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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus病在亚洲和欧洲造成严重的生态和经济损失[1-2]，伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola (EV菌)是松材线虫的内寄生真菌，产生的新月形孢子能侵染并杀死松材线虫，在松材线虫的生物防治方面具有良好的应用前景[3]。同时，EV菌亦可侵染拟松材线虫B. mucronatus、水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi等线虫。研究表明：EV真菌胞内存在共生细菌[4]，共生细菌对真菌的生物学和生态学具有重要的作用，如Rhizopus microsporus胞内的共生细菌Burkholderia能产生植物毒素根霉素，然后由宿主真菌分泌到环境中，导致水稻枯萎病[5]。菌丝内的共生微生物(细菌或病毒)是重要的能直接或间接改变真菌和宿主关系的互作生物[6-8]，提高宿主真菌的生态适应性[9-10]。存在共生细菌的真菌对碳氮源如何响应，其代谢产物发生何种变化，目前尚未见相关报道。
代谢组学是系统生物学研究中非常重要的一个环节，旨在研究生物体或组织，甚至单个细胞的全部小分子代谢物成分及其动态变化[11]。通过对代谢物质的分析，可以从生物样本中检测并筛选出具有重要生物学意义和显著差异的代谢物质，并以此为基础研究生物体的代谢过程和变化机制[12]。对EV菌在不同碳、氮培养条件下代谢物的变化进行分析，明确显著差异代谢物，特别是重要的信号分子，不仅为EV菌的应用提供重要理论基础，而且对深入研究内共生细菌在EV菌的功能亦具有重要意义。
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伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola CBS115803购于荷兰菌物保存中心。
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碳培养基为24 g 马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，Becton， Dickinson and Company，美国)和10 g琼脂溶于1 L双蒸水。氮培养基为5 g酵母粉(OXOID公司，英国)和10 g琼脂溶于1 L双蒸水。
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Nano高分辨液质联用分析仪QE (Thermo Q-Exactive，德国)；赛多利斯BSA124S电子天平；真空浓缩仪(Labogene MaixVac Alpha, 丹麦)；Sigma 3-30KS高速离心机，KQ5 200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；色谱级甲醇(Fisher，美国)。
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配制碳、氮固体培养基，培养基凝固后放入已灭菌的尼龙膜(孔径3 μm，赛多利斯)，接种EV菌后于25 ℃培养7 d。将长满菌丝和孢子的尼龙膜用无菌镊子取出，用超纯水冲洗尼龙膜，再用无菌的吸水纸吸掉尼龙膜接触培养基面的水分，而后将菌丝和孢子刮入2 mL圆底灭菌干燥离心管，装样品前后分别称量离心管的质量，迅速将样品管放入液氮中淬灭后于−80 ℃保存。每处理设置5次生物学重复，编号依次为C1~C5和N1~N5。加入冷冻洁净无菌的直径为3 mm的钢珠2个，液氮冷冻条件下使用莱驰RETSCH MM 400研磨2 min。将研磨好的样品管置于干冰上，加入2 mL预冷的体积分数为80%甲醇于−80 ℃冰箱静置1 h，4 ℃、14 000 g离心20 min后将上清液转移至另一相同体积离心管，真空浓缩干燥样品后于−80 ℃保存。用300 μL体积分数为90%甲醇超声复溶并经0.45 μm的滤膜过滤，完成亲水代谢产物提取。
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采用非靶标的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对样品进行测定和代谢物识别。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm)。流动相：0.1%甲酸-水溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)。洗脱条件：0~0.5 min，95%B；0.5~7.0 min，95%~65% B；7.0~8.0 min，65%~40% B；8.0~9.0 min，40%B；9.0~9.1 min，40%~95%B；9.1~12.0 min，95%B。质谱参数条件：鞘气，310 275 Pa；辅助气，103 425 Pa；喷雾电压，4 000 V (正)/3 500 V (负)；离子传输管温度：350 ℃。在采集软件(Xcalibur 4.0.27，Thermo)的控制下，采用一级质谱全扫描(全MS)结合自动触发二级质谱扫描(MS/MS)模式，使用阴、阳离子模式2种电离方式采集质谱数据。运行时间：0~18 min。分辨率：全MS，170000；MS/MS，17500。
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对原始数据进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，最终得到1个保留时间、质荷比和代谢物信号(峰面积)的数据矩阵。将处理后的代谢物信号与一级和二级数据库进行匹配，将其中二级得分＜30的化合物可信予以剔除。分析时10份样品共插入3个质量对照(QC)样本以考察整个分析过程中仪器的稳定性，QC样本每种化合物的峰面积的变异系数若＞30%，则予以剔除。未检出值设定为0，缺失值由其余重复样品的均值填补。
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由Metaboanalyst 4.0在线软件(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)完成。利用对数转换和pareto缩放对各代谢物相对含量进行标准化处理。使用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判别法(PLS-DA)评估不同处理的分组情况。结合以下2个标准对2种培养基的阴阳离子模式的差异化合物进行筛选：经FDR (false discovery rate)校正的t检验的P＜0.05；正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中变量投影重要性(variable influence on projection，VIP)得分＞1。
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代谢通路分析由Metaboanalyst 4.0 (
https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/upload/PathUploadView.xhtml )中的代谢通路分析模块(pathway analysis module)完成。该分析将选定的差异代谢物与KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库(2019年10月)和人类代谢组数据库(HMDB)进行匹配，然后选择酵母Saccharomyces cerevisiae的代谢通路库作为参照进行富集分析和拓扑分析。富集分析中采用参数超几何法(hypergeometric test)检验每个代谢通路的显著性(P＜0.05)；拓扑分析中差异显著性检验的方法为相对介数中心性(relative-betweeness centrality)。 -
阳离子模式下鉴定到的化合物多于阴离子模式下鉴定的化合物。阴、阳离子模式分别检测出279和461种化合物，其中74种为2种模式共同检出，共计666种化合物。通过质量控制过滤处理，阴、阳离子模式分别有176和362种化合物，其中2种模式共同含有40种化合物，共计498种化合物。数据总的缺失值的比例平均为0.74%：阴离子模式下，碳和氮培养基下的代谢物缺失率均为0.23%；阳离子模式下，碳培养基下的缺失率为2.38%，高于氮培养基0.11%。
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阴离子和阳离子模式下EV菌菌丝体代谢物的主成分分析得分图(图1A~B)显示：前2个主成分分别解释了94.9% (主成分1为92.5%，主成分2为2.4%)和92.5% (主成分1为89.5%，主成分2为3.0%)的变异。2种离子模式下EV菌代谢谱在碳、氮培养基培养后差异大，分组明显。偏最小二乘法判别法的分组结果(图1C~D)与主成分分析法结果一致。
图 1 碳、氮培养条件下EV菌代谢物的PCA和PLS-DA分析
Figure 1. PCA and PLS-DA of EV metabolites under carbon and nitrogen culture conditions
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采用火山图的形式进行差异化合物展示，见图2。t检验差异显著(P＜0.05)的化合物共有444种，占总数的89.2%；阴离子和阳离子模式分别有162和310种，28种为2种模式共有。VIP＞1的化合物共有469种，占总数的94.2%；阴离子和阳离子模式分别有167和334种，32种为2种模式共有。利用VIP＞1筛选出的化合物包含t检验法的筛选结果，表明后者更严格，且更符合统计要求。
图 2 碳、氮培养条件下EV菌的差异代谢物
Figure 2. Differential metabolites of EV bacteria under carbon and nitrogen culture conditions
以碳为对照组，在氮组中上调代谢物的数量是下调的3.4倍，分别为342和102种；上调和下调代谢物分别有309和86种匹配到HMDB数据库，有159和71种匹配到KEGG数据库。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是在氮培养下大量产生的特有代谢物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是代谢物在氮培养条件下显著上调(表1)。
表 1 部分差异化合物
Table 1. Part of significantly different metabolites
化合物名称 质荷比 保留时间/min 二级数据库得分 变化倍数 P KEGG编号 磷酸胍基乙酸酯 198.03 9.86 62 12.46 1.13×10−13 C03166 对甲酚硫酸盐 187.01 6.17 53 12.41 8.88×10−15 邻氨基苯甲酸酯 136.04 2.00 50 9.93 1.67×10−8 C00108 尿酸 190.05 1.29 40 8.26 6.26×10−7 C01717 尼古丁 163.12 4.68 44 5.51 1.14×10−6 C16150 4-羟基-2-喹啉羧酸 188.03 5.76 30 5.48 9.62×10−8 C01717 烟酸 124.04 3.50 41 5.17 1.71×10−7 C00253 尿囊素 159.05 5.46 50 5.09 2.53×10−4 C01551 吲哚丙烯酸 188.07 7.98 98 4.20 4.68×10−8 2-吡咯烷酮 86.06 3.79 41 4.10 2.57×10−5 C11118 咪唑乙酸 127.05 9.62 69 3.54 1.56×10−7 C02835 组胺 112.09 5.74 45 3.34 2.79×10−8 C00388 谷胱甘肽 306.08 1.02 58 3.26 5.97×10−4 C00051 光色素 243.09 1.58 70 3.00 2.79×10−4 C01727 肌肽 227.11 12.66 55 2.40 3.30×10−5 C00386 甜菜碱醛 102.09 6.73 68 2.25 9.68×10−3 C00576 吲哚 118.07 8.32 57 2.12 4.40×10−3 C00463 苹果酸 133.01 0.90 43 1.90 2.86×10−5 C00711 甜菜碱 118.09 8.30 51 1.88 2.79×10−8 C00719 胍基乙酸d 118.06 8.26 38 1.87 1.19×10−3 C00581 葫芦巴碱 138.06 9.05 38 1.59 1.71×10−7 C01004 海藻糖 341.11 1.04 78 1.34 6.16×10−5 C01083 左旋肉碱 162.11 9.31 72 1.34 2.97×10−6 C00318 邻乙酰左旋肉碱 204.12 8.54 73 1.32 1.69×10−6 C02571 茶碱 181.07 2.24 55 −1.64 6.07×10−7 C07130 二乙醇胺 106.09 8.16 45 −1.73 1.42×10−4 C06772 去甲肾上腺素 170.08 5.83 57 −2.40 1.52×10−5 C00547 阿魏酸盐 193.05 5.36 32 −3.58 2.87×10−5 C01494 核糖醇 151.06 1.01 46 −4.08 3.13×10−8 C00474 甲基咪唑乙酸 141.07 9.52 41 −4.51 2.90×10−8 C05828 赤藓糖醇 121.05 1.04 75 −5.20 2.80×10−5 C00503 -
由表2和图3可见：利用KEGG数据库对氮培养中上调和下调的显著差异代谢产物进行富集分析。上调代谢产物主要富集到氨基酸代谢通路，包括氨酰基tRNA的生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，精氨酸生物合成，牛磺酸和低牛磺酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。下调的显著差异代谢产物主要涉及糖类代谢通路，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、淀粉和蔗糖代谢。
表 2 碳、氮培养条件下EV菌差异代谢物富集到的KEGG通路
Table 2. Enriched KEGG pathways by differential metabolites of EV under carbon and nitrogen culture conditions
代谢通路编号 代谢通路名称 匹配情况 P 影响大小 上调 sce00970 氨酰基tRNA的生物合成 18/46 4.38×10−4 0.11 sce00330 精氨酸和脯氨酸代谢 10/25 7.53×10−3 0.33 sce00220 精氨酸生物合成 8/18 8.05×10−3 0.60 sce00430 牛磺酸和低牛磺酸代谢 4/7 2.28×10−2 1.00 sce00250 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 8/22 3.06×10−2 0.81 下调 sce00520 氨基糖和核苷酸糖代谢 8/24 3.41×10−4 0.48 sce00052 半乳糖代谢 5/17 8.98×10−3 0.82 sce00040 戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化 4/12 1.22×10−2 0.27 sce00500 淀粉和蔗糖代谢 4/15 2.79×10−2 0.35 说明：匹配情况为匹配化合物个数/通路化合物总数 
图 3 差异代谢产物富集到的显著代谢通路
Figure 3. Significant metabolic pathways enriched by differential metabolites
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本研究在代谢组水平探究含内共生细菌的生防真菌EV菌对不同碳氮培养基的化学响应，鉴定到一些差异显著的化合物，尤其是在氮源培养基中特有的代谢产物，并定位到重要代谢途径上。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是在氮培养下EV菌大量产生的特有代谢物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是氮培养条件下显著上调的代谢物。对甲酚硫酸盐是细菌代谢酪氨酸的产物[13]。已有研究证实：拟杆菌科Bacteroidaceae、双歧杆菌科Bifidobacteriaceae、梭菌科Clostridiaceae、肠杆菌科Enterobacteriaceae、肠球菌科Enterococcaceae、优杆菌科Eubacteriaceae、梭杆菌科Fusobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳杆菌科Lactobacillaceae、紫单胞菌科Porphyromonadaceae、葡萄球菌科Staphylococcaceae、疣微菌科Ruminococcaceae和韦荣氏菌科Veillonellaceae等细菌是对甲酚硫酸盐的产生菌[14]。已有研究表明：细菌也可以降解对甲酚[15]，真菌Trichosporon cutaneum和Aspergillus fumigatus也可以利用对甲酚作为碳源[16-17]。因此推测：对甲酚硫酸盐可能是在高氮源培养下，由于碳源严重缺乏，EV菌胞内共生细菌代谢酪氨酸产生对甲酚或对甲酚硫酸盐，从而将其做为碳源进一步利用。
多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌(迄今为止共有85种)都会产生大量的吲哚。作为细胞间信号分子，吲哚控制细菌生理的多个方面，例如孢子形成、质粒稳定性、耐药性、生物膜形成和吲哚产生细菌的毒力[18]。在细菌中，吲哚由氨基酸色氨酸的降解产物产生。吲哚是细菌Ⅲ型分泌系统表达的信号分子[19]。EV真菌细菌共生体可产生吲哚，根据上述目前的研究只在细菌发现吲哚的产生，因此我们推测胞内细菌可能是吲哚的产生者，细菌可以利用吲哚这一信号分子协调两者行为，以在真菌胞内生存。
前期研究表明：EV菌基因组中含有比其他杀线虫真菌，如Arthrobotrys oligospora、Dactylellina haptotyla、Drechmeria coniospora更多的尿囊素转运蛋白[20]。此外，EV菌胞内的共生细菌属于假单孢属Pseudomonas[6]。尿囊素是腺嘌呤和鸟嘌呤代谢的中间产物，尿囊素可以被某些真菌、细菌和植物用作碳和氮的来源，尿囊素或尿囊素通路的衍生物可能有助于提高真菌向宿主植物提供氮的能力[21]。如在一些外生菌根真菌中，已鉴定出尿囊素/尿囊酸转运蛋白[21-22]。研究发现：假单孢属的细菌和酵母Saccharomyces cerevisiae也可以降解尿囊素[23-24]。在氮源充足的氮培养条件下，尿囊素代谢产物约是碳培养条件下的32倍，因此，尿囊素很可能是EV菌供给胞内共生细菌氮源的一种形式。
海藻糖在自然界中分布广泛，包括细菌、真菌、植物、无脊椎动物和哺乳动物。由于其特殊的物理特性，海藻糖能够保护细胞的完整性免受各种环境损害和营养限制。细菌可以使用海藻糖作为碳和能量的唯一来源，一些分枝杆菌中海藻糖可作为细胞壁的结构成分，而酵母细胞在很大程度上不能以海藻糖为碳源生长[25]。在根瘤菌-豆科Leguminosae植物共生期间，海藻糖在根瘤发育过程中被储存在根瘤中，并成为细菌的主要碳水化合物，而与所供应的碳源和氮源类型无关[26]。内源性海藻糖在碳缺乏或在给定培养基中碳源耗尽后被动员。海藻糖很可能是EV共生细菌的一种碳源，在碳源缺乏时作为储备能源(氮培养下产生的海藻糖是碳培养下的2.5倍)。
光色素是核黄素的光敏分解产物。关于光色素的酶促转化路径已在假单胞菌等细菌中进行研究[27]。已有研究认为：光色素是细菌群感效应的信号分子[28]，是能影响植物生长的细菌信号分子[29]，同时也是共生的信号分子[30-31]。不同的营养条件(如氮和磷)可改变细菌产生光色素的浓度[30]。本研究使用的氮源是有机氮源。在该氮培养下产生的光色素是碳培养下的8倍，氮培养条件下光色素的产量远高于碳培养条件，不同于前人报道的高浓度硝酸盐降低光色素的产量[30]。
差异最显著的代谢物多数未能富集到显著的代谢通路，原因在于这些化合物的代谢通路尚未研究透彻，或者它们是EV菌的特异化合物，尚未包括在参照数据库中。无论以真菌还是细菌数据库为参照，富集到的显著代谢通路基本一致，均与氨基酸和糖类代谢相关，而这些通路是真菌和细菌共有的，无法区分内共生细菌对其真菌宿主代谢的影响。笔者曾试图利用多种抗生素去除内共生细菌以解决该问题，并未获得成功，需要更深入的研究。
Metabolome of nematicidal fungus Esteya vermicola in carbon and nitrogen culture
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摘要:
目的 比较伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola (EV菌)在碳、氮营养源培养下的代谢差异，并找到重要代谢物或信号分子。 方法 选取培养真菌的碳培养基[主要为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)]和培养细菌的氮培养基(主要为酵母粉)，将EV菌在2种培养基上25 ℃条件下培养7 d，收获菌丝体并提取代谢产物。采用非靶标的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)，在阴、阳离子模式下对代谢物组分进行分析和鉴定，并分析差异显著代谢物的代谢通路。 结果 共得到498种代谢物，阴、阳离子模式分别有176和362种，其中2种模式共同含有40种。差异显著的代谢物共有444种，占总数的89.2%，其中阴、阳离子模式分别有162和310种，有28种为2种模式共有。主成分和偏最小二乘判别分析均可使碳、氮培养条件下的代谢物聚为不同的簇并显著分离。氮培养条件下，磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是大量产生且特有的代谢物；重要代谢物尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖产量显著上调。通路分析将显著上调和下调的代谢物分别富集到氨基酸和糖类代谢相关的代谢通路。 结论 EV菌在碳培养和氮培养条件下呈现明显的代谢差异，代谢通路主要涉及糖类和氨基酸代谢。重要代谢物可为EV菌的高效培养和应用提供基础。图3表2参31 Abstract:Objective The objective is to compare the metabolic differences of the nematode-killing fungus Esteya vermicola (EV) cultured in carbon and nitrogen nutrient sources and to identify key metabolites or signal molecules. Method The carbon medium (mainly composed of PDB) for culturing fungi and the nitrogen medium (mainly composed of yeast powder) for culturing bacteria were selected. EV bacteria were cultured on two kinds of culture media at 25 ℃ for 7 days. The mycelia were harvested and the metabolites were extracted. Non-target high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) was used to analyze and identify metabolite components in both positive and negative ion modes. The metabolic pathways of metabolites with significant differences were analyzed. Result A total of 498 metabolites were identified, including 176 negative and 362 positive ion modes and 40 metabolites in both modes. There were 444 metabolites with significant differences, accounting for 89.2% of the total, among which 162 were negative and 310 were positive, and 28 were common to the two modes. Both principal component analysis and partial least square discriminant analysis could cluster the metabolites into different clusters and separate them significantly in carbon and nitrogen culture. In nitrogen culture, guanidine phosphate acetate and p-cresol sulfate were abundant and unique metabolites, and the yield of allantoin, photopigment, indole, and trehalose were significantly up-regulated. Pathway analysis enriched the significantly up-regulated and down-regulated metabolites into the metabolic pathways related to amino acid and carbohydrate metabolism, respectively. Conclusion EV bacteria showed significant metabolic differences in carbon and nitrogen culture. The metabolic pathway mainly involves carbohydrate and amino acid metabolism. The important metabolites will provide a theoretical basis for efficient culture and application of EV. [Ch, 3 fig. 2 tab. 31 ref.] -
Key words:
- biocontrol fungi /
- Esteya vermicola /
- metabonomics /
- LC-MS
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随着环境保护要求的不断提高，环保型木材防腐剂越来越受到重视，此类防腐剂多以高效低毒的有机农药为主成分，配合其他助剂制备成有机型或水基型防腐剂[1-2]。三唑类杀菌剂，如丙环唑、戊唑醇、环丙唑醇、氟环唑和苯醚甲环唑等，既可以单独使用，又可以与铜制剂复配[3-4]，是目前常用的木材防腐剂；这些三唑类杀菌剂杀菌谱不尽相同，作用机制也有所差异，应用较广泛的是丙环唑和戊唑醇[5-6]。常见的木材防霉剂有异噻唑啉酮类如卡松、1,2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)、4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮(DCOI)等，有机碘类如碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)，三唑类等[7]，杀菌谱也不尽相同；常用的仓储水果防霉剂如溴菌腈和抑霉唑[8-9]，防霉活性较高，但较少应用于木材防霉。菊酯类杀虫剂是常见的防治白蚁的药剂，具有用量少、成本较低、废弃物易回收、环境相对友好等优点；高效氯氟氰菊酯在菊酯类杀虫剂中活性较高、稳定性较强、耐雨水冲刷性能较好。因含有大量羟基等亲水基团[10]，木材变色、发霉、腐朽、变形等问题频发，品质降低[11-13]，常用亚麻油、桐油、豆油、核桃油等含甘油三脂肪酸酯的植物油[14]和沥青、石蜡等含长链烷烃的矿物油用作木材防水；现代工业多将植物油与动植物蜡等复配成木蜡油[15]，用作木材的表面防水处理剂。如马红霞等[16]使用56号石蜡制备木材防水剂，当石蜡质量浓度为5%时，防水效率可达54%；由此可见，石蜡可作为良好的木材防水剂。液体石蜡是经原油分馏得到的无色无味的液态烃类混合物，室温下为液态，用作防水剂时可省去加热融化环节，节约了能源和时间。木材在使用过程中需要多重保护，如防腐、防霉、防虫和防水等，存在工序繁琐、成本高昂等问题，为满足木材不同生物危害防治需要，本研究拟制备一种同时具有防腐、防霉、防虫和防水多项功能的水基型有机木材保护复合制剂，通过室内抑菌圈法筛选不同杀菌剂的抑菌活性，从中挑选活性较好、杀菌谱互补的防腐成分与防霉成分进行复配，并筛选两者的最佳配比；将其与杀虫成分和防水成分复配，制备成可以兑水自动乳化的乳油制剂。制备的复合制剂稳定性好，兼具防水、防腐、防霉、防白蚁等性能，同时处理工序简单，可达到常规生物危害防治要求的目的，为木材保护提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 杀菌剂、杀虫剂和防水剂
杀菌剂包括氟环唑(FCZ)、戊唑醇(TEB)、丙环唑(PPZ)、苯醚甲环唑(DCZ)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)、溴菌腈(BMN)、抑霉唑(IMZ)。杀虫剂为高效氯氟氰菊酯(CLT)。防水剂为液体石蜡(化妆品级)。以上试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.2 测试菌种
木材腐朽菌有褐腐菌密粘褶菌Gloeophyllun trabeum、白腐菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor。木材混合霉菌有黑曲霉Aspergillus sp.、木霉Trichoderma sp.、青霉Penicillium sp.。木材变色菌可可球二孢Botryodiplodia theobromae。所有菌株均为实验室保存的生物测试标准用菌株。
测试树种为辐射松Pinus radiata。
1.2 试验方法
预实验通过满细胞法确定辐射松边材吸液(水)量为750~850 kg·m−3；根据三唑类药剂防腐有效载药量(200.0~400.0 g·m−3)[17]，换算药剂质量浓度为150.0~300.0 mg·L−1，确定试验用药质量浓度为200.0 mg·L−1。
1.2.1 防腐、防霉成分及配比筛选
通过室内抑菌效果普筛挑选出效果较好且杀菌谱互补的杀菌剂作为防腐和防霉成分。将挑选出的防腐和防霉成分按照不同配比混合进行复配，再次测试室内抑菌效果，确定效果较好的复配比例作为药剂配伍。
1.2.2 室内抑菌圈测试
参照《中华人民共和国药典》的“抗生素微生物检定法”测试抑菌圈。将5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ、IPBC)统一配制成质量分数为5.00%的乳油，分别加水稀释到200.0 mg·L−1；防霉剂IMZ配制为400.0 mg·L−1，BMN分别配制为400.0、600.0和800.0 mg·L−1。在各涂满真菌孢子液的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，分别摆放4个装有0.3 mL待测药液的牛津杯。随着药液的扩散，培养基上的真菌菌丝会受到抑制形成抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明药剂抑菌效果越好。
1.2.3 制剂性能测试
乳液稳定性测试。参照GB/T 1603—2001《农药乳液稳定性测定方法》，在100.0 mL室温标准硬水中慢慢加入不同体积样品，边加入边搅拌，加完后继续搅拌30 s；然后在30 ℃恒温水浴中静置1 h，观察不同稀释倍数下样品乳状液分离情况。无浮油、沉淀或沉油则视为乳液稳定性合格。
防水性能测试。将含液体石蜡质量分数为40.00%的复合制剂分别兑水，稀释液体石蜡质量分数为2.00%、4.00%、8.00%，满细胞法处理试块。辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，室温平衡21 d后称质量，然后蒸馏水浸泡30 min，取出试块，称质量，参照GB/T 1934.1—2009《木材吸水性测定方法》计算吸水率；测量弦向尺寸变化，参照GB/T 29901—2013《木材防水剂的防水效率测试方法》计算防水效率。
室内防腐性能测试。参照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能第1部分：天然耐腐性实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍备用，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组6块试块，经真空−0.09 MPa处理10 min，常压浸渍10 min，参照标准测试防腐性能。试块质量损失率＜10%，属于Ⅰ级强耐腐；质量损失率为11%~24%，属于Ⅱ级耐腐；质量损失率为25%~44%，属于Ⅲ级稍耐腐；质量损失率＞45%，属于Ⅳ级不耐腐。
室内防霉性能测试。参照GB/T 18261—2013《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，参照标准方法处理试块，测试防霉性能。试块表面无菌丝、霉点时，定义侵染值为0；试块表面感染面积＜1/4，定义为1；试块表面感染面积1/4~1/2，定义为2；试块表面感染面积1/2~3/4，定义为3；试块表面感染面积＞3/4，定义为4。
室内防白蚁测试。参照GB/T 18260—2015《木材防腐剂对白蚁毒效实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组5块试块，参照标准方法处理试块，测试室内防白蚁性能。试块蚁蛀程度为完好无损，定义试样完好等级为10；微痕蛀蚀，定义为9.5；轻微蛀蚀，截面面积＜3%的蛀蚀，定义为9；中等蛀蚀，截面面积3%~10%的蛀蚀，定义为8；中等蛀蚀，截面面积10%~30%的蛀蚀，定义为7；严重蛀蚀，截面面积30%~50%的蛀蚀，定义为6；非常严重蛀蚀，截面面积50%~75%的蛀蚀，定义为4；试块几乎完全被蛀毁，定义完好等级为0。
2. 结果与分析
2.1 有效成分筛选
从表1可以看出：5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ和 IPBC)对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)均具有较好的抑制效果，但FCZ、TEB和PPZ对变色菌(可可球二孢)和混合霉菌几乎没有抑制作用，只有DCZ对可可球二孢有抑制效果，因此优选DCZ作为防腐成分。IPBC和IMZ对所测试菌种均有较好的抑制效果，BMN和IMZ虽然对混合霉菌和变色菌有抑制作用，但抑菌圈均小于IPBC。因此，优先IPBC作为防霉成分。
表 1 各杀菌剂的室内抑菌效果Table 1 Result of inhibition zones test by bactericide杀菌剂 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌FCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 TEB 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 PPZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 34.6 21.9 BMN 800.0 37.2 35.4 12.8 10.6 600.0 38.1 29.0 9.0 9.4 400.0 26.8 31.8 8.3 7.1 IMZ 400.0 39.2 41.6 26.9 12.7 将DCZ和IPBC按质量比1∶1、1∶3、3∶1的比例配制混合药剂，测试DCZ+IPBC复配药剂对腐朽菌和霉菌的抑制效果；将其他3种三唑类防腐药剂(FCZ、TEB和PPZ)与IPBC按照质量比1∶1配制复配药剂，作为对照测试抑菌效果。由表2可以看出：DCZ+IPBC复配药剂对木材腐朽菌、变色菌和混合霉菌的抑制效果较好，其中按照1∶1比例复配的药剂效果最高。相其他三唑类与IPBC的复配药剂，抑菌效果亦有所提高。由此确认防腐/防霉复配药剂，DCZ和IPBC按照1∶1进行配制。
表 2 不同三唑类药剂与IPBC复配的抑菌效果Table 2 Result of inhibition zones test by compounded of different preservatives组分 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 DCZ+IPBC 150.0+50.0 ＞45.0 ＞45.0 22.4 15.1 DCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 31.0 23.6 DCZ+IPBC 50.0+150.0 ＞45.0 ＞45.0 29.1 23.7 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 30.6 21.9 FCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.7 21.8 PPZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.8 22.5 TEB+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 24.0 21.0 为探索CLT对白蚁的防治效果，设计含梯度载药量的辐射松边材室内抗白蚁效果测试，拟定辐射松边材载药量分别为5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 g·m−3。由表3可知：试块中CLT载药量达10.9 g·m−3以上时，白蚁蛀蚀完好值＞8.0，质量损失率＜11%，而未添加药剂处理的对照木材，完好值仅4.6，质量损失率＞40%。因此，设计的复合制剂中防虫成分的目标载药量为7.5~30.0 g·m−3。
表 3 不同CLT载药量木材的白蚁蛀蚀结果Table 3 Result of lab anti-termite test of cyhalothrin载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%− 4.6 42.9±14.6 15.5 8.0 10.5±1.4 5.3 8.0 11.3±0.7 21.8 9.1 5.2±1.4 10.9 8.6 5.9±1.5 32.1 8.4 5.1±1.9 说明：−表示未添加药剂 综上，本研究设计制备了含苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯、液体石蜡等多种有效成分的木材保护复合制剂，通过调试乳化剂和助溶剂的用量和配比，最终配制出稳定、均相、透明、入水可自乳化的乳油制剂。制剂制备时按比例称取原药和乳化剂，加入助溶剂，充分溶解混匀后加入液体石蜡，搅拌均匀即可。测试使用的制剂为乳油，组成成分质量分数为0.20%苯醚甲环唑、0.20%碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%高效氯氟氰菊酯和40.00%液体石蜡。
2.2 制剂性能测试
2.2.1 乳液稳定性测试
制剂兑水稀释250倍，制剂呈乳白色，初入水时呈乳白色团雾状，可自动扩散，摇匀后呈均匀的乳状液，静置1 h未见分层、析油和沉淀，稳定性可保持3~4 h；过夜后破乳，药液表面有大量浮油，颠倒摇匀后可恢复乳液状，不影响正常使用。
2.2.2 防水性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，经水浸泡30 min后测试试块的吸水率和防水效率。由表4可知：未添加药剂处理的木材，吸水率为54.7%；随着制剂中石蜡质量分数升高，木材试块中石蜡含量相应增加，试块吸水率依次降低，从43.5%下降到26.6%，木材防水效率则随之增强，从44.4%提升到了77.8%。
表 4 防水剂处理后试块的防水性能Table 4 Efficiency of waterproof稀释
倍数制剂中液体石
蜡质量分数/%试块中液体石
蜡含量/(kg·m−3)吸水
率/%防水效
率/%5 8 49.1 26.6±7.4 77.8±19.1 10 4 19.4 35.0±17.3 68.9±22.1 20 2 10.5 43.5±15.1 44.4±20.6 − 0 0 54.7±5.8 0 说明：−表示未添加药剂 2.2.3 室内耐腐性能测试
由表5可知：未处理木材受白腐菌侵染后质量损失率达75.7%，受褐腐菌侵染质量损失率为19.4%，而所有处理试块质量损失率均低于6%，达到强耐腐。制剂稀释20倍后处理试块，试块中DCZ和IPBC载药量超过71.1 g·m−3，试块质量损失率可达1%，达到Ⅰ级强耐腐。值得注意的是，稀释20倍的药液处理后，试块质量损失率低于稀释5倍的药液，原因是高质量浓度制剂处理后，试块内含有大量的液体石蜡，在长达3个月的试验期内，液体石蜡自动扩散到培养基，试块质量损失增加。但取样现场也发现：高质量浓度制剂处理的试块无腐朽菌菌丝附着生长，说明添加防水剂实际进一步提升了制剂的防腐性能。
表 5 制剂处理后试块的室内耐腐性能Table 5 Result of lab sand block test on sapwood P. radiate稀释
倍数彩绒革盖菌 密粘褶菌 试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%5 311.2+311.2 5.5±0.6 320.6+320.6 3.6±0.3 10 150.9+150.9 2.7±0.2 139.0+139.0 3.4±0.4 20 71.2+71.2 0.6±0.1 71.1+71.1 1.0±0.2 − 0 75.7±4.3 0 19.4±2.1 说明：−表示未添加药剂 2.2.4 室内防霉性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，测试室内防霉效果。由表6可知：未处理木材的霉菌和变色菌侵染值为4，该制剂稀释5倍时，试块表面的DCZ和IPBC含量均达0.165 g·m−2，处理试块变色菌和混合霉菌侵染值均为0，防治效果优良。在实际使用中可根据木材树种的天然耐腐性及所处环境适当增减制剂的用量，以达到理想的防霉效果。
表 6 室内防霉测试结果Table 6 Result of lab mildew proof test稀释
倍数可可球二孢 混合霉菌 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 5 0.165+0.165 0 0.202+0.202 0 10 0.106+0.106 1.5 0.148+0.148 0.5 20 0.045+0.045 4.0 0.048+0.048 3.3 − 0 4.0 0 4.0 说明：−表示未添加药剂 2.2.5 室内抗白蚁测试
由表7可知：不同稀释倍数的制剂处理后，试块质量损失率均＜3%，而未添加抗虫剂的对照试块，质量损失率为42.9%；制剂稀释5倍时，试块载药量达29.1 g·m−3，试块白蚁蛀蚀完好值为9.6；稀释20倍时，试块载药量为7.6 g·m−3， 试块白蚁蛀蚀完好值为8.9，而未处理木材的白蚁蛀蚀后完好值仅为4.7，质量损失率达42.9%，显示该制剂的防治白蚁效果优良。结合表3可知：相比单用高效氯氟氰菊酯时，复合制剂处理材在同等载药量下对白蚁的防治效果要好得多；当高效氯氟氰菊酯质量浓度为15.0、30.0 g·m−3时，该复合制剂防治白蚁的效果远远优于单剂，由此可知其他组分的加入起到了增效作用。
表 7 室内抗白蚁测试结果Table 7 Result of lab anti-termite test稀释
倍数木材中高效氯氟氰菊酯
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%白蚁蛀蚀
完好值5 29.1 2.8±0.5 9.6 10 14.7 2.6±0.3 9.2 20 7.6 2.5±0.7 8.9 − 0 42.9±14.6 4.7 说明：−表示未添加药剂 3. 讨论
针对不同的木材败坏防治需求，本研究制备了一种具有防腐、防霉、防虫、防水多功能的复合制剂，类型为乳油，有效成分为苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯和液体石蜡。
该制剂兑水稀释后呈乳液状，稳定性可保持3~4 h，符合GB/T 1603—2001 《农药乳液稳定性测定方法》的规定。石蜡作为常见的防水剂被广泛应用，多数所使用的时熔点较高的固体石蜡[18]，而该制剂以液体石蜡为防水组分，优点是室温下即为液体，无需加热融化，缺点是液体石蜡密度较小，相较常规药剂，兑水稀释后稳定性差，药液兑水约 4 h 后就会分层破乳；不过，稍微搅拌即可恢复乳状，基本不影响正常使用。该制剂防水性能较好，然而应注意的是防水剂含量很大，大剂量液体石蜡的使用，存在一定的消防隐患，后期应配合表面阻燃处理。石蜡基防水剂的主要防水机制是通过石蜡的疏水作用[19]，石蜡的使用同时增强了木材的尺寸稳定性[20]，石蜡分子量较大，不易进入木材内部，因此需要将其乳化成细小的乳状液，然而，乳化剂的过量使用可能会有石蜡的疏水性降低的风险，需要在以后的开发中引起重视。结合室内耐腐试验菌丝生长状况可以发现：防水剂液体石蜡的加入，可以明显增加药剂的防腐性能，而木材中石蜡的含量很高，当木材与环境中土壤或者水体接触时，石蜡会从木材中自由扩散到环境中，可能会增加药剂流失的风险。
室内防霉测试结果来看，将制剂稀释 5 倍使用，即辐射松试块苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯载药量均为 0.165 g·m −2 时，混合霉菌的生长才能被完全抑制，这与李晓文等[21]的IPBC防霉效果结论一致。室内防霉测试所选的温湿度条件适合霉菌生长，且霉菌的孢子液人为接种，因此，通常可以通过室内防霉测试的药剂，在实际生产中的防霉效果也会很好。
室内防白蚁测试结果可知：制剂稀释 20 倍后，试块受白蚁蛀蚀程度仍较低，质量损失率较小，防蚁性能优异。同时，比较单独使用高效氯氟氰菊酯和添加防水剂后的防白蚁效果可以看出：防水剂的添加明显增加了药剂的防白蚁效果。分析原因可能是石蜡是一种化石能源，白蚁不喜食。
4. 结论
为满足木材不同生物危害防治需要，本研究制备出一种含石蜡水基型有机多功能木材防腐剂，可以一次处理基本满足木材常规保护的要求。该木材保护复合制剂同时具有防腐、防霉、防虫、防水多功能，剂型为乳油，质量分数分别为0.20%的苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%的高效氯氟氰菊酯和40.00%的液体石蜡。
当环境中生物危害较轻时，可将该复合制剂稀释20倍使用，当生物危害较重时，可将复合制剂稀释5倍甚至直接使用。将制剂稀释5到10倍处理木材，即木材中液体石蜡为25.0~50.0 kg·m−3，苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯为150.0~300.0 g·m−3，高效氯氟氰菊酯载药量为15.0~30.0 g·m−3，可满足多大多数生物危害的防治需求。
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图 1 碳、氮培养条件下EV菌代谢物的PCA和PLS-DA分析
Figure 1 PCA and PLS-DA of EV metabolites under carbon and nitrogen culture conditions
图 2 碳、氮培养条件下EV菌的差异代谢物
Figure 2 Differential metabolites of EV bacteria under carbon and nitrogen culture conditions
图 3 差异代谢产物富集到的显著代谢通路
Figure 3 Significant metabolic pathways enriched by differential metabolites
表 1 部分差异化合物
Table 1. Part of significantly different metabolites
化合物名称 质荷比 保留时间/min 二级数据库得分 变化倍数 P KEGG编号 磷酸胍基乙酸酯 198.03 9.86 62 12.46 1.13×10−13 C03166 对甲酚硫酸盐 187.01 6.17 53 12.41 8.88×10−15 邻氨基苯甲酸酯 136.04 2.00 50 9.93 1.67×10−8 C00108 尿酸 190.05 1.29 40 8.26 6.26×10−7 C01717 尼古丁 163.12 4.68 44 5.51 1.14×10−6 C16150 4-羟基-2-喹啉羧酸 188.03 5.76 30 5.48 9.62×10−8 C01717 烟酸 124.04 3.50 41 5.17 1.71×10−7 C00253 尿囊素 159.05 5.46 50 5.09 2.53×10−4 C01551 吲哚丙烯酸 188.07 7.98 98 4.20 4.68×10−8 2-吡咯烷酮 86.06 3.79 41 4.10 2.57×10−5 C11118 咪唑乙酸 127.05 9.62 69 3.54 1.56×10−7 C02835 组胺 112.09 5.74 45 3.34 2.79×10−8 C00388 谷胱甘肽 306.08 1.02 58 3.26 5.97×10−4 C00051 光色素 243.09 1.58 70 3.00 2.79×10−4 C01727 肌肽 227.11 12.66 55 2.40 3.30×10−5 C00386 甜菜碱醛 102.09 6.73 68 2.25 9.68×10−3 C00576 吲哚 118.07 8.32 57 2.12 4.40×10−3 C00463 苹果酸 133.01 0.90 43 1.90 2.86×10−5 C00711 甜菜碱 118.09 8.30 51 1.88 2.79×10−8 C00719 胍基乙酸d 118.06 8.26 38 1.87 1.19×10−3 C00581 葫芦巴碱 138.06 9.05 38 1.59 1.71×10−7 C01004 海藻糖 341.11 1.04 78 1.34 6.16×10−5 C01083 左旋肉碱 162.11 9.31 72 1.34 2.97×10−6 C00318 邻乙酰左旋肉碱 204.12 8.54 73 1.32 1.69×10−6 C02571 茶碱 181.07 2.24 55 −1.64 6.07×10−7 C07130 二乙醇胺 106.09 8.16 45 −1.73 1.42×10−4 C06772 去甲肾上腺素 170.08 5.83 57 −2.40 1.52×10−5 C00547 阿魏酸盐 193.05 5.36 32 −3.58 2.87×10−5 C01494 核糖醇 151.06 1.01 46 −4.08 3.13×10−8 C00474 甲基咪唑乙酸 141.07 9.52 41 −4.51 2.90×10−8 C05828 赤藓糖醇 121.05 1.04 75 −5.20 2.80×10−5 C00503 
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表 2 碳、氮培养条件下EV菌差异代谢物富集到的KEGG通路
Table 2. Enriched KEGG pathways by differential metabolites of EV under carbon and nitrogen culture conditions
代谢通路编号 代谢通路名称 匹配情况 P 影响大小 上调 sce00970 氨酰基tRNA的生物合成 18/46 4.38×10−4 0.11 sce00330 精氨酸和脯氨酸代谢 10/25 7.53×10−3 0.33 sce00220 精氨酸生物合成 8/18 8.05×10−3 0.60 sce00430 牛磺酸和低牛磺酸代谢 4/7 2.28×10−2 1.00 sce00250 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 8/22 3.06×10−2 0.81 下调 sce00520 氨基糖和核苷酸糖代谢 8/24 3.41×10−4 0.48 sce00052 半乳糖代谢 5/17 8.98×10−3 0.82 sce00040 戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化 4/12 1.22×10−2 0.27 sce00500 淀粉和蔗糖代谢 4/15 2.79×10−2 0.35 说明：匹配情况为匹配化合物个数/通路化合物总数
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