Resistance of Phoebe sheareri to anthracnose induced by salicylic acid

紫楠Phoebe sheareri又名紫金楠、金丝楠等，由建德市欣林林木服务中心提供，为2年生盆栽苗。供试菌株胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides由浙江农林大学森林保护学科菌种储存室提供。

配制质量浓度为500、200、100、50 mg·L⁻¹水杨酸溶液(pH 6.8)进行喷雾试验，约30 mL·株⁻¹，1 d后重复喷洒，并设置无菌水对照。5 d后采集叶片，选择心叶下完全展开的功能叶片，用灭菌剪刀取样，样品成熟度保持一致。每处理3株，4次重复。采用孢子悬浮液进行离体刺伤接种，以不刺穿叶片为宜。于25 ℃下12 h光照12 h黑暗保湿培养，7 d后统计叶片发病情况，采用网格法测病斑面积，重复3次取平均值，计算病斑减小率。病斑减小率 = (对照处理病斑面积−诱导处理病斑面积)/对照处理病斑面积×100%

选取长势良好大小一致的2年生紫楠植株，配置SA的最终质量浓度为500、200、100、50 mg·L⁻¹，均匀喷洒于植株上，以溶液布满叶片不流下为宜。以无菌水喷洒作为对照，1 d后重复喷洒，使植物充分吸收，5 d后采集长势均一的成熟叶片进行生理测定，包括可溶性蛋白质、SOD、POD、CAT，每处理3次重复。可溶性蛋白质采用紫外吸收法测定^[14]。取紫楠叶片0.5 g，按照1∶9的体积比加入9倍体积0.1 mol·L⁻¹磷酸缓冲液(pH 7)，5 000 r·min⁻¹离心10 min，上清液为蛋白质提取液。取蛋白质原液0.5 mL稀释至5 mL，利用紫外分光光度计测取280 nm及260 nm处的光密度D(280)和D(260)，以pH=7.0磷酸缓冲液进行空白调0。蛋白质质量浓度(g·L⁻¹)=1.45×D(280)−0.74×D(260)。其中1.45和0.74为校正值。SOD活性测定：本研究通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，氧化羟胺形成子纠缠亚硝酸盐，在显色剂的反应下呈现紫红色，根据南京建成生物工程研究所测试盒步骤进行测定，用可见光分光光度计测其光密度。组织中SOD活力定义：每克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位(1 U=16.67 nkat)。SOD活力(16.67 nkat·g⁻¹)=[(对照光密度−测定光密度)÷对照光密度]÷50% ×反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷匀浆液浓度(kg·L⁻¹)。CAT活性测定：CAT分解过氧化氢(H₂O₂)的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H₂O₂与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，按照南京建成生物工程研究所测试盒处理结果在405 nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。CAT活力定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1 μmol的H₂O₂的量为1个活力单位。CAT活力(16.67 nkat·g⁻¹)=(对照光密度−测定光密度)×271÷60÷取样量(mL)÷匀浆液浓度(kg·L⁻¹)。POD活性测定：过氧化氢酶可催化过氧化氢反应，根据南京建成生物工程研究所测试盒测定420 nm处可见光光密度变化来计算酶活性。组织中POD活力定义：在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1 μg底物的酶量定义为一个活力单位(1 U=16.67 nkat)。POD活力(16.67 nkat·g⁻¹)=[(对照光密度−测定光密度)÷(12×1 cm比色光径)]×反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷反应时间(30 min)÷匀浆液浓度(kg·L⁻¹)×1 000。

为确定SA对孢子萌发是否有影响，配置含SA的最终质量浓度为0、50、100、200、500 mg·L⁻¹的楠木炭疽病病原菌孢子悬浮液，采用凹玻片萌发法^[14]，调节pH至6.8进行25 ℃全黑暗保湿培养，每处理3次重复，12 h后观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率。孢子萌发率 = 已萌发孢子数/观察孢子总数×100%；

根据质量浓度诱导结果，选用最适宜质量浓度SA进行喷雾处理，1 d后重复喷施，对照为等量无菌水。本实验共设置4个处理：在第2次SA处理2 h后活体接种(A)；SA处理不接种(B)；无菌水处理并接种(C)；无菌水处理不接种(ck)。每处理3株，4次重复。采用孢子悬浮液针刺接种，脱脂棉保湿处理。不同处理在第2次SA或无菌水喷施后1、2、3、5、7、10、15 d采集生长状况一致的叶片，于−80 ℃冰箱保存备用，进行后续生理指标变化测定。

由图1可以看出：不同质量浓度的SA对紫楠均具有诱导作用，对病斑抑制效果差异显著(P＜0.05)。与无菌水喷洒处理相比SA质量浓度为100 mg·L⁻¹诱导植物叶片病斑减小率最高，达64.28%，其次是50和200 mg·L⁻¹，诱导效果为59.8%、56.72%，500 mg·L⁻¹诱导效果最差，其中各质量浓度诱导植物病斑大小差异显著。

Figure 1.  Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination

结果表明(图1)：低质量浓度SA处理孢子萌发率与对照相比无显著差异，即对孢子萌发无明显抑制作用，当SA质量浓度为200、500 mg·L⁻¹时抑制作用显著(P＜0.05)，分别为69.58%和34.75%，同低质量浓度相比差异较大。

从图2可以看出：不同质量浓度SA均可诱导可溶性蛋白质的增加(P＜0.05)，100 mg·L⁻¹所诱导的蛋白质质量浓度是对照的2.11倍，50和200 mg·L⁻¹的诱导效果差异不显著，与对照相比差异显著，分别是对照的1.77和1.69倍。500 mg·L⁻¹ SA诱导后，可溶性蛋白质质量浓度较其他处理低，但显著高于对照(P＜0.05)。

Figure 2.  Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD

SOD是植物体内重要的抗氧化酶，SA施用后引起植株SOD活性升高(图2)。其中500和200 mg·L⁻¹与对照之间无显著差异，SA质量浓度为100 mg·L⁻¹时酶活性高于50 mg·L⁻¹时的酶活性，差异显著(P＜0.05)。表明不同质量浓度SA对植物中SOD酶活性的影响不同。

CAT活性随SA质量浓度的上升表现出先升高后降低的趋势(图2)，500 mg· L⁻¹质量浓度处理与对照的CAT相比无显著差异，200、100、50 mg·L⁻¹处理差异显著(P＜0.05)，均能使CAT活性增加。其中100 mg·L⁻¹的SA处理对楠木植株CAT活性诱导效果最好，是对照的2.03倍。

不同质量浓度SA处理对POD活性的影响与CAT趋势相似(图2)，均为随SA质量浓度的增加表现为先上升后下降。100 mg·L⁻¹SA诱导的POD活性最高，是对照的1.3倍。200和50 mg·L⁻¹诱导的CAT活性无显著差异，但显著高于500 mg·L⁻¹和对照处理。不同质量浓度SA均可引起POD活性增加。上述研究表明：不同质量浓度SA对楠木诱导效果均存在差异，500 mg·L⁻¹诱导效果最差，100 mg·L⁻¹诱导效果最好，因此选择100 mg·L⁻¹的SA进行下一步实验。

从图3可以看出：不同处理均可引起紫楠叶片可溶性蛋白质质量浓度的增加。SA处理后其蛋白质质量浓度在1~5 d持续增加，5 d时达峰值，处理A在第7天达峰值，随后下降，可溶性蛋白质质量浓度显著高于未经SA处理过的处理C和ck。处理A效果最好，第7天时是ck的2.57倍，经SA处理过的植株第15天可溶性蛋白质质量浓度仍显著高于对照，处理C在第1~3天升高随后下降，趋势相较于A处理和B处理趋势较为平缓。15 d时SA处理过的植株可溶性蛋白质质量浓度显著高于对照，因此SA可以诱导紫楠植株可溶性蛋白质增加。

Figure 3.  Effect of different treatments on soluble protein, SOD, CAT and POD

本研究SA处理均可引起紫楠叶片SOD活性增加(图3)，随SA的作用时间先逐渐升高后缓慢下降。当SA作用时间为7 d时，处理A的SOD活性达最大值，是ck的1.21倍，之后开始下降，处理A和处理B的SOD活性始终显著高于处理C和ck。

SA诱导后可引起紫楠体内CAT活性增加(图3)，有利于增强植株抗病性。紫楠叶片经SA处理和接种处理后，CAT活性在第5天达到峰值，处理A是ck的2.04倍，处理B是ck的1.63倍，5 d后CAT活性下降。处理C的CAT活性虽有增加但到后期与ck相比差异不显著。

100 mg·L⁻¹的SA诱导后，植株POD活性迅速升高(图3)，处理A与处理B的POD活性具有基本相似的变化趋势，处理A相较于处理B迟一些达到最大值，且POD活性是ck的1.46倍，SA诱导15 d后的植株POD活性仍显著高于未诱导的植株。

诱抗剂有着更好的抗病性和低毒性^[15-16]。目前，诱导剂在农业等方面应用广泛，在林业方面研究相对较少。将诱导剂应用于林业实践可减少化学杀菌剂的使用，与杀菌剂、生物防治等相结合可达到更好的效果^[17-19]。当SA质量浓度低于500 mg·L⁻¹时对孢子萌发无影响，可以证明低质量浓度外源SA的施用对病原菌孢子无直接毒力。本研究证实：不同质量浓度SA对紫楠均具有诱导抗性作用。100 mg·L⁻¹为SA最适宜质量浓度，酶活性均达到最大值，差异显著。SA处理后可溶性蛋白质质量浓度，SOD、CAT、POD活性先上升然后下降至稳定水平，实验持续了15 d，所测结果仍高于正常水平，其中CAT变化最为明显，经SA诱导的紫楠接种或不接种处理，生理指标活性均显著高于对照，这与山茶^[11]、橡胶树Hevea brasiliensis ^[20]等抗性诱导研究结果一致。

SA是存在于植物体内的内源性生长物质，可以引起植物体内H₂O₂浓度升高，促进H₂O₂生成的化合物，诱导SAR相关蛋白及防御酶等活性的增加，促进相关基因的表达^[21-22]。外源SA可以诱发植物触发病理相关蛋白基因的表达，在诱导植物产生抗病性的同时大量积累病程相关蛋白。外源SA的应用可诱导植物内源性CAT和POD活性增加，以及相关基因的表达，能引发植物的诱导抗性^[23]。POD除了具有解毒作用外，还是植物体内多种次生代谢产物生物合成的关键调控酶之一，植物次生代谢产物参与了植物对病原体的防御反应，SOD在清除高毒性和不稳定活性氧中起重要作用，CAT、POD和SOD被认为是保护细胞免受氧化损伤的主要抗氧化系统，多种酶活性的升高可能是使植物体产生抗性，抵抗病原菌侵染的重要原因。因此，SA可以诱导楠木对病原菌的入侵产生抗性，为防治提供依据。