Assessment of crossability and authenticity of progeny in distant hybridization of Lilium davidii var. unicolor

以兰州百合、亚洲百合杂种系(A)品种‘虎宝宝’ ‘Tiger Babies’、‘紫梦’ ‘Purple Dream’、‘黑色魅力’ ‘Black Charm’，麝香百合L. Longiflorum × 亚洲百合杂种系(LA)品种‘甜糖’ ‘Sweet Sugar’、‘眼线’ ‘Eye Liner’，麝香百合×东方百合杂种系(LO)品种‘小玩意’ ‘Gizmo’，麝香百合杂种系(L)品种‘守望’ ‘Watch Up’为材料(图1)。温室内种植，常规水肥管理。

Figure 1.  Flowers of the samping lilies

参考凌吴等^[11]的方法，使用光学显微镜观察并统计花粉的萌发情况，随机选取3个视野，每个视野不少于100个花粉粒。花粉管若长于花粉粒直径，则认为花粉已经萌发，计算花粉萌发率。花粉萌发率=萌发花粉粒数/视野内花粉粒总数×100%。

在花朵开放前采集花药，于阴凉干燥处静置24 h，使其自然散粉并收集保存。以兰州百合为母本，‘紫梦’ ‘黑色魅力’ ‘守望’为父本，以及兰州百合为父本，‘虎宝宝’ ‘紫梦’ ‘黑色魅力’ ‘甜糖’ ‘眼线’ ‘小玩意’ ‘守望’为母本，共10个杂交组合进行杂交，授粉前1~2 d进行去雄操作，并在7:00—11:00采用3种授粉方法授粉：①直接授粉，把花粉涂抹到柱头上，然后用锡纸裹住柱头；②切割柱头授粉，用小刀切除2/3花柱，在横断面中间纵切0.2 cm深，将纵裂撑开，授新鲜的父本花粉，然后用锡纸包裹柱头；③NAA涂抹柱头授粉，在柱头上涂抹1 g·L⁻¹的NAA水溶液后授粉，然后用锡纸裹住柱头。总计授粉1231朵，授粉后挂上标签，1周后摘除锡纸。

在授粉30 d后统计杂交结果情况，并计算蒴果膨大率、坐果率和有胚率。膨大率=膨大蒴果数(授粉30 d后的膨大蒴果)/杂交花朵数×100%；坐果率=结实蒴果数(授粉后成活时间大于40 d的蒴果)/杂交花朵数×100%；有胚率=有胚种子数/全部种子数×100%。

花粉管荧光观察参考雷家军等^[12]的方法，取杂交组合直接授粉后4、8、12、24、36、48、72、120 h的母本花柱和子房各3~5个进行固定染色，在荧光显微镜下，观察记录花粉粒在柱头上的萌发情况、花粉管的生长状况以及向胚珠伸长的过程。

取50~60 d膨大的蒴果，消毒处理后，将有胚种子接种到培养基中。胚萌发与胚培养的培养基为：MS培养基 + 6 g·L⁻¹琼脂+30 g·L⁻¹蔗糖+0.1 mg·L⁻¹ NAA+1.0 mg·L⁻¹ 6-苄基腺嘌呤(6-BA)^[13]，总计接种数为1726个，计算幼胚萌发率：萌发率=萌发胚数/接种胚数×100%。

选择杂交亲本和生长健壮的杂种后代组培幼苗，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)^[14]从叶片中分离并纯化出完整的脱氧核糖核酸分子，用于后续的遗传分析。根据已有文献^[15−16]筛选5对SSR引物进行合成(表1)，通过初筛选择在亲本中扩增稳定且具有多态性的SSR引物，用于全部百合杂交后代鉴定和遗传分析，杂种扩增结果中具有双亲特征条带的为真杂种，只有母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种^[17]。

运用Excel软件对试验数据进行处理，应用SPSS软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，邓肯法(Duncan)比较各处理之间的显著性差异。

观察发现各材料花粉萌发率存在差异，其中兰州百合花粉萌发率为34.33%，‘虎宝宝’ ‘甜糖’ ‘眼线’ ‘小玩意’的花粉未萌发，‘紫梦’花粉萌发率最高，达到46.70%，‘黑色魅力’花粉萌发率仅为0.91%，‘守望’花粉萌发率为36.73%(表2)。因此，以兰州百合为母本时，选定‘紫梦’ ‘黑色魅力’ ‘守望’作为父本；兰州百合为父本时，选定‘虎宝宝’ ‘紫梦’ ‘黑色魅力’ ‘甜糖’ ‘眼线’ ‘小玩意’ ‘守望’作为母本杂交。

‘甜糖’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2A)：授粉4 h后，花粉在柱头上大量萌发，8 h后花粉管在柱头上伸长，开始向花柱延伸，24 h后花粉管沿着柱头向子房方向延伸，到达花柱1/2处，48 h后花粉管成簇状，到达花柱底部开始伸入子房，72 h后花粉管伸入子房，进入胚珠。‘眼线’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2B)：授粉4 h时大量花粉附着于柱头开始萌发，花粉管较短，24 h时已萌发的花粉管仍缠绕在柱头且产生大量胼胝质，花粉管生长变慢，72 h时大量花粉管向花柱延伸至3/5处发生折叠、缠绕停止生长，96 h时少部分花粉管继续往子房延伸，120 h时极少数花粉管进入子房，完成受精。‘虎宝宝’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2C)：授粉4 h时大量花粉在柱头上萌发，24 h时花粉管伸长，产生大量胼胝质，部分花粉管基部膨大，缩短增粗，48 h时花粉管伸长到花柱1/3处，部分花粉管折叠停止生长，72 h时一部分花粉管聚集成簇状延伸至花柱底部，开始伸入子房，96 h时花粉管进入子房完成受精。‘紫梦’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2D)：授粉4 h时少量花粉在柱头上萌发，8 h时花粉大量萌发且开始伸长但仍附着在柱头上，24 h时产生大量胼胝质，部分花粉管停止生长，48 h时花粉管向下延伸至花柱底部，开始进入子房，72 h时部分花粉管进入子房，完成受精。‘黑色魅力’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2E)：授粉4 h时花粉在柱头上萌发，8 h时花粉开始向柱头延伸，逐渐聚集成簇状，24 h时簇状花粉管到达花柱1/2处，48 h时花粉管向下延伸至花柱底部，开始进入子房，72 h时部分花粉管进入子房，完成受精。‘守望’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2F)：授粉24 h时柱头上仅少量附着且花粉不萌发；‘小玩意’× 兰州百合花粉管生长荧光观察结果显示(图2G)：授粉24 h时柱头上无花粉附着。

Figure 2.  Fluorescence observation results of pollen tubes

‘甜糖’ ‘眼线’ ‘虎宝宝’ ‘紫梦’ ‘黑色魅力’作为母本与兰州百合杂交时，柱头花粉均能萌发，花粉管可以延伸到子房完成受精，表明组合杂交亲和性良好。其中‘眼线’ ‘虎宝宝’ ‘紫梦’作为母本杂交时，花粉管中途出现异常现象，表明其与兰州百合杂交亲和性次于‘甜糖’和‘黑色魅力’。而‘守望’和‘小玩意’作为母本时，仅有少部分花粉附着或无附着，说明其与兰州百合杂交亲和性差。

以亚洲百合(除‘虎宝宝’)为母本进行杂交时，3种授粉方法的果实膨大率和坐果率均较高。‘虎宝宝’作母本时，NAA涂抹柱头授粉方法抑制了果实的膨大和坐果，而切割授粉方法则将膨大率和坐果率提高至95.00%，说明切割授粉是‘虎宝宝’与兰州百合杂交的最优方法(表3)。‘紫梦’和‘黑色魅力’为母本进行杂交时，直接授粉和NAA涂抹柱头授粉方法均取得了较好的效果，尤其是后者的果实膨大率达到了100.00%，坐果率也超过了80.00%。LA系列百合(‘甜糖’和‘眼线’)为母本时，直接授粉的效果最好，NAA涂抹柱头授粉次之，切割授粉效果较差，其中直接授粉的果实膨大率超过80.00%，坐果率超过70.00%。LO系列百合‘小玩意’与L系列百合‘守望’作为母本时，所有授粉方法在15 d后蒴果逐渐萎蔫，果实膨大率和坐果率均为0。此外，兰州百合作为母本时，与A系列百合杂交的2个组合的果实膨大率和坐果率均超过50.00%，而与‘守望’杂交后的果实膨大率和坐果率均为0，这可能是由于兰州百合与其亲缘关系较远，无法完成受精和正常发育。由此得出：相较于LO、L系列百合，兰州百合与A、LA系列百合的亲和性较高，且不同杂交组合适宜的授粉方法也存在差异，其中直接授粉虽非所有组合最优方式，但其普适性更高。

对各组合种子总数和有胚种子数进行统计，计算有胚率(表3)。其中‘黑色魅力’× 兰州百合的有胚率最高，为9.10%，其坐果率达到100.00%，这表明‘黑色魅力’与兰州百合亲和性高。其次是‘甜糖’× 兰州百合和兰州百合 ב黑色魅力’，有胚率分别为8.11%和4.39%，坐果率为83.33%和52.63%。这些数据进一步证实‘黑色魅力’无论作为母本还是父本，都与兰州百合有较好的结实潜力。因此，相较其他组合，‘甜糖’作为母本和‘黑色魅力’作为母本或父本与兰州百合杂交亲和性更高，是合适的杂交选择。

不同杂交组合幼胚萌发率和成苗率存在差异，兰州百合 ב紫梦’幼胚萌发率最高为77.78%，成苗率为85.71%(表4)；兰州百合 ב黑色魅力’的幼胚萌发率为48.78%，成苗率相对较低，仅为76.67%；‘紫梦’× 兰州百合、‘黑色魅力’× 兰州百合和‘甜糖’× 兰州百合的幼胚萌发率分别为23.91%、45.73%、41.68%，成苗率都在85.00%以上；‘虎宝宝’× 兰州百合和‘眼线’× 兰州百合的幼胚萌发率较低，分别为16.88%、13.33%，成苗率为69.23%和80.00%。

对SSR引物ivflmre179、ivflmre738、ivflmre486、MJ037和MJ066在亲本中进行筛选，扩增产物片段大小见表5，选择在亲本间有明显特异性条带且多态性较好的引物ivflmre179用于后续子代的鉴定。

使用所筛选的特异性条带清晰的SSR引物ivflmre179扩增子代，经鉴定‘甜糖’× 兰州百合杂交子代99株、‘黑色魅力’× 兰州百合杂交子代10株、‘虎宝宝’× 兰州百合杂交子代9株、‘眼线’× 兰州百合杂交子代5株、兰州百合 ב黑色魅力’杂交子代18株、兰州百合 ב紫梦’的杂交后代4株，共145株子代中均可以扩增出父母本的特异性条带(表6)，鉴定所有后代均为真杂种。

远缘杂交是百合育种中培育新品种的重要手段之一^[18]，但由于百合属植物遗传背景的复杂性，常存在远缘杂交不亲和现象。因此，科学评价亲本间的亲和性对提高杂交效率十分重要，目前亲和性常见评价指标包括坐果率和有胚率等^[19]。本研究中‘黑色魅力’× 兰州百合的有胚率和坐果率均最高，显示其杂交亲和性高，而‘眼线’× 兰州百合虽然坐果率较高，但有胚率很低，说明二者很大程度不亲和^[20]，因此，百合杂交育种中，应综合选择多指标进行亲和性评价，从而更准确地筛选高亲杂交组合。

随着荧光显微镜技术的广泛应用^[21]，研究者在多种植物中观察到不亲和组合授粉后花粉管出现异常现象或者有强烈的胼胝质反应^[22−25]。本研究中，以‘甜糖’ ‘眼线’ ‘虎宝宝’ ‘紫梦’ ‘黑色魅力’为母本与兰州百合杂交时，花粉在柱头上萌发并向下延伸受精，其中‘眼线’ ‘虎宝宝’ ‘紫梦’在作为母本杂交时部分花粉管出现胼胝质积累、缩短增粗、折叠缠绕停止增长等异常现象，说明存在杂交障碍。‘守望’和‘小玩意’作为母本时，花粉极少附着或不萌发，说明其和兰州百合不亲和，推测是由于柱头分泌物影响花粉的水合作用，抑制了其萌发^[26]。这些观察结果与杂交结果相符，说明花粉管生长与亲和性有一定联系。

上述花粉管行为异常现象属于典型的杂交障碍中受精前障碍表现，而杂交障碍还包括受精后障碍，主要指胚乳或胚等发育异常或败育，通常通过优化授粉方式、适时的胚拯救等克服^[27−28]。本研究比较了直接授粉、切割柱头授粉和NAA涂抹柱头法授粉后不同杂交组合的结实情况，发现授粉方法效果具有组合特异性^[29−30]。其中，‘小玩意’和‘守望’与兰州百合的杂交组合中均未能成功获得膨大的蒴果，这可能由于其和兰州百合的亲缘关系较远，今后可以尝试采取离体授粉^[19]、桥接杂交^[31]等方式提高远缘杂交成功率。此外，杂交亲本之间存在的倍性差异也会造成由于染色体不平衡而导致的胚胎败育或果实不发育^[32−33]。本研究还观察到‘虎宝宝’× 兰州百合和‘眼线’× 兰州百合组合的幼胚萌发率较低，幼苗生长速度较慢，除亲和性影响外，还可能与胚拯救时间、培养条件等有关，后续应深入研究培养基配方、激素浓度、胚龄选择和培养方式等，优化培养效果，提高杂种成苗率^[34]。

本研究通过对兰州百合和多个品系观赏百合远缘杂交观察发现：不同杂交组合亲和性存在差异。因此，在百合杂交育种中，亲本组合的选择除考虑性状互补外，还应兼顾亲和性因素。尽管本研究部分杂交组合样本量较小，但结果呈现出明显的趋势，可以为未来研究提供有用参考，结合授粉方法优化、胚培养与胚拯救方式以及倍性调控等技术，扩大实验规模，以制定更合理的杂交策略，提高杂交成功率和后代获得率，推动百合种质的创新。

本研究将兰州百合与多品系观赏百合进行远缘杂交，并结合花粉管行为、坐果率和有胚率等指标对亲和性进行评价，得出所用材料中‘甜糖’‘黑色魅力’与兰州百合杂交亲和性较高。不同授粉方式影响杂交坐果率，其中直接授粉普适性强，切割授粉可以有效改善‘虎宝宝’× 兰州百合的坐果率。此外，SSR分子标记鉴定可以早期鉴定杂种苗真实性，成功获得多组合真杂种后代，为多用途百合新品种培育提供了材料基础。