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液氨预处理法(liquid ammonia treatment，LAT)在氨纤维爆破预处理法(ammonia fiber explosion, AFEX)的基础上改进得来，通过提高反应温度、去除爆破工艺，将氨由快速释放转化为慢速释放，从而降低预处理工艺操作难度，具有非常广阔的发展前景[1]。赵相君等[2]研究了液氨预处理法和双氧水预处理法对稻草(水稻Oryza sativa)酶解转化率的影响，发现双氧水预处理后的葡聚糖和木聚糖的酶解转化率仅为61.6%和47.8%，显著低于液氨预处理法(88.6%和79.3%)。OLADI等[3]和ZHAO等[4]利用响应面法对液氨预处理工艺(温度、氨添加量、反应时间等)进行了优化，当反应温度为170 ℃、氨与原材料质量比为5∶1、载水与原材料质量比为0.8~1.6∶1.0、反应时间为10 min时，芦竹Arundo donax葡聚糖和木聚糖的酶解转化率最高，达到了94.2%和84.4%，总糖回收率高达530.9 g·kg−1。现有文献主要集中于研究LAT预处理工艺对单种生物质原料酶解率的影响[5-7]，而对多种生物质经预处理后化学结构的变化规律(如微观形貌结构、表面化学官能团、纤维素结晶度等)的研究还鲜有报道。中国是农业生产大国，农业生物质资源丰富[8]。小麦Triticum aestivum、高粱Sorghum bicolor和苜蓿Lotus corniculatus作为传统且非常有潜力的农作物，具有栽植面积广，产量可观的优势[9-11]。本研究以麦秸秆、苜蓿草、高粱秸秆及其混合物(质量比为1∶1∶1)为原料，在不同温度条件下开展LAT预处理试验，利用热重分析仪(TGA)、傅里叶变化红外光谱仪(FTIR)、X-射线衍射仪(XRD)、扫描电镜(SEM)等对原料预处理前后的物理化学特性进行表征分析，并利用高效液相色谱(HPLC)对4类原料中葡聚糖/木聚糖的酶解转化率进行对比，探究最理想的LAT预处理温度及预处理前后材性的变化，为LAT预处理工艺设计提供理论依据，也为农作物转化为生物燃料建立基础。
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麦秸秆取自浙江省杭州市临安区清凉峰镇，苜蓿草和高粱秸秆取材于甘肃省白银市会宁县，混合物由麦秸秆、苜蓿草、高粱秸秆按质量比1∶1∶1混合而成。先将原料烘干至含水率低于15%，再粉碎成粒径为50~100目的粉末。用水分分析仪(MA35，赛多利斯科学仪器有限公司)测试实际含水率，测试后用密封袋密封低温(−20 ℃)保存。纤维素酶(NS50013)和β-葡萄糖苷酶(NS50010)由诺维信公司(中国)提供。
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称取各生物质原料20 g，加去离子水，使固液质量比达到70%，搅拌均匀并平衡10 min后转移到高压反应釜(GCF-1 L20/350，大连自控设备厂)中，并对反应釜抽真空。将液氨注入称量小钢瓶，使氨与原材料的质量比为1∶1；加热小钢瓶至50 ℃，用以提升氨的压力，再将氨注入反应釜。控制每组样品的反应釜温度在70、90、110、130、150和170 ℃下各反应5 min，反应结束后快速冷却反应釜并释放氨气。取出原料，40 ℃真空烘箱中干燥24 h后测量质量和含水率，计算预处理后原料得率，再将处理后的原料放入−20 ℃的冰箱冷藏备用。
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采用元素分析仪(Vario EL Ⅲ，德国 Elementary 公司) 测定预处理前后原料的元素组成；根据国家可再生能源实验室(NREL)标准中的LAP002方法[12]测定碳水化合物相对含量，根据LAP003方法[12]测定酸不溶性木质素(Klason木质素)相对含量；采用高效液相色谱(HPLC-1200，美国安捷伦科技有限公司)测定各种单糖质量分数，并计算葡聚糖(纤维素)、木聚糖、阿拉伯聚糖等组分的相对含量；根据GB/T 2677.3−1993《造纸原料灰分的测定》标准测定原料灰分测定原料灰分。
采用热重分析仪(TG209F1，德国耐驰仪器制造有限公司)分析预处理前后的原料的热失重规律。称取10 mg原料放入三氧化二铝坩埚中，以20 ℃·min−1升温速率升至600 ℃；载气为高纯氮气(99.999%)，载气流量为40 mL·min−1，保护气流量为20 mL·min−1。采用傅里叶红外光谱仪(Nicolet 6700，美国尼高力仪器公司)分析预处理前后原料的表面官能团。称取1 mg样品粉末与溴化钾(质量比1∶200)混合研磨均匀并压片，在4 000~500 cm−1波长范围内扫描。采用冷场发射扫描电镜(SEM，SU8010，日本日立公司)观察预处理前后样品微观结构。采用 X 射线衍射仪(XRD-6000，日本岛津公司)分析预处理前后原料的结晶度进行。称取200 mg粉末样品，压片处理后放入样品室，扫描范围为5°~40°，步长为0.05°，扫描速度为5°·min−1。根据公式计算纤维素结晶度ICr=(I002−Iam)/I002×100%。其中，I002为结晶峰的衍射强度，Iam为无定形区域衍射强度。
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根据NREL标准中的LAP009[12]规程进行酶水解实验。称取150 mg葡聚糖当量的原料，用pH 4.8的蒸馏水-柠檬酸钠缓冲溶液溶解得到15 mL酶解液，加入抗生素(四环素和环己酰亚胺)防止菌落滋生。预混合1 h，添加纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，放入摇床。酶解温度为50 ℃，摇床转速为150 r·min−1。
酶解24和72 h时取样，酶解液摇匀后用移液枪量取1 mL样品注入离心管，100 ℃下放置20 min，使酶蛋白变性完全失效，−20 ℃下冷却5 min，15 000 r·min−1转速下离心5 min，经0.22 μm聚醚砜膜过滤后注入HPLC分析瓶中，测定酶解液中的单糖相对含量。HPLC采用示差检测器，色谱柱(HPX-87H Ion Exclusion Column，Bio-Rad公司)条件：进样量为15 μL，每个样品运行20 min，柱温为50 ℃，流动相为0.005 mol·L−1稀硫酸，流速为0.5 mL·min−1。
用实际获得的单糖与原料中聚糖理论上可转换的同类单糖之比表示酶解率。计算其中葡聚糖和木聚糖的酶解率d=g×15/m×c×k×1 000×100%。其中：g为HPLC测得的酶解液中葡萄糖或木糖的质量浓度(g·L−1)；m为加入原料的干基质量(g)；c为原料成分分析(酸解法)葡聚糖或木聚糖相对含量(%)；k为葡聚糖或木聚糖分别转化为葡萄糖或木糖的系数，取0.90和0.88。总糖回收量定义为1 000 g干基材料经LAT预处理72 h后酶解所释放的葡聚糖和木聚糖总质量之和。
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由表1可知：预处理前高粱秸秆中葡聚糖、木聚糖以及阿拉伯聚糖的总相对含量(58.88%)高于麦秸秆和苜蓿草，而Klason木质素和灰分的总相对含量(17.20%)低于麦秸秆和苜蓿草，表明高粱秸秆中能有效转化为乙醇的多糖组分更多，其水解制备乙醇的潜力更大。经LAT预处理，3种原料的固体得率均出现少量下降；以高粱秸秆为例，葡聚糖、木聚糖以及阿拉伯聚糖相对含量分别从37.90%、17.63%和3.35%下降至33.72%、14.69%和3.28%，木质素从13.53%下降至10.53%；分析原因可能是液氨预处理过程中产生的诱导效应使木质素中的α-醚键发生断裂，引起木质素大分子结构部分断裂，木质素苯环上的甲基芳基醚键在氢氧根(OH−)作用下断裂，发生脱甲基反应，木质素的亲水性增强[13]，使得部分小分子组分从生物质中脱落，溶解于预处理反应溶液中；与此同时，多糖组分的水解转化率得到提高[9]。如表2所示：预处理前，苜蓿草中碳和氢元素相对含量(43.79%和7.22%)及热值(22.24 MJ·kg−1)最高，麦秸秆中氧元素相对含量(53.16%)最高；经LAT预处理，3种原料中的碳元素相对含量都有所增加，而氢和氧相对含量下降，表明LAT预处理使得生物质原料中少量含氧和氢的官能团和联接键出现断裂和脱落，如羟基(—OH)、β—O—4芳基醚键，造成生物质结构疏松，有利于提高酶解率[14]。此外，预处理后原料中的氮元素相对含量增加，以苜蓿草为例，氮元素相对含量增加了1.2倍，表明在LAT预处理过程中，液氨中的氮元素与生物质中的官能团发生了化学反应，形成了少量的乙酰基[15]。
表 1 LAT预处理前后原料的化学组分分析
Table 1. Content of chemical components in biomass before and after LAT
样品 葡聚糖/% 木聚糖/% 阿拉伯聚糖/% Klason木质素/% 灰分/% 固体得率/% 未处理的麦秸秆 35.54 19.06 3.19 18.92 13.83 100 LAT预处理的麦秸秆 32.86 17.99 3.19 15.34 11.59 99.84 未处理的苜蓿草 27.38 12.88 3.02 21.38 5.90 100 LAT预处理的苜蓿草 25.81 11.53 3.01 20.09 5.04 99.77 未处理的高粱秸秆 37.90 17.63 3.35 13.53 3.67 100 LAT预处理的高粱秸秆 33.72 14.69 3.28 10.35 2.71 98.99 未处理的混合物 33.58 17.23 3.44 16.70 7.89 100 LAT预处理的混合物 30.32 16.81 3.43 13.61 7.22 99.46 表 2 LAT预处理前后原料的元素分析
Table 2. Ultimate analysis of biomass before and after LAT
样品 碳/% 氢/% 氧/% 氮/% 硫/% 高位热值/(MJ·kg−1) 未处理的麦秸秆 39.06 6.63 53.16 0.79 0.36 20.33 LAT预处理的麦秸秆 39.07 6.49 52.69 1.49 0.27 20.14 未处理的苜蓿草 43.79 7.22 47.47 1.36 0.16 22.24 LAT预处理的苜蓿草 43.87 6.90 46.83 3.10 0.29 21.29 未处理的高粱秸秆 43.53 7.09 48.21 1.01 0.17 22.29 LAT预处理的高粱秸秆 43.57 6.91 46.61 2.74 0.17 21.52 未处理的混合物 42.46 6.93 49.36 1.03 0.22 21.25 LAT预预处理的混合物 41.60 6.58 49.23 2.40 0.19 20.51 -
用20 ℃·min−1的升温速率对原料做热重分析，发现LAT预处理前后原料的热重(TG)曲线和微分热重(DTG)曲线不同。经LAT预处理的样品，热解后残余质量百分比增加，平均增幅为2%~3%(图1A、图1B和图1C)。由DTG曲线(图1D，图1E和图1F)可知：原料的热解过程可分为脱水、快速热解和炭化3个阶段[16-17]。30~200 ℃为脱水阶段，此时质量损失来源于游离水和结合水的脱除，由于样品已经经过烘干处理，因此原料失重率非常低[18-19]。当温度升至200~400 ℃时，生物质中的纤维素和半纤维素发生快速热解失重，预处理导致原料在此阶段的最大失重峰处的失重率下降；麦秸秆从13.02%·min−1下降至12.16%·min−1，高粱秸秆从13.57%·min−1下降至12.72%·min−1，苜蓿草从14.37%·min−1下降至13.62%·min−1。结合表1可知：LAT预处理造成生物质中的葡聚糖、木聚糖和阿拉伯糖相对含量下降，使得此阶段可降解物质相对含量下降，是本阶段失重率下降的原因[20]。此外，由图1E可知：高粱秸秆原料热解时存在1个热解失重肩峰，主要是由半纤维素热降解产生的；但LAT预处理后的高粱秸秆此肩峰消失，表明部分半纤维素(木聚糖和阿拉伯糖)已经在LAT预处理过程中移出，半纤维素的分解使得木质素-碳水化合物复合体(LCC)被破坏，提高了样品酶解可及度。400~800 ℃为炭化阶段，此阶段主要由木质素热降解造成，木质素经过慢速热解后逐步转化为生物质炭[21]。
图 1 麦秸秆、高粱秸秆和苜蓿草在LAT预处理前后的热重和微分热重曲线
Figure 1. TG and DTG curves of wheat straw, sorghum straw and alfalfa before and after LAT
图 2 LAT预处理前后样品的红外光谱图
Figure 2. FTIR analysis of samples before and after LAT
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由图2可知：LAT预处理前后样品的部分特征官能团的吸光度出现了轻微的变化。3 450 cm−1为羟基(—OH)的伸缩振动峰，主要来源于自由水以及纤维素、半纤维素和木质素化学结构上的羟基，经过LAT预处理后的样品在此处的吸光度强度出现一定程度下降，表明生物质中羟基含量下降，纤维素中的氢键被破坏，使得生物质结构更加疏松，与ZHAO等[8]的研究结论一致。1 631 cm−1处为碳—氮(C—N)伸缩振动吸收峰，经过LAT预处理后的样品在此处的吸光度强度出现一定程度增加，说明氨水与样品中的3大组分(纤维素、半纤维素和木质素)发生了化学反应，氮元素以酰胺的形式存在于样品中，与元素分析结果一致。1 595 cm−1处为苯环上碳=碳(C=C)键振动吸收峰，是木质素中苯丙烷基本结构单元的特征吸收峰，与原料谱图对比，LAT预处理后峰强度减弱，且有分峰出现，说明预处理使木质素结构发生改变，部分木质素溶解于液氨并脱除出生物质，使得生物质化学结构紧密程度降低，从而降低酶解顽抗性。3种原料吸收峰从大到小依次为苜蓿草、麦秸秆、高粱秸秆，侧面证明木质素相对含量大小依次为苜蓿草、麦秸秆、高粱秸秆。1 268 cm−1处吸收峰来自于纤维素和半纤维素的碳—氧(C—O )伸缩振动，对比发现，LAT预处理后该峰略微增强，归因于木质素和半纤维素联结生成LCC复合体，存在大量醚键，在碱性条件下，醚键断裂，LCC复合体破坏生成苯丙烷结构单元和多糖类物质[15，22-23]。
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由图3可知：LAT预处理前后样品的微观形貌存在差异。未处理的麦秸秆纤维形状规则，排列整齐，纤维表面存在着规则排列的硅质细胞(图3A)，预处理后纤维排列疏松膨胀，孔隙度增加(图3D)，有利于进一步酶解反应。经过LAT预处理的高粱秸秆纤维表面暴露程度增加(图3B和图3E)，苜蓿草表面结构发生扭曲和破坏，纤维暴露并出现裂纹和气孔，表面粗糙度变大，多孔性增加(图3C和图3F)。由此认为：LAT预处理能有效提高样品的比表面积，在压力作用下，氨水渗透进细胞腔和胞间层，引起纤维素的溶胀和结晶体的相变，LCC复合体被破坏，生成大量活性基团[24]。
图 3 LAT预处理前后3种原料的表观形貌
Figure 3. Micrograph of samples before and after LAT pretreatment
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生物质的纤维素上存在结晶区和非结晶区，结晶度是用来表征纤维素结晶区含量的重要指标。结晶区域，纤维素链间以氢键紧密结合，纤维素大分子长链紧密排列，化学结构相对致密；非结晶区域，纤维素链随机排列、结构疏松，较有利于纤维素酶在其表面的键结。因此，纤维素的结晶度能够显著影响木质纤维素的酶解率。由图4可知：3种原料XRD谱图中主要存在2个峰，分别为16°和22°处纤维素的非结晶区和结晶区衍射峰；经过LAT预处理后纤维素结晶度下降，表明LAT预处理能破坏纤维素结晶区，氢键发生断裂，导致部分结晶区转化为无定形区，使得酶在纤维素化学结构上的可及度增加，从而提升酶解转化率[5]。
图 4 LAT预处理前后3种原料的XRD谱图
Figure 4. XRD analysis of samples before and after LAT
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如图5所示：随着LAT预处理温度升高，葡聚糖的酶解转化率呈现先增加后减小的趋势，90 ℃时达到最大。在90 ℃下酶解24 h，葡聚糖酶解率为79.98%，是未经预处理原料的葡聚糖转化率(30.74%)的1.60倍；酶解至72 h时，进一步增至89.98%，达到最大值。木聚糖的酶解转化率也在90 ℃、72 h时达最高(79.03%)，是未经处理原料的木聚糖转化率(14.87%)的4.34倍。认为90 ℃、酶解72 h为LAT预处理的最优条件。研究发现：HP预处理的最佳工艺条件下，麦秸秆总糖回收率为368.9 g；而利用优化条件下的LAT预处理，干基麦秸秆可转化单糖569.7 g·kg−1，是未经预处理原料产糖量(195.0 g)的2.92倍，是双氧水预处理的1.50倍，说明LAT预处理对麦秸秆酶解非常有效[11]。
图 5 LAT预处理温度对麦秸秆中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 5. Effect of temperatureof LAT on the glucan and xylan conversion of wheat straw
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如图6所示：随着LAT预处理温度升高，苜蓿草葡聚糖的酶解转化率呈现先增加后减小趋势，110℃时达到最大值。在110 ℃下酶解24 h，葡聚糖酶解率为62.07%，比未经预处理原料的葡聚糖转化率(45.67%)提高了36.00%。继续酶解至72 h，葡聚糖酶解率最高可达到68.95%。木聚糖酶解转化率与葡聚糖大致相同，110 ℃下酶解72 h时，转化率达到最高值(68.22%)，是未经处理原料的木聚糖转化率(11.96%)的4.70倍。110℃预处理后酶解72 h后，葡萄糖和木糖转化的单糖得率分别为244.0和102.6 g·kg−1，单糖总产量为316.3 g·kg−1。相比之下，低于麦秸秆的单糖产量(569.7 g·kg−1)，推测原因是苜蓿草木质素相对含量较高，阻碍酶对纤维素和半纤维素的可及性，并与水解酶结合，导致酶水解速度降低，影响了酶解效果[8]。
图 6 LAT预处理温度对苜蓿草中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 6. Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of alfalfa
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如图7所示：随着LAT预处理温度升高，高粱秸秆中葡聚糖酶解转化率呈现先增加后减小的趋势，110 ℃时转化率达到最大值。110 ℃下酶解24 h，葡聚糖酶解率为65.26%，比未经预处理原料(51.03%)增加了14.23%。继续酶解至72 h时，葡聚糖酶解率达到最大值(82.12%)。木聚糖酶解转化率与葡聚糖大致相同，但相同温度下大于葡聚糖。110 ℃酶解24 h，木聚糖转化为率为78.58%，比未处理样品(47.00%)提高了31.58%，酶解72 h时达到最大(91.21%)。预处理促进了原料中葡聚糖和木聚糖的酶解效果，高粱秸秆(干基)在110 ℃下酶解72 h，总糖回收量为559.5 g·kg−1，高于未处理原料(329.7 g·kg−1)，说明液氨预处理提高了高粱秸秆单糖产量，LAT预处理有效。
图 7 LAT预处理温度对高粱秸秆中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 7. Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of sorghum straw
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麦秸秆、苜蓿草、高粱秸秆按质量比1∶1∶1混合，混合物葡聚糖和木聚糖的酶解转化率随LAT预处理温度升高呈现先增加后减小的趋势(图8)，在90 ℃时达到最大值；当温度由90℃升至170℃，混合物酶解转化率差异不明显。90℃下酶解24 h，混合物葡聚糖酶解率为70.19%，比未经预处理样品的葡聚糖酶解率(50.72%)提高了19.47%；继续酶解至72 h，葡聚糖酶解率为84.90%，比未处理样品提高了34.18%。木聚糖酶解转化率与葡聚糖大致相同，在90℃下酶解24 h，混合物木聚糖转化为率70.68%，比未经预处理样品的木聚糖转化率(30.39%)提高了40.29%，继续酶解至72 h，木聚糖转化率为81.02%，比未处理样品提高了50.63%。
图 8 LAT预处理温度对混合物中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 8. Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of mixture
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采用LAT法对麦秸秆、苜蓿草、高粱秸秆以及三者混合物(质量比1∶1∶1)进行预处理，研究预处理温度与葡聚糖和木聚糖酶解转化率的关系，得到结论如下：①LAT预处理对生物质原料的化学结构影响显著。LAT预处理后，原料化学组分中葡聚糖、木聚糖和阿拉伯糖的相对含量下降；元素组分中的氧和氢相对含量下降，碳和氮相对含量上升；结晶度小幅下降，生物质表面孔隙结构增强，使得酶在生物质化学结构上的可及度增加。②麦秸秆和混合物中葡聚糖和木聚糖的酶解率在LAT预处理温度为90 ℃时达到最大值，苜蓿草和高粱秸秆在110 ℃时达到最大值。随着酶解时间延长，4种原料葡聚糖和木聚糖的酶解率均增加；葡聚糖的最大酶解率从大到小依次为麦秸秆、混合物、高粱秸秆、苜蓿草，木聚糖的最大酶解率从大到小依次为高粱秸秆、麦秸秆、混合物、苜蓿草。
Effects of LAT on chemical structure and enzymatic hydrolysis of crop straw
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摘要:
目的 探索液氨预处理(liquid ammonia treatment，LAT)对生物质原料水解顽抗性和纤维素类生物质酶解效率的影响。 方法 采用LAT法对小麦Triticum aestivum秸秆(以下称麦秸秆)、高粱Sorghum bicolor秸秆、苜蓿Lotus corniculatus草及三者混合物(质量比为1∶1∶1)进行预处理，利用热重分析仪、傅里叶变化红外光谱仪、X-射线衍射仪和扫描电镜等对其预处理前后的化学结构变化进行表征，研究预处理温度和酶解时间对4种原料中葡聚糖和木聚糖的酶解转化率的影响。 结果 LAT预处理对生物质原料的化学结构影响显著。经LAT预处理后，葡聚糖、木聚糖和阿拉伯糖等化学组分的相对含量降低；氧(O)和氢(H)元素的相对含量降低，部分含氢(H)、氧(O)元素的官能团发生脱落；结晶度出现小幅下降，生物质表面孔隙结构增多，酶在生物质化学结构上的可及度增加。麦秸秆和混合物的最佳预处理温度为90 ℃，苜蓿草和高粱秸秆的最佳预处理温度为110 ℃；随酶解时间延长，4种原料中葡聚糖和木聚糖的酶解率都增加；葡聚糖的最大酶解率从大到小为麦秸秆、混合物、高粱秸秆、苜蓿草，木聚糖的最大酶解率从大到小依次为高粱秸秆、麦秸秆、混合物、苜蓿草。 结论 LAT预处理可以提高木质纤维素生物质尤其是麦秸秆和高粱秸秆的酶解效率。图8表2参24 Abstract:Objective This study aims to investigate the effects of liquid ammonia treatment (LAT) pretreatment on the hydrolysis resistance of biomass and the enzymatic hydrolysis rate of lignocellulosic biomass. Method Four different types of lignocelluloses biomass, namely wheat straw (Triticum aestivum), alfalfa (Lotus corniculatus), sorghum straw (Sorghum bicolor), and their mixture (mass ratio 1∶1∶1), were pretreated by LAT method, and the effect of LAT on their chemical structure changes was studied by using thermo gravimetric analysis (TGA), Fourier transform infrared spectrometer (FTIR), X-ray diffractometer (XRD), and scanning electron microscope (SEM). Then, the effect of pretreatment temperature and enzymatic hydrolysis time on the enzymatic hydrolysis conversion rates of glucan and xylan in the four raw materials was investigated. Result LAT had a significant effect on the chemical structure of biomass materials. After this pretreatment, the relative content of glucan, xylan, and arabinan in four types of lignocelluloses biomass slightly decreased. The relative content of O and H decreased because some functional groups containing O and H dropped off. The crystallinity decreased slightly, while the surface pore structure significantly increased, and the availability of enzymes in the chemical structure of biomass increased. The optimum pretreatment temperature of wheat straw and mixture was 90 ℃, while that of alfalfa and sorghum straw was 110 ℃. The enzymatic hydrolysis rates of glucan and xylan increased with the increase of enzymatic hydrolysis time. Among the four types of lignocelluloses biomass, the highest enzymatic hydrolysis rate of glucan obtained at the optimal enzymatic hydrolysis condition was wheat straw, followed by the mixture, sorghum straw, and alfalfa. The enzymatic hydrolysis rate of xylan ranging from large to small was sorghum straw, wheat straw, the mixture, and alfalfa. Conclusion LAT can improve the enzymatic hydrolysis efficiency of lignocellulosic biomass, especially that of wheat straw and sorghum straw. [Ch, 8 fig. 2 tab. 24 ref.] -
Key words:
- wheat straw /
- alfalfa /
- sorghum straw /
- liquid ammonia treatment /
- enzymatic hydrolysis /
- cellulose ethanol
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独脚金内酯（strigolactones）是一些天然的独脚金醇类化合物及人工合成类似物的总称[1]。独脚金内酯由植物根系分泌，并刺激了寄生植物种子发芽[2-3]和丛枝（AM）菌根的分枝生长[1, 4]。独脚金内酯几乎存在于所有的高等植物之中，在调节植物生长发育过程中起着重要的作用。除了被鉴定为控制植物侧枝发育的关键信号物质外[5-6]，独脚金内酯还在调控根部构型[7]、叶片衰老[8]以及抗旱胁迫[9-10]上起着重要的作用。另外，近年来研究发现，独脚金内酯处理能特异地促进植物叶片捕光色素蛋白相关基因的表达[11]，说明了独脚金内酯也可能调节植物光系统的构成，目前，对独脚金内酯与植物光合关系的研究还较少。虽然目前独脚金内酯的生物合成及信号通路还没有被完全揭示，但部分参与其生物功能的关键基因已经被发现。其中D27，MAX1，MAX3和MAX4等蛋白酶参与了独脚金内酯的合成[12-15]，而D14和MAX2等蛋白则与独脚金内酯的信号传递相关[16-18]。植物的叶绿素荧光信号能表征植物对光能的利用情况，是光合生理研究的重要探针[19]。利用调制叶绿素荧光测定仪可通过荧光诱导的方法构建植物的叶绿素荧光动力学参数，从而快速而灵敏地探测植物的光合及生理状态信息。笔者通过对拟南芥Arabidopsis thaliana独脚金内酯合成突变体max1与信号突变体max2与野生型拟南芥叶片的光合色素及叶绿素荧光特性的分析，探讨独脚金内酯对植物光合系统的影响，从而为深入了解独脚金内酯的生物功能及作用机制提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
实验材料拟南芥独脚金内酯突变体max1，max2和野生型（WT）均为哥伦比亚生态型，种子为日本东京大学浅见忠男惠赠。将种子播种在包含1/2 MS（Murashige and Skoog）盐及质量分数为1%蔗糖的固体培养基上，于黑暗下4 ℃春化3 d, 然后转移到人工气候培养箱, 生长温度为22~23 ℃，光照强度为120 μmol·m-2·s-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗。培养7 d后，选择长势一致的拟南芥幼苗，转移到泥炭和珍珠岩混合基质中进行培养。在拟南芥生长30 d后进行叶绿素荧光动力学参数测定，并采集叶片测定光合色素质量分数。
1.2 光合色素质量分数测定
参照分光光度法测定植物叶片的光合色素质量分数[20]。剪取50~100 mg的拟南芥功能叶的叶片，用体积分数为95%乙醇在室温下暗处浸提叶片至完全变白（24 h）后，用UV-2600（SHIMADZU）分光光度计分别测定在664.2，648.6和470.0 nm波长的吸光度，并通过公式计算叶绿素a，叶绿素b，总叶绿素，类胡萝卜素质量分数以及叶绿素a/b。
1.3 叶绿素荧光参数的测定
选择成熟的莲座功能叶3~4片，采用德国Walz公司的Imaging-PAM叶绿素荧光仪进行叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线的测定。在测定前，将拟南芥幼苗暗处理30 min。测定叶绿素荧光诱导动力学曲线时, 先用弱光照射测定初始荧光（Fo），随后进行饱和脉冲光（2 800 μmol·m-2·s-1）处理，得到最大荧光（Fm），然后打开可以测量光（102 μmol·m-2·s-1），当荧光基本稳定时测定稳态荧光（Fs）。之后再进行饱和脉冲光处理，1个脉冲关闭后, 得到光化光下的最大荧光（Fm'）。充分暗适应PSⅡ的最大光化学量子产量（Fv/Fm），表观电子传递速率（ETR），PSⅡ光化学能量转化的有效量子产量[Y（Ⅱ）]，光化学猝灭系数（qP），非光化学猝灭系数（qN，QNP），非调节性能量耗散的量子产量[Y（NO）]等各参数数值均是在选定模式下系统自动计算生成。将经过叶绿素荧光诱导动力学后的叶片样品，立即进行快速光响应曲线的测定，将叶片连续暴露在连续光强梯度（PAR）0，9，40，75，133，210，248，319，455，577，730，800 μmol·m-2·s-1下, 20 s·步-1，测定相对电子传递速率ErTR及其他荧光参数。
1.4 数据处理和统计方法
各参数值导出后，用Excel进行基本的数据统计，不同突变体之间的差异采用SPSS统计软件进行方差分析和最小显著差法（LSD）多重比较。
2. 结果与分析
2.1 独脚金内酯突变体幼苗叶片光合色素质量分数
从表 1可以看出：2个独脚金内酯突变体光合色素质量分数均低于野生型。其中max1突变体的叶绿素a质量分数相对于野生型降低了13%，但叶绿素b的质量分数却基本没有变化；而max2的叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素质量分数分别较野生型降低了18%，19%和18%，差异显著（P < 0.05），说明MAX2蛋白可能参与了植物叶绿素合成的调控。比较叶绿素a/b发现，max1的叶绿素a/b显著低于野生型和max2（P < 0.05），虽然max2的叶绿素a和b质量分数相对于野生型均显著降低，但叶绿素a/b没有显著变化。独脚金内酯突变体叶片中类胡萝卜素质量分数也低于野生型，其中max1降低了最多，达到24%，而max2只降低了12%。因此，max1类胡萝卜素与叶绿素的比值低于野生型和max2，并与max2达到了显著性差异（P < 0.05）。
表 1 拟南芥独脚金内酯突变体叶片光合色素质量分数及部分比值Table 1. Content and partial ratio of photosynthetic pigments in leaves of strigolactione mutants and WT of Arabidopsis thaliana材料 叶绿素a/(mg·g-1) 叶绿素b/(mg·g-1) 总叶绿素/(mg·g-1) 类胡萝卜素/(mg·g-1) 叶绿素a/b 类胡萝卜素/叶绿素 野生型 1.18±0.12a 0.42±0.04 a 1.60±0.15a 0.25±0.03 a 2.79±0.11a 0.15±0.01ab max1 1.03±0.12a 0.41±0.04 a 1.44±0.16a 0.19±0.03 a 2.51±0.09 b 0.13±0.01b max2 0.97±0.01b 0.34±0.01b 1.32±0.00 b 0.22±0.01a 2.84±0.10a 0.17±0.01b 说明：同列不同小写字母表示差异达到显著水平(P < 0.05)。 2.2 独脚金内酯突变体幼苗叶片荧光参数比较
初始荧光Fo表示光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心处于完全开放时的荧光产量，最大荧光Fm表示PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量[21]。Fv/Fm表示光合中心将吸收的光能用于光化学反应的最大效率，是表征PSⅡ反应中心光能转化效率的关键指标[22]。Fv/Fo值表示PSⅡ潜在的光化学活性大小，反映光能吸收转化机构的完整性[21]。如表 2所示，与野生型相比，max1的Fo和Fm分别较野生型增加了20%和21%（P < 0.05），这种同比例上升的结果，虽然没有显著改变Fv/Fm值，但造成了Fv/Fo的显著下降。而在max2突变体中，Fm相对野生型和max1均显著降低，导致Fv/Fm显著下降。
表 2 拟南芥独脚金内酯突变体叶片Fv/Fm和Fv/Fo参数比较Table 2. Comparison of Fv/Fm and Fv/Fo between strigolactione mutants and WT of Arabidopsis thaliana材料 Fo Fm Fv Fv/Fm Fv/Fo 野生型 0.060±0.008 b 0.299±0.035 b 0.239±0.027 b 0.801±0.005 a l2.62±1.97 a max1 0.075±0.002 a 0.379±0.002 a 0.305±0.002 a 0.803±0.006 a 9.77±0.40 b max2 0.054±0.002 b 0.252±0.008 c 0.198±0.006 c 0.786±0.002 b l3.59±0.52 a 说明：同列不同小写字母表示差异达到显著水平(P < 0.05)。 进一步比较不同拟南芥中PSⅡ实际量子产量Y（Ⅱ），光化学淬灭系数qP，非光化学淬灭系数qN和QNP，非调节性能量耗散的量子产量Y（NO）以及电子传递速率ETR等荧光参数。结果如表 3所示：独脚金内酯信号突变体max2的Y（Ⅱ），qP及ETR等参数较野生型降低了21%，17%和21%，均达到显著差异（P < 0.05）；而叶片的qN，QNP则显著升高，Y（NO）较野生型没有显著变化。而max1突变体则与max2不同，其Y（Ⅱ），ETR等较野生型略有降低，但没达到显著差异。虽然max1的qP值较对照降低，但仍然显著高于max2；而max1的qN和QNP与对照比没有显著差异，但Y（NO）值却显著高于野生型和max2（P < 0.05）。
表 3 拟南芥独脚金内酯突变体叶片Y（Ⅱ），qP，qN，QNP，Y（NO）和ETR参数比较Table 3. Comparison of Y(Ⅱ), qP, qN, QNP, Y(NO) and ETR between strigolactione mutants and WT of Arabidopsis thaliana材料 Y（Ⅱ） qP qN QNP Y(NO) ETR 野生型 0.543±0.014 a 0.756±0.014 a 0.440±0.020 b 0.142±0.011 b 0.291±0.006 b 23.25±0.59 a max1 0.521±0.025 a 0.720±0.027 b 0.435±0.018 b 0.138±0.008 b 0.308±0.013 a 22.30±1.08 a max2 0.427±0.015 b 0.647±0.015 c 0.579±0.018 a 0.227±0.013 a 0.301±0.001 b 18.28±0.63 b 说明：不同小写字母表示差异达到显著水平（P < 0.05）。 2.3 独脚金内酯突变体幼苗叶片快速光响应曲线
为进一步分析不同突变体叶绿素荧光参数对光强的响应，分别分析PSⅡ的有效量子产量Y（Ⅱ），光化学猝灭系数qP，非光化学猝灭系数QNP以及相对电子传递速率ErTR随光照强度变化。图 1是不同拟南芥独脚金内酯突变体的快速光响应曲线。结果显示：叶片的ErTR与qNP随光照强度的增加而增加，Y（Ⅱ）与qP随光照强度的增加而减小。其中在弱光和低光强时，突变体max1的光化学荧光指标与野生型差异不大，但随着光强的增加，max1的qP和QNP均低于野生型。而max2突变体的ErTR，Y（Ⅱ）和qP等指标随着光强的增加较野生型和max1显著降低，但QNP则显著高于野生型和max1。野生型在光强达到577 μmol·m-2·s-1时ErTR达到最大值，光强继续增加到800 μmol·m-2·s-1时ErTR基本保持稳定；而max1和max2的最大ErTR值则较野生型延后，出现在更高的光强水平（730 μmol·m-2·s-1），随光强继续增加则ErTR显著降低。
图 1 拟南齐独脚金内酯突变体叶片叶绿素焚光的快速光响应曲线Figure 1. Rapid light-fesponse cuire of chlorophyll fluorescence parameters in the leaves of strigolactione mutants of Arabidopsis thaliana3. 讨论
MAX1解码一个细胞色素P450单加氧酶（Cyt P450），可以将独脚金内酯的前体物质己内酯（carlactone）水解成具活性的独脚金内酯类物质，是独脚金内酯合成中的关键步骤[23-24]。MAX2编码一个F-box蛋白，通过形成SCF (skp1-cullin-f-box）蛋白复合体，参与蛋白泛素化并介导蛋白质降解。独脚金内酯可以促进MAX2结合蛋白的降解，从而推动独脚金内酯的信号传递[25-26]，而MAX2的突变体抑制了独脚金内酯信号的传递。本研究结果表明：独脚金内酯及其信号对植物的光合系统有着重要的影响。其中max1突变体的叶绿素质量分数较野生型并没有显著降低，但叶绿素a/b却发生了显著改变。叶绿素a/b的变化对植物利用不同波长的光能具有重要意义[27]，突变体max1叶绿素a/b的变化说明独脚金内酯可能通过调节植物叶片光合色素的结构，从而改变对光能的俘获能力，这与在番茄Lycopersicon esculentum中发现的独脚金内酯处理能促进叶片捕光基因表达的结果是一致的[11]。不同研究均发现：独脚金内酯是重要的与环境互作的植物信号分子，比如独脚金内酯重要功能之一就是调节植物株型从而响应环境中低磷营养的胁迫[28]。本实验结果说明了独脚金内酯也可能与参与了植物光合的调节来适应环境的改变。而max2突变体的叶绿素质量分数显著低于野生型，但叶绿素a/b并没有显著变化，说明MAX2蛋白自身可能参与了植物光和色素合成的调控，同时由于阻断了独脚金内酯信号的传递，max2突变体无法通过调节独脚金内酯的信号来改变调节植物叶绿素的组成。
比较叶绿素荧光参数发现，max1和max2突变体在荧光特性上存在显著差异。max1突变体的叶绿素荧光参数与野生型相比并没有显著降低，但初始荧光(Fo）和Y (NO）值较野生型增加显著。Fo增加说明max1突变体的PSⅡ反应中心可能遭到破坏，而Y (NO）是表征光损伤的重要指标，说明max1更易受到光损伤。从max1的快速光曲线可以看出，虽然这些破坏在低的光强下可能并不影响植物的光合效率，但在高光强下max1可能更容易受到损伤。max2突变体的Fv/Fm，Y (Ⅱ）以及qP值均显著低于野生型，说明max2突变体叶片PSⅡ反应中心的光能转化效率较低，植物的光合作用潜力较小，MAX2蛋白可能对植物光系统的建成具有基础作用。另外，max2突变体具有较高的qNP，说明突变体能将过剩的光能以热的形式耗散出去，从而保护光系统免于破坏，暗示max2的光保护系统仍然健全。
独脚金内酯合成突变体max1，max3和max4等与信号突变体max2在植物发育上的差异在不同研究中均有体现。如在植物光形态建成的研究中发现，max2突变体对光形态建成不敏感，但独脚金内酯合成突变体max1，max3和max4则与野生型相一致[29]，显示了max2突变体与独脚金内酯合成突变体对光信号响应的差异。在对独脚金内酯在抗旱胁迫上的作用上也发现，max2突变体的抗旱能力显著下降，但max3，max4等合成突变体的耐旱性下降并不明显[10]。说明了MAX2蛋白除了介导独脚金内酯信号的传导，还具有调控植物发育及形态建成等多方面的功能，而独脚金内酯则通过MAX2蛋白的介导从而调节植物生长发育以及对环境响应。本研究也发现，max1和max2突变体在光和色素质量分数及叶绿素荧光参数上存在显著差异。综合来看，MAX2蛋白可能对植物光系统的建成具有基础作用，而独脚金内酯则通过MAX2蛋白调控植物光合变化从而适应环境的改变。
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图 1 麦秸秆、高粱秸秆和苜蓿草在LAT预处理前后的热重和微分热重曲线
Figure 1 TG and DTG curves of wheat straw, sorghum straw and alfalfa before and after LAT
图 3 LAT预处理前后3种原料的表观形貌
Figure 3 Micrograph of samples before and after LAT pretreatment
图 5 LAT预处理温度对麦秸秆中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 5 Effect of temperatureof LAT on the glucan and xylan conversion of wheat straw
图 6 LAT预处理温度对苜蓿草中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 6 Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of alfalfa
图 7 LAT预处理温度对高粱秸秆中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 7 Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of sorghum straw
图 8 LAT预处理温度对混合物中葡聚糖/木聚糖酶解转化率的影响
Figure 8 Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of mixture
表 1 LAT预处理前后原料的化学组分分析
Table 1. Content of chemical components in biomass before and after LAT
样品 葡聚糖/% 木聚糖/% 阿拉伯聚糖/% Klason木质素/% 灰分/% 固体得率/% 未处理的麦秸秆 35.54 19.06 3.19 18.92 13.83 100 LAT预处理的麦秸秆 32.86 17.99 3.19 15.34 11.59 99.84 未处理的苜蓿草 27.38 12.88 3.02 21.38 5.90 100 LAT预处理的苜蓿草 25.81 11.53 3.01 20.09 5.04 99.77 未处理的高粱秸秆 37.90 17.63 3.35 13.53 3.67 100 LAT预处理的高粱秸秆 33.72 14.69 3.28 10.35 2.71 98.99 未处理的混合物 33.58 17.23 3.44 16.70 7.89 100 LAT预处理的混合物 30.32 16.81 3.43 13.61 7.22 99.46 
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表 2 LAT预处理前后原料的元素分析
Table 2. Ultimate analysis of biomass before and after LAT
样品 碳/% 氢/% 氧/% 氮/% 硫/% 高位热值/(MJ·kg−1) 未处理的麦秸秆 39.06 6.63 53.16 0.79 0.36 20.33 LAT预处理的麦秸秆 39.07 6.49 52.69 1.49 0.27 20.14 未处理的苜蓿草 43.79 7.22 47.47 1.36 0.16 22.24 LAT预处理的苜蓿草 43.87 6.90 46.83 3.10 0.29 21.29 未处理的高粱秸秆 43.53 7.09 48.21 1.01 0.17 22.29 LAT预处理的高粱秸秆 43.57 6.91 46.61 2.74 0.17 21.52 未处理的混合物 42.46 6.93 49.36 1.03 0.22 21.25 LAT预预处理的混合物 41.60 6.58 49.23 2.40 0.19 20.51
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190575
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