Effect of endophytic fungi on growth and physiology of saline stressed Sophora japonica seedlings

菌株由本课题组病理实验室提供，于2014年8月分离自周公庙古国槐（1 700 a）的健康叶片。将内生真菌（表 1）按照H-1，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-7和H-8的顺序统一编号后，分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养基，26 ℃恒温培养箱扩繁培养7~10 d后，轻轻刮取菌丝、孢子，无菌水润洗数次后，通过BTH-329PE小型搅拌机搅拌打碎、震荡均匀，并按浓度梯度稀释，在显微镜下对菌丝片段计数，用无菌水调节使菌丝片段悬液浓度为5×10³菌落形成单位·L^-1，制成菌剂。

盆栽试验在陕西杨凌西北农林科技大学南校区日光玻璃温室中进行。国槐种子采自杨凌，选取颗粒饱满均匀、具有光泽的国槐种子，75 ℃热水浸泡，自然冷却至室温后，置于27 ℃恒温培养箱培养3 d，进行催芽。

将采自杨凌的农耕土过2 mm筛后，V（农耕土）: V（腐殖质土）=1 : 1，121 ℃高压灭菌2 h，混合土有机质质量分数为80.12 g·kg^-1，全氮3.55 g·kg^-1，速效磷166.53 mg·kg^-1，速效钾541.41 mg·kg^-1。将催芽露白一致的国槐种子播种于盛有等体积混合土的塑料花盆中（花盆尺寸为直径18 cm，高10 cm），待幼苗生长30 d开始间苗，保留壮苗1株·盆^-1。

2015年4月24日，选择长势良好，苗高基本一致的国槐苗，并记录初始高度（mm）后，浇灌25 mL·盆^-1预先配制的菌株悬液，处理设重复10个·菌株^-1，以浇灌等量的无菌水为对照（ck）。5月4日进行第2次灌根处理。

盐胁迫试验从2015年5月8日至6月1日共持续24 d，期间隔3~4 d，各个处理同时浇灌200 mmol·L^-1氯化钠溶液100 mL。

6月2日，记录国槐苗高（mm），并将幼苗自地径处剪断，根部用蒸馏水洗净，滤纸吸干表面水分，称量地上部和根鲜质量（g），然后分别在105 ℃下杀青1 h，70 ℃烘干至恒量，测定地上部干质量（g）和根干质量（g），计算国槐鲜质量含水量（%）和根冠比。计算公式：苗高增长量=处理后苗高-处理前苗高，根冠比=根干质量/地上部干质量；鲜质量含水量（%）=[（W_f-W_d）/W_f]×100%，其中W_f为鲜质量（g），W_d为干质量（g）。

分别采集国槐幼苗相同部位的幼嫩叶片，称取约0.1 g，液氮研磨后，转移至10 mL离心管中，体积分数为95%乙醇定容10 mL，离心8 min（4 000 r·min^-1，4 ℃），取上清液测定叶绿素质量分数^[6]。游离脯氨酸的测定采用磺基水杨酸提取法^[7]。

制备粗酶液：称取鲜叶约0.3 g，pH 7.8的冷磷酸缓冲液研磨并冲洗，转移至离心管中，定容8 mL，离心15 min（10 000 r·min^-1，4 ℃），取上清液即为粗酶液，4 ℃保存，并进行生理指标测定^[7-9]：超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法；丙二醛（MDA）质量摩尔浓度测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。

运用Excel 2003和SPSS 22软件进行数据处理和统计分析，Duncan法进行多重比较，判断差异显著性。

200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，8株不同内生真菌悬液灌根处理对国槐苗高产生不同程度的影响（图 1）。菌株H-3和H-4处理的幼苗生长最快，苗高增量分别为对照（ck）的148%和136%，显著高于对照（P＜0.05），表明菌株H-3和H-4灌根可减弱盐胁迫对国槐幼苗的影响；菌株H-5和H-7灌根处理的苗高增量分别为对照的69%和80%，显著低于对照（P＜0.05），表明菌株H-5和H-7灌根减弱了国槐苗的抗盐生长；其他菌株处理对国槐幼苗的抗盐生长作用不明显。

Figure 1.  Effect of the different endophytic fungi on the growth rate of Sophora japonica

200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，内生真菌H-3灌根处理的幼苗干质量和根冠比均显著高于对照（P＜0.05，图 2），分别为对照的117%和121%，表明H-3灌根促进了国槐幼苗干物质的积累，同时将更多的能量分配于根部，增大根冠比，提高了国槐苗对盐胁迫的适应性；而H-5处理的幼苗干重和根冠比均显著低于对照（P＜0.05，图 2），分别为对照的83%和78%，表明H-5灌根抑制了幼苗生物量的积累，同时降低根冠比，减弱了国槐苗的抗盐性。

Figure 2.  Effect of the different endophytic fungi on the dry weight and root shoot radio of Sophora japonica

含水量的大小，可说明植物的生理活动是否旺盛。200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，8株内生真菌灌根处理对国槐地上部分鲜质量含水量的影响不明显，但对地下部分鲜质量含水量的影响显著（P＜0.05，图 3）。H-1，H-3，H-4和H-6灌根处理的幼苗地下部分鲜质量含水量均显著高于对照（P＜0.05），分别为对照的111%，104%，104%和106%，其他菌株处理与对照比较均无显著差异，表明菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根可减少国槐幼苗水分的散失或增加根系对水分的吸收，缓解了国槐在盐环境的生理干旱，从而增强国槐的耐受性。

Figure 3.  Effect of the different endophytic fungi on the water content of fresh weight of Sophora japonica

叶绿素（Chl）是植物光合作用最主要的色素，影响植物的光合速率，且其质量分数与叶色呈正相关，能大致反映出植物的营养状况^[10]。200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，8株内生真菌灌根处理对国槐苗叶绿素质量分数的影响差异明显（图 4）：菌株H-1，H-4和H-6灌根处理的国槐叶绿素质量分数均显著高于对照（P＜0.05），分别为3.86，3.99和4.03 mg·g-1；而H-5和H-7灌根处理的叶绿素质量分数显著低于对照，其他菌株处理与对照无明显差异（P＜0.05）。8株内生真菌灌根处理对国槐苗的叶绿素a/b比值的作用效果不明显。内生真菌可能通过提高或降低国槐幼苗的叶绿素质量分数，来增强或降低国槐幼苗的光合作用。

Figure 4.  Effect of the different endophytic fungi on the Chl content and Chla/Chlb of Sophora Japonica

200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根处理的国槐幼苗丙二醛（MDA）质量摩尔浓度显著低于对照（P＜0.05，图 5），分别为对照的88%，88%，86%和83%，表明菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根后抑制了丙二醛的产生，降低盐分对植物的伤害；菌株H-5灌根处理的国槐幼苗丙二醛质量摩尔浓度显著高于对照，国槐抵抗盐胁迫的能力最差，受到的伤害最大。就脯氨酸（Pro）质量分数而言，H-1和H-3处理的国槐质量分数分别为对照的140%和151%，显著高于对照，H-5灌根处理的国槐脯氨酸质量分数为对照的81%，显著低于对照（P＜0.05，图 5）。

Figure 5.  Effect of the different endophytic fungi on Pro and MDA content of Sophora japonica leaf

200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，H-1灌根处理的国槐叶片超氧化物歧化酶活性为对照的134%，H-4灌根处理的国槐叶片过氧化物物酶活性为对照的135%，均显著高于对照；H-5处理的国槐叶片过氧化物物酶活性显著低于对照，为对照的72%，可见菌株H-1和H-4灌根处理可显著提高植物的抗逆性，有效抵御盐胁迫对国槐幼苗的伤害，H-5灌根处理降低了国槐自身对盐胁迫的忍受能力，而其他菌株灌根处理对国槐叶片超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的影响不明显（P＞0.05，图 6）。

Figure 6.  Effect of the different endophytic fungi on SOD and POD activities of Sophora japonica leaf

200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，8株内生真菌灌根处理对国槐幼苗生长表现出促进、抑制或无明显作用。菌株H-3的促进作用最明显，幼苗高增长量、干质量、根冠比和鲜质量含水量显著高于对照，表明H-3灌根处理可增加国槐苗高、干物质积累，H-4的促进作用次之；菌株H-5则抑制其生长，国槐幼苗生长势减弱，吸收水分的能力差，地上部分的生物量积累受到抑制，其他菌株作用不明显。叶绿素质量分数的大小直接影响植物的光合强弱^[10]，菌株H-1，H-4和H-6处理的国槐叶绿素质量分数均显著高于对照，而H-5和H-7处理的叶绿素质量分数显著低于对照，内生真菌可能通过提高或降低国槐幼苗的叶绿素质量分数，来增强或降低国槐幼苗的光合作用。

随着研究的深入，在植物抗逆（抗盐）中，活性氧代谢的作用非常重要，受到越来越多人的关注，当遇到逆境时，植物体内的代谢会受到影响，有利于自由基的产生，而当自由基积累到一定程度时，便会损伤植物的细胞膜^[11]。丙二醛是植物逆境时积累的有害物质，含量越高，说明细胞膜受到的伤害越大^[12]。超氧化物歧化酶、过氧化物酶等能有效地清除自由基，是酶促防御系统的重要组成成分，因此，在盐胁迫条件下, 植物体内超氧化物歧化酶等活性的增加可以提高植物的抗盐能力。脯氨酸的积累作为植物耐盐性评价生理指标具有不确定性。有研究表明植物体内游离脯氨酸的含量与植物的抗逆性成正相关性^[13]，也有报道认为，脯氨酸的积累与耐盐程度无相关性^[14]，更有报道认为脯氨酸的积累是胁迫对植物伤害的结果^[15]。本研究试验结果表明：200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，8株内生真菌灌根处理对国槐幼苗的生长和生理作用表现为正效应、负效应和无显著效应；菌株H-1，H-3，H-4和H-6灌根处理的国槐幼苗丙二醛质量分数显著低于对照，其中H-6处理的国槐叶片丙二醛质量分数最低，表明H-6在盐胁迫过程中较大程度抑制了丙二醛的产生，降低盐分对国槐的伤害，提高了国槐幼苗的抗性；H-1处理的国槐叶片超氯化物歧化酶活性和H-4处理的国槐叶片过氧化物物酶活性显著高于对照，H-1和H-3处理的国槐幼苗的脯氨酸质量分数显著高于对照，从而缓解了盐胁迫对国槐苗的伤害；而菌株H-5灌根处理的国槐幼苗丙二醛显著高于对照，脯氨酸质量分数、过氧化物酶活性显著低于对照，说明本处理下国槐抵抗盐胁迫的能力最差，H-5可能是国槐的“机会病原菌”，间接或直接降低了国槐自身对盐胁迫的忍受能力。另外，本研究结果认为：脯氨酸质量分数的变化与植物的抗逆性成正相关性，与贺道耀等^[13]的观点一致。

部分植物根际微生物可以促进植物生长和养分吸收，提高宿主植物抗逆性，如AM真菌可显著提高植物耐盐性^[16]，玉米Zea mays接种丁香假单胞菌Pseudomonas syringae后，可忍受对一定浓度的盐胁迫^[17]，深色有隔内生真菌D575对盐胁迫具有较强的耐受性^[18]。本研究中，200 mmol·L^-1氯化钠胁迫下，H-1，H-3，H-4和H-6灌根处理的国槐幼苗抗盐能力提高，且每种菌株处理下的国槐生物量与生理变化趋势基本一致，具有应用潜力。值得一提的是，内生真菌侵染对宿主植物的作用具有不确定性，例如一些内生真菌在一种植物中表现致病，而在另一宿主中可表现互惠共生，甚至在不同条件下同一种植物中，也可表现出不同的作用关系^[19-21]，这与内生真菌和宿主的遗传物质、植物营养供应、温度、土壤湿度和水分条件等均有关系，其作用机制尚需深入研究^[22]。