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硫代葡萄糖苷(glucosinolates，GS)，简称硫苷，又称芥子油苷，是植物中一类富含氮硫的阴离子次生代谢物质，主要存在于十字花科Cruciferae，尤其是芸薹属Brassica植物中，如白菜Brassica rapa ssp. pekinensis，甘蓝Brassica oleracea，油菜Brassica napus，芥菜Brassica juncea，芜菁Brassica rapa，拟南芥Arabidopsis thaliana等[1]。自从BUSSY[2]于1839年从芥菜子中首次发现硫苷后，硫苷的种类以及降解产物逐渐被人所认识。目前，鉴定出结构的硫苷已经超过132种[3]。所有硫苷都有一个共同的化学结构：一般由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基团以及来源于氨基酸的侧链R基团组成。根据氨基酸侧链R基团的不同，可将硫苷分为3类：脂肪族硫苷(侧链主要来源于甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，吲哚族硫苷(侧链主要来源于色氨酸)和芳香族硫苷(侧链主要来源于苯丙氨酸或酪氨酸)[1, 4]。硫苷本身性质比较稳定，并不具备生物活性，主要存在于植物细胞的液泡中，而硫代葡萄糖苷酶(又称黑芥子酶)则位于特定的蛋白体中，只有当植物组织破碎时(如病虫害侵袭或机械损伤)，两者得以接触，硫苷在黑芥子酶的作用下水解产生异硫氰酸盐、硫氰酸脂、腈类等生物活性物质[4]。这些水解产物具有重要的生物学功能，不仅是十字花科蔬菜独特风味物质的主要来源，而且在抵御昆虫取食[5-7]、病原菌侵染[8]以及各种非生物胁迫[9](如水分、温度、光照、盐胁迫)等植物防卫反应中也发挥了重要作用，更重要的是它对人体而言具有预防结肠癌、乳腺癌、肺癌等癌症发生的作用[10-11]。经过数十年的研究，硫苷的生物合成途径及其调节基因在模式植物拟南芥中已经基本阐明[12-14]。硫苷的生物合成过程主要包括以下3个阶段：氨基酸侧链的延长，核心结构的形成和侧链的次级修饰[12]。在硫苷核心结构形成过程中，硝基化合物或氧化腈在谷胱甘肽硫转移酶(gultathione-S-transferase，GST)的作用下与硫供体(半胱氨酸或谷胱甘肽)结合，形成S-烷基硫代氧肟；以及脱硫硫苷在磺基转移酶(sulfotransferase，SOT)的催化下，与高能硫供体3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸(3′-phospho-adenosine-5′-phosphosullfate，PAPS)结合，在N末端生成一个SO42-，从而形成基本的硫苷结构。这2步反应都需要硫供体，也使得最终的硫苷中含有大量的硫元素且被运送到种子中储存起来，用于应对缺硫胁迫，保证植物体内的硫平衡[15]。笔者总结了近年来硫苷生物合成过程中硫来源的研究进展，并在此基础上分析了初生硫代谢与硫苷合成的关系，希望进一步完善硫苷的代谢网络，为日后研究硫的初生与次生代谢途径间的相互作用提供理论指导。
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半胱氨酸(cysteine，Cys)是硫营养代谢的枢纽，植物吸收的无机硫经过一系列还原和同化反应进入有机骨架，形成Cys；植物以Cys为前体，合成众多具有重要生物学功能的含硫化合物；因此，Cys在细胞内的积累量很低，但通量很高[16]。一直以来，Cys被认为是硫苷合成过程中的还原硫供体，在GST或者GST类似功能酶的催化下与硝基化合物或者氧化腈结合形成S-烷基硫代氧肟。同位素标记的体内试验表明：半胱氨酸比甲硫氨酸等硫醇类物质更易参与到硫苷的合成过程；但是，体外试验表明：硫醇类物质都易与硝基化合物结合[17]。而最近的研究表明，谷胱甘肽也可以为硫苷的合成提供还原硫。
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谷胱甘肽(glutathione，GSH)，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，是植物体内广泛存在的生物活性物质，其活性位点为半胱氨酸的巯基[18-19]。巯基的存在使其具有很强的还原能力；此外，谷氨酸与半胱氨酸之间存在1个不多见的γ-肽键能够保护GSH不被许多肽酶水解[18]。GSH特殊的化学结构使其具有重要的生物学功能。它在还原硫的储存和转运，酶活性的调节，清除活性氧，抵抗各种逆境胁迫(重金属、干旱胁迫、盐胁迫、病菌侵染)等方面都具有重要作用[20-26]。最近的研究表明：GSH也可以作为还原硫供体与硝基化合物或者氧化腈结合，直接参与硫苷的生物合成过程。
首次指出GSH参与硫苷合成的试验来自于对pad2突变体的分析，此突变体缺失γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-Glu-Cys synthetase，GSH1)[27]，即GSH合成的关键酶，突变体的GSH含量只有野生型的20%，同时Cys含量上升了5倍，但是与野生型相比硫苷的含量却没有显著变化；而经过24 h的昆虫(夜蛾Noctuidae)诱导，突变体的吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷和4-甲基亚磺酰丁基硫代葡萄糖苷的含量只有野生型的50%[17, 28]，这就说明GSH与硫苷的合成存在一定的关系，但是由于GSH功能的复杂性，具体关系在此研究中并未阐明。
GEUFLORES等[29]利用基因工程手段在烟草Nicotiana tabacum中首次证明了GSH可以为硫苷合成提供还原硫。当苯甲基硫代葡萄糖苷(benzylgulcosinolate，BGLS)合成基因(CYP79A2，CYP83B1，SUR1，UGT74B1，SOT16)在烟草叶片中共表达时，产生低含量的BGLS，但同时积累了GSH与硝基化合物的共轭物(S-[(Z)-phenylacetohydroximoyl]-L-glutathione，GS-B)[29]。这是因为C-S裂解酶(C-S lyase，SUR1)不能催化谷氨酸与半胱氨酸之间的γ-谷酰基的水解。这就意味着存在一个酶对γ-谷酰基具有水解作用。然而，有类似功能酶的γ-谷酰基转肽酶家族(GGT家族)定位于非原质体或者是液泡，而硫苷的合成定位于细胞质，这就排除了GGT酶在硫苷合成中的作用[30]。另外，在大肠埃希菌Escherichia coli中也发现了具有类似功能的酶，此酶含有一个γ-谷酰基转移酶结构域[30]。而当含有同型结构域的γ-谷酰基水解酶(γ-glutamyl peptidase，GGP)重组体在上述烟草叶片中共表达时，GS-B的积累下降，BGLS的含量上升(大约5倍)，这就证明了非GGT家族的γ-谷酰基水解酶的存在[29]。此外，体外试验也证明了GGP1可以催化γ-谷酰基的水解。
以上在不合成硫苷的植物(烟草)中证明了GSH为硫苷的合成提供硫，并且证明了GGP1对γ-谷酰基的水解作用，但还需要证明在含有硫苷的植物中也存在这种机制。GEUFLORES等[31]又以模式植物拟南芥的GGP1和GGP3的双突变体为研究对象，研究表明此突变体的硫苷含量显著下降，并且积累了10种GSH与硝基化合物的共轭物；同时亚细胞定位表明，GGP1和GGP3定位于细胞质，这与硫苷合成的相关酶系相一致，这就为GSH可以作为硫苷合成过程中的还原硫供体提供了更为明确和直接的证据，而且也进一步证明GGP对γ-谷酰基的水解作用。然而，GGP1和GGP3的双突变体中仍然含有大量的硫苷，这说明可能还存在其他的γ-谷酰基水解酶，有待于进一步研究和确认[30]。
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高能硫供体3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸(PAPS)是活化硫酸盐在细胞内的积累形式，也是磺基转移酶(SOT)作用的底物[32]。在硫苷核心结构合成的最后一步，PAPS在SOT的作用下将硫酸根(SO42-)转移至脱硫硫苷的羟基，形成基本的硫苷结构[33]。目前，在拟南芥中发现磺基转移酶家族共有18个成员，根据编码序列的同源性可分成7个亚家族，主要功能是催化硫苷、黄酮、植物磺肽素等次生代谢物的硫酸化反应[34]。其中，SOT16，SOT17和SOT18主要负责硫苷的硫酸化反应，表达水平受到组织器官、生长阶段以及光照条件等的影响，且具有不同的底物专一性，SOT16主要催化吲哚族和芳香族硫苷的硫酸化反应，而SOT17和SOT18对长链的脂肪族脱硫硫苷具有更高的亲和性[34-35]。
PAPS是植物吸收的SO42-在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的参与下由ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase，ATPS)和APS激酶(APS kinase，APK)催化合成。目前，在拟南芥中发现APK家族共有4个成员，而只有apk1apk2双突变体的硫苷含量显著减少，同时积累了大量的脱硫硫苷[34, 36-37]。且亚细胞定位表明：硫苷的合成定位于细胞质(SOT16，SOT17和SOT18均位于细胞质)，而APK基因家族中只有APK3位于细胞质，APK1，APK2和APK4均位于叶绿体[34, 37]。这说明存在一个转运机制将PAPS从叶绿体转运至细胞质以供硫苷的合成。近来的研究证实了PAPS转运蛋白(PAPS transporter，PAPST1)可以顺着浓度梯度将PAPS跨膜转运至细胞质[37]。
进一步的研究表明：PAPS脱去硫酸根后的产物3′, 5′磷酸腺苷(3′, 5′-phosphoadenosine，PAP)具有细胞毒性(抑制RNA酶对畸形RNA的分解作用)，而PAPST1可以顺着浓度梯度将PAP转运至叶绿体，在叶绿体中存在PAP磷酸酶(PAP phosphatase，FRY1)催化PAP降解形成腺苷酸(adenosine monophosphate, AMP)[37]。因此，在PAPST1顺浓度梯度跨膜转运机制的基础上，PAPS的合成与利用以及PAP的降解相互作用，共同调控硫苷的生物合成途径。缺失PAPST1的拟南芥突变体硫苷含量也显著减少且积累了脱硫硫苷，但是积累程度不及apk1apk2双突变体，说明可能还存在其他的PAPS转运体，还有待于进一步研究确认。同时这也说明了SOT催化的脱硫硫苷的硫酸化作用不仅受到低浓度PAPS的抑制，而且当PAPS/PAP的转运机制失调时，此反应也受到抑制[37]。
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植物根部吸收的硫酸盐，在多种硫酸盐转运蛋白的协同作用下，通过木质部和韧皮部，最终进入叶绿体或质体被ATPS活化形成5′腺苷磷酸硫酸(adenosine 5′-phosphosulfate，APS)[16, 38-39]。APS在能量上是不稳定的，可以被APS还原酶(APS reductase，APR)还原形成SO32-，进入硫的初生代谢途径，形成半胱氨酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸等含硫化合物，并进一步为硫苷等次生代谢物的合成提供原料；也可以在APK的作用下磷酸化形成PAPS，PAPS进入次生代谢途径，为硫苷等次生代谢物的合成提供活化硫酸盐[34, 37]。因此，硫苷的合成与硫代谢间有着密切的关系。
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初生硫代谢为硫苷的合成提供了前体氨基酸(甲硫氨酸，Met)，还原硫供体(Cys和GSH)以及活化硫酸盐(PAPS)，而硫苷的合成受植物体内硫营养水平的调控。研究表明：增施硫肥能够显著提高植物体内硫苷的积累[40]；而在缺硫条件下，拟南芥的硫苷合成基因的表达下调，黑芥子酶编码基因的表达上调，说明植物一方面通过减少硫苷的合成以降低次生代谢对硫的利用，另一方面增加其降解以提高硫从次生代谢向初生代谢的转化，以缓解缺硫胁迫，保证植物正常的生长发育[41]。HUSEBY等[42]研究表明：光照条件下，硫酸盐转运蛋白、APR等初生硫代谢基因表达上调，同时硫苷合成基因的表达也上调，硫苷含量上升。此外，Met是合成脂肪族硫苷的前体氨基酸，而与吲哚族和芳香族硫苷相比，脂肪族硫苷对环境供硫水平的反应更为灵敏[41]。
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初生硫代谢与硫苷合成的调控机制错综复杂，受到APK和APR等硫代谢关键基因，MYB等硫苷合成转录因子以及细胞内的氧化还原水平等多方面的影响。
在硫代谢途径中，APS可以在APK的作用下，与ATP反应形成PAPS，PAPS为硫苷的合成提供活化硫酸盐；或者在APR的作用下，进入硫的还原和同化途径[16, 39]，因此，APS成为硫初生与次生代谢途径的分支点，APK和APR则成为重要的调控因子。MUGFORD等[36]研究表明，apk1apk2拟南芥突变体的硫苷含量只有野生型的15%，微阵列分析显示硫苷合成基因(UGT74B1，CYP83B1，SUR1，SOT16，SOT18)的转录水平上调，脱硫硫苷积累；PAPS合成受阻导致初生硫代谢途径上调，Cys和GSH的含量显著上升，但是APS含量下降，APR活性没有明显的变化；而硫酸盐转运基因以及ATPS(ATPS1和ATPS3)表达的上调可能是受到PAPS不足的诱导[34]。在APK过量表达的材料中，硫苷含量并没有显著变化(尽管MAM3和SOT17的转录水平上调)，但是APR活性受诱导，进入初生硫代谢的通量上升[34, 37]。APR是硫还原同化途径的重要调控因子，并受Cys和GSH的反馈抑制，即缺硫会导致APR的活性显著升高；而当Cys或者GSH浓度高时，APR的活性就会受到抑制，这也体现了硫代谢途径受需求驱动的特点[16, 39]。
MYB是一类转录因子，能在转录水平上通过调节与其相关的基因的表达来调控硫苷的合成[12]。其中，MYB28，MYB29和MYB76能够调控脂肪族硫苷的合成，MYB34，MYB51和MYB122能够调控吲哚族硫苷的合成[12]。研究表明：MYB也可以直接调控ATPS和APR等初生硫代谢基因[39]。MYB的过量表达导致ATPS1和ATPS3的转录水平上调，硫初生代谢途径受诱导，GSH含量上升；而缺失MYB的突变体中，APR的转录水平下调[34]。
此外，初生硫代谢与硫苷的合成还受到细胞内氧化还原水平的调节。研究表明：APR受氧化应激的诱导，而APK在还原产物含量高时活性更高。当植物处于胁迫状态时，活性氧的产生导致APR活性上升，而APK活性受抑制，硫的初生代谢途径上调[34, 37]。因此，当细胞处于氧化状态时，硫进入初生代谢的通量提高，而当细胞处于还原状态时，硫更倾向于进入硫苷合成等次生代谢途径。
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硫苷是十字花科植物一类富含氮硫的次生代谢物，因硫苷作为十字花科蔬菜风味物质的来源被人们认识已久，而且硫苷及其降解产物因在植物防御以及降低人体癌症发生率方面的重要生物学功效而受到越来越广泛的关注。到目前为止，硫苷的生物合成过程及其调控基因在模式植物拟南芥中已经基本阐明。硫苷作为植物体内有机硫的重要储存形式，其合成过程也伴随着硫的还原和同化，且硫还原同化途径产物Cys和GSH是硫苷合成过程中的还原硫供体，PAPS则为硫苷的合成提供了活化硫酸盐，因此硫苷的合成与硫的还原和同化途径(初生硫代谢途径)间有着密切的联系。但是硫的初生代谢与硫苷的合成受到APK和APR等硫代谢关键基因，MYB等硫苷合成转录因子以及细胞内的氧化还原水平等多方面的影响，其调控机制错综复杂，还存在许多悬而未决的问题，比如硫营养信号转导、硫与氮等其他营养元素之间的协调、葡萄糖等植物激素之间的信号交流对硫苷合成的生物调控，这都有待于进一步研究，以明确硫的初生代谢与次生代谢途径间的相互作用。此外，以GSH作为硫苷合成的还原硫供体时，是否还存在羧肽酶的水解作用还不明确，尚需进一步探究；GGP的具体作用机制仍处于推论阶段，仍需进一步研究；GSH的动态平衡对硫苷合成的调控作用也是人们关注的问题，也有可能成为新的研究热点。随着科学研究的不断深入，在未来可以利用遗传学、蛋白组学、代谢组学、基因工程等手段人为操纵硫苷的生物合成，这对提高作物对病虫害的抗性、作物的抗癌活性以及新品种的选育和改良具有十分重要的意义。
Advances of research on sulfur source in the biosynthesis of glucosinolates
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摘要: 硫苷是十字花科Cruciferae植物中一类富含氮硫的次生代谢物，硫苷合成途径，特别是硫与硫苷合成关系的研究取得了很多进展。从硫苷核心结构形成过程中还原硫供体来源、活化硫酸盐来源以及半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）和高能硫供体3'磷酸腺苷5'磷酰硫酸（PAPS）等初生硫代谢产物与硫苷合成间的关系等方面对硫苷合成过程中硫来源的研究进展进行了综述，提出GSH等初生硫代谢调控因子、氮硫等营养元素之间的平衡以及葡萄糖等信号分子对硫苷生物合成的调控机制将成为新的研究热点，以期为硫苷的生物合成调控研究提供理论依据。Abstract: Glucosinolates are nitrogen-and sulfur-containing secondary metabolites that mainly found in the Brassicaceae plants. In recent years, the study which involves the biosynthesis of glucosinolates, especially its relationship with sulfur has made some new progress. The research attempted to review the research progresses on the sources of reduced sulfur and active sulfate in the formation of the core glucosinolate structure. The paper also discussed the link between primary sulfur metabolites including Cys, GSH, PAPS and glucosinolate biosynthesis, as well as the relevant research in the future, so as to lay the foundation for the further study.
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Key words:
- botany /
- glucosinolates /
- biosynthesis /
- GSH /
- PAPS /
- primary sulfur metabolism /
- review
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植物的蒸腾作用是其水分利用的主要方式，拉动水分在“土壤—植物—大气”连续体体系中不断循环迁移。蒸腾耗水与植物生命表征直接联系，决定着植物的水分盈缺和灌溉与否[1]。对活立木蒸腾耗水的准确测定，可以为低耗水树种选择、合理密度配置以及城市园林绿化等工作提供理论依据和参考[2]。树木蒸腾耗水产生的水势差会拉动水分通过木质部向上运输进而形成液流，因此树干液流可作为评估树木蒸腾耗水能力的一项重要指标[3-4]。目前，有多种方法可以评估树木蒸腾耗水能力，多数是通过测定树木液流速率来估算蒸腾耗水量和耗水能力。不同树干液流测定方法测量精度不同，在选择树干液流速率测量方法时需要考虑实验研究目的、活立木树种的生理条件和实验研究所处的自然环境等因素。目前液流速率的测量主要有同位素示踪法和热技术法[5] 2类。其中同位素示踪法通过将化学同位素作为示踪剂注射到树木木质部，从而检测树木液流速率；但该方法在野外应用不便，且测定精度较低，有待改进[6]。利用热技术法测定树干液流不受外界环境和树木自身结构影响，安装布置操作相对简易，并且对树木组织结构损伤较小，具有一定的应用优势[7]，因此被广泛应用于树干液流测定、液流速率与环境因子的关系研究中[8-10]。如王檬檬等[11]应用热技术法研究了晋西黄土区苹果Malus pumila树液流速率与太阳辐射、大气水份等的关系；温淑红等[12]应用热技术法分析了宁南黄土陵区山桃Amygdalus davidiana树树干液流速率与太阳辐射、温度、风速的关系；杨洁等[13]应用热技术法研究了树干液流时滞效应，并精确估算树木的蒸腾耗水；还有学者[14-15]应用热技术法探究树干木质部径向不同深度的液流速率和不同时间尺度下的液流速率特征等。目前常用的测量树干液流的热技术法主要有热脉冲法(Heat Pluse Velocity Method，HPVM)、热平衡法、热扩散法、热场变形法以及外热比法等，前3种方法在国内应用较多，后2种方法在国外有较为详细的应用描述，但在国内的研究有限。鉴于此，本研究综述了现有的树干液流无损检测方法，阐述这些方法的基本原理、装置布置、应用领域和最新研究案例，对不同热技术方法的测量精度、适用范围、潜在优势以及今后改进方向等方面进行讨论和比较，并对不同研究目标和实验条件下适用的测定方法给出建议，展望各自在液流研究方面的应用前景。
1. 基于热技术的液流检测方法
1.1 热脉冲法
热脉冲法最早由HUBER等[16]提出，首次用热作为液体流动的示踪剂，利用热脉冲测量植物液流速率。该装置由加热元件和2个热电偶组成探针块，通过测量加热器发出热脉冲随着液流上升到达热电偶处所需的时间，计算液流速率(图1A)。由于热传导和对流会使得测量结果偏高，MARSHALL[17]利用热流方程建立了热脉冲法的模型框架，为热脉冲法的进一步发展提供了理论基础。
基于脉冲加热的方法包括补偿热脉冲法、最大温差法(T-max法)以及热比率法。其中补偿热脉冲法(Compensation Heat Pulse Method，CHPM)通过测量2个对称放置在线性加热器两侧的温度传感器达到相同温度时的时间来计算液流密度，该装置安装探针时会对周围木材组织造成损伤而导致液流速率失真，因此需要根据不同探针间距设置校正参数[18]，从而使液流速率的测量值更接近真实值。T-max法[19]的装置由加热器和1个温度探针组成，通过记录从发出热脉冲至温度探针到达最大温度时的时间，再根据MARSHALL的基础理论计算液流速率。该方法设备简单，仅需确定被测树干边材的导热系数，即可计算树干液流密度。热比率法(Heat Ratio Method，HRM)基于补偿热脉冲法提出[20]，测量范围可以达到零值甚至延伸至负值，其装置由1个加热器和2个安装在加热器上下游的温度探针组成，通过测定2个探针的增温比即可计算液流速率。
1.2 热平衡法
热平衡法(Heat Balance Method，HBM)的原理是当树干内通过一定量液流时，加热元件作为热源会向树干提供已知的热量，直至树干温度趋于稳定。若不考虑热传导以及隔热层损失热量，热源提供的热量应与被液流带走的热量相等，可根据这种热平衡关系计算液流速率。热平衡法可分为茎热平衡法和树干热平衡法[21]。
1.2.1 茎热平衡法
茎热平衡法(Stem Heat Balance，SHB)[22]以环形加热元件作为热源，提供稳定的热量，热量散失途径包括树干液流带走、热传导向树干上下方散失和对流散失。装置(图1B)设计为包裹式，利用包裹式隔热层(通常为聚苯乙烯泡沫)防止热辐射造成的热量散失(树干周围的热辐射忽略不计)。加热元件上下方安装2对热电偶，用来测定液流通过后的温差，依据热量平衡关系计算液流。SHB法适用于测定胸径较小的树干，其优点是检测时不需要标定，不需要将热电偶插入树干中，对树木无直接损伤。
1.2.2 树干热平衡法
树干热平衡法(Trunk Heat Balance，THB)[23]的原理与茎热平衡法类似，均通过热量平衡关系计算液流，不同点是THB法测量装置(图1C)由插入树干的加热片和1对热电偶组成，2个热电偶分别安装在紧挨加热片上端(温度场最大值)和加热片下端(不受温度场影响)位置，通过记录液流通过前后树干温度差来计算液流。THB法同样不需要标定，并且可测定胸径较大的树干。但THB法设备较多，安装相对复杂，易对树干造成微损伤。目前热平衡法的应用较为广泛，通常用来研究环境因子与液流速率的关系以及耗水特性。
1.3 热扩散法
热扩散法(Thermal Dissipation Method，TDM)[24]又称Granier法，是目前应用最广泛的液流测定方法。该装置(图1D)包含2个传感器探针，沿液流方向插入树干中。下游(上部)探针包括加热元件(长约20 mm)，并缠绕在装有热电偶的钢针上，热电偶尖端正对加热元件的中间；下游(上部)探针不加热，用作参考探头，以测量木质部的环境温度。工作时下游探针以恒定功率(0.2 W)连续加热，受液流的散热影响，2个探头间存在温度差异，因此可通过温差与液流速率间的关系计算液流速率。
TDM法常用来研究树干液流与环境因子的关系。万艳芳等[25]应用热扩散技术测定并分析了青海云杉Picea crassifolia树干液流密度与环境因子的关系，确定液流密度的主要环境影响因子是太阳辐射。朱敏捷等[26]利用热扩散法测定了尾叶桉Eucalyptus urophylla树干液流，研究了树干液流的方位差异以及与环境因子的关系。姚增旺等[27]应用热扩散探针测定梭梭Haloxylon ammodendron树干液流，研究了树干液流与环境因子之间的时滞效应。另外，通过测定单株树干液流还可以推算林分蒸腾量。王志超等[28] 研究了林分蒸腾耗水规律后发现：忽略夜间林分蒸腾耗水量会导致对林分蒸腾耗水量的估计不准确。
1.4 热场变形法
基于热脉冲法测量树木液流密度时，需要测量热脉冲前后温度，获得温度差，这就要求木材具有较高的热稳定性；热脉冲法两侧测量需要时间间隔，可以测得液流密度的最大值为45 cm3·cm−2·h−1，说明该方法具有一定的局限性。为解决以上问题，NADEZHDINA等[29]提出了热场变形法(Heat Field Deformation，HFD)，通过记录线性加热器周围的木质部中不同径向位置的热场变化，将热场变形与树干木质部的液流密度联系起来。热场变形法液流检测系统(图1E)包括3个探针和1个加热器，其中2个探针沿轴向对称安装在加热器的上游和下游，另1个探针沿切向平行于加热器水平安装在加热器侧边，轴向探针测量对称温差，切向探针测量不对称温差。通过测定加热器周围轴向和切向的温度差来表征由树液流动而产生的热场变化，进而确定液流密度。液流密度q (cm3·cm−2·h−1)的一般计算公式为：
$$ q=3\; 600D_{{\rm{st}}}(K＋T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 其中：Dst表示树干边材热扩散率(m2·s−1)；(K＋Ts-a)/Tas表示温差比率；ZaxZtg表示传感器探针间距离的校正因子；Lsw表示边材深度。K表示零液流下Ts-a的绝对值，其中Ts-a为Tsym与Tas的差。Tsym表示对称探针间的温差；Tas表示非对称探针间的温差；Zax表示轴向上游探针与加热器的距离；Ztg表示切向探针与加热器的距离。
HFD传感器也可以记录反向流量，即将Tsym改为负值。因此，计算公式转换为：
$$ q＝－3 \;600D_{{\rm{st}}}(－K+T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 用HFD法测量液流密度，非零液流下，利用线性外推法能准确测得零液流密度，相比其他热技术方法优势显著。同时HFD法结合了对称与非对称温差测量，利用对称温差测量低液流密度较为有效，而测得的高液流密度与实际蒸腾量线性关系不显著，因此高液流密度准确性不够[30]。而利用非对称温差测量是中高液流密度准确性较高。因此，HFD法对于低液流量和高液流量都可以准确测定。
HFD法广泛应用于液流指数(the sap flow index，SFI) 的测定。SFI是植物水分状况的敏感指标，用来决定植物是否需要灌溉。SFI值通过在加热器周围轴向等距安装差动热电偶测得，是液流速率测定的原始数据之一[31]。此外，HFD法可以直接监测木质部的水分运动[32]，通过沿着木质部半径的不同深度，用围绕普通线性加热器的传感器进行液流测定，具有快速响应和高度敏感的特性。NADEZHDINA[33]在对枫树Acer spp. 水运输路径的研究中，利用HFD法测定枫树木质部液流，证实了枫树的维管结构具有完整拓扑结构。
1.5 外热比法
外热比法(External Heat-Ratio，EHR)是在热比率法的基础上提出的，用外部加热元件代替插入式加热元件，其基本原理与激光脉冲法(laser heat-pulse gauge，LHPG)类似。不同点是后者用近红外激光源代替插入式加热元件，并通过红外摄像机从外部监控热量传播，热脉冲速度由温度数据确定，并与液流速率相关。HELFTER等[34]利用激光脉冲法对小茎木本植物的液流速率进行了测定，发现小茎木本植物韧皮部与木质部液流速率几乎一致。CLEARWATER等[35]首次提出了外热比法(图1F)，将1个微型外部加热器(电子芯片电阻)和温度传感器(精密热电偶)粘在软木块上，并压在茎干表面。释放热脉冲后，根据2个热电偶的增温比来计算液流密度。利用外热比法可以测定灌木液流速率[36]，研究植物水动力学，对直径较小的茎干具有良好的适用性。外热比法最小可测直径为5 mm，可测液流密度为0.36~50.00 cm3·cm−2·h−1，较少应用于直径较大的茎干。因此，下一步可改进EHR技术，用于测定较大茎段植物的液流密度。
2. 问题与建议
2.1 热技术方法的不足与改进
探针的使用会对树干边材造成一定的破坏，使得探针处树干边材的热均匀性改变，从而降低测量结果的准确性。GREEN等[37]用二维的“热-液流”模型确定不同伤口大小的校正因子，给出了补偿脉冲法和T-max法的校正因子表，并通过比较美洲黑杨Populus deltoides与白柳Salix alba的液流通量值与实际蒸腾速率值的关系证明了校正因子的有效性。TESTI等[38]在补偿热脉冲法的基础上提出了校准平均梯度法(calibrated average gradient，CAG)，有效测定了低速液流，使用也较为简易。
LANGENSIEPEN等[39] 发现：为更好地适应小麦Triticum aestivum茎的解剖结构和热物理特性，在应用茎热平衡法测量小麦液流速率时，通过引入降噪方程可有效提高液流计的测量精度。TRCALA等[40]利用热场变形法的温度场理论，通过改变传感器的几何形状(从垂直到水平)来改善热平衡法的传感性能，实现了零液流和反向液流的测定。这种方法也被称为线性热平衡法[41]，是从基础传导—对流传热方程解析得出的精确方程，不仅提高了液流测定的精度，而且基于热导率信息实现了水含量的估算。NAKANO等[42]发现：对金柑Fortunella crassifocia进行环剥处理后，可利用热平衡法测定其韧皮部和木质部的液流速率。
TDM法测定液流速率需要估算线性回归关系，确定零液流状态下的温差，而这个过程会产生一定误差[43]，许多情况下准确性受到质疑[44]。因此用热扩散法确定树木的蒸腾量时，有必要对测量树种液流量估计方程进行校准[45-47]。
外热比法也存在一些不足。首先，大多数加热传感器从加热芯片的中心到两侧感温元件有一定的窄间距。随着热量沿横截面向内传播和沿茎轴上下传播，热量到达木质部导管时变得非常分散，来自液流的热比率信号会减弱。其次，加热器和温度传感器被安置在1个矩形的不导电硅酮/软木块中，无法有效隔绝环境温度对检测温度的影响，增加了液流检测结果的误差。再次，矩形加热芯片横压在圆柱形树干上，载荷不均匀，加热器元件使用窄的矩形芯片电阻，比圆形芯片更容易断开。为此，王胜[48]开发了1种新设计的EHR加热传感器，增加了加热元件至温度传感器的间距，使之更适应直径较大的茎干。改良后的装置茎干直径检测范围扩大，可用于胸径较小的树木测量。
2.2 基于热技术液流速度测量的常用方法比较
目前，基于热技术的树干液流测定方法日趋完善，不同方法具有相对应的优势和劣势。由表1可知：不同热技术方法液流测定装置均包括为加热器提供能量的能量供应单元和用于收集检测数据的数据记录仪。具体来看，热脉冲法不受环境条件以及树冠结构及根系特性的影响，装置简洁，但存在一定的灵敏度和精度问题。热平衡法无需标定，测量精度有所提高，但仅适于测定高液流密度。热扩散法是目前研究蒸腾耗水特性应用最广泛的方法，测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的商业化产品，但测定结果容易被低估。热场变形法操作复杂，应用较少，但该方法能够准确测定零液流以及逆向液流，测定精度与范围也有很大的提升。外热比法与激光脉冲法均可实现精确的零破坏检测，但仅适用于胸径较小的树干，另外，激光脉冲法装置成本昂贵，未能普及。
表 1 树干液流的测定方法对比Table 1 Comparison of methods for sap flow measurement方法 装置 优点 缺点 热脉冲法 加热器，2个热电偶 不受环境条件，树冠结构及根系特性的影响，简洁准确， 经济可行[49] 存在测定精度问题[37−38] 热平衡法 探针，加热元件 无需标定，进一步提高了测量精度[22−23] 不适用于液流速率较高的 植物[50] 热扩散法 加热探针，参照探针 测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的 商品化产品[51] 液流可能被低估[43] 激光热脉冲法 近红外激光源，红外摄像机 无须将热源插入植物茎干内，避免对茎干内组织破坏而造 成误差[34] 成本较高 热场变形法 加热器，3根探针 能够准确地测定零液流量以及逆向液流[52] 测定过程较复杂[29] 外热比法 微型外部加热传感器 精确、无损地测定胸径较小的树干中的双向液流[53] 微型外部量规的配置尚存 在问题[35−36] 2.3 活立木液流测定方法选择建议
利用热技术方法测定液流速率，可以精确估算树木蒸腾耗水量[54]，但不同热技术方法的测量精度、测定范围以及适用性不尽相同，实际应用时应根据不同实验条件选择不同的热技术方法。选择热技术方法测定树干液流通常需要考虑树木胸径大小、热技术方法的误差范围、热技术方法的测定精度、热技术方法的可行性等因素。
首先，不同胸径活立木应选用不同的热技术方法，外热比法和茎热平衡法适合测定胸径较小的树木，树干热平衡法适合测定胸径较大的树木。其次，不同热技术方法可测得的液流速率范围不同，补偿热脉冲法、T-max法以及热扩散法测定低速液流的误差较大，茎热平衡法测定高液流速率时误差较大，热比率法和热场变形法测定液流范围较广。热场变形法和外热比法可以测定逆向液流，热场变形法还可以准确测定零液流。热脉冲法、热平衡法和热扩散法较成熟[55]，应用较广泛，可行性较高。另外，将不同测定范围的热技术方法组合使用，可以有效提高测定精度。不同植物的液流速率不同。向日葵Helianthus annuus和玉米Zea mays等植物的液流速率相对较低，在利用T-max方法测定时，测量值总是略高于实际值[56]；换成热比率法测定也不够精确，而采用T-max法与热比率法组合测量则较为准确。
3. 热技术方法应用展望
利用热技术方法测定液流速率约80多年的研究，方法不断得到改进与创新，在校准度、测定范围和测定精度上均有所提高，同时，实验操作不断简化，数据实现自动化采集和存储，并逐步实现连续时间以及多层空间的同步测定[57]。其中，热脉冲法、热平衡法、热扩散法经一系列的发展与完善，极大程度上减小了测量误差[58]。热扩散法还形成了成熟的商业化产品，并得到了广泛的应用。虽然利用外热比法和热场变形法测定活立木液流速率的研究有限，但外热比法实现了精确的零破坏检测，热场变形法液流速率测定范围广，并可准确的测定零液流和逆向液流。在利用外热比法测定液流速率时，需要针对不同样本以及实验条件设计不同的量规，这是外热比法的不足之处。因此，外热比法和热场变形法亟待更为深入研究。
目前，热技术方法成为液流测量的首要选择。在未来，应用热技术测定树干液流仍需关注以下热点：在完善研究活立木蒸腾耗水特点的同时，结合土壤生物因子和气象因子与树干液流的关系，进一步深入研究活立木生理作用；从微观和宏观方面监控水分运动，研究水分利用与树木生长的关系；在生产实际方面，进一步完善活立木单株和森林林区的数据监控，为实现高效的林区治理提供有力依据。
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2018.01.022
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