Identification and analysis of floral scent compounds of Prunus mume cultivars

所有梅花品种保存于浙江农林大学梅花种质资源圃。选取株龄相同、长势一致的梅花品种，共20个品种，6个品种群。其中：朱砂品种群有6个品种，分别为‘晨晖朱砂’‘Chenhui Zhusha’‘粉红朱砂’‘Fenhong Zhusha’‘红颜朱砂’‘Hongyan Zhusha’‘先春朱砂’‘Xianchun Zhusha’‘银红朱砂’‘Yinhong Zhusha’‘大盃’‘DaBei’；宫粉品种群有5个品种，分别为‘粉皮宫粉’‘Fenpi Gongfen’‘粉晕宫粉’‘Fenyun Gongfen’‘晓红宫粉’‘Xiaohong Gongfen’‘早花宫粉’‘Zaohua Gongfen’‘春意早宫粉’‘Chunyizao Gongfen’；绿萼品种群有3个品种，分别为‘变绿萼’‘Bian Lve’‘小绿萼’‘Xiao Lve’‘素玉绿萼’‘Suyu Lve’；玉蝶品种群有3个品种，分别为‘乔妆玉蝶’‘Qiaozhuang Yudie’‘月光玉蝶’‘Yueguang Yudie’‘长蕊玉蝶’‘Changrui Yudie’；垂枝品种群有1个品种，为‘单粉垂枝’‘Danfen Chuizhi’；跳枝品种群有2个品种，分别为‘单粉跳枝’‘Danfen Tiaozhi’和‘筋入春日野’‘Jinruchunriye’。所用试剂为C7~C30正构烷烃混合标准品(Sigma公司，德国)。

用镊子取下3朵盛开期的梅花，将其快速转移至22 mL的采样瓶，封口膜密封瓶盖，平衡10 min，将固相微萃取SPME纤维头(Supelco公司，美国)插入花朵上方2 cm处的采样瓶中吸附30 min。将吸附完花香的萃取头插入GC-MS联用仪的进样口进行分析，3次平行重复实验。GC-MS分析条件：色谱柱HP-5MS (30.00 m×250.00 μm×0.25 μm)，载入氦气，流速1.2 mL·min⁻¹；起始柱温为45 ℃，保持3 min，以5 ℃·min⁻¹升至120 ℃，然后以6 ℃·min⁻¹升温至260 ℃，保持3 min，离子电离能量70 eV，离子阱温度为230 ℃。每个品种3次生物学重复。

在相同分析条件下，测定C7~C30正构烷烃混合标准品，计算待鉴定化合物的保留指数，并结合GC-MS联用仪计算机的NIST05a.L/NIST11.L标准谱库自动检索分析各组分。保留指数计算公式^[18]为I_R=100n+100(t−t_n)/(t_n+1−t_n)。其中：I_R为保留指数，n和n+1分别为目标化合物出峰前后正构烷烃的碳原子数，t_n和t_n+1分别为相应正构烷烃的保留时间，t为待鉴定化合物在谱图中的保留时间(t_n＜t＜t_n+1)。依据总离子流各色谱峰平均峰面积，并通过面积归一化方法计算各香气成分的相对含量。

通过文献查找主要花香化合物的香气阈值，结合花香化合物的相对含量计算其香气贡献值，相对含量与香气阈值的比值即为香气贡献值。使用Origin 2021绘制花香成分的聚类分析图。

在20个梅花品种中共鉴定出43种挥发性成分，包括苯环/苯丙烷类化合物23种，萜烯类化合物7种，脂肪酸衍生物9种，烷烃类4种(表1)。朱砂品种群检测到的成分最多，有35种，包括苯环/苯丙烷类16种，萜烯类7种，脂肪酸衍生物9种，烷烃类3种；宫粉品种群共检测到30种成分，包括苯环/苯丙烷类20种，萜烯类4种，脂肪酸衍生物3种，烷烃类3种；玉蝶品种群共检测到20种成分，包括苯环/苯丙烷类13种，萜烯类3种，脂肪酸衍生物4种；绿萼品种群共检测到23种成分，包括苯环/苯丙烷类15种，萜烯类3种，脂肪酸衍生物5种；跳枝品种群共检测到28种成分，包括苯环/苯丙烷类15种，萜烯类6种，脂肪酸衍生物7种；垂枝品种群共检测到17种成分，包括苯环/苯丙烷类9种，萜烯类4种，脂肪酸衍生物4种。不同类型化合物的相对含量也存在较大差异，苯环/苯丙烷类的相对含量最高，为87.01%~99.87%，脂肪酸衍生物的相对含量为0~6.95%，萜烯类物质的相对含量为0~6.15%。

如表2所示：‘晨晖朱砂’中乙酸苯甲酯(44.97%)、苯甲醇(41.83%)、丁子香酚(5.98%)和苯甲醛(2.84%)等相对含量较高。‘粉红朱砂’与‘晨晖朱砂’相似，其最主要的花香成分为乙酸苯甲酯(48.25%)、苯甲醇(34.21%)、丁子香酚(5.25%)和苯甲醛(5.24%)等。‘红颜朱砂’中苯甲醇(72.86%)、丁子香酚(7.37%)、肉桂醇(5.97%)和苯甲醛(5.61%)等相对含量较高。‘先春朱砂’中苯甲醇(63.15%)、肉桂醇(13.67%)、苯甲醛(8.72%)和丁子香酚(7.59%)等相对含量较高。‘银红朱砂’的挥发性成分为乙酸苯甲酯(50.48%)、苯甲醇(39.96%)和丁子香酚(3.93%)等相对含量较高。‘大盃’中乙酸苯甲酯(25.56%)、苯甲醛(17.53%)、草蒿脑(12.44%)、丁子香酚(10.50%)、4-(2-丙烯基)苯酚(9.66%)和乙酸-2-己烯酯(4.63%)等相对含量较高。

对梅花香气贡献率(表3)的计算发现：β-紫罗兰酮、肉桂醇、丁子香酚和甲基丁香酚对朱砂品种群梅花的香气的贡献率较高。由于β-紫罗兰酮的香气阈值很低，所以其在梅花花朵香气中的贡献率最高。

如表4所示：‘粉皮宫粉’中苯甲醇(53.90%)、肉桂醇(16.19%)、苯甲醛(11.44%)和丁子香酚(9.35%)等相对含量较高。‘粉晕宫粉’与‘粉皮宫粉’相似，其中苯甲醇(54.94%)、肉桂醇(19.83%)、丁子香酚(9.57%)和苯甲醛(5.10%)等是其主要的花香成分。‘晓红宫粉’中乙酸苯甲酯(53.19%)、苯甲醇(30.57%)和丁子香酚(7.13%)等相对含量较高。‘早花宫粉’中苯甲醇(30.31%)、乙酸苯甲酯(25.32%)、乙酸肉桂酯(9.94%)、丁子香酚(9.15%)、苯甲醛(8.74%)和肉桂醇(7.42%)等为主要的香气成分。‘春意早宫粉’中乙酸苯甲酯(46.72%)、苯甲醇(40.05%)、丁子香酚(7.13%)和苯甲醛(4.06%)等为主要的香气物质。

如表5所示：在‘粉晕宫粉’和‘粉皮宫粉’中，香气贡献值从高到低依次是β-紫罗兰酮、肉桂醇、对甲苯甲醚、丁子香酚和甲基丁香酚，未检测到乙酸叶醇酯。‘晓红宫粉’香气贡献值从高到低依次是丁子香酚、甲基丁香酚、乙酸叶醇酯和乙酸苯甲酯。‘早花宫粉’香气贡献值从高到低依次是肉桂醇、丁子香酚和甲基丁香酚。在‘春意早宫粉’中，香气贡献值从高到低依次是β-紫罗兰酮、肉桂醇、丁子香酚和甲基丁香酚。

如表6所示：‘乔妆玉蝶’中乙酸苯甲酯(62.67%)、苯甲醇(24.35%)、丁子香酚(5.36%)和苯甲醛(4.42%)等相对含量较高。‘月光玉蝶’中乙酸苯甲酯(72.90%)、苯甲醛(7.83%)、苯甲醇(7.73%)和丁子香酚(3.06%)等相对含量较高。‘长蕊玉蝶’中乙酸苯甲酯(62.63%)、苯甲醇(18.80%)、丁子香酚(6.17%)和苯甲醛(5.94%)等相对含量较高。

如表7所示：在‘长蕊玉蝶’中，香气贡献值从高到低依次是β-紫罗兰酮、丁子香酚、甲基丁香酚、乙酸叶醇酯、乙酸苯甲酯和草蒿脑。在‘月光玉蝶’中，香气贡献值从高到低依次是丁子香酚、甲基丁香酚、乙酸叶醇酯和乙酸苯甲酯，未检测到β-紫罗兰酮。‘乔妆玉蝶’中香气贡献值从高到低是丁子香酚和乙酸苯甲酯。

如表8所示：‘变绿萼’中乙酸苯甲酯(57.43%)、苯甲醛(14.67%)、苯甲醇(8.26%)、对甲苯甲醚(5.41%)和丁子香酚(5.34%)等相对含量较高。‘小绿萼’中乙酸苯甲酯(65.13%)、苯甲醇(23.37%)和丁子香酚(3.74%)等相对含量较高。‘素玉绿萼’中乙酸苯甲酯(59.20%)、苯甲醇(24.56%)、丁子香酚(5.81%)和苯甲醛(5.45%)等相对含量较高。

如表9所示：‘变绿萼’中香气贡献值从高到低依次是对甲苯甲醚、丁子香酚、甲基丁香酚、乙酸叶醇酯和异戊醇，未检测到β-紫罗兰酮。在‘小绿萼’中，香气贡献值从高到低依次是β-紫罗兰酮、丁子香酚、甲基丁香酚、乙酸叶醇酯和乙酸苯甲酯。在‘素玉绿萼’中，香气贡献值从高到低依次是丁子香酚、甲基丁香酚、乙酸叶醇酯和草蒿脑，未检测到β-紫罗兰酮。

如表10所示：‘单粉跳枝’中苯甲醇(59.78%)、苯甲醛(17.58%)、丁子香酚(5.50%)和肉桂醇(4.14%)等相对含量较高。‘筋入春日野’中乙酸苯甲酯(63.54%)、苯甲醇(12.20%)、苯甲醛(9.12%)和乙酸-2-己烯酯(4.31%)等相对含量较高。‘单粉垂枝’中乙酸苯甲酯(55.42%)、苯甲醛(16.53%)、苯甲醇(13.88%)、丁子香酚(4.88%)和乙酸-2-己烯酯(3.02%)等相对含量较高。

如表11所示：在‘单粉跳枝’中，香气贡献值从高到低依次是β-紫罗兰酮、肉桂醇、丁子香酚、甲基丁香酚、壬醛和癸醛。‘筋入春日野’中香气贡献值最高的依次是丁子香酚、乙酸叶醇酯和甲基丁香酚。‘单粉垂枝’香气贡献值最高的依次是β-紫罗兰酮、丁子香酚、甲基丁香酚和乙酸叶醇酯。

如图1所示：20个梅花品种依据花香成分组成及相对含量，被分为5类。第1类为‘晨晖朱砂’‘银红朱砂’‘粉红朱砂’‘春意早宫粉’和‘晓红宫粉’，其花香成分特点是乙酸苯甲酯和苯甲醇相对含量较高，且相近。第2类为‘单粉垂枝’‘筋入春日野’、玉蝶品种群及绿萼品种群，其花香特点是乙酸苯甲酯相对含量最高，其次是苯甲醇，且苯甲醇相对含量远低于乙酸苯甲酯。第3类仅包括朱砂品种群的‘大盃’，其花香特点是乙酸苯甲酯、苯甲醛、草蒿脑相对含量均较高且相近，萜烯类物质相对含量也较高。第4类仅包括宫粉品种群的‘早花宫粉’，其花香特点是苯甲醇和乙酸苯甲酯相对含量最高，其次是乙酸肉桂酯、丁子香酚和苯甲醛。第5类包括‘红颜朱砂’‘先春朱砂’‘粉皮宫粉’‘粉晕宫粉’和‘单粉跳枝’，其花香成分组成特点是苯甲醇相对含量最高，均高于50%，其次是苯甲醛，而乙酸苯甲酯相对含量极低，均低于2%。

Figure 1.  Cluster dendrogram of floral scent components in twenty cultivars of P. mume

梅花是中国拥有第1个国际登录权的物种，目前已有超过400个梅花品种被登录^[19]。郝瑞杰等^[20]研究表明：决定梅花香气的主要成分是苯环/苯丙烷类化合物，其中以乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛和丁子香酚等为主。本研究结果与郝瑞杰等^[20]的研究结果一致，苯环/苯丙烷类化合物是梅花花香的主要成分，其中乙酸苯甲酯、苯甲醛、苯甲醇和丁子香酚占比最高，还含有少量萜烯类和脂肪酸类物质。ZHANG等^[21]对8个不同花色梅花品种的花香成分进行了分析，表明苯基/苯丙烷类化合物占总排放量的95%以上。白花品种的花香挥发物以乙酸苯甲酯为主，品种间差异较小，粉花品种的花香挥发物组成存在差异。本研究发现：梅花不同品种群间香气种类及相对含量有明显差异，朱砂和宫粉品种群花香化合物数量最多，其次是跳枝和绿萼品种群，玉蝶和垂枝品种群花香化合物数量较少。

花朵香气特征并不完全由香气物质的种类与相对含量决定，还与香气物质的香气阈值有关，相对含量越高且阈值越小，香气强度就越大，对香气的贡献值就越大^[14]。LI等^[22]分析了6个梅花品种的花香及挥发性代谢组的差异，根据花香化合物的香气阈值筛选出了6种促进梅花不同品种香气差异的成分，包括苯甲醛、苯甲酸甲酯、乙酸苯甲酯、丁子香酚、反式肉桂醇、4-烯丙基苯酚、2-壬烯醛、3,4-二甲氧基甲苯和反式-β-紫罗兰酮。本研究通过计算梅花主要花香成分的香气贡献值，发现β-紫罗兰酮、丁子香酚、甲基丁香酚、肉桂醇、对甲苯甲醚、草蒿脑、苯甲醛和乙酸苯甲酯等对梅花花香贡献较大。

苯甲醇具清香、果香和甜香味^[23]，苯甲醛具有苦杏仁、木香、樱桃香味，乙酸苯甲酯具有茉莉香、浓甜香味，在蜡梅中，乙酸苯甲酯与芳樟醇共同构成其特征香气^[24]。丁子香酚有强烈的丁香气味，有抗虫、杀菌的效果。在矮牵牛Petunia hybrida中，丁子香酚的挥发部位主要是花瓣和雄蕊^[25]。β-紫罗兰酮具有紫罗兰Matthiola incana、水果、鸢尾花Iris tectorum香味，是紫花含笑Michelia crassipes初花期的特征挥发性物质，也是四季桂Osmanthus fragrans‘Fragrans Group’和金桂Osmanthus fragrans var. thunbergii的主要花香成分^[26−27]。其香气阈值极低，在花朵中仅存在少量就能释放出强烈的香气。草蒿脑呈大茴香香气，存在于欧洲越橘Vaccinium padifolium、龙蒿Artemisia dracunculus、茴香Foeniculum vulgare等中^[28]。本研究分析了不同类型梅花花香的成分组成，通过香气阈值计算出主要成分的香气贡献值，从而明确其主要贡献成分。

不同梅花品种，其香气成分、相对含量和气味品质差异较大。朱砂和宫粉品种群花香化合物种类最多，且苯环/苯丙烷类化合物种类最多。其次是跳枝品种群、绿萼品种群、玉蝶品种群和垂枝品种群。依据梅花主要花香成分的差异，可将20个梅花品种分为5种不同香气类型。本研究鉴定分析了梅花不同品种的花香物质，明确了主要香气成分。后期可进一步明确决定梅花花香差异的主要物质，并结合转录组分析梅花花香的代谢机制。