 a 6.65±0.11 a 10.44±0.50 a 58.91±0.54 b 1.87±0.19 a 八 13.10±1.44 a 11.03±0.74 a 84.13±0.60 a 5.60±0.04 b 10.39±0.15 a 60.38±2.43 ab 2.23±0.20 a 六 12.65±0.71 a 10.80±021 a 85.41±1.38 a 6.56±0.08 a 10.24±0.21 a 67.24±2.17 a 2.17±0.13 a 六 桂 15.22±0.49 a 12.67±1.43 a 82.94±5.24 a 7.56±0.19 a 11.70±0.41 a 51.81±1.47 b 2.47±0.09 a 八 11.79±0.66 b 9.46±0.59 a 80.59±2.76 a 7.22±0.29 a 12.11±0.45 a 54.41±0.81 b 2.60±0.15 a 六 14.67±0.62 a 11.77±0.05 a 80.56±3.62 a 7.54±0.23 a 11.68±0.41 a 58.65±0.34 a 2.73±0.03 a 乌 桂 9.93±0.69 ab 7.87±0.62 ab 79.08±0.79 a 7.24±0.11 b 11.99±0.15 a 62.11±1.94 a 1.53±0.27 ab 八 10.77±0.31 ab 8.58±0.27 ab 79.63±0.16 a 7.34±0.04 b 12.33±0.72 a 62.23±3.75 a 1.60±0.31 ab 六 11.85±0.90 a 9.33±0.80 a 78.64±0.80 ab 6.49±0.17 c 8.67±0.14 b 55.36±0.24 a 1.43±0.03 ab 乌 10.39±0.19 ab 8.12±0.25 ab 78.13±1.00 ab 7.94±0.13 a 12.22±0.79 a 60.44±1.99 a 1.30±0.31 ab 玫 10.82±0.65 a 8.06±0.78 ab 74.20±2.21 b 6.08±0.03 d 7.87±0.13 b 56.61±0.51 a 1.27±0.03 b 浅 8.75±0.30 b 6.82±0.14 b 78.23±1.43 ab 6.81±0.19 d 8.38±0.13 b 59.63±1.06 a 2.07±0.03 a 玫 乌 10.80±0.07 a 8.59±0.03 a 79.57±0.28 a 8.13±0.11 c 9.85±0.38 a 64.55±2.13 a 1.33±0.17 a 玫 10.12±0.31 ab 8.11±0.29 a 80.17±0.69 a 8.84±0.17 b 10.63±0.62 a 61.36±1.11 ab 1.40±0.30 a 浅 9.57±0.18 b 7.36±0.18 b 76.81±0.46 b 10.43±0.09 a 10.78±0.39 a 58.20±1.21 b 1.03±0.28 a 浅 桂 12.40±0.50 ab 10.57±0.36 a 85.33±0.82 a 7.42±0.07 b 10.38±0.50 a 55.39±0.74 a 1.93±0.03 a 乌 12.88±0.29 a 10.25±0.51 a 79.47±2.86 a 7.85±0.05 a 10.25±0.16 a 55.01±1.62 a 2.07±0.03 a 玫 13.88±0.42 a 11.33±0.37 a 81.35±1.77 a 6.52±0.04 c 10.53±0.13 a 56.03±0.80 a 1.67±0.09 b 浅 10.59±0.77 b 8.70±0.22 b 82.84±2.13 a 7.56±0.09 b 10.24±0.29 a 52.25±1.26 a 1.94±0.06 a 说明：数值为均值±标准误。不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 -
由表3可知：总体授粉品种对同母本组合的种仁淀粉和蛋白质质量分数的影响显著，对可溶性糖及脂肪质量分数的影响较小。‘桂花香’为母本时，‘八月红’授粉的蛋白质质量分数(6.60%)显著高于‘六月暴’授粉(6.12%)(P＜0.05)，淀粉质量分数(64.32%)显著低于‘六月暴’授粉(69.57%)(P＜0.05)；‘八月红’为母本时，异交显著提高了蛋白质质量分数(P＜0.05)，同时，‘六月暴’授粉的淀粉质量分数(67.24%)显著高于‘桂花香’授粉(58.91%)(P＜0.05)；‘六月暴’为母本时，自交的淀粉质量分数(58.65%)显著高于异交(51.81%、54.41%)(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本时，自交的蛋白质质量分数(7.94%)显著高于异交(P＜0.05)，淀粉质量分数差异不显著；‘玫瑰红’为母本时，‘浅刺大板栗’授粉显著提高了蛋白质质量分数(P＜0.05)，‘乌壳栗’授粉的淀粉质量分数(64.55%)显著高于‘浅刺大板栗’授粉(58.20%)；‘浅刺大板栗’为母本时，‘八月红’授粉显著提升了蛋白质质量分数(P＜0.05)，‘六月暴’授粉显著降低了脂肪质量分数，但各组合的淀粉质量分数差异不显著。
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由表4可知：按照特征根＞1的原则，共提取到4个主成分，它们的累计贡献率为83.441%。其中，主成分1特征值为5.092，贡献率为39.167%，刺苞高、仁质量、坚果质量、刺苞横径和刺苞纵径的载荷较高；主成分2特征值为2.705，贡献率为20.809%，种仁蛋白质质量分数、单刺苞坚果数、刺苞横径和刺苞质量的载荷较高；主成分3特征值为1.658，贡献率为12.751%，种仁淀粉和可溶性糖质量分数的载荷较高；主成分4特征值为1.389，贡献率为10.688%，出籽率和出仁率的载荷较高。
表 4 果实性状的载荷矩阵
Table 4. Component matrix of fruit characters
性状 第1主成分 第2主成分 第3主成分 第4主成分 性状 第1主成分 第2主成分 第3主成分 第4主成分 刺苞质量 0.560 0.508 −0.308 −0.485 出仁率 0.532 −0.497 0.331 0.487 刺苞横径 0.797 0.547 0.166 −0.105 蛋白质质量分数 −0.052 0.768 −0.072 0.310 刺苞纵径 0.792 0.477 0.310 −0.069 可溶性糖质量分数 0.459 0.337 0.606 0.142 刺苞高度 0.889 0.219 −0.098 0.224 淀粉质量分数 −0.250 −0.070 0.774 −0.117 单刺苞坚果数 −0.534 0.683 0.052 −0.016 脂肪质量分数 0.637 −0.501 0.276 −0.105 出籽率 −0.161 0.258 −0.204 0.839 特征值 5.092 2.705 1.658 1.389 坚果质量 0.836 −0.211 −0.391 0.009 贡献率/% 39.167 20.809 12.751 10.688 仁质量 0.867 −0.298 −0.274 0.070 累计贡献率/% 39.167 59.975 72.726 83.414 根据主成分1~4的得分(F1~F4)和各主成分权重，计算总得分(F)，得出各授粉组合板栗果实的综合性状排名(表5)。由表5可知：同母本的授粉组合中，排名前 2 的组合(♀×♂)分别为：‘桂花香’ב六月暴’、‘桂花香’ב八月红’；‘八月红’ב八月红’、‘八月红’ב六月暴’； ‘六月暴’ב桂花香’、‘六月暴’ב六月暴’； ‘乌壳栗’ב桂花香’、‘乌壳栗’ב乌壳栗’；‘玫瑰红’ב浅刺大板栗’、‘玫瑰红’ב乌壳栗’；‘浅刺大板栗’ב乌壳栗’、‘浅刺大板栗’ב桂花香’。
表 5 综合主成分值
Table 5. Comprehensive principal component values
授粉组合(♀×♂) F1 F2 F3 F4 F 排名 六×桂 5.16 0.30 −1.04 −0.58 2.27 1 六×六 4.54 0.99 −0.18 −1.36 2.18 2 六×八 2.44 −0.20 0.60 −1.54 0.99 3 八×八 2.52 −1.32 0.06 −0.08 0.85 4 八×六 1.61 −1.03 1.22 0.36 0.73 5 乌×桂 −0.38 2.38 1.02 −1.01 0.44 6 八×桂 0.32 −0.01 0.66 0.45 0.31 7 玫×浅 −1.61 3.85 −0.39 0.76 0.25 8 浅×乌 0.64 0.04 −1.60 1.29 0.24 9 乌×乌 −0.73 1.92 0.62 −0.29 0.19 10 浅×桂 0.91 −1.62 −0.71 1.70 0.14 11 玫×乌 −0.88 1.92 0.14 0.05 0.09 12 浅×玫 0.67 −0.63 −1.75 1.44 0.08 13 乌×八 −0.88 1.11 1.03 0.20 0.04 14 玫×玫 −1.47 1.30 0.23 1.06 −0.19 15 浅×浅 −0.58 −0.39 −0.90 2.32 −0.20 16 桂×六 −0.42 −1.08 2.03 −0.92 −0.28 17 桂×八 −2.08 −0.69 2.36 0.63 −0.71 18 桂×桂 −0.60 −3.66 1.37 0.06 -0.98 19 乌×六 −1.97 −1.31 −2.05 −1.23 −1.72 20 乌×玫 −3.16 −0.45 −2.39 −2.35 −2.26 21 乌×浅 −4.02 −1.42 −0.32 −0.97 −2.42 22 -
父本雄花盛花期与母本雌花盛花期相遇时间较长，能保证充分授粉和受精，是开展授粉配置研究的前提[18−19]。板栗树体高大，同一株树上，树冠上部的雌、雄花进入盛花期较早，树冠下部和内堂的雌、雄花进入盛花期较晚。在实际生产中，为了提高产量，应尽量使整株树的雌花都能够充分授粉，这就要求所选品种的花期相遇天数越多越好。本研究选择的22个授粉组合中，雌、雄花盛花期相遇天数均不少于3 d。
不同授粉组合对板栗的成果率及单个刺苞内的坚果数均有较大影响，表明授粉亲和性对板栗产量的影响较大，这与刘宁伟等[20]对板栗和张旭辉等[21]对锥栗C. henryi的研究结果一致。郭素娟等[22]认为：大部分板栗品种自花授粉亲和性差。在本研究中，多数自交组合不仅空苞率高，且成果率和每个刺苞中的坚果个数均显著低于异交组合。但也有自交授粉成果率较高，自交亲和性较好的品种，如‘乌壳栗’和‘浅刺大板栗’，其中，‘乌壳栗’自交所结果实的品质优良。可见，板栗自交授粉的亲和性也因品种而异。在油茶Camellia oleifera [23]、梨Pyrus[24]、文冠果Xanthoceras sorbifolium [25]、中国李Prunus salicina[26]品种的授粉研究中也发现了类似现象。
在本研究中，异花授粉显著提高了成果率和单刺苞内的坚果个数，可能原有的营养水平难以满足果实生长发育需要，导致‘六月暴’和‘八月红’异交组合的刺苞质量和体积显著小于自交组合。因此，在合理选配板栗品种授粉组合的同时，还需提高水肥供应，做好田间管理，促进板栗果实的生长和发育，提高板栗产量及果实的品质。
本研究发现这6个品种各有优劣。‘六月暴’各授粉组合的刺苞质量较大，为72.32~82.21 g，种仁蛋白质、糖类和脂肪丰富，果实品质综合排名靠前。从果实成熟时间来看，‘六月暴’为早熟品种，在8月下旬成熟，而罗田县大多数板栗品种成熟时间为9月上中旬，因此‘六月暴’可较早进入市场。但‘六月暴’成果率低，仅为30.42%~47.28%，表现出不丰产的特性。‘桂花香’风味独特，但其刺苞和坚果均较小，果实品质综合评分较低。
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不同授粉处理对板栗的结实率、空苞率、成果率、刺苞性状、坚果性状和种仁营养物质质量分数均有不同程度的影响。综合成果率和果实品质，结合主成分分析，筛选出6个品种的成果率高、果实品质优良的授粉组合(♀×♂)各1~2个，分别为‘桂花香’ב八月红’、‘八月红’ב六月暴’、‘六月暴’ב桂花香’、‘六月暴’ב八月红’、‘乌壳栗’ב六月暴’、‘玫瑰红’ב浅刺大板栗’、‘浅刺大板栗’ב桂花香’、‘浅刺大板栗’ב乌壳栗’。在实际生产中，‘八月红’和‘六月暴’互相授粉表现均优秀，可以等比例栽植。其余组合正向授粉表现优秀，反向授粉表现一般，应以母本为主，少量栽植授粉树。由此可见，合理的品种授粉配置可以有效降低罗田板栗品种的果实空苞率，提高果实产量与品质，实现高产优质栽培。罗田县板栗品种资源丰富，本研究只研究了其中的6个品种，后续可以对其余品种进行相关研究，掌握开花物候期和适宜的授粉品种。
Pollination configuration of Castanea mollissima cultivars in Luotian County
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摘要:
目的 筛选湖北省罗田县板栗Castanea mollissima品种高产优质的授粉组合。 方法 选用‘桂花香’ ‘Guihuaxiang’、‘八月红’‘Bayuehong’、‘六月暴’‘Liuyuebao’、‘乌壳栗’‘Wukeli’、‘玫瑰红’‘Meiguihong’、‘浅刺大板栗’‘Qiancidabanli’等6个罗田县栽培的板栗品种，在花期相遇的基础上，设计22个授粉组合，开展品种授粉配置试验，对各授粉组合的授粉结实性和果实性状进行测定分析。 结果 异交显著降低了空苞率，除‘乌壳栗’外，各品种的异交空苞率均低于自交。异交显著提高了成果率(P＜0.05)，除‘乌壳栗’外，各品种的自交成果率均低于50%。授粉品种对各品种的刺苞性状、坚果性状、种仁的蛋白质和淀粉质量分数均有显著性影响(P＜0.05)。综合成果率、果实性状等指标及主成分分析，筛选出各品种的成果率高、果实品质较好的授粉组合(♀×♂)是: ‘桂花香’ב八月红’、‘八月红’ב六月暴’、‘六月暴’ב桂花香’、‘六月暴’ב八月红’、‘乌壳栗’ב六月暴’、 ‘玫瑰红’ב浅刺大板栗’、‘浅刺大板栗’ב桂花香’、‘浅刺大板栗’ב乌壳栗’。 结论 合理进行品种授粉配置可以有效降低罗田板栗品种的果实空苞率，提高果实产量与品质，实现高产优质栽培。图3表5参26 Abstract:Objective This objective was to screen pollination combinations with high fruit yield and quality for Castanea mollissima (chestnut) cultivars in Luotian County, Hubei Province. Method Six chestnut cultivars cultivated in Luotian County, Hubei Province, were selected. Based on flowering period overlap, 22 pollination combinations were designed and the pollination configuration experiments were carried out, fruiting after pollination and fruit characteristic were investigated and analyzed. Result Cross-pollination significantly decreased the empty bract rate (P＜0.05), except ‘Wukeli’, each other cultivars’ empty bract rate of cross-pollination was lower than that of self-pollination. Cross-pollination significantly increased the final fruit setting rate (P＜0.05), the final fruit setting rate of self-pollination was lower than 50% except for ‘Wukeli’. Pollination cultivars showed significant effect on bracts index, nuts index, kernel’s protein and starch content (P＜0.05). Based comprehensively on final fruit rate, fruit characteristic indexes and principal component analysis, pollination combinations(♀×♂) with high fruit setting rate and good fruit quality were: ‘Guihuaxiang’ × ‘Bayuehong’, ‘Bayuehong’ × ‘Liuyuebao’, ‘Liuyuebao’ × ‘Guihuaxiang’, ‘Liuyuebao’ × ‘Bayuehong’, ‘Wukeli’ × ‘Liuyuebao’, ‘Meiguihong’ × ‘Qiancidabanli’, ‘Qiancidabanli’ × ‘Guihuaxiang’, ‘Qiancidabanli’ × ‘Wukeli’. Conclusion Proper pollination varieties configuration could efficiently decrease the fruit empty bract rate and promote the fruit yield and quality of chestnut cultivars in Luotian County, and the high yield and excellent quality production could be realized. [Ch, 3 fig. 5 tab. 26 ref.] -
金线莲Anoectochilus roxburghii为兰科Orchidaceae开唇兰属Anoectochilus多年生草本植物，别名金线草、金线兰等，主要分布在中国福建、浙江、云南和台湾等地区。金线莲因含有黄酮类、多糖类、生物碱类等成分[1]，其药用价值日益被重视。由于金线莲对生长环境要求严格，且野生资源被过度采摘，导致金线莲已濒临灭绝[2]，因此有必要开展金线莲资源的保护。种质资源收集和遗传多样性评估是金线莲资源保护的基础研究工作。分子标记可以在DNA水平上揭示植物的遗传变异，是一种稳定可靠的遗传分析方法[3]。简单重复序列间扩增多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)和序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)主要针对非特异性序列进行扩增，对于基因组序列信息匮乏的物种较为有效[4]。目前，分别利用ISSR、SRAP等单一分子标记对金线莲遗传多样性的评价[5-11]已取得了一定的进展，但单一的分子标记技术经常受到扩增区域限制、引物扩增能力差异、模糊显性标记主观计入等因素影响，不能完全评价生物遗传多样性[12-13]，而综合运用多种分子标记，能最大程度优化聚类分析结果[14-15]。目前，结合ISSR与SRAP分子标记技术已经应用于薄荷Mentha haplocalyx[12]、烟草 Nicotiana tabacum[16-17]、韭菜Allium tuberosum [18]、栀子Gardenia jasminoides [19]等研究。本研究采用ISSR与SRAP相结合的方法对浙江与福建等地引种、杂交与野生的金线莲样品进行研究，揭示金线莲个体间与种源间的遗传分化，为金线莲资源的保护和利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
48份金线莲新鲜叶片样品详见表1。
表 1 金线莲供试样品信息Table 1 Tested samples of A. roxburghii编号 样品 来源地 编号 样品 来源地 编号 样品 来源地 1 健君1号 浙江温州 17 尖叶自交辐射选育种 福建福州 33 福建网纹种 福建厦门 2 健君2号 浙江温州 18 红霞变异种 福建厦门 34 福建无网纹种 福建厦门 3 金康1号 浙江金华 19 小叶金线莲 福建福州 35 大福星 福建厦门 4 大圆叶 福建厦门 20 温州文成野生种 浙江温州 36 大圆宝 福建厦门 5 健君1号原种 浙江温州 21 尖叶金线莲 福建泉州 37 红霞 福建厦门 6 戴云山野生种 福建泉州 22 大叶金线莲 福建三明 38 健君1号 浙江温州 7 福建永春黄带种 福建泉州 23 云南金线莲 云南昆明 39 尖叶金线莲 福建三明 8 台湾金线莲 台湾高雄 24 野生无纹 福建厦门 40 庆元无网纹 浙江庆元 9 台湾金线莲 台湾高雄 25 尖叶红杆种 福建福州 41 福建金草繁育种 福建厦门 10 无纹(G) 福建三明 26 尖叶变异筛选种 福建福州 42 小圆叶 福建三明 11 福建金线莲 福建福州 27 尖叶变异筛选种 福建福州 43 银圆宝 台湾高雄 12 大叶(H) 福建三明 28 大叶金线莲 福建三明 44 尖叶自交选育种 福建福州 13 野生种子繁育种 福建三明 29 野生种子繁育种 福建三明 45 尖叶杂交种 福建福州 14 林下尖叶(台州) 浙江台州 30 福建本地银线莲 福建厦门 46 大叶红霞 福建三明 15 林下沙畈本地无纹 浙江金华 31 福建小圆叶 福建厦门 47 尖叶变异筛选种 福建福州 16 野生金线莲 江西萍乡 32 金华本地种 浙江金华 48 无纹金线莲 福建三明 1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与检测
参照DNA提取试剂盒说明书提取金线莲的DNA，得到的DNA用50 μL双蒸水(ddH2O)溶解。以ddH2O为对照，使用超微量分光光度计检测DNA溶解液的浓度以及纯度。
1.2.2 金线莲ISSR引物筛选及检测
采用哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列，由北京擎科生物科技有限公司合成。使用3个已提取的DNA对100个ISSR引物进行筛选，反应体系总体积为20 μL，其中2×Taq Plus MasterMix 10 μL、ddH2O 8 μL、ISSR引物 1 μL、DNA溶解液1 μL，PCR扩增程序为98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s，退火(不同引物退火温度不同) 15 s，72 ℃延伸15 s，循环35次；最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，挑选出多态性好、扩增条带清晰的引物对48个DNA样品进行扩增。
1.2.3 金线莲SRAP引物筛选及检测
参照FERRIOL等[20]的设计原理建立SRAP标记分析体系，由北京擎科生物科技有限公司合成，包含14条上游引物(Me1~Me14)和17条下游引物(Em1~Em17)，上下游引物可随机组成238对SRAP引物组合。使用2个已提取的DNA对238对SRAP引物组合进行筛选，PCR体系及扩增程序同上。将挑选出的多态性好、扩增条带清晰的引物对48个DNA样品进行扩增。
1.2.4 数据统计及分析
对PCR扩增产物电泳胶图进行人工读带，对扩增条带按有(1)或无(0)进行统计，形成“0, 1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及两者综合的数据。利用Excel统计每个(对)引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态位点百分率(PPB)。使用POPGENE 32.0软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、居群总基因多样性(Ht)、居群内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst=1−Hs/Ht)和基因流(Nm)等遗传多样性相关参数，并计算不同种源间的遗传距离和遗传一致度，使用OmicStudio工具对遗传距离进行主坐标分析(PCoA)，使用NTSYS-PC 2.1软件对所采集的金线莲样品进行聚类分析并绘制非加权组平均法(UPGMA)树状图。
2. 结果与分析
2.1 引物筛选及扩增多态性
2.1.1 ISSR引物的筛选及其扩增多态性
经过2次筛选，共获得11条条带较为清楚的引物(表2)。11条引物共扩增出86条条带，其中多态性条带有84条，PPB平均值为97.67%，平均扩增条带数是7.82个，平均多态性条带数为7.64个。扩增条带数最多的引物是UBC880 (13条)，其次是UBC861 (12条)，扩增条带最少的是UBC810 (4条)。PPB为83.33%~100%，其中，UBC807、UBC810、UBC826、UBC834、UBC841、UBC842、UBC865、UBC68和UBC861的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的81.82%；UBC856的PPB最低，为83.33%。
表 2 ISSR引物信息及扩增结果Table 2 ISSR primer information and amplification results编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数多态性
条带数PPB/% 1 UBC807 (AG)8T 6 6 100 2 UBC810 (GA)8T 4 4 100 3 UBC826 (AC)8C 6 6 100 4 UBC834 (AG)8YT 8 8 100 5 UBC841 (GA)8YC 10 10 100 6 UBC842 (GA)8YG 8 8 100 7 UBC856 (AC)8YA 6 5 83.33 8 UBC865 (CCG)6 6 6 100 9 UBC868 (GAA)6 7 7 100 10 UBC880 (GGAGA)3 13 12 92.30 11 UBC861 (ACC)6 12 12 100 平均 7.82 7.64 97.67 合计 86 84 说明：Y=(C, T)；PPB为多态位点百分率 2.1.2 SRAP引物的筛选及其扩增多态性
经过2次筛选，共获得11对条带较为清楚的引物组合(表3)。11对引物共扩增出88条条带，其中多态性条带有86条，PPB平均值为97.73%，平均扩增条带数是8个，平均多态性条带数为7.82个。扩增条带数最多的引物组合是Me11-Em4 (12条)；其次是组合Me4-Em13、Me2-Em14和Me13-Em10，扩增出9条条带；扩增条带最少的是Me13-Em16组合，只扩增出6条条带。PPB为88.89%~100%，其中，Me11-Em4、Me8-Em7、Me13-Em7、Me13-Em16、Me4-Em14、Me5-Em11、Me13-Em10、Me14-Em14和Me3-Em2组合的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的81.82%；Me4-Em13和Me2-Em14组合的PPB最低，为88.89%。
表 3 SRAP引物信息及扩增结果Table 3 SRAP primer information and amplification results编号 SRAP引物 正向引物
(5′→3′)反向引物
(5′→3′)扩增条
带数多态性
条带数PPB/% 1 Me11-Em4 BACG DTGA 12 12 100 2 Me8-Em7 BTGC DCAA 7 7 100 3 Me13-Em7 BAAC DCAA 8 8 100 4 Me4-Em13 BACC DCTA 9 8 88.89 5 Me13-Em16 BAAC DGAT 6 6 100 6 Me2-Em14 BAGC DCTC 9 8 88.89 7 Me4-Em14 BACC DCTC 7 7 100 8 Me5-Em11 BAAG DCAC 7 7 100 9 Me13-Em10 BAAC DCAG 9 9 100 10 Me14-Em14 BTCC DCTC 7 7 100 11 Me3-Em2 BAAT DTGC 7 7 100 平均 8 7.82 97.73 合计 88 86 说明：B=TGAGTCCAAACCGG；D=GACTGCGTACGAATT；PPB为多态位点百分率 2.2 遗传距离和遗传一致度分析
ISSR研究中遗传一致度为0.4767~0.9070，遗传距离为0.0976~0.7408。其中，遗传一致度最高的1号与2号、3号与17号、14号与17号，均为0.9070，它们的遗传距离最小，均为0.0976，说明其亲缘关系较近；遗传一致度最低的是7号与22号，为0.4767，其遗传距离最大，为0.7408，说明其亲缘关系较远。在SRAP研究中遗传一致度为0.4659~0.9545，遗传距离为0.0465~0.7638。其中，遗传距离最小的是36号与37号，遗传距离最大的是10号与39号。综合ISSR和SRAP的数据后，遗传一致度为0.5115~0.8793，遗传距离为0.1286~0.6704。其中，遗传距离最小的是34号与37号，遗传距离最大的是10号与39号。
将48份样品按照产地来源分为5个群体(浙江、福建、台湾、江西和云南)，利用POPGENE 32软件对其遗传距离和遗传一致度进行计算，结果如表4所示。使用OmicStudio工具将ISSR+SRAP的标记结果进行PCoA分析，结果如图1所示：由于来自台湾(3个)、江西(1个)和云南(1个)的样品数目较少，故不作分析。结合表4与图1可知：浙江省与福建省金线莲种质混杂。
表 4 金线莲群体间的遗传一致度与遗传距离Table 4 Genetic agreement and genetic distance among A. roxburghii populations分子标记 产地 浙江 福建 台湾 江西 云南 ISSR 浙江 0.9577 0.8842 0.8416 0.7285 福建 0.0433 0.8916 0.7792 0.7336 台湾 0.1231 0.1148 0.7310 0.6552 江西 0.1724 0.2495 0.3133 0.5814 云南 0.3168 0.3098 0.4228 0.5423 SRAP 浙江 0.9853 0.9480 0.7960 0.8351 福建 0.0148 0.9531 0.7880 0.8233 台湾 0.0534 0.0480 0.7796 0.7978 江西 0.2282 0.2383 0.2490 0.6250 云南 0.1802 0.1945 0.2259 0.4700 ISSR+SRAP 浙江 0.9712 0.9160 0.8187 0.7818 福建 0.0292 0.9229 0.7835 0.7798 台湾 0.0878 0.0802 0.7555 0.7270 江西 0.2000 0.2439 0.2804 0.6034 云南 0.2462 0.2487 0.3188 0.5051 说明：对角线下方为Nei’s遗传距离，对角线上方为Nei’s遗传一致度 2.3 遗传多样性分析
分析浙江与福建种源的样品，结果如表5所示：ISSR分析显示，43个种源在物种水平上，Na为1.9651，Ne为1.4403，H为0.2727，I为0.4247，PPB为96.51%；在群体水平上，Na为1.7093~1.9302，Ne为1.3409~1.4325，H为0.2075~0.2668，I为0.3207~0.4147，PPB为70.93%~93.02%，相对于物种水平而言，群体间的遗传多样性水平较低。SRAP结果与ISSR结果相似。结合ISSR与SRAP的数据分析：43个种源在物种水平上，Na为1.9713，Ne为1.3797，H为0.2429，I为0.3873，PPB为97.13%；在群体水平上，Na为1.7816~1.9425，平均值为1.8621；Ne为1.3578~1.3607，平均值为1.3593；H为0.2239~0.2288，平均值为0.2264；I为0.3488~0.3664，平均值为0.3576；PPB为78.16%~94.25%，平均值为86.21%，也是群体间的遗传多样性水平更低。其中，从ISSR、SRAP及综合研究结果来看，Na、Ne、H、I及PPB中基本上是福建省大于浙江省，说明福建省的金线莲种群遗传多样性更高。
表 5 金线莲遗传多样性参数Table 5 Genetic diversity parameters of A. roxburghii分子标记 产地 等位基
因数 (Na)有效等位
基因数 (Ne)Nei’s基因多样
性指数 (H)Shannon’s多态性
信息指数 (I)多态位点百
分率 (PPB)/%ISSR 浙江 1.709 3 1.340 9 0.207 5 0.320 7 70.93 福建 1.930 2 1.432 5 0.266 8 0.414 7 93.02 群体水平 1.819 8 1.386 7 0.237 2 0.367 7 81.98 物种水平 1.965 1 1.440 3 0.272 7 0.424 7 96.51 SRAP 浙江 1.852 3 1.380 0 0.239 9 0.376 3 85.23 福建 1.954 5 1.284 8 0.191 6 0.319 1 95.45 群体水平 1.903 4 1.332 4 0.215 8 0.347 7 90.34 物种水平 1.977 3 1.320 6 0.213 8 0.350 8 97.73 ISSR+SRAP 浙江 1.781 6 1.360 7 0.223 9 0.348 8 78.16 福建 1.942 5 1.357 8 0.228 8 0.366 4 94.25 群体水平 1.862 1 1.359 3 0.226 4 0.357 6 86.21 物种水平 1.971 3 1.379 7 0.242 9 0.387 3 97.13 2.4 UPGMA聚类分析
2.4.1 基于ISSR标记的聚类
由图2可见：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.62~0.91，变幅为0.29。在遗传相似系数为0.67处，48份金线莲样品被划分为3类：在Ⅰ类中地理位置相同的主要有浙江温州的1、2、5、38号以及福建福州的17、25、26、27、44、45号，两地间亲缘关系相对较近；而Ⅱ类与Ⅲ类中样品的来源组成均较为分散，无明显特征。
2.4.2 基于SRAP标记的聚类
图3显示：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.62~0.95，变幅为0.33。在遗传相似系数为0.65处，48份金线莲样品被划分为2类，Ⅰ类中1、5、38号均来自浙江温州，且品种相似，故聚为一类；而在Ⅱ类中，各个品种难以明显划分出小类，这也是各地种质较为混乱所带来的结果。与ISSR标记相比，SRAP标记更难划分类别。
2.4.3 基于ISSR+SRAP标记聚类
图4显示：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.64~0.88，变幅为0.24。在遗传相似系数为0.68处，48份金线莲样品被划分为4类，Ⅰ类中地理位置相同的主要有浙江温州的1、2、5、38号以及台湾高雄的8、9号，两地间可能品种相互引种；Ⅱ类中主要为来自福建福州的样品，包括17、25、26、27、44、45号；Ⅲ类中地理位置相同的主要有福建厦门的4、18、24、31、33、34、36、37号以及福建三明的12、13、22、28、29、48号，两地间品种互引的可能性较大。2种分子标记结合的方法更易体现样品间亲缘关系、划分类别，更清楚地体现地理位置对亲缘关系的影响。
3. 讨论与结论
本研究利用ISSR与SRAP对48份不同来源金线莲样品进行遗传特性分析，共筛选获得11条ISSR引物，扩增86条条带，其中多态性条带84条，PPB为97.67%；筛选出的11对SRAP引物共扩增出了88条条带，多态性条带86条，PPB为97.73%。说明供试金线莲样本具有丰富的遗传多样性，且相较于王剑锴等[10]筛选出的用于检测金线莲资源遗传特性的RAPD分子标记，ISSR与SRAP的标记多态性明显增多，进一步验证了ISSR与SRAP在金线莲种源多态性检测方面的高效率。
基于ISSR与SRAP分子标记对金线莲样品的遗传距离与遗传一致度分析发现：遗传距离最小的是34号(福建厦门福建无网纹种)与37号(福建厦门红霞)，其亲缘关系较近；遗传距离最大的是10号(福建三明的无纹G)与39号(福建三明的尖叶)，其亲缘关系较远。从遗传多样性分析结果来看，来自福建的金线莲遗传多样性更高，同时结合金线莲群体间的遗传一致度与遗传距离结果以及PCoA分析，可以看出各地间金线莲种质资源十分混杂，其中包含了大量的野生种、半野生种和人工驯化的栽培种及杂交种，这种复杂性导致不同种源间的差异性明显，金线莲种质的遗传多样性增加。浙江省市场内流通的栽培种多为省外引入种[21-22]，各种质遗传交流频繁，这有利于培育出较优的金线莲品种。
本研究单独使用ISSR或SRAP的UPGMA聚类结果中，均出现各地间种源相互混杂的状况，并未严格按照地理距离的差异进行归类，而2种分子标记结合的聚类结果中，金线莲种质资源的聚类与不同地理位置分布的情况有比较高的一致度，表现出了一定地域性分布规律，说明2种分子标记方法结合相较于单一的分子标记方法能更准确地体现不同地区金线莲的差异性。由于2种分子标记所检测的基因座位以及所用的引物等因素存在差异，故两者得到的遗传距离不同，其聚类图也存在差异[23]，且每种分子标记方法均有其优势与不足，结合多种标记技术则能更全面、准确地揭示种质遗传特性。因此，本研究结合ISSR与SRAP能更准确地揭示金线莲资源的遗传多样性和亲缘关系，为金线莲良种培育以及野生金线莲资源保护等方面提供了帮助。此外物种的遗传特性容易受到生态环境、繁殖方式以及各种人为活动的影响，野生金线莲经过长期的自然选择，其遗传背景较为复杂；人工栽培种种源多来自于野生金线莲，品种混杂。同时金线莲在野外萌发所需的自然条件苛刻，加之生境的易碎性对其生存产生很大压力[24]，因此金线莲的遗传多样性受到生态环境极大的影响，所以有必要保护当地的生态环境以维护金线莲物种多样性。
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表 1 授粉组合设计
Table 1. Design of pollination combination
母本
(♀)父本(♂) 桂 八 六 乌 玫 浅 桂 √ √ √ − − − 八 √ √ √ − − − 六 √ √ √ − − − 乌 √ √ √ √ √ √ 玫 − − − √ √ √ 浅 √ − − √ √ √ 说明：√表示雌雄花盛花期相遇天数≥3 d，进行授粉实验；−表示雌雄花盛花期相遇天数＜3 d，不进行授粉试验。 
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表 2 不同授粉组合的主要刺苞性状
Table 2. Main bracts characters of different pollination combinations
母本(♀) 父本(♂) 质量/g 横径/mm 纵径/mm 高/mm 每刺苞坚果数 出籽率/% 桂 桂 44.03±1.79 b 68.71±1.24 c 61.23±0.95 b 57.64±0.70 a 1.17±0.07 c 31.84±0.40 c 八 47.67±1.40 b 75.68±0.72 b 63.65±1.22 b 54.26±0.65 b 2.37±0.03 a 43.44±0.46 a 六 59.72±0.98 a 79.34±0.58 a 67.89±0.76 a 59.54±0.32 a 1.93±0.03 b 36.48±1.80 b 八 桂 56.65±0.78 b 81.62±0.45 a 71.39±0.62 a 65.47±0.97 a 2.26±0.20 a 39.27±1.51 a 八 66.59±0.91 a 84.00±0.93 a 73.35±0.41 a 64.44±0.27 a 1.65±0.04 b 41.35±0.18 a 六 58.28±2.12 ab 81.78±1.03 a 71.05±1.40 a 65.90±1.37 a 2.18±0.16 ab 38.17±1.65 a 六 桂 73.32±2.60 b 92.63±1.35 ab 77.13±1.61 a 69.47±1.16 a 1.66±0.04 b 33.74±0.77 a 八 62.74±1.28 c 88.75±1.09 b 74.06±1.00 a 63.83±1.07 b 1.46±0.05 c 28.55±1.07 b 六 80.21±0.75 a 93.70±1.08 a 77.70±1.24 a 66.98±0.66 ab 1.91±0.04 a 35.73±1.51 a 乌 桂 70.66±0.93 a 85.53±0.47 a 70.84±0.36 a 62.32±0.67 a 2.82±0.04 a 37.61±0.69 abc 八 58.61±2.45 bc 78.13±1.13 c 68.25±1.43 a 60.23±0.73 ab 2.59±0.14 ab 41.70±0.77 a 六 61.00±4.99 abc 69.81±1.67 b 57.46±1.76 b 57.26±1.46 abc 2.16±0.04 c 33.72±0.17 c 乌 62.82±2.98 abc 81.4±2.39 ab 70.31±1.89 a 60.79±1.24 ab 2.33±0.13 bc 39.39±1.96 ab 玫 66.19±2.00 ab 70.59±1.46 c 58.16±2.52 b 55.34±1.82 bc 2.31±0.12 bc 34.85±1.70 c 浅 52.74±3.17 c 65.19±2.12 c 57.94±2.43 b 53.32±2.65 c 2.38±0.08 bc 36.46±1.39 bc 玫 乌 65.42±1.55 a 82.72±1.04 a 70.89±1.85 a 60.92±0.17 a 2.61±0.09 a 43.83±0.75 a 玫 56.21±1.77 b 79.12±0.20 b 66.37±0.73 a 60.15±0.77 a 2.27±0.12 b 44.85±0.36 a 浅 62.15±2.54 ab 83.99±0.97 a 70.79±0.92 a 61.49±0.53 a 2.60±0.10 a 44.51±0.33 a 浅 桂 54.56±2.29 ab 75.14±2.17 a 65.00±1.03 a 64.23±1.11 a 1.67±0.10 a 43.62±1.27 a 乌 59.96±2.86 ab 78.38±0.76 a 65.08±0.68 a 64.82±1.45 a 1.95±0.28 a 48.86±2.45 a 玫 62.29±2.77 a 76.85±0.32 a 63.81±1.04 a 62.16±0.75 a 2.06±0.06 a 51.10±3.19 a 浅 51.94±1.69 b 76.58±0.70 a 63.86±0.23 a 62.93±0.25 a 2.05±0.15 a 50.62±2.12 a 说明：数值为均值±标准误。不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。
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表 3 不同授粉组合的主要坚果性状和种仁营养物质质量分数
Table 3. Main nuts characters and nutrient contents in kernel of different pollination combinations
母本(♀) 父本(♂) 坚果质量/g 仁质量/g 出仁率/％ 蛋白质质量
分数/%可溶性糖质量
分数/%淀粉质量
分数/%脂肪质量
分数/%桂 桂 11.71±0.19 a 9.82±0.22 a 83.67±0.67 a 6.52±0.02 ab 10.84±0.48 a 65.50±1.24 ab 2.18±0.07 a 八 9.58±0.88 a 7.28±0.16 b 81.00±1.16 a 6.60±0.18 a 12.53±0.49 a 64.32±0.45 b 2.33±0.07 a 六 9.87±0.67 a 8.91±0.42 a 81.69±0.15 a 6.12±0.12 b 10.69±0.68 a 69.57±1.52 a 2.17±0.15 a 八 桂 10.34±0.52 b 8.61±0.31 b 83.38±1.34 a 6.65±0.11 a 10.44±0.50 a 58.91±0.54 b 1.87±0.19 a 八 13.10±1.44 a 11.03±0.74 a 84.13±0.60 a 5.60±0.04 b 10.39±0.15 a 60.38±2.43 ab 2.23±0.20 a 六 12.65±0.71 a 10.80±021 a 85.41±1.38 a 6.56±0.08 a 10.24±0.21 a 67.24±2.17 a 2.17±0.13 a 六 桂 15.22±0.49 a 12.67±1.43 a 82.94±5.24 a 7.56±0.19 a 11.70±0.41 a 51.81±1.47 b 2.47±0.09 a 八 11.79±0.66 b 9.46±0.59 a 80.59±2.76 a 7.22±0.29 a 12.11±0.45 a 54.41±0.81 b 2.60±0.15 a 六 14.67±0.62 a 11.77±0.05 a 80.56±3.62 a 7.54±0.23 a 11.68±0.41 a 58.65±0.34 a 2.73±0.03 a 乌 桂 9.93±0.69 ab 7.87±0.62 ab 79.08±0.79 a 7.24±0.11 b 11.99±0.15 a 62.11±1.94 a 1.53±0.27 ab 八 10.77±0.31 ab 8.58±0.27 ab 79.63±0.16 a 7.34±0.04 b 12.33±0.72 a 62.23±3.75 a 1.60±0.31 ab 六 11.85±0.90 a 9.33±0.80 a 78.64±0.80 ab 6.49±0.17 c 8.67±0.14 b 55.36±0.24 a 1.43±0.03 ab 乌 10.39±0.19 ab 8.12±0.25 ab 78.13±1.00 ab 7.94±0.13 a 12.22±0.79 a 60.44±1.99 a 1.30±0.31 ab 玫 10.82±0.65 a 8.06±0.78 ab 74.20±2.21 b 6.08±0.03 d 7.87±0.13 b 56.61±0.51 a 1.27±0.03 b 浅 8.75±0.30 b 6.82±0.14 b 78.23±1.43 ab 6.81±0.19 d 8.38±0.13 b 59.63±1.06 a 2.07±0.03 a 玫 乌 10.80±0.07 a 8.59±0.03 a 79.57±0.28 a 8.13±0.11 c 9.85±0.38 a 64.55±2.13 a 1.33±0.17 a 玫 10.12±0.31 ab 8.11±0.29 a 80.17±0.69 a 8.84±0.17 b 10.63±0.62 a 61.36±1.11 ab 1.40±0.30 a 浅 9.57±0.18 b 7.36±0.18 b 76.81±0.46 b 10.43±0.09 a 10.78±0.39 a 58.20±1.21 b 1.03±0.28 a 浅 桂 12.40±0.50 ab 10.57±0.36 a 85.33±0.82 a 7.42±0.07 b 10.38±0.50 a 55.39±0.74 a 1.93±0.03 a 乌 12.88±0.29 a 10.25±0.51 a 79.47±2.86 a 7.85±0.05 a 10.25±0.16 a 55.01±1.62 a 2.07±0.03 a 玫 13.88±0.42 a 11.33±0.37 a 81.35±1.77 a 6.52±0.04 c 10.53±0.13 a 56.03±0.80 a 1.67±0.09 b 浅 10.59±0.77 b 8.70±0.22 b 82.84±2.13 a 7.56±0.09 b 10.24±0.29 a 52.25±1.26 a 1.94±0.06 a 说明：数值为均值±标准误。不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。
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表 4 果实性状的载荷矩阵
Table 4. Component matrix of fruit characters
性状 第1主成分 第2主成分 第3主成分 第4主成分 性状 第1主成分 第2主成分 第3主成分 第4主成分 刺苞质量 0.560 0.508 −0.308 −0.485 出仁率 0.532 −0.497 0.331 0.487 刺苞横径 0.797 0.547 0.166 −0.105 蛋白质质量分数 −0.052 0.768 −0.072 0.310 刺苞纵径 0.792 0.477 0.310 −0.069 可溶性糖质量分数 0.459 0.337 0.606 0.142 刺苞高度 0.889 0.219 −0.098 0.224 淀粉质量分数 −0.250 −0.070 0.774 −0.117 单刺苞坚果数 −0.534 0.683 0.052 −0.016 脂肪质量分数 0.637 −0.501 0.276 −0.105 出籽率 −0.161 0.258 −0.204 0.839 特征值 5.092 2.705 1.658 1.389 坚果质量 0.836 −0.211 −0.391 0.009 贡献率/% 39.167 20.809 12.751 10.688 仁质量 0.867 −0.298 −0.274 0.070 累计贡献率/% 39.167 59.975 72.726 83.414
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表 5 综合主成分值
Table 5. Comprehensive principal component values
授粉组合(♀×♂) F1 F2 F3 F4 F 排名 六×桂 5.16 0.30 −1.04 −0.58 2.27 1 六×六 4.54 0.99 −0.18 −1.36 2.18 2 六×八 2.44 −0.20 0.60 −1.54 0.99 3 八×八 2.52 −1.32 0.06 −0.08 0.85 4 八×六 1.61 −1.03 1.22 0.36 0.73 5 乌×桂 −0.38 2.38 1.02 −1.01 0.44 6 八×桂 0.32 −0.01 0.66 0.45 0.31 7 玫×浅 −1.61 3.85 −0.39 0.76 0.25 8 浅×乌 0.64 0.04 −1.60 1.29 0.24 9 乌×乌 −0.73 1.92 0.62 −0.29 0.19 10 浅×桂 0.91 −1.62 −0.71 1.70 0.14 11 玫×乌 −0.88 1.92 0.14 0.05 0.09 12 浅×玫 0.67 −0.63 −1.75 1.44 0.08 13 乌×八 −0.88 1.11 1.03 0.20 0.04 14 玫×玫 −1.47 1.30 0.23 1.06 −0.19 15 浅×浅 −0.58 −0.39 −0.90 2.32 −0.20 16 桂×六 −0.42 −1.08 2.03 −0.92 −0.28 17 桂×八 −2.08 −0.69 2.36 0.63 −0.71 18 桂×桂 −0.60 −3.66 1.37 0.06 -0.98 19 乌×六 −1.97 −1.31 −2.05 −1.23 −1.72 20 乌×玫 −3.16 −0.45 −2.39 −2.35 −2.26 21 乌×浅 −4.02 −1.42 −0.32 −0.97 −2.42 22
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