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米尔贝霉素（milbemycins）是1967年日本Sankyo公司以二斑叶螨Tetranychus urticae为试虫筛选出的微生物代谢产物。1983年开发出了米尔贝霉素A3和A4组分的混合物[m（A3）:m（A4）=3:7]为有效成分的杀螨剂[1]。米尔贝霉素具有活性高，毒性低，对环境污染小，对人畜安全等优点[2]。它和阿维菌素一起被誉为当今活性最高的杀虫剂，是目前最有应用前景的生物农药之一[3]。作为微生物源农药，米尔贝霉素和阿维菌素特性相同，米尔贝霉素在阳光、紫外光下易分解[4]。这一特性也限制了米尔贝霉素的开发和利用。阿维菌素和矿物油一起使用时，可延长阿维菌素的防治效果和药效期[5]，这也是米尔贝霉素开发需要解决的问题。松节油是松树上采集的松脂经加工得到的化工产品，它是世界上产量最大、价格最为便宜的植物精油[6]。松节油绿色环保、安全无毒，对米尔贝霉素有良好的溶解性。本研究拟在此基础上，探讨松节油对米尔贝霉素的增效和稳定性作用，为开发以松节油为溶剂的米尔贝霉素绿色乳油制剂提供依据。
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朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus：由浙江省化工研究院提供，在人工气候室条件下[（26±1）℃，相对湿度为（70±5）%，光周期为14 h/10 h]，接种于蚕豆苗上培养。
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松节油（150～270 ℃的馏分，江西吉安市国光香料厂）；质量分数为95%米尔贝霉素原药[Milbemycin，m（A3）:m（A4）=3:7]，由浙江海正药业有限公司提供；试剂均为分析纯，市购。
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Waters 600高效液相色谱仪；ZF-20D暗箱式紫外分析仪；Potter喷雾塔（英国Burkard仪器公司）；奥林巴斯解剖镜SZ2-LGB（中国上海赖氏科技有限公司）；Agilent technologies气质联用色谱仪（7890A GS system，7693Autosampler，5875C insert MSD），HP-INNOWAX毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.50 μm），Agilent化学工作站。
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制剂配制：准确称取一定质量的米尔贝霉素原药，分别用松节油和乙醇为溶剂、OP10为乳化剂配成乳油：质量分数为2%米尔贝霉素乳油（米尔贝霉素1.0 g，乙醇45.0 g，OP10 4.0 g）；质量分数2%米尔贝霉素松节油乳油（米尔贝霉素1.0 g，松节油45.0 g，OP10 4.0 g）；质量分数为90%松节油乳油（松节油45.0 g，OP10 5.0 g）。用蒸馏水将各制剂稀释成系列质量浓度药液。米尔贝霉素制剂稀释质量浓度梯度为0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg· L-1，松节油稀释100，250，500，1 000，2 000，4 000，6 000倍。采用叶碟喷雾法[7]测定各制剂对朱砂叶螨的活性。使用POLO软件处理数据，用几率值分析法计算各化合物的毒力回归方程、半致死浓度（CL50值）、95%置信限和相关系数。用共毒系数（CTC）[8]来判断松节油对米尔贝霉素的增效作用。
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紫外光光解稳定性测定。采用玻璃膜状光解稳定性试验方法[9]。分别取质量分数2%米尔贝霉素乳油和质量分数2%米尔贝霉素松节油乳油（高效液相色谱法HPLC测定其含量）1.0 mL置于Φ2 cm的培养皿中（按照光照时间标记培养皿，每时间段设3个重复），立即放入暗室中，室温下待溶剂在自然状态下完全挥发后，形成面积为培养皿底面的药剂薄膜，放入ZF-20D暗箱式紫外分析仪下（培养皿距离紫外灯管20 cm，对照用锡纸遮盖），用波长为254 nm的紫外光照射，紫外光光照强度为420 lx，经0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，24.0，36.0，48.0，72.0 h取样，将药膜用5.0 mL甲醇分3次振荡溶解后转移到棕色样品瓶，HPLC测定其质量分数，用式（1）计算米尔贝霉素各制剂的紫外光分解率。
太阳光光解稳定性测定。同样采用玻璃膜状光解稳定性试验方法。将涂有米尔贝霉素制剂的培养皿置于室外阳光下照射，对照用锡纸遮盖，光照强度1 200～1 500 lx（光照时间累积计算，8 h·d-1），夜间或阴天将培养皿密封置于冰箱存放。经0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，24.0，36.0，48.0，72.0 h照射时间后分别取样检测质量分数变化，按（1）式求出光解率。
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质量分数2%米尔贝霉素乳油和质量分数2%米尔贝霉素松节油乳油各取25.0 mL，密封于安瓿瓶内，分别进行冷储和热储试验，重复3次·试验-1。于0 ℃冰水浴冷储7 d，（54±2）℃热水浴热储14 d，测定储存前后质量，按式（2）计算冷储和热储降解率。
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采用高效液相色谱分析米尔贝霉素含量。Waters symmetry C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm × 5.0 μm），分析米尔贝霉素以V（甲醇）:V（水）=95:5为流动相，V（乙腈）:V（甲醇）:V（体积分数为0.1%的三乙胺）=56:28:16，检测波长243 nm，进样量20 μL，流速1.0 mL·min-1，米尔贝霉素A3和A4保留时间分别为15.48 min和21.15 min。
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气相色谱条件：HP-INNOWAX毛细管柱，起始温度60 ℃，保持2 min，以30 ℃·min-1升至190 ℃，再以10 ℃·min-1升至230 ℃，保持10 min。氦气为载气，流速1.0 mL·min-1，进样量1.0 μL，分流比10:1；进样口温度250 ℃，检测器温度250 ℃。质谱条件：EI离子源能量为70 eV，扫描范围为30～250。
1.1. 供试昆虫
1.2. 供试药剂
1.3. 仪器
1.4. 实验方法
1.4.1. 对叶螨雌成螨的毒力测定
1.4.2. 松节油对米尔贝霉素的光解稳定性
1.4.3. 松节油对米尔贝霉素冷储和热储稳定性
1.5. 松节油含量及成分分析
1.5.1. 米尔贝霉素含量分析
1.5.2. 成分分析方法
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各供试制剂对朱砂叶螨雌成螨的毒力测定结果见表 1。松节油单独使用时对朱砂叶螨的半致死质量浓度（CL50）为227.050 3 mg· L-1，活性较低。松节油为溶剂配制的米尔贝霉素乳油对朱砂叶螨半致死质量浓度为0.031 4 mg· L-1，乙醇为溶剂的米尔贝霉素乳油对朱砂叶螨半致死质量浓度为0.139 0 mg· L-1，松节油对米尔贝霉素的共毒系数为442.68，表现出显著的增效作用。
药剂 毒力回归方程 半致死质量浓度/（mg·L-1） 相关系数 95 %置信限/（mg·L-1） 共毒系数 松节油 y=2.516 6+1.054 04x 227.050 3 0.988 0 221.280 5~232.973 1 米尔贝霉素/乙醇 y=6.644 7+1.919 4x 0.139 0 0.966 8 0.131 5~0.258 0 米尔贝霉素/松节油 y=9.564 2+3.036 0x 0.031 4 0.965 4 0.037 7~0.054 9 442.68 Table 1. Toxicity of turpentine and milbemycin to female adult of Tetranychus cinnabarinus
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由图 1可见：在波长254 nm光照条件下，质量分数为2%米尔贝霉素乳油紫外光照射下的降解率要显著高于质量分数为2%米尔贝霉素松节油乳油在紫外光下的降解率。在紫外光光照72 h后，2%米尔贝霉素乳油降解率接近100%，而2%米尔贝霉素松节油乳油降解率则为17.76%。
Figure 1. Ultraviolet Photodagration of milbemycin
由图 2可见：在1 200～1 500 lx光照条件下，2%米尔贝霉素乳油的降解率要显著高于质量分数为2%米尔贝霉素松节油乳油的光照降解率。在光照12 h后，2%米尔贝霉素乳油降解率达到98.37%，而质量分数为2%米尔贝霉素松节油乳油降解率则为28.72%；在光照72 h后，质量分数为2%米尔贝霉素乳油已基本分解，2%米尔贝霉素松节油乳油降解率为48.61%。
Figure 2. Photodagration of milbemycin
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从表 2中可知：2种米尔贝霉素乳油经冷、热储后的有效成分的降解率均小于5%，外观无沉淀和分层现象符合制剂冷、热储要求。
储存方式 药剂 冷/热储前质量/mg 冷/热储后质量/mg 降解率/% 外观 冷储 2%米尔贝霉素乳油 509.25 495.38 2.72 透明均一 2%米尔贝霉素松节油乳油 516.00 509.70 1.22 油状透明均一 热储 2%米尔贝霉素乳油 509.25 493.73 3.05 透明均一 2%米尔贝霉素松节油乳油 516.00 491.93 4.67 油状透明均一 Table 2. Cold storage, heated storage to stability influence of milbemycin
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采用毛细管柱，在所设定的条件下对松节油进行检测，松节油总离子流图见图 3。从图 3中可以看出：在4.0～7.5 min为松节油的特征峰范围，保留时间为4.203 min时的色谱峰，丰度明显高于其他峰，经数据库比对确定该物质为松节油主要成分α-蒎烯。松节油中相对含量大于1%的成分及其分子结构见表 3。供试松节油中，含量超过1%的成分多为单萜类同分异构体，相对含量最高为α-蒎烯（19.84%），其次为（R）-苧烯（11.70%），莰烯（10.33%）和3-蒈烯（7.29%）。
Figure 3. Total ion chromatogram of turpentine
名称 相对含量/% 保留时/min 分子式 2-莰烯 1.63 3.95 C10H16 1, 3, 5, 5-四甲基-1, 3-环己二烯 1.84 4.04 C10H16 （1S）-3, 7, 7-三甲基双环［4.1.0］庚-3-烯 2.10 4.11 C10H16 α-蒎烯 19.84 4.20 C10H16 莰烯 10.33 4.33 C10H16 葑酮 1.05 4.55 C10H16O 1, 3, 5, 5-四甲基-1, 3-环己二烯 1.77 4.57 C10H16 γ-松油烯 1.25 4.73 C10H16 3-蒈烯 7.22 4.72 C10H16 萜品油烯 3.36 4.81 C10H16 1-甲基-2-异丙基苯 8.49 4.87 C10H16 （R）-苧烯 11.70 4.91 C10H16 萜品油烯 3.31 5.30 C10H16 2-甲氧基-4-甲基苯酚 1.82 5.91 C8H10O2 Table 3. GC-MS analysis results of turpentine
2.1. 松节油及米尔贝霉素制剂对朱砂叶螨雌成螨的毒力测定
2.2. 松节油对米尔贝霉素光解稳定性测定
2.3. 松节油对对米尔贝霉素的冷、热储稳定性测定
2.4. 松节油成分分析
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松节油是松树Pinus上采集的松脂经加工得到的化工产品，它是世界上产量最大、价格最为便宜的植物精油。中国松树资源丰富，松树面积约1 600 × 104 km2，年产松节油约8 × 104 t，仅次于美国，位居世界第2位[6]。松节油具有一定的生物活性，可直接用于治疗肌肉痛、关节痛、神经痛和软组织损伤，还可作为药物助剂，如溶剂、杀菌消毒剂和透皮促进剂等[10-11]。目前松节油多用于合成龙脑、薄荷脑、维生素类、药用樟脑等[12]，农药制备方面多用于开发杀虫增效剂、萜类驱避剂、拒食剂和保幼激素类似物等[13]。研究表明：松节油对米尔贝霉素有显著的增效作用，光解、冷热储试验表明：松节油对提高米尔贝霉素稳定性也具有很好的效果，气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析其主要成分为α-蒎烯，（R）-苧烯、莰烯和3-蒈烯[14]等萜烯类化合物。萜烯类化合物具有良好的脂溶性，对昆虫表皮有较强的渗透作用[15]，是松节油对米尔贝霉素增效的主要原因。
松节油对米尔贝霉素还具有较强的稳定作用，是其增效的另一原因。米尔贝霉素在环境中的稳定性相对较差，在强阳光下容易分解，这也是生物源农药的共同特点。例如紫外线能使印楝素快速分解[9]，印楝素-A涂敷成薄膜在紫外灯照射下的半衰期只有48 min[16]。阿维菌素在阳光照射下，半衰期＜10 h[17-19]。生物源农药的不稳定性严重限制了它们的田间使用，从而使其商品化进程缓慢。而以松节油为溶剂在抗紫外、抗强阳光、制剂的冷、热储方面，对米尔贝霉素都能够起到很好的稳定作用。以松节油为溶剂配制的其他药剂对小菜蛾Plutella xyllostella，蚜虫Aphis craccivora，菜青虫Pieris rapae，东方黏虫Mythimna separata的室内毒力结果表明：药剂均表现出良好的增效作用，昆虫也表现出良好的拒食作用[20]。
农药乳油制剂加工成本低、使用方便，田间效果优于相同成分的其他类型制剂，但使用大量的有机溶剂会对环境造成极大的压力。松节油来源丰富，价格适中，对米尔贝霉素有良好的溶解性，并具有显著的增效和稳定作用，是米尔贝霉素绿色乳油制剂加工的良好溶剂选择。
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