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桂花Osmanthus fragrans是中国十大传统名花之一，深受人们喜爱。不同学者已经从桂花的花芽分化[1-3]、开花机制[4-5]、花色呈现[6-7]、花香释放[8-9]等不同层面展开了研究。随着分子水平研究的不断深入，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析基因的表达已成为研究这些过程机理的重要手段，而筛选得到适合不同研究的内参基因格外重要。研究认为[10-11]，内参基因并不存在通用性，不同处理、不同组织中内参基因的表达水平都会发生改变[12]；选用一种内参基因无法准确反映不同植物组织、同一组织不同处理下的基因表达水平[13-14]。因此，根据具体的实验材料和处理条件筛选合适的内参基因十分必要[15]。光周期和温度处理能对桂花的基因表达水平、花芽分化进程等产生影响。研究表明[4, 16]：长日照和相对低温都能够加快桂花花芽分化进程，而短日照条件下桂花的花芽分化相对较慢，低温或高温都会抑制桂花的花芽分化。本研究在不同光周期和温度条件下对桂花常用的7个候选内参基因进行比较分析，筛选最佳内参基因，为后期研究光周期和温度影响桂花开花的机理奠定基础。
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实验材料为多年生‘佛顶珠’O. fragrans‘Foding Zhu’盆栽植株，种植于浙江农林大学桂花资源圃。设置4个处理：长日照高温（光照/黑暗＝14 h/10 h，26 ℃），长日照低温（光照/黑暗＝14 h/10 h，19 ℃），短日照高温（光照/黑暗＝10 h/14 h，26 ℃）和短日照低温（光照/黑暗＝10 h /14 h，19 ℃），光照强度为100%，相对湿度为60%~80%。实验材料在上述环境中培养40 d。处理结束后从8:00起，每隔4 h取当年生枝条的第2片或第3片嫩叶，液氮速冻，放于-80 ℃保存。
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每样品取50~100 mg，充分研磨后按照RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）说明书步骤提取各样品RNA。通过紫外分光光度计和质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA浓度和品质。以所提样品RNA为模板，按照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）说明书合成cDNA第1条链，合成后于-20 ℃储存备用。
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从桂花转录组数据库中选择肌动蛋白基因（OfACT）、延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α）、NADP-异柠檬酸脱氢酶基因（OfIDH）、GTP结合蛋白RNA1基因（OfRNA1）、β微管蛋白基因（OfTUB）、泛素结合酶E2基因（OfUBC2）和18S核糖体RNA基因（Of18S）[12, 17]等7个使用较多的内参基因作为候选内参基因。采用SYBR green Ⅱ荧光染料嵌合法进行内参基因的筛选，设计候选内参基因的引物，通过Bioxman和Primer Premier 5软件对引物进行校验，并利用Primer-BLAST进行检测以确认引物序列的特异性。选用的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表 1）。
表 1 qRT-PCR相关内参基因引物信息
Table 1. List of primers for qRT-PCR
基因简称 引物序列（5′→3′） 退火温度/ ℃ OfACT CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT 55.0 ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfEF1α CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA 58.0 GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT OfIDH CTTGAAGCAGATGTGGAAGAGTC 57.5 CTTTGTCCATCCTGGGACCAGTC OfRAN1 AGAACCGACAGGTGAAGGCAA 57.5 TGGCAAGGTACAGAAAGGGCT OfTUB AGAAGGGATGGATGGAATGGA 56.0 GTCTTCTTCGTCCTCGGCAGT OfUBC2 TGTTGACAAAACCGATGGAAGGA 57.5 GTGGAGTGTGGAGGATAAGGGTG Of18S AGCCTGAGAAACGGCTACCAC 55.0 ATACGCTATTGGAGCTGGAA -
qRT-PCR实验方法参考SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（Takara，大连）试剂盒。采用20.0 μL的反应体系：其中双蒸水6.4 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，SYBRⅡ荧光染料10.0 μL。反应在ABI 7300实时PCR仪中进行，反应程序为：95 ℃下预变性30 s；95 ℃下反应5 s，60 ℃反应31 s，共40个循环；95 ℃下反应15 s，60 ℃下反应1 min，95 ℃下反应30 s，60 ℃下反应15 s[17]。3次生物学重复。
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用geNorm，NormFinder和BestKeeper软件分别对qRT-PCR中所得到样品的反应循环数（Ct值）进行分析，比较7个候选内参基因表达的稳定性，并选择最佳内参基因。geNorm软件以各候选内参基因在样品中的表达水平为依据，计算各候选基因的表达稳定性（M），M值越小越稳定；M＜1.5时认为是理想内参[18-19]。geNorm软件还可以根据候选内参基因标准化因子的配对差异性分析（Vn /Vn+1）得出最佳内参基因的个数；其中V表示配对差异值，n表示内参基因个数。软件默认的（Vn /Vn+1）值为0.15，当Vn /Vn+1＜0.15时，表明引入的n个内参基因已经稳定，不需要引入（n+1）内参基因，当Vn /Vn+1＞0.15时，则需要引入（n+1）个内参基因[17, 20]。因geNorm软件最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，所以n≥2。为了了解引用1个内参基因的稳定性，需要通过NormFinder和BestKeeper软件做进一步分析。NormFinder软件对内参基因的筛选是基于方差分析的结果，利用ΔCt法计算候选内参基因表达的稳定值（S），从而评估候选内参基因的表达稳定性；S越小，基因越稳定[21]。BestKeeper软件通过计算标准偏差（SD）对候选内参基因的表达稳定性进行评价和排序，SD越小，则该基因的稳定性越好；若SD＞1，则认为该基因不稳定[20-21]。最后通过昼夜节律基因GI的相对表达水平，对选择的最佳内参基因进行验证。
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提取不同处理桂花样品的总RNA，经紫外分光光度计检测，所有样品总RNA的吸光度值[D（260）/D（280）和D（260）/D（230）]均为1.8~2.1。将所有样品的cDNA等量混合后作为模板，进行普通PCR和定量PCR检测。为检测引物的扩增效率，设置6个cDNA浓度梯度（原液，5-1，5-2，5-3，5-4，5-5原液），根据qRT-PCR结果，利用公式E＝（10-1/s-1）×100%得出基因的扩增效率（表 2），其中：E（%）表示扩增效率，s表示曲线斜率。经计算，扩增效率为95%~110%，相关系数为0.993~0.998，符合qRT-PCR的基本要求。
表 2 7个候选内参基因扩增参数
Table 2. Amplification parameters of seven candidate reference genes
基因 Ct 扩增效率/% 曲线斜率 线性相关系数 条带长度/bp OfACT 22.77 ± 0.55 103.66 －3.237 3 0.995 5 143 OfEF1α 20.61 ± 0.42 103.19 －3.247 8 0.995 7 89 OfIDH 23.59 ± 0.39 95.78 －3.453 8 0.997 7 118 OfRNA1 21.68 ± 0.07 95.43 －3.436 5 0.996 2 117 OfTUB 28.44 ± 0.40 107.49 －3.154 6 0.993 2 106 OfUBC2 25.73 ± 0.54 107.15 －3.161 8 0.994 5 75 Of18S 8.99 ± 0.55 108.15 －3.140 9 0.996 8 208 -
根据扩增效率，将各样品的原始cDNA稀释50倍后作为模板进行qRT-PCR。通过比较循环数（Ct）来评估各候选内参基因在所有样品中的转录水平（表 2），候选内参基因平均Ct为8.99~28.44，其中Of18S的Ct最小，说明平均表达水平最高；OfTUB最大，说明平均表达水平最低；其他候选内参基因平均表达水平差异则相对较小。
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geNorm软件分析发现（表 3），所有候选内参基因的稳定值均小于1.5，符合内参基因筛选的标准；其中OfRAN1和OfIDH的稳定值相等且最小（M＝0.347），在不同样品中表达最为稳定，其次是OfACT基因（M＝0.393），Of18S稳定值最大（M＝0.601），说明Of18S表达稳定性最差。对候选内参基因的配对差异值测算可知（图 1）：V2/3＝0.126＜0.15，表明引入2个内参基因已经稳定，无需引入更多的内参基因。geNorm软件分析结果表明，最佳候选内参基因为OfRAN1和OfIDH。
表 3 不同软件分析7个候选内参基因表达稳定性
Table 3. Gene expression stability of seven reference genes by different software
基因名称 geNorm分析 NormFinder分析 BestKeeper分析 稳定值 排序 稳定值 排序 稳定值 排序 OfACT 0.393 2 0.232 3 0.288 3 OfEF1α 0.524 5 0.390 6 0.497 6 OfIDH 0.347 1 0.206 2 0.133 1 OfRNA1 0.347 1 0.135 1 0.180 2 OfTUB 0.479 4 0.361 5 0.372 5 OfUBC2 0.422 3 0.343 4 0.346 4 Of18S 0.601 6 0.474 7 0.611 7 
图 1 geNorm软件分析候选内参基因的配对差异值
Figure 1. Pairwise variationof candidate reference genes as calculated by geNorm
NormFinder软件分析发现，OfRAN1基因的表达稳定性最高，其次是OfIDH，Of18S基因表达稳定最差，与geNorm软件分析的结果一致（表 3）。BestKeeper软件的分析结果显示（表 3），在7个候选内参基因中，OfIDH基因的表达稳定性最高，其次是OfRAN1，Of18S基因的表达稳定性最差。分析结果尽管与geNorm和NormFinder软件的结果有些差异，但最佳候选内参基因结果一致。
综合3个软件的分析结果可以得出，不同处理条件下，OfRAN1和OfIDH的表达稳定性均为最高，可作为最佳内参基因，而Of18S是表达稳定性最差的基因。
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GIGANTEA基因（GI）是光周期途径的重要调控基因，其表达呈现明显的昼夜节律。选用桂花昼夜节律相关基因GI对候选内参基因进行验证，可提高内参基因筛选的准确性，保证最佳内参基因对光周期途径基因表达水平的校准作用。选择OfRAN1/OfIDH，OfRAN1，OfIDH以及其他候选内参基因对GI基因的相对表达水平进行校准（图 2），结果显示：相比其他内参基因，不同处理下OfRAN1/OfIDH校准的GI基因的表达模式表现为光照条件下积累，黑暗条件下降低的周期性表达，符合GI基因的昼夜表达规律。说明3个内参基因筛选软件对候选内参基因筛选的结果是正确的，即OfRAN1和OfIDH基因可作为桂花不同光周期和温度处理的最佳内参基因。
图 2 不同内参基因或组合校正桂花不同条件下GI基因的相对表达
Figure 2. Relative expression levels of GI in different conditions using different reference genes or reference gene combination for normalization
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荧光定量PCR因其众多优点被广泛运用于基因表达的研究中，成为量化基因转录表达，揭示基因表达规律的有效方法[22-23]；但引用适当的内参基因对qRT-PCR的结果进行校准是非常必要的[20]。理想内参基因在不同组织、不同发育阶段、不同生长条件下均能稳定表达[17, 24]，但事实上并没有哪一个基因能够满足所有条件[25]。因此，根据不同实验材料和处理条件，筛选出合适的、特定的内参基因是确保实验成功的必要条件。
研究发现[26]：选用2个或更多内参基因组合可以提高内参基因校准的精确度，弱化单一内参基因带来的不准确性。RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白的一类，在细胞生理进化中起到重要的作用，它的很多同源基因是不同光周期、温度条件下常用的内参基因[12, 17]。IDH的同源基因被证实为不同温度条件下桉树Eucalyptus robusta的最佳内参基因[27]；ACT和18S同源基因分别可作为不同光周期[28]、温度条件[29]下大豆Glycine max的内参基因；EF1a和TUB基因可作为不同光周期、温度条件下玉米Zea mays的内参基因[30]；UBC2的同源基因可作为不同温度条件下欧芹Petroselinum crispum的内参基因[31]。本研究选用了桂花中常用的7个候选内参基因，对其在不同光周期和温度处理下嫩叶中的表达稳定性进行研究；利用geNorm，NormFinder和BestKeeper等3个常用于内参基因筛选的软件进行评估，发现这7个候选内参基因在所有样品中表达稳定性的排序基本相同，均显示OfRAN1和OfIDH基因是最稳定的2个内参基因，将两者进行组合可以准确的校准不同处理下桂花叶片中目的基因的表达水平；而Of18S表达最不稳定，在所有实验材料中都存在较高的表达丰度，因而不适合作为本研究的内参基因。
光周期和温度途径在调控植物成花过程中发挥重要作用。筛选得到的桂花不同光周期和温度条件下的内参基因，能够为研究桂花在不同温度和光周期处理条件下的成花机制提供参考依据，为了解相关成花基因表达模式提供保障。
Screening reference genes of Osmanthus fragrans with differing photoperiod and temperature treatments
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摘要: 光周期和温度处理能够影响桂花Osmanthus fragrans的基因表达水平和花芽分化过程，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析基因表达已成为研究这些过程机制的重要手段，而筛选出适合光周期和温度处理的内参基因在研究桂花分子机制中尤为重要。为了得到不同光周期和温度处理下桂花中稳定的内参基因，以桂花品种‘佛顶珠’O.fragrans‘Foding Zhu’当年生枝条的第2或第3对幼叶为材料，以OfACT，OfEF1α，OfIDH，OfRAN1，OfTUB，OfUBC2和Of18S等7个基因作为候选内参基因，利用geNorm，NormFinder和BestKeeper 3个软件对候选内参基因的表达稳定性进行比较分析；以昼夜节律相关基因GIGANTEA（GI）对筛选出的最佳内参基因进行验证。结果表明：在不同处理条件下，桂花叶片中OfRAN1和OfIDH为最佳内参基因，Of18S的稳定性最差（geNorm分析结果显示OfRAN1和OfIDH的稳定值为0.347，而Of18S的稳定值为0.601；NormFinder显示OfRAN1和OfIDH的稳定值为0.135和0.206，而Of18S为0.474；BestKeeper显示OfRAN1的稳定值为0.80，OfIDH为0.133，而Of18S为0.474）；GI基因的相对表达水平分析表明（昼夜节律基因GI的表达模式为在白天累积并在夜间下降），在7个内参基因及OfRAN1和OfIDH的基因组合中，使用OfRAN1和OfIDH的内参基因组合可获得GI基因更为精确的基因表达结果。综上所述，OfRAN1和OfIDH内参基因组合是桂花在不同光周期和温度处理下最佳内参基因组合。这为桂花分子机制研究奠定基础。Abstract: Photoperiod and temperature treatment can affect the gene expression level and flower bud differentiation process of Osmanthus fragrans. Analysis of gene expression by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) has become an important means to study the mechanism of these processes and it is especially important to screen for an internal reference gene suitable for photoperiod and temperature treatment. To screen reference genes in O. fragrans using different photoperiod and temperature treatments, the young leaves of O. fragrans 'Foding Zhu' were used as materials. The O. fragrans treatment conditions were 14 h D (light)/10 h N (dark) +26℃, 14 h D/10 h N +19℃, 10 h D/14 h N +26℃ and 10 h D/14 h N +19℃, light intensity 100%, relative humidity 60%-80%. After treatment for 40 days, the second or third young leaves of the current shoots were taken every 4 h from 8:00 in the morning frozen in the liquid nitrogen and stored at -80℃. The seven genes, including OfACT, OfEF1α, OfIDH, OfRAN1, OfTUB, OfUBC2, and Of18S, were chosen as candidate reference genes. qRT-PCR was used to screen the reference genes, and GeNorm, NormFinder, and BestKeeper were used to analyze the stability of the candidate reference genes and screen out the best ones. Finally, the circadian rhythm gene GIGANTEA (GI) was used to verify the best reference genes. Results showed that OfRAN1 and OfIDH had the highest stability(GeNorm showed that the stable value of OfRAN1 and OfIDH were 0.347, while Of18S was 0.601; NormFinder showed that the stable value of OfRAN1 and OfIDH were 0.135 and 0.206, while Of18S was 0.474; BestKeeper showed that the stable value of OfRAN1 was 0.800 and OfIDH was 0.133, while Of18S was 0.474), which meant they were the best reference genes for the different conditions and Of18S had the worst stability(The greater the stability value, the worse the stability). The relative expression level of GI balanced by seven reference genes and the genetic combinations of OfRAN1 and OfIDH meant more accurate expression results(The expression pattern of circadian rhythm gene GI is accumulated during the day and falls at night). In summary, the genetic combinations of OfRAN1 and OfIDH were the best combination of reference genes used to study the molecular mechanism of O. fragrans under different photoperiod and temperature treatments.
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Key words:
- botany /
- Osmanthus fragrans /
- reference gene /
- qRT-PCR /
- GI
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滨海湿地是土壤碳(C)的大型储存库，能够以高于陆地森林生态系统10~100倍的速率持续固定大气二氧化碳(CO2)[1]。尽管全球滨海湿地仅占地球海洋表面的2%，但碳储量却相当可观。据估计，全球滨海湿地每年碳储量约116 Tg，占海洋储碳总量的50%以上[2]，这些碳储量和碳通量统称为滨海湿地“蓝碳”。滨海湿地的碳汇速率主要取决于其垂直沉积物的代谢速率和土壤碳汇密度[3]，在海平面上升的影响下，这些蓝碳生态系统的土壤不会达到碳饱和[1]，是显著区别于内陆生态系统的重要特征。只要土壤的增加量继续与海平面上升保持同步，沉积物的吸收速率就可以保持在一定水平，因此滨海湿地碳汇的寿命相比内陆碳汇的潜力更大，长时期内减缓气候变化能力也更强。目前，滨海湿地作为温室气体排放抵消工程的目标，受到了广泛的关注。然而，定量评估预测全球变化影响滨海湿地生态系统碳汇功能的研究较少，还需进一步分析滨海湿地对全球气候变化与人类干扰的响应机制，为滨海湿地的保护、管理及利用提供参考方向，以达到增加未来碳储存的目的[1, 4]。近代以来，人类活动向生态系统输入了大量的活性氮[5]，大气氮富集量已超过工业革命前的2倍[6]。过剩的含氮化合物经由淋洗、径流以及挥发等途径进入江河湖海和大气中，使沿海近岸水体富营养化[7]。在潮汐作用下，富氮水体经由海水入侵进入滨海湿地，对滨海湿地生态系统的碳循环过程产生重要影响[8-10]。已有多项研究证实：氮输入对陆地碳循环过程的影响结果并不一致，由生态系统类型、覆被种类和其他多种环境因素共同决定[11-13]。如何在不同的环境背景下，评估和预测生态系统碳循环过程对氮输入的响应，目前未有定论。基于滨海湿地碳汇功能的重大生态价值，本研究系统阐述了氮输入对滨海湿地生态系统碳循环过程的影响，总结了几种常见的碳循环模型在湿地生态系统应用中的主要研究进展。一方面梳理过去相关研究，提高对氮输入下滨海湿地碳动态变化及碳循环模型领域发展态势的认识；另一方面总结碳循环模型在滨海湿地的应用和不足，为模型改进提供参考方向，有利于更精确地预测滨海湿地碳汇功能的未来发展。
1. 滨海湿地碳循环过程
陆地碳循环是由观察者定义的边界开放系统，该边界与外部环境的碳交换主要通过光合作用进行，为碳的主要输入过程，并具有多种输出通量，如自养和异养呼吸以及溶解的有机形式[14-15]，由此可见，碳循环过程往往伴随碳形态的转变。滨海湿地主要由植被和土壤2个碳库组成，对2个碳库及其影响因素的认识是湿地碳循环研究的关键部分[16]。此外，水体中也存在部分碳化合物，碳元素在滨海湿地生态系统中主要存在5种形式，包括：植物生物量固定碳、颗粒有机碳(POC)、可溶性有机碳(DOC)、微生物量固定碳及气态终产物如甲烷(CH4)和CO2[17]。它们之间通过各种途径相互转化，又因为条件的差异而使得转化速率不同，从而形成不同存在形式的积累或消耗，决定了滨海湿地生态系统碳源或碳汇的最终结果。
陆地植物中固定的碳通常被称为“绿碳”，滨海湿地、海藻床等生态系统中固存的碳则被称为“蓝碳”[1]。滨海湿地碳循环的基本模式与其他陆地生态系统存在一定的相似性。湿地植被通过光合作用吸收大气中的CO2，并合成为有机物，完成湿地的碳汇过程。此时碳被固定在植被中，使滨海湿地成为抑制大气温室效应的有效碳汇。当植物死亡，固定的碳在微生物作用下形成腐殖质，分解产生CO2、CH4等气体释放到大气中，此时湿地又转化为碳源[18]。这2个部分是滨海湿地在垂直方向上进行碳交换的主要过程[19]，结果主要取决于土壤中的碳，在一定时间内输入输出量以及储存的时间，其核心是土壤中有机碳的动态转化和平衡过程[20-21]。
滨海湿地作为连接陆地与海洋的纽带，与其他湿地类型最大的差异和最显著的特征是存在规律性的潮汐作用，这使得滨海湿地能够随着潮汐过程进行周期性的淹没和暴露，同时伴随盐分表聚与淋洗的干湿交替过程[19]，是控制CO2产生、扩散和排放的重要因素[22-23]。除此以外，陆地与海洋的碳库能够通过潮汐在滨海湿地中进行横向交换，例如DOC、可溶性无机碳(DIC)、POC等，因此滨海湿地的碳循环过程相较于普通的湿地生态系统更为复杂。综上，滨海湿地碳循环过程可分为内循环和外循环2个部分(图1)，其中外部循环主要由生物地球化学作用及潮汐作用的机械搬运主导，包括有机碳和无机碳的输入输出过程；内部循环则主要由矿化作用主导[6, 24]，包括有机碳与无机碳之间的形态转化[25]。
图 1 滨海湿地大气-植被-水体-土壤间的碳循环关键过程Figure 1 Key processe of carbon cycle among atmosphere, vegetation, water and soil in coastal wetlands由于上述过程受到多种因素的共同作用，滨海湿地碳库的动态评估存在着不确定性，使湿地既可以表现为碳源也能够充当碳汇，碳源/碳汇的研究方向可总结为主要与湿地年龄、人类活动和气候等条件有关[25]。目前，大部分研究仅集中于短期较小区域尺度内的特征描述[26-27]，不一定适用于长期大范围的尺度变化。此外，全球变化对湿地的影响，一方面表现为气候变暖加速土壤腐殖质分解造成的碳释放，使湿地由大气碳汇变为碳源的正反馈循环[28]；另一方面还包括氮沉降及近岸水体富营养化等条件的改变，使滨海湿地从增加陆地碳汇的氮限制生态系统[29]，可能向增强大气碳汇的负反馈循环方向转变。如何对滨海湿地碳循环过程中碳源、碳汇进行长期预测，以及准确评估计算全球变化条件下湿地碳储存及碳通量的变化，已成为如今亟待解决的问题。
2. 氮输入对滨海湿地碳循环过程的影响机制
2.1 氮输入影响植被碳库的机制
氮输入通过影响植被-土壤产生和消耗CO2的过程来改变其排放通量，所得结果或促进、或抑制或不显著[12, 30]。研究发现：在较大浓度范围内，氮输入均会促进植物生长[31]，提高地上净初级生产力，显著增加植物组织的碳氮含量，从而增加凋落物的产量，并有助于土壤有机质(SOM)的积累。但同时氮添加会增强环境过滤作用，降低植物的氮素利用效率[32]，减少微生物量碳和植物组织、土壤和微生物量的碳氮比，甚至威胁陆地植物的群落多样性[33]。在氮限制的滨海湿地生态系统中，湿地植物对氮输入的响应与其所积累的氮比例有关，然而该比例同时具有确定性和随机性过程[34]，因此得到的结果并不唯一。此外，这些反应还取决于氮的输入速率，以及不同氮化合物在生态系统中的持续时间[35]。
在植物生理方面，氮输入会改变植物的物候规律，叶片化学计量中的碳氮比是控制该因素的主要表现形式，可以为评估地上和地下系统如何响应全球变化提供有用的策略[36]。植物叶片氮含量与植物的光合作用紧密相关，氮输入会增加叶片氮含量[37]，使与其相关的叶绿体和光合二氧化碳固定酶大量合成，同时加快光反应和暗反应速率，最终使植物提前进入成熟期和衰老期[38]。氮输入还会提高植物组织中的氮浓度，使植物呼吸作用显著增强[39]，但对植物净光合速率与植物光合速率的影响基本一致，随植被类型的变化可能得出不同的结果[40-41]。不同的氮供应形态和浓度也会对植物光合能力产生不同的影响，如添加铵态氮比硝态氮能够更多地刺激植物光合作用[42]。然而植物自身存在适应环境的机制，可以通过增加蒸腾作用来维持营养平衡，从而适应长期的氮沉降[43]。因此，在探究氮输入对碳循环影响机制的过程中，还应考虑植物、微生物等对维持环境稳态的适应性所表现的体征。
2.2 氮输入影响土壤碳库的机制
输入生态系统的活性氮是影响滨海湿地土壤有机碳(SOC)损失的关键因素[44-45]。受氮输入水平、氮形态、初始土壤性质和其他环境参数差异的影响，氮输入可能导致SOC损失前后不一致[46-47]。氮输入对土壤有机质的影响分为直接和间接2个作用，土壤微生物在其中充当重要的媒介。直接作用表现在改变土壤氮素的可利用性，引起土壤微生物群落的变化，最终影响有机质的产量[48]。间接作用则是先提高植被的生产力，使得凋落物性质发生变化[49]，基质的可利用性发生改变[50]，最终通过影响土壤微生物间接影响有机质的累积。根据养分挖掘理论与化学计量学理论，氮有效性对SOC存在“激发效应”(priming effect)[51]，即增加凋落物的输入会促进土壤有机质的分解，当养分氮处于低有效性时，由养分挖掘理论主导，此时微生物生物量处于k生存策略的正激发，生物能量来源于SOM的分解；当养分氮处于高有效性时，由化学计量学理论主导，微生物生物量处于r生存策略的正激发，主要利用新添加的底物进行生长繁殖[52]。
滨海湿地属于氮限制的生态系统，多项研究证明：氮输入会加速滨海湿地SOC分解并刺激CO2排放[9, 53]，然而该结果受到多个因素的共同作用，例如生态系统类型、覆被种类、水位高度、温度等。低氮输入水平会刺激SOC分解，该促进作用可能与土壤养分、植被、土壤碳储量和土壤环境的氮相关变化有关[13]。而在高氮输入水平下，SOC分解则会受到抑制[54-55]，使土壤碳的有效性降低[56]。长期和短期的氮输入研究结果也存在差异，两者均会促进土壤养分的整体增加，从而潜在地加速SOM分解。但与短期相比，长期氮输入的生态系统中，总SOC或矿物有机碳(MAOC)的含量可能不会发生变化，而是改变SOC的化学成分，如减少烃基氧等不稳定官能团的百分比，这可能是由于不稳定有机质的分解以及根沉积物输入增强引起的[57]。
2.3 氮输入影响水体碳化合物的机制
滨海生态系统内部和系统间的碳循环是全球碳循环和碳收支的主要组成部分[58]。据统计，每年有超过19 Pg的悬浮物在滨海系统间进行交换，其中包括0.3 Pg DOC和0.2 Pg POC[59]。大多数陆源性POC随地表径流散布到海洋中，而存在于近地表土壤水及地下水中的可溶性有机质(DOM)，则通过海洋与陆地间的水文连通进行交换，这种交换也称为滨海湿地的碳横向输出。滨海湿地在碳的横向输出过程中起关键作用，在强降雨和冲刷作用下，滨海湿地流失DOM的量达到森林地下有机碳年产量的1/3[60]，并为河口提供约35%的总有机碳(TOC)[61]。横向的碳通量是湿地净生态系统碳平衡收支(NECB)中的重要术语[62-63]，也是NECB中属于湿地碳损失过程中具有较高重要性和不确定性的组成部分。碳横向输出包括地下水流通和潮汐交换2种途径，虽然地下水DIC浓度高于潮汐水体，但潮汐水体交换速率大于地下水排水速率，使得潮汐作用下碳输出速率大于地下水碳输出速率。最终地下水横向DIC和DOC通量均比潮汐横向通量低1个数量级，因此对整体横向碳输出而言，潮汐的输出占主导地位[64]。
当湿地被潮汐淹没时，呼吸作用产生的大部分CO2以DIC的形式溶解，与总初级生产力(GPP)产生或从植物生物量中浸出的DOC同时进行横向输出。当含氮化合物增加了地上生物量(AGB)，并且潮汐水中含有丰富的沉积物时，氮输入会增加该地区外源碳的积累[65]和海拔高度[66]。在氮输入的内陆湿地中，由于垂直排放而损失的碳和横向碳通量能够由外来碳沉积物的增加所抵消[67]，因此氮输入对系统内部NECB的影响很小。但是，在滨海湿地的边缘，由于垂直排放和横向输出，碳输入量不足以抵消碳的损失，氮输入将大幅增加滨海系统边缘碳的净损失。因此，如果仅在湿地内部进行相同的研究，就将大大低估氮输入对湿地碳积累的负面影响。氮输入通过增加代谢率来增加横向DIC和DOC的出口，这表明增加对滨海湿地生态系统的氮输入将增加碳向相邻水域的横向输出。同时，在水生环境中除了水平运输外，表层沉积物的垂直再悬浮现象也普遍存在[68]。当电流和波浪引起的底部切应力超过底部沉积物的侵蚀阈值时，就会发生沉积物的潜在迁移[69]。在重悬过程中，重悬的物质包括有机碳及其通过细菌和原生动物产生的降解产物，可能加重水体富营养化[70]。
3. 氮输入影响生态系统碳循环的建模方法与分类
陆地生态系统模型的建立主要基于量(abundance)、群(coupling)、流(flow)、场(field)的概念，分别表示数量、有机整体、交换流动及各种作用力[71]。在模型中，陆地碳循环通常被概念化为一组库或池，如叶、木、根和土壤，通过生态过程以不同的形式如气态、溶解态、固态进行碳的储存和交换[72]。早期的碳循环模型通常以不连续的时间段(如天或年)对系统状态进行更新，并且仅更新单独某一池的碳库，而其他模型则基于具有可变时间间隔的一般或偏微分方程组来实现更新规律。生物地球化学模型对物质循环和元素运动轨迹的追踪表现出较高的吻合度和实用性，真正实现了对整个生态系统过程的模拟。为了实现对生态系统的所有过程参量更全面的模拟，生物地球化学模型一般以小时、日或月为步长，对SOC、植物生物量、土壤含水量、CO2浓度等状态变量进行积分，得到长时间尺度的模拟结果。同时该模型还可结合大面积高频采样数据，实现对生态系统空间上的多指标模拟，从而增大模拟的尺度范围，通过积分最终得到区域尺度上的生态系统状态的估计[73]。
为了准确捕获氮对地球系统模型中陆地碳汇的影响，需要评估模型对氮限制和生态系统氮输入的响应。一方面可以通过评估固定量的氮输入对植物-土壤碳库中碳储量变化的影响，另一方面也可追踪氮输入生态系统后，通过氮损失途径减少的氮量及轨迹[74]。目前，氮循环已被整合到多个全球陆地模型中，各模型按照不同的方式表示碳氮耦合过程[75-76]。例如，当土壤中氮的有效性无法满足植物生长所需氮含量时，这些模型均可模拟氮限制下植物的生长过程，但植物生长对氮需求的表现会有所不同[75-76]。同时，按照模型的建立方法和建立过程，碳循环模型可分为经验、参数和过程模型3个大类。经验模型是严格由数据确定，基于经验推导出的统计关系，包括气候和遥感相关模型[77]。它的局限性在于不涉及潜在机制的知识，仅在与其相关的数据范围内最准确。参数模型利用光合有效辐射及与其相关的调控因素，实现植被生产力的估算，因此也称为光能利用效率模型[78]，目前与遥感结合的应用较为广泛[79]。过程模型则是通过生态生理过程以机械方式模拟生态系统的功能，通常需要考虑各个过程的机制以及多个因素的共同作用，能够运用于长时间、大尺度的模拟[80]，包括简单过程模型、过程耦合模型和遥感-过程耦合模型。此外，模型中是否含有随机成分，例如某些参数的值随时间或个体是否变化，决定了相同初始条件和时间段对应的结果是否相同，因此也分为确定性模型和随机性模型[15]。
4. 氮输入影响滨海湿地碳循环的模型应用和局限
4.1 氮输入影响滨海湿地碳循环的模型应用
碳循环有非常丰富的建模历史，目前已经提出了各种具有不同复杂程度和侧重方向的模型[81-82]。利用模型了解和确定生态系统的主要特征和机制，并对人类活动改变生态系统中碳循环的方式(如化石燃料燃烧、施肥和开发等)进行评估，再借助于真实的观测数据验证模型的拟合度[83]。代表大气与陆地生物圈之间碳交换的模型包括多个过程和机制，其复杂性在过去几十年中不断增加，主要表现在模型过程中的细节被不断增加和完善。由于各模型所代表的过程、应用范围以及运算方式各有不同，因此不同模型之间难以比较，只能以模型输出数值的准确度来评估模型的性能[82]，而不能直接在模型中实现概念和数学的评价及比较。
滨海湿地碳循环过程主要由生物和非生物因素共同驱动，常见为基于点位的测量。而在较大空间尺度的研究中，则通常使用替代技术(如涡度协方差技术等)对长时间、大尺度的数据进行补充[84]。然而全球数据存在高度异质性，包括采样时间、试验持续时间和植被类型变化等，这些都进一步增加了滨海湿地碳交换估算的不确定性。由于滨海湿地生态系统的复杂性，经验和参数模型相比过程模型所受限制更多，因为过程模型还可通过增加相应模块建立子模型，达到对特定生态系统进行拟合的目的。同时，为了研究氮输入对滨海湿地生态系统的影响，碳循环模型中除了包含各碳库之间的相互交换，还应该包括水文、碳氮耦合过程的模块。目前在研究过程模型的领域中，满足以上要求且应用较为广泛的有DNDC(过程模型)、PEATBOG(过程模型)、TECO(过程模型)、Biome-BGC(过程模型)、AVIM(过程耦合模型)、TEM(遥感-过程耦合模型)和CENTURY(过程模型)等几种模型，或可应用于氮输入影响滨海湿地生态系统碳循环过程的模拟(表1)。
表 1 碳循环模型的开发及其在氮输入影响中的应用Table 1 Development and application in wetland of carbon cycle models模型名称 模型类型 模型概述 建立年份 时间步长 适用范围 应用案例 Biome-BGC[85] 过程模型(生物地球化学模型) 模拟生态系统中植被、凋落物、土壤碳、氮、水的储量和通量，模拟木本植物、C3/C4草本植物的碳、氮、水的循环过程与交互影响 1988 1 d 常绿/落叶、针叶/阔叶林、C3/C4草本植物和灌木林，点位、区域和全球尺度 增加了地下水、苔藓植被、土壤营养物质分解、土壤水分压力指数等作用机理的描述。应用于加拿大森林湿地、红壤丘陵区湿地、千烟洲人工湿地、中国南海湿地红树林等湿地生态系统净初级生产力(NPP)、生物量和土壤碳积累的模拟研究[86-89] CENTURY[90] 过程模型(生物地球化学模型) 基于土壤的结构功能，模拟碳、氮和磷的生物地球化学循环过程，同时结合气温、降水量等气候驱动因子，模拟生态系统生产力 1988 30 d 森林、草原生态系统 通过调整厌氧参数，用于泥炭湿地碳动态模拟[91] DNDC[92] 过程模型(生物地球化学模型) 增加了苔藓及草本植物的生长参数，开发了地下水位动态变化、厌氧条件下土壤生物地球化学过程等算法[93] 1992 1 d 森林、农田、草地、湿地生态系统，点位和区域尺度 最初建立用于描述农业生态系统，现可应用于水稻田、湿地、泥炭地等生态系统的碳氮循环研究[94-97] AVIM[98] 过程耦合模型(大气-植被耦合模型) 陆面物理-植被生理生态的有机耦合，包含植被-土壤-大气间热量和水分的交换以及植物光合-呼吸等CO2的交换，实现了大气和包括根圈在内的植物圈之间的动态相互作用 1995 1 h 森林、草地、农田、冰川、湿地、湖泊等生态系统 添加土壤碳氮动态模块[99]，再与其他模块相结合，已应用于研究湿地覆被类型对模拟结果的影响[100] TECO[101] 过程模型(生物地球化学模型) 具有与目前大多数生物地球化学模型相似的碳池结构和参数。经过改进和完善，可用于模拟陆地生态系统中的碳、氮和水文循环 2008 冠层光合作用和土壤水分动态子模型：1 h；植物生长和土壤碳转移子模型：1 d 陆地生态系统 调节植物和生态系统对CO2升高、变暖和降水变化的交互响应的关键过程，已应用于Duke森林应对CO2升高的固碳过程的若干研究中[102-103]以及SPRUCE泥炭地的碳动力和土壤动力学的研究中[104] PEATBOG[105] 过程模型(生物地球化学模型) 强调了土壤固、水、气相与植被之间的物质流动，土壤组分的高空间分辨率，对碳、氮通量的化学计量控制，以及对植被和土壤中碳、氮反应活性的持续概念化 2013 1 d 泥炭地碳氮耦合循环的模拟 已应用于研究长期施氮对泥炭沼泽碳循环的影响分析，并模拟预测了未来80 a间各碳组分的动态趋势，以确定氮肥的潜在影响和影响模型行为的主要因素[106] 4.2 碳循环模型应用的局限性
滨海湿地显著区别于其他湿地的特征是周期性的潮汐作用，整个湿地在淹水-暴露中形成干湿交替的生境，土壤环境改变，最终影响湿地碳交换过程[19, 107]。同时，潮汐作用也使得富营养化的近岸水体将大量活性氮输入系统中。与单个影响因素的作用相比，2个过程的共同作用可能对湿地碳变化的影响结果有所不同。然而，已有碳循环模型对周期性潮汐水文过程的关注不足。碳循环机制取决于当前研究对碳循环过程认识的程度，一些机制性的问题依然利用经验模型解决，例如微生物分解碳速率、植物-土壤碳分配等。且碳循环模型简化了各碳库之间的交互关系，模拟相对静态的过程时效果较好，但无法解释和表达动态的过程，例如不同氮素种类或浓度对优势物种、微生物的选择等。碳动态预测要求考虑土壤、水文和植被等之间的相互作用，却很少有同时存在这些作用的且适用于湿地生态系统的综合型碳模型。虽然一些模型(如DNDC和BIOME-BGC模型)在改进过程中增加了描述湿地生态系统机理的模块[86, 108]，然而，湿地生态系统碳循环过程较为复杂，兼有草本和木本植物，包括沼生植物、湿生植物和水生植物等，化学组分也存在较大差异，形成多种不同类型的湿地，改进后的模型适应性仍有待论证。例如，改良的Biome-BGC模型仍然无法模拟长期遭受洪水侵袭的真正湿地，因为它不会追踪有机土壤形成、地下水位变化、土壤氧化还原电位或厌氧过程[86]。
评估氮输入对碳储量的影响，可以通过测量固定量的氮输入下植物-土壤碳库的变化，还可追踪氮进入系统后通过氮损失途径减少的氮量及轨迹[109]。因此，氮与碳循环之间的相互作用还需进一步完善。例如在氮输入过程中，土壤碳储量的增加并不等同于植物凋落物产量的增加，还与分解速率的降低相关[110-111]。这种增加可以通过植物-土壤-微生物反馈的变化来解释，即激发效应是增加还是减少生态系统碳储量，取决于加速分解造成的土壤碳损失，以及与氮矿化增加促进的植被碳吸收之间的平衡[112]。此外，先前的建模研究证明微生物能够改善土壤碳储量预测[113]，精确地估算植物和微生物生物量及其对无机氮的酶亲和力，可以更好地捕获生态系统中氮的轨迹[114]。部分模型具有隐含的微生物过程，这些过程构成了氮进入土壤有机质的主要途径[115]，但模型没有明确微生物对氮的吸收和转化过程，在植物、土壤和氮素损失途径中的氮分配方面尚有不足。
目前，在提高模型预测能力方面研究依然进展缓慢，对初始条件差异的极端敏感性，以及对系统状态描述的不完备，从根本上限制了未来预测的精确度。建模领域已经采用了多种不同的方法来改善陆地碳模型，但仍未显著减少模型预测之间的差异[109]。常见的方法是将更多的已知过程纳入影响碳循环的过程，以使模型尽可能逼真。但是，包含的过程越多，模型就越复杂且难以处理。其他方法如模型比较，虽然可以有效揭示模型预测之间差异的程度[116-117]，但通常对于其起源只提供了有限的解释。但迄今为止，基准分析能提供针对标准数据集的模型性能评估[118]，仅限于短时间内发生的过程(例如数天至数年)[119]。数据同化可将简单模型或模型组件直接约束于观测值[120]，作为1种集成多源空间数据，它能够高效利用多种数据，但不适用于系统性的复杂模型[121]。
5. 问题与展望
滨海湿地生态系统处于陆地与海洋之间，是能量和物质加工和转化的热点，也是生产力、碳储存/分解的热点。近岸水体富营养化引起的氮输入，将改变滨海湿地植物-土壤-大气碳分配的碳循环关键过程和碳汇功能，然而这些影响存在不确定性。相比于其他的生态系统，滨海湿地植被、土壤、水体之间的交互作用更为复杂，碳交换包括垂直和横向2个过程，因此碳循环建模需要考虑更多的因素，模拟过程中仍存在以下问题，有待进一步发展和完善：①需加强对潮汐水文过程模块的开发。虽然当前尚无将湿地水文、生物地球化学和植被相结合的综合方法，但存在有用的“构建模块”，从一组选定的源模型中组合这些关键因素可能是编译此类通用模型的可行且有效的方法[122]。②碳氮耦合机制有待进一步完善。改进植物和土壤中氮素命运的模型显示：利用植物-土壤-微生物反馈过程，能够更准确地反映土壤碳对氮输入的响应[112]。同时，增加参数或生态过程可能会增加模型预测的不确定性，为限制这种增加的不确定性，可以使用基于过程的、更加稳健且有代表性的数据集来设计和评估新的模型表现[123-124]。③提高模型模拟精度。较小规模的试验可在处理和响应变量评估中提供更高的精度[125]，而较大规模的试验，诸如升温、淹水、氮输入等处理对整个生态系统规模的影响试验，在提供了更高真实性[126]的同时，也增加了模拟精度的复杂性。理想状态是将响应归因于一个整体变化的驱动因素，但试验处理与混杂的环境驱动因素(例如土壤水分、盐度、pH和氧化还原状态)可以同时控制生态系统过程，并调节全球变化驱动因素的影响。在这些不确定性下模拟不同尺度的变化，需要加强不同环境条件下，对应系统中植被、土壤等参数的研究，实现标准化测定，减少参数本地化带来的模拟误差。可尝试将多模型过程进行耦合，提高模型模拟的准确性，形成更完善的环境反馈机制。引入多时相、多传感器的遥感数据及其产品，也是在区域乃至全球尺度进行碳循环模拟的主要方向之一。同时还可以利用数据同化的方法，尽可能减少和控制数据本身及模型模拟过程中所产生的误差，提高模型的可信度和准确性。
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图 1 geNorm软件分析候选内参基因的配对差异值
Figure 1 Pairwise variationof candidate reference genes as calculated by geNorm
图 2 不同内参基因或组合校正桂花不同条件下GI基因的相对表达
Figure 2 Relative expression levels of GI in different conditions using different reference genes or reference gene combination for normalization
表 1 qRT-PCR相关内参基因引物信息
Table 1. List of primers for qRT-PCR
基因简称 引物序列（5′→3′） 退火温度/ ℃ OfACT CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT 55.0 ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfEF1α CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA 58.0 GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT OfIDH CTTGAAGCAGATGTGGAAGAGTC 57.5 CTTTGTCCATCCTGGGACCAGTC OfRAN1 AGAACCGACAGGTGAAGGCAA 57.5 TGGCAAGGTACAGAAAGGGCT OfTUB AGAAGGGATGGATGGAATGGA 56.0 GTCTTCTTCGTCCTCGGCAGT OfUBC2 TGTTGACAAAACCGATGGAAGGA 57.5 GTGGAGTGTGGAGGATAAGGGTG Of18S AGCCTGAGAAACGGCTACCAC 55.0 ATACGCTATTGGAGCTGGAA 
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表 2 7个候选内参基因扩增参数
Table 2. Amplification parameters of seven candidate reference genes
基因 Ct 扩增效率/% 曲线斜率 线性相关系数 条带长度/bp OfACT 22.77 ± 0.55 103.66 －3.237 3 0.995 5 143 OfEF1α 20.61 ± 0.42 103.19 －3.247 8 0.995 7 89 OfIDH 23.59 ± 0.39 95.78 －3.453 8 0.997 7 118 OfRNA1 21.68 ± 0.07 95.43 －3.436 5 0.996 2 117 OfTUB 28.44 ± 0.40 107.49 －3.154 6 0.993 2 106 OfUBC2 25.73 ± 0.54 107.15 －3.161 8 0.994 5 75 Of18S 8.99 ± 0.55 108.15 －3.140 9 0.996 8 208
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表 3 不同软件分析7个候选内参基因表达稳定性
Table 3. Gene expression stability of seven reference genes by different software
基因名称 geNorm分析 NormFinder分析 BestKeeper分析 稳定值 排序 稳定值 排序 稳定值 排序 OfACT 0.393 2 0.232 3 0.288 3 OfEF1α 0.524 5 0.390 6 0.497 6 OfIDH 0.347 1 0.206 2 0.133 1 OfRNA1 0.347 1 0.135 1 0.180 2 OfTUB 0.479 4 0.361 5 0.372 5 OfUBC2 0.422 3 0.343 4 0.346 4 Of18S 0.601 6 0.474 7 0.611 7
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