下载:
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小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染山羊Capra hircus、绵羊Ovis aries以及其他野生小反刍兽，以发热，眼、鼻分泌物增多，胃炎、腹泻和肺炎为特征。该病主要流行于亚洲和非洲，2007年中国在西藏阿里地区首次发现该病，2010年8月在阿里地区日土县再次发生疫情[1-2]。2013年末，该病传入中国新疆地区，并迅速传播至22个省份，对中国养羊业造成严重危害[3-4]。PPRV属于副黏病毒科Paramyxovirdae麻疹病毒属Morbolivirus；基因组为单股负链RNA，长度为15 948 nt或者15 954 nt；基因组3′末端为前导序列(leader)，5′末端为尾随序列(trailer)；6个基因排列顺序为3′-N-P-M-F-H-L-5′，依次编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)；P基因还编码2个非结构蛋白C和V。根据F基因或N基因部分核苷酸序列差异可将PPRV毒株分为4个基因系[5-6]，亚洲国家流行的毒株属于基因Ⅳ系[1]。小反刍兽疫病毒在流行过程中，基因组发生点突变，核苷酸变异速率大约为9×10−4位点·a−1[7-8]。对中国2013年11月至2014年6月间25个毒株的基因组序列的比对和分析发现：P基因变异最大，非同义突变率最高[8]。随着全面免疫的实施，受免疫选择压的作用，病毒各基因尤其是P基因的变异率及非同义突变率发生变化，有必要进一步研究。PPRV P基因核苷酸长度为1 530 nt，编码509个氨基酸，编码的P蛋白分子量约54.9 kD。P蛋白在病毒RNA的转录和复制过程中发挥作用，也能单独与N蛋白-RNA模板复合物结合激活转录，同时与L蛋白相结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶，并与N蛋白-RNA模板结合形成核糖核蛋白复合体，进行病毒RNA的转录和复制[9]。本研究对2013年以来中国PPRV流行毒株P基因进行序列测定和分析，探讨病毒流行过程中P基因的序列变异情况。
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2014−2017年，采集到9个省12个疫点的PPRV阳性组织样品12份，由中国动物卫生与流行病学中心保存并提供，具体样品信息见表1。
表 1 2014−2017年中国12株PPRV毒株信息
Table 1. Details of the 12 PPRV strains collected in China during 2014−2017
毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 JL472014 2014-04-06 吉林 JS142016 2016-01-20 江苏 JX62014 2014-07-21 江西 GX22016 2016-08-22 广西 ZJ82014 2014-10-11 浙江 HN182016 2016-10-16 湖南 JX172015 2015-03-30 江西 XJ302017 2017-02-12 新疆 AH162015 2015-04-09 安徽 HN02017 2017-03-05 湖南 GZ112015 2015-09-02 贵州 GZ252017 2017-09-21 贵州 -
取肠系淋巴结组织100 mg，用组织匀浆仪匀浆后，根据High Pure Viral RNA Kit (Roche)的操作说明提取病毒RNA，−80 ℃保存备用。
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采用Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit (TaKaRa)扩增PPRV P基因。反应体系共50 µL，包括2× 1 Step Buffer 25 µL，Primerscript 1 step Enzyme Mix 2 µL，上、下游引物各2 µL，病毒RNA 5 µL。RT-PCR反应条件为：50 ℃逆转录30 min，94 ℃ 2 min，进行Taq酶激活；40个循环的聚合酶链式反应(PCR)(94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min)；72 ℃ 7 min再延伸。对PCR产物进行切胶回收。
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纯化后的PCR产物送青岛华大公司测序，获得12个毒株的P基因序列；从GenBank中下载2013−2014年中国25个PPRV流行毒株的基因组序列[8](表2)，截取P基因序列后进行核苷酸和氨基酸序列比对。从GenBank中下载中国及其他10个国家共15个PPRV代表毒株的基因组序列(表3)，绘制系统进化树。用MEGA 4.0 软件进行序列比对，用最大似然法构建分子进化树，bootstrap测试1 000次重复。用Simplot软件进行序列同源性分析。
表 2 2013−2014年中国PPRV流行毒株信息
Table 2. Details of the PPRV strains collected in China during 2013−2014
病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 XJYL2013 2013-11-30 新疆 山羊 JL2014 2014-04-01 吉林 绵羊 XJ22013 2013-12-20 新疆 山羊 JS2014 2014-04-02 江苏 山羊 XJ32013 2013-12-21 新疆 绵羊 HeN2014 2014-04-03 河南 山羊 XJ42013 2013-12-22 新疆 山羊 HB2014 2014-04-03 湖北 山羊 XJ52013 2013-12-29 新疆 山羊 AH2014 2014-04-03 安徽 山羊 GS2014 2014-01-22 甘肃 绵羊 SX2014 2014-04-05 山西 山羊 NX2014 2014-02-17 宁夏 绵羊 GX2014 2014-04-16 广西 山羊 LN2014 2014-03-17 辽宁 山羊 GZ2014 2014-04-21 贵州 山羊 CQ2014 2014-03-30 重庆 山羊 ZJ2014 2014-04-25 浙江 山羊 HLJ2014 2014-03-31 黑龙江 山羊 HN2014 2014-04-25 湖南 山羊 YN2014 2014-04-01 云南 山羊 GD2014 2014-05-15 广东 山羊 SaX2014 2014-04-01 陕西 山羊 SC2014 2014-06-10 四川 山羊 JX2014 2014-04-01 江西 山羊 表 3 PPRV参考毒株信息
Table 3. Details of the PPRV reference strains used in this study
毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 Tibet/30/2007 2007 中国西藏 山羊 FJ905304 Ethiopia 2010 2010 埃塞俄比亚 山羊 KJ867541 Tibet/33/2007 2007 中国西藏 山羊 KX421388 Ghana NK1 2010 2010 加纳 山羊 KJ466104 Tibet/Bharal/2008 2008 中国西藏 山羊 JX217850 Oman 1983 1983 阿曼 山羊 KJ867544 Côte d' Ivoire 89 1989 科特迪瓦 山羊 EU267273 UAE 1986 1986 阿联酋 山羊 KJ867545 Nigeria 76/1 1976 尼日利亚 山羊 EU267274 India TN Gingee 2014 2014 印度 山羊 KR261605 Turkey 2000 2000 土耳其 山羊 NC-006383 Uganda 2012 2012 乌干达 山羊 KJ867543 CIV 01 P 2009 2009 科特迪瓦 山羊 KR781451 Morocco 2008 2008 摩洛哥 山羊 KC594074 Ethiopia 1994 1994 埃塞俄比亚 山羊 KJ867540 -
2013−2017年，来自中国21个省份37个疫点的37株PPRV毒株P基因核苷酸序列间遗传距离为0~0.009 2。其中，2013年11月至2014年10月间的18个毒株P基因序列完全一致。这些毒株分别来自新疆(XJYL2013、XJ22013、XJ32013、XJ42013、XJ52013)、甘肃(GS2014)、辽宁(LN2014)、重庆(CQ2014)、云南(YN2014)、江苏(JS2014)、湖北(HB2014)、河南(HeN2014)、山西(SX2014)、吉林(JL2014)、贵州(GZ2014)、湖南(HN2014)、四川(SC2014)、浙江(ZJ82014)等14个省份。毒株XJ302017与GZ252017间的基因核苷酸序列差异最大，为0.009 2，共14个位点存在序列差异。
为考察毒株序列变异与流行时间的关系，选取最早采集的XJYL2013毒株作为参照，将其余36个毒株与其进行P基因核苷酸序列比对。结果发现：36个毒株分别在0~8个位点发生了突变。其中2013年11月至2014年10月间来自14省份的17个毒株与XJYL2013的P基因核苷酸序列完全一致。2014年3月至2015年3月黑龙江的HLJ2014、江西的JX2014、安徽的AH2014、广西的GX2014和广东的GD2014等5个毒株在不同位点发生了1个变异。2014年2月至2016年8月宁夏的NX2014、陕西的SX2014、吉林的JL2014、江西的JX2014和JX62014、浙江的ZJ2014、广西的GX62016等7个毒株在2个位点发生了变异。2015年4月安徽的AH162015和2016年1月的江苏JS142016等2个毒株在3个位点发生了变异。2015年9月贵州的GZ112015、2016年10月湖南的HN182016、2017年3月湖南的HN02017等3个毒株在4个位点发生了变异。2017年9月贵州的GZ252017、2017年2月新疆的XJ302017分别在6和8个位点发生了变异。37个毒株之间的核苷酸变异位点分布于P基因的47个位点，其中45个突变位点仅存在于1个毒株中，2个突变位点分别为3个毒株共有。上述结果表明P基因核苷酸序列突变位点数与毒株流行时间正相关，突变无地域相关性。利用Simplot软件对核苷酸序列发生变异的19株PPRV毒株与XJYL2013进行P基因核苷酸序列同源性比较分析(图1)，结果显示：P基因序列的850~1 250 nt间序列同源性较高，突变分布少，500~800 nt区域变异较大。
图 1 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸序列同源性Simplot分析
Figure 1. P gene nucleotide sequence similarity of China 2013−2017 PPRV strains using Simplot analysis
P基因的47个核苷酸变异位点中，有26个核苷酸变异导致了氨基酸序列的改变(表4)：17个变异发生于第1位密码子，其中的16个位点导致氨基酸改变；9个变异位于第2位密码子，全部导致氨基酸改变；21个变异位于第3位密码子，1个位点导致氨基酸改变。
表 4 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸和氨基酸序列变异情况
Table 4. Nucleotide and amino acid diversity of China 2013−2017 PPRV strains
变异位点 核苷酸/个 氨基酸/个 非同义突变率/% 中国2013−2017年流行毒株 第1位密码子 17 16 94.12 第2位密码子 9 9 100.00 第3位密码子 21 1 4.76 合计 47 26 55.32 中国2013−2017年流行毒株与其他代表毒株 第1位密码子 2 1 50.00 第2位密码子 2 2 100.00 第3位密码子 6 0 0.00 合计 10 3 30.00 -
2013−2017年中国37个PPRV毒株P基因氨基酸序列之间的遗传距离为0~0.007 9。P基因编码的509个氨基酸位点中，25个发生了突变，其中氨基端(1~250位氨基酸)16个，羧基端(251~509位氨基酸) 9个(图2)。第21、83、505位氨基酸位点分别有2个、3个和3个毒株发生了变异。在第21位氨基酸位点，XJ302017第1位密码子发生突变，导致丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)，HN182016第2位密码子发生突变，导致丙氨酸(A)突变至缬氨酸(V)。第83位氨基酸位点，3个毒株在同一个核苷酸位点发生不同突变，JL2014和 JX2014导致苯丙氨酸(F)突变至亮氨酸(L)，SaX2014苯丙氨酸(F)突变为缬氨酸(V)。第505位氨基酸位点，3个毒株在同一个核苷酸位点发生相同突变，JX62014、HN182016和GZ112015均发生了亮氨酸(L)至缬氨酸(V)的突变。
图 2 2013−2017年中国37个PPRV毒株P蛋白氨基酸序列比对
Figure 2. P protein amino acid sequence alignment of China 2013−2017 PPRV strains
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比较2013−2017年中国37株PPRV流行毒株与之前15株代表毒株的P基因核苷酸序列，发现遗传距离为0.025 4~0.139 7，其中与2007−2008年中国西藏地区3个毒株P基因核苷酸序列遗传距离为0.025 4~0.031 5，而西藏地区3个流行毒株之间的P基因核苷酸序列遗传距离为0~0.001 3。与15株代表毒株的氨基酸序列比对发现：2013−2017年中国37株PPRV流行毒株P基因的10个位点发生了核苷酸序列突变，其中3个导致了氨基酸序列的改变(表4)；2个变异发生于第1位密码子，其中1个导致氨基酸改变；2个变异位于第2位密码子，全部导致氨基酸改变；6个变异位于第3位密码子，未导致氨基酸改变。
2013−2017年，中国37株PPRV流行毒株与15株代表毒株P基因氨基酸序列的3个变异位点均位于175~243 位氨基酸，全部处在P蛋白的氨基端，其中175和176等2个相邻位点都为变异位点。
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基于P基因核苷酸序列构建系统发育树，发现2013−2017年中国37株PPRV流行毒株构成基因Ⅳ系中1个独立的进化小分支，而中国西藏地区流行毒株与印度2014年毒株形成1个小分支(图3)。
图 3 52个PPRV毒株P基因分子进化树
Figure 3. Phylogenetic relationships of 52 PPRV genome sequences
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本研究对2013−2017年中国21个省份37个疫点的PPRV流行毒株P基因进行序列分析，探明了PPRV流行过程中P基因序列变异情况，为PPR控制和消灭策略的制定提供了数据支持。
2013−2017年中国37个PPRV流行毒株的P基因变异较大。PPRV在中国流行的4 a间，P基因47个核苷酸位点发生了突变，其中26个导致了氨基酸序列的改变，非同义突变率为55.3%。研究[8]发现：2013年11月至2014年6月，25个毒株P基因在12个位点发生突变，其中10个导致了氨基酸序列的改变，非同义突变率为83.3%，高于F、H、L、N和M基因。已有研究[10]表明：2013−2017年中国37个PPRV流行毒株H基因的非同义突变率为58.5%，高于本研究中的P基因。这一结果提示：实施全面免疫后，PPRV在中国的流行受到了免疫选择压的作用，P基因的非同义突变率降低。
2013−2017年中国流行的PPRV毒株P蛋白氨基酸序列在10个位点发生了特征性的核苷酸突变，其中第21、83和505位3个导致了氨基酸序列改变。已有研究[9]表明：P蛋白对病毒RNA合成至关重要，可以分别与N蛋白、L蛋白及核衣壳结合形成不同的复合体发挥作用。P蛋白与L蛋白结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶进行病毒基因组RNA的转录，L蛋白发挥RNA聚合酶(RdRp)的作用，而P蛋白的作用是引导P-L复合体与核衣壳结合。一旦获得足够多的病毒蛋白，N蛋白就与病毒RNA结合，在这个过程中，P蛋白发挥蛋白伴侣的作用，引导N蛋白以游离形式与RNA结合。通常认为[9]：N-P复合体调节从转录到复制的转变。P-L复合体负责病毒基因组的复制，也就是说，先合成全长正链反向基因组RNA，然后以其为模板合成负链基因组RNA，用以组装病毒粒子[11]。P蛋白通过与游离的N蛋白结合，从而阻止N蛋白发生非特异性的自我组装，形成的N0-P复合物在复制过程中对新合成的RNA进行加帽化。副粘病毒P蛋白C末端的X-domain是主要的N蛋白结合位点[9]。PPRV第429~509位氨基酸区域高度保守，推测可能为N蛋白结合位点[12]。P蛋白与其他蛋白相互作用的功能域主要分布于羧基端，因此，在病毒演化过程中，P蛋白的羧基端较为保守。本研究发现：2013−2017年中国流行的PPRV毒株P蛋白氨基酸序列在505位发生了高频突变。该突变对其结构及功能的影响还需要进一步的研究。
在中国流行过程中，PPRV毒株P基因突变位点的数量与毒株流行时间呈正相关。本研究发现：相对于最早分离的XJYL2013，2013−2014年流行的毒株P基因突变位点为0~2个，而2017年流行毒株P基因突变位点为4~8个，随着毒株流行时间增长，P基因突变位点增多。已有研究[8]表明：PPRV毒株基因组在流行过程中的核苷酸突变进化速率为9.54×10−4位点·a−1。在流行过程中PPRV毒株P基因持续发生突变，但不同毒株突变位点不同，表现为相对随机的突变。随着流行时间的增长，在稳定免疫选择压的作用下，是否会出现变异位点的稳定和定植，还有待进一步的研究。持续实时监测PPRV各基因分子变异，对于该病的防控具有重要意义。
Evolution characterization of P gene of peste des petits ruminants virus in China from 2013 to 2017
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摘要:
目的 探究中国小反刍兽疫病毒(PPRV)田间流行毒株P基因的分子进化特征。 方法 对2013−2017年中国21省份37个疫点的小反刍兽疫病毒流行毒株进行磷蛋白基因(P基因)序列比较和分子进化分析。 结果 37个毒株P基因核苷酸序列间的遗传距离为0~0.009 2，变异分布在47个位点；P蛋白氨基酸序列间的遗传距离为0~0.007 9，变异分布在26个位点。与15株代表毒株的序列比对发现：2013−2017年中国37株PPRV流行毒株P基因的10个位点发生了核苷酸序列突变，其中3个导致了氨基酸序列的改变。以最大似然法构建分子进化树，发现2013−2017年中国流行的37个毒株构成基因Ⅳ系中1个独立的进化分支，与2007年传入西藏的毒株处于不同的进化分支。 结论 2013−2017年中国小反刍兽疫病毒P基因变异较大；随毒株流行时间增长，P基因的突变位点增多，但不同毒株突变位点不同，表现为相对随机的突变。图3表4参12 Abstract:Objective The objective of this study is to explore the molecular evolution characteristics of P gene of peste des petits ruminants virus (PPRV) during an epidemic in China. Method Bioinformatics analysis on the sequences of P gene of PPRV strains from 37 epidemic sites in 21 provinces of China from 2013 to 2017 was carried out. Result The genetic distances among the nucleotide sequences of P gene of 37 strains was 0−0.0092, and the variation sites were distributed in 47 sites. The genetic distances among the amino acid sequences of P gene of these strains ranged from 0−0.0079, and the variation sites were distributed in 26 sites. Sequence comparison with 15 representative strains showed that nucleotide sequence mutations occurred at 10 sites of P gene of 37 PPRV epidemic strains in China since 2013, and 3 of them led to the change of amino acid sequence. Phylogenetic analysis of P gene using maximum likelihood method revealed that all the 37 PPRV strains prevalent in China from 2013 to 2017 could be grouped into an independent clade in lineageⅣ, different from the strain introduced into Tibet in 2007. Conclusion From 2013 to 2017, the P gene mutation of peste des petits ruminants virus in China was relatively large. With the increase of epidemic time, the mutation sites of P gene increased, but the mutation sites of different strains were different, showing a relatively random mutation. [Ch, 3 fig. 4 tab. 12 ref.] -
Key words:
- peste des petits ruminants virus /
- P gene /
- sequence mutation /
- genetic evolution
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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus病在亚洲和欧洲造成严重的生态和经济损失[1-2]，伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola (EV菌)是松材线虫的内寄生真菌，产生的新月形孢子能侵染并杀死松材线虫，在松材线虫的生物防治方面具有良好的应用前景[3]。同时，EV菌亦可侵染拟松材线虫B. mucronatus、水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi等线虫。研究表明：EV真菌胞内存在共生细菌[4]，共生细菌对真菌的生物学和生态学具有重要的作用，如Rhizopus microsporus胞内的共生细菌Burkholderia能产生植物毒素根霉素，然后由宿主真菌分泌到环境中，导致水稻枯萎病[5]。菌丝内的共生微生物(细菌或病毒)是重要的能直接或间接改变真菌和宿主关系的互作生物[6-8]，提高宿主真菌的生态适应性[9-10]。存在共生细菌的真菌对碳氮源如何响应，其代谢产物发生何种变化，目前尚未见相关报道。
代谢组学是系统生物学研究中非常重要的一个环节，旨在研究生物体或组织，甚至单个细胞的全部小分子代谢物成分及其动态变化[11]。通过对代谢物质的分析，可以从生物样本中检测并筛选出具有重要生物学意义和显著差异的代谢物质，并以此为基础研究生物体的代谢过程和变化机制[12]。对EV菌在不同碳、氮培养条件下代谢物的变化进行分析，明确显著差异代谢物，特别是重要的信号分子，不仅为EV菌的应用提供重要理论基础，而且对深入研究内共生细菌在EV菌的功能亦具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 菌株
伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola CBS115803购于荷兰菌物保存中心。
1.2 培养基
碳培养基为24 g 马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，Becton， Dickinson and Company，美国)和10 g琼脂溶于1 L双蒸水。氮培养基为5 g酵母粉(OXOID公司，英国)和10 g琼脂溶于1 L双蒸水。
1.3 仪器和试剂
Nano高分辨液质联用分析仪QE (Thermo Q-Exactive，德国)；赛多利斯BSA124S电子天平；真空浓缩仪(Labogene MaixVac Alpha, 丹麦)；Sigma 3-30KS高速离心机，KQ5 200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；色谱级甲醇(Fisher，美国)。
1.4 处理
配制碳、氮固体培养基，培养基凝固后放入已灭菌的尼龙膜(孔径3 μm，赛多利斯)，接种EV菌后于25 ℃培养7 d。将长满菌丝和孢子的尼龙膜用无菌镊子取出，用超纯水冲洗尼龙膜，再用无菌的吸水纸吸掉尼龙膜接触培养基面的水分，而后将菌丝和孢子刮入2 mL圆底灭菌干燥离心管，装样品前后分别称量离心管的质量，迅速将样品管放入液氮中淬灭后于−80 ℃保存。每处理设置5次生物学重复，编号依次为C1~C5和N1~N5。加入冷冻洁净无菌的直径为3 mm的钢珠2个，液氮冷冻条件下使用莱驰RETSCH MM 400研磨2 min。将研磨好的样品管置于干冰上，加入2 mL预冷的体积分数为80%甲醇于−80 ℃冰箱静置1 h，4 ℃、14 000 g离心20 min后将上清液转移至另一相同体积离心管，真空浓缩干燥样品后于−80 ℃保存。用300 μL体积分数为90%甲醇超声复溶并经0.45 μm的滤膜过滤，完成亲水代谢产物提取。
1.5 HPLC-MS分析
采用非靶标的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对样品进行测定和代谢物识别。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm)。流动相：0.1%甲酸-水溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)。洗脱条件：0~0.5 min，95%B；0.5~7.0 min，95%~65% B；7.0~8.0 min，65%~40% B；8.0~9.0 min，40%B；9.0~9.1 min，40%~95%B；9.1~12.0 min，95%B。质谱参数条件：鞘气，310 275 Pa；辅助气，103 425 Pa；喷雾电压，4 000 V (正)/3 500 V (负)；离子传输管温度：350 ℃。在采集软件(Xcalibur 4.0.27，Thermo)的控制下，采用一级质谱全扫描(全MS)结合自动触发二级质谱扫描(MS/MS)模式，使用阴、阳离子模式2种电离方式采集质谱数据。运行时间：0~18 min。分辨率：全MS，170000；MS/MS，17500。
1.6 代谢物注释分析
对原始数据进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，最终得到1个保留时间、质荷比和代谢物信号(峰面积)的数据矩阵。将处理后的代谢物信号与一级和二级数据库进行匹配，将其中二级得分＜30的化合物可信予以剔除。分析时10份样品共插入3个质量对照(QC)样本以考察整个分析过程中仪器的稳定性，QC样本每种化合物的峰面积的变异系数若＞30%，则予以剔除。未检出值设定为0，缺失值由其余重复样品的均值填补。
1.7 差异代谢物筛选
由Metaboanalyst 4.0在线软件(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)完成。利用对数转换和pareto缩放对各代谢物相对含量进行标准化处理。使用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判别法(PLS-DA)评估不同处理的分组情况。结合以下2个标准对2种培养基的阴阳离子模式的差异化合物进行筛选：经FDR (false discovery rate)校正的t检验的P＜0.05；正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中变量投影重要性(variable influence on projection，VIP)得分＞1。
1.8 代谢通路分析
代谢通路分析由Metaboanalyst 4.0 (
https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/upload/PathUploadView.xhtml )中的代谢通路分析模块(pathway analysis module)完成。该分析将选定的差异代谢物与KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库(2019年10月)和人类代谢组数据库(HMDB)进行匹配，然后选择酵母Saccharomyces cerevisiae的代谢通路库作为参照进行富集分析和拓扑分析。富集分析中采用参数超几何法(hypergeometric test)检验每个代谢通路的显著性(P＜0.05)；拓扑分析中差异显著性检验的方法为相对介数中心性(relative-betweeness centrality)。2. 结果与分析
2.1 阴阳离子模式下鉴定的化合物
阳离子模式下鉴定到的化合物多于阴离子模式下鉴定的化合物。阴、阳离子模式分别检测出279和461种化合物，其中74种为2种模式共同检出，共计666种化合物。通过质量控制过滤处理，阴、阳离子模式分别有176和362种化合物，其中2种模式共同含有40种化合物，共计498种化合物。数据总的缺失值的比例平均为0.74%：阴离子模式下，碳和氮培养基下的代谢物缺失率均为0.23%；阳离子模式下，碳培养基下的缺失率为2.38%，高于氮培养基0.11%。
2.2 组间差异分析
阴离子和阳离子模式下EV菌菌丝体代谢物的主成分分析得分图(图1A~B)显示：前2个主成分分别解释了94.9% (主成分1为92.5%，主成分2为2.4%)和92.5% (主成分1为89.5%，主成分2为3.0%)的变异。2种离子模式下EV菌代谢谱在碳、氮培养基培养后差异大，分组明显。偏最小二乘法判别法的分组结果(图1C~D)与主成分分析法结果一致。
图 1 碳、氮培养条件下EV菌代谢物的PCA和PLS-DA分析Figure 1 PCA and PLS-DA of EV metabolites under carbon and nitrogen culture conditions2.3 差异化合物
采用火山图的形式进行差异化合物展示，见图2。t检验差异显著(P＜0.05)的化合物共有444种，占总数的89.2%；阴离子和阳离子模式分别有162和310种，28种为2种模式共有。VIP＞1的化合物共有469种，占总数的94.2%；阴离子和阳离子模式分别有167和334种，32种为2种模式共有。利用VIP＞1筛选出的化合物包含t检验法的筛选结果，表明后者更严格，且更符合统计要求。
图 2 碳、氮培养条件下EV菌的差异代谢物Figure 2 Differential metabolites of EV bacteria under carbon and nitrogen culture conditions以碳为对照组，在氮组中上调代谢物的数量是下调的3.4倍，分别为342和102种；上调和下调代谢物分别有309和86种匹配到HMDB数据库，有159和71种匹配到KEGG数据库。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是在氮培养下大量产生的特有代谢物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是代谢物在氮培养条件下显著上调(表1)。
表 1 部分差异化合物Table 1 Part of significantly different metabolites化合物名称 质荷比 保留时间/min 二级数据库得分 变化倍数 P KEGG编号 磷酸胍基乙酸酯 198.03 9.86 62 12.46 1.13×10−13 C03166 对甲酚硫酸盐 187.01 6.17 53 12.41 8.88×10−15 邻氨基苯甲酸酯 136.04 2.00 50 9.93 1.67×10−8 C00108 尿酸 190.05 1.29 40 8.26 6.26×10−7 C01717 尼古丁 163.12 4.68 44 5.51 1.14×10−6 C16150 4-羟基-2-喹啉羧酸 188.03 5.76 30 5.48 9.62×10−8 C01717 烟酸 124.04 3.50 41 5.17 1.71×10−7 C00253 尿囊素 159.05 5.46 50 5.09 2.53×10−4 C01551 吲哚丙烯酸 188.07 7.98 98 4.20 4.68×10−8 2-吡咯烷酮 86.06 3.79 41 4.10 2.57×10−5 C11118 咪唑乙酸 127.05 9.62 69 3.54 1.56×10−7 C02835 组胺 112.09 5.74 45 3.34 2.79×10−8 C00388 谷胱甘肽 306.08 1.02 58 3.26 5.97×10−4 C00051 光色素 243.09 1.58 70 3.00 2.79×10−4 C01727 肌肽 227.11 12.66 55 2.40 3.30×10−5 C00386 甜菜碱醛 102.09 6.73 68 2.25 9.68×10−3 C00576 吲哚 118.07 8.32 57 2.12 4.40×10−3 C00463 苹果酸 133.01 0.90 43 1.90 2.86×10−5 C00711 甜菜碱 118.09 8.30 51 1.88 2.79×10−8 C00719 胍基乙酸d 118.06 8.26 38 1.87 1.19×10−3 C00581 葫芦巴碱 138.06 9.05 38 1.59 1.71×10−7 C01004 海藻糖 341.11 1.04 78 1.34 6.16×10−5 C01083 左旋肉碱 162.11 9.31 72 1.34 2.97×10−6 C00318 邻乙酰左旋肉碱 204.12 8.54 73 1.32 1.69×10−6 C02571 茶碱 181.07 2.24 55 −1.64 6.07×10−7 C07130 二乙醇胺 106.09 8.16 45 −1.73 1.42×10−4 C06772 去甲肾上腺素 170.08 5.83 57 −2.40 1.52×10−5 C00547 阿魏酸盐 193.05 5.36 32 −3.58 2.87×10−5 C01494 核糖醇 151.06 1.01 46 −4.08 3.13×10−8 C00474 甲基咪唑乙酸 141.07 9.52 41 −4.51 2.90×10−8 C05828 赤藓糖醇 121.05 1.04 75 −5.20 2.80×10−5 C00503 2.4 代谢通路分析
由表2和图3可见：利用KEGG数据库对氮培养中上调和下调的显著差异代谢产物进行富集分析。上调代谢产物主要富集到氨基酸代谢通路，包括氨酰基tRNA的生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，精氨酸生物合成，牛磺酸和低牛磺酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。下调的显著差异代谢产物主要涉及糖类代谢通路，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、淀粉和蔗糖代谢。
表 2 碳、氮培养条件下EV菌差异代谢物富集到的KEGG通路Table 2 Enriched KEGG pathways by differential metabolites of EV under carbon and nitrogen culture conditions代谢通路编号 代谢通路名称 匹配情况 P 影响大小 上调 sce00970 氨酰基tRNA的生物合成 18/46 4.38×10−4 0.11 sce00330 精氨酸和脯氨酸代谢 10/25 7.53×10−3 0.33 sce00220 精氨酸生物合成 8/18 8.05×10−3 0.60 sce00430 牛磺酸和低牛磺酸代谢 4/7 2.28×10−2 1.00 sce00250 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 8/22 3.06×10−2 0.81 下调 sce00520 氨基糖和核苷酸糖代谢 8/24 3.41×10−4 0.48 sce00052 半乳糖代谢 5/17 8.98×10−3 0.82 sce00040 戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化 4/12 1.22×10−2 0.27 sce00500 淀粉和蔗糖代谢 4/15 2.79×10−2 0.35 说明：匹配情况为匹配化合物个数/通路化合物总数 
图 3 差异代谢产物富集到的显著代谢通路Figure 3 Significant metabolic pathways enriched by differential metabolites3. 讨论
本研究在代谢组水平探究含内共生细菌的生防真菌EV菌对不同碳氮培养基的化学响应，鉴定到一些差异显著的化合物，尤其是在氮源培养基中特有的代谢产物，并定位到重要代谢途径上。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是在氮培养下EV菌大量产生的特有代谢物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是氮培养条件下显著上调的代谢物。对甲酚硫酸盐是细菌代谢酪氨酸的产物[13]。已有研究证实：拟杆菌科Bacteroidaceae、双歧杆菌科Bifidobacteriaceae、梭菌科Clostridiaceae、肠杆菌科Enterobacteriaceae、肠球菌科Enterococcaceae、优杆菌科Eubacteriaceae、梭杆菌科Fusobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳杆菌科Lactobacillaceae、紫单胞菌科Porphyromonadaceae、葡萄球菌科Staphylococcaceae、疣微菌科Ruminococcaceae和韦荣氏菌科Veillonellaceae等细菌是对甲酚硫酸盐的产生菌[14]。已有研究表明：细菌也可以降解对甲酚[15]，真菌Trichosporon cutaneum和Aspergillus fumigatus也可以利用对甲酚作为碳源[16-17]。因此推测：对甲酚硫酸盐可能是在高氮源培养下，由于碳源严重缺乏，EV菌胞内共生细菌代谢酪氨酸产生对甲酚或对甲酚硫酸盐，从而将其做为碳源进一步利用。
多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌(迄今为止共有85种)都会产生大量的吲哚。作为细胞间信号分子，吲哚控制细菌生理的多个方面，例如孢子形成、质粒稳定性、耐药性、生物膜形成和吲哚产生细菌的毒力[18]。在细菌中，吲哚由氨基酸色氨酸的降解产物产生。吲哚是细菌Ⅲ型分泌系统表达的信号分子[19]。EV真菌细菌共生体可产生吲哚，根据上述目前的研究只在细菌发现吲哚的产生，因此我们推测胞内细菌可能是吲哚的产生者，细菌可以利用吲哚这一信号分子协调两者行为，以在真菌胞内生存。
前期研究表明：EV菌基因组中含有比其他杀线虫真菌，如Arthrobotrys oligospora、Dactylellina haptotyla、Drechmeria coniospora更多的尿囊素转运蛋白[20]。此外，EV菌胞内的共生细菌属于假单孢属Pseudomonas[6]。尿囊素是腺嘌呤和鸟嘌呤代谢的中间产物，尿囊素可以被某些真菌、细菌和植物用作碳和氮的来源，尿囊素或尿囊素通路的衍生物可能有助于提高真菌向宿主植物提供氮的能力[21]。如在一些外生菌根真菌中，已鉴定出尿囊素/尿囊酸转运蛋白[21-22]。研究发现：假单孢属的细菌和酵母Saccharomyces cerevisiae也可以降解尿囊素[23-24]。在氮源充足的氮培养条件下，尿囊素代谢产物约是碳培养条件下的32倍，因此，尿囊素很可能是EV菌供给胞内共生细菌氮源的一种形式。
海藻糖在自然界中分布广泛，包括细菌、真菌、植物、无脊椎动物和哺乳动物。由于其特殊的物理特性，海藻糖能够保护细胞的完整性免受各种环境损害和营养限制。细菌可以使用海藻糖作为碳和能量的唯一来源，一些分枝杆菌中海藻糖可作为细胞壁的结构成分，而酵母细胞在很大程度上不能以海藻糖为碳源生长[25]。在根瘤菌-豆科Leguminosae植物共生期间，海藻糖在根瘤发育过程中被储存在根瘤中，并成为细菌的主要碳水化合物，而与所供应的碳源和氮源类型无关[26]。内源性海藻糖在碳缺乏或在给定培养基中碳源耗尽后被动员。海藻糖很可能是EV共生细菌的一种碳源，在碳源缺乏时作为储备能源(氮培养下产生的海藻糖是碳培养下的2.5倍)。
光色素是核黄素的光敏分解产物。关于光色素的酶促转化路径已在假单胞菌等细菌中进行研究[27]。已有研究认为：光色素是细菌群感效应的信号分子[28]，是能影响植物生长的细菌信号分子[29]，同时也是共生的信号分子[30-31]。不同的营养条件(如氮和磷)可改变细菌产生光色素的浓度[30]。本研究使用的氮源是有机氮源。在该氮培养下产生的光色素是碳培养下的8倍，氮培养条件下光色素的产量远高于碳培养条件，不同于前人报道的高浓度硝酸盐降低光色素的产量[30]。
差异最显著的代谢物多数未能富集到显著的代谢通路，原因在于这些化合物的代谢通路尚未研究透彻，或者它们是EV菌的特异化合物，尚未包括在参照数据库中。无论以真菌还是细菌数据库为参照，富集到的显著代谢通路基本一致，均与氨基酸和糖类代谢相关，而这些通路是真菌和细菌共有的，无法区分内共生细菌对其真菌宿主代谢的影响。笔者曾试图利用多种抗生素去除内共生细菌以解决该问题，并未获得成功，需要更深入的研究。
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图 1 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸序列同源性Simplot分析
Figure 1 P gene nucleotide sequence similarity of China 2013−2017 PPRV strains using Simplot analysis
图 2 2013−2017年中国37个PPRV毒株P蛋白氨基酸序列比对
Figure 2 P protein amino acid sequence alignment of China 2013−2017 PPRV strains
表 1 2014−2017年中国12株PPRV毒株信息
Table 1. Details of the 12 PPRV strains collected in China during 2014−2017
毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 毒株编号 采样时间(年-月-日) 来源省份 JL472014 2014-04-06 吉林 JS142016 2016-01-20 江苏 JX62014 2014-07-21 江西 GX22016 2016-08-22 广西 ZJ82014 2014-10-11 浙江 HN182016 2016-10-16 湖南 JX172015 2015-03-30 江西 XJ302017 2017-02-12 新疆 AH162015 2015-04-09 安徽 HN02017 2017-03-05 湖南 GZ112015 2015-09-02 贵州 GZ252017 2017-09-21 贵州 
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表 2 2013−2014年中国PPRV流行毒株信息
Table 2. Details of the PPRV strains collected in China during 2013−2014
病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 病毒名称 采样时间(年-月-日) 来源省份 宿主 XJYL2013 2013-11-30 新疆 山羊 JL2014 2014-04-01 吉林 绵羊 XJ22013 2013-12-20 新疆 山羊 JS2014 2014-04-02 江苏 山羊 XJ32013 2013-12-21 新疆 绵羊 HeN2014 2014-04-03 河南 山羊 XJ42013 2013-12-22 新疆 山羊 HB2014 2014-04-03 湖北 山羊 XJ52013 2013-12-29 新疆 山羊 AH2014 2014-04-03 安徽 山羊 GS2014 2014-01-22 甘肃 绵羊 SX2014 2014-04-05 山西 山羊 NX2014 2014-02-17 宁夏 绵羊 GX2014 2014-04-16 广西 山羊 LN2014 2014-03-17 辽宁 山羊 GZ2014 2014-04-21 贵州 山羊 CQ2014 2014-03-30 重庆 山羊 ZJ2014 2014-04-25 浙江 山羊 HLJ2014 2014-03-31 黑龙江 山羊 HN2014 2014-04-25 湖南 山羊 YN2014 2014-04-01 云南 山羊 GD2014 2014-05-15 广东 山羊 SaX2014 2014-04-01 陕西 山羊 SC2014 2014-06-10 四川 山羊 JX2014 2014-04-01 江西 山羊
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表 3 PPRV参考毒株信息
Table 3. Details of the PPRV reference strains used in this study
毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 毒株 分离年 来源地 宿主 GenBank号 Tibet/30/2007 2007 中国西藏 山羊 FJ905304 Ethiopia 2010 2010 埃塞俄比亚 山羊 KJ867541 Tibet/33/2007 2007 中国西藏 山羊 KX421388 Ghana NK1 2010 2010 加纳 山羊 KJ466104 Tibet/Bharal/2008 2008 中国西藏 山羊 JX217850 Oman 1983 1983 阿曼 山羊 KJ867544 Côte d' Ivoire 89 1989 科特迪瓦 山羊 EU267273 UAE 1986 1986 阿联酋 山羊 KJ867545 Nigeria 76/1 1976 尼日利亚 山羊 EU267274 India TN Gingee 2014 2014 印度 山羊 KR261605 Turkey 2000 2000 土耳其 山羊 NC-006383 Uganda 2012 2012 乌干达 山羊 KJ867543 CIV 01 P 2009 2009 科特迪瓦 山羊 KR781451 Morocco 2008 2008 摩洛哥 山羊 KC594074 Ethiopia 1994 1994 埃塞俄比亚 山羊 KJ867540
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表 4 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸和氨基酸序列变异情况
Table 4. Nucleotide and amino acid diversity of China 2013−2017 PPRV strains
变异位点 核苷酸/个 氨基酸/个 非同义突变率/% 中国2013−2017年流行毒株 第1位密码子 17 16 94.12 第2位密码子 9 9 100.00 第3位密码子 21 1 4.76 合计 47 26 55.32 中国2013−2017年流行毒株与其他代表毒株 第1位密码子 2 1 50.00 第2位密码子 2 2 100.00 第3位密码子 6 0 0.00 合计 10 3 30.00
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190742
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