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白及Bletilla striata为兰科Orchidaceae白及属Bletilla多年生草本植物，主产于安徽、浙江、江西、贵州等地[1]，以干燥块茎入药，又名甘根、白给、白芨等[2]。具有收敛止血，消肿生肌的功效，对于咯血、吐血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等有效[3]。因白及以其干燥块茎入药，故国内外对白及花的研究较少。白及花期为每年4−5月，花序具花3~10朵，花色为紫红色、粉红色[4]，具有较高的观赏价值，还富含多种花青素等活性成分，其水提物具有较好的抗氧化能力，可作为饮品进行开发利用[5]。花青素(anthocyanidins)为水溶性天然色素，属于多酚化合物中的类黄酮化合物，是由花色苷水解得到的有颜色的苷元[6−7]，但在自然界中很少以游离的苷元而多以糖苷的形式存在[8]。花青素不仅是植物中的主要呈色物质，还具有抗氧化[9]、降血脂[10]、抗癌[11]、抑制神经炎症、改善血管功能[12]、平衡肠道微生物群落[13]、减缓与肝功能及结构有关的衰老恶化[14]与改善轻度至中度痴呆老年人的特定认知结果[15]等功效。花青素稳定性差，在提取纯化过程中易发生降解[16]。微波法对天然色素的提取具有色素产率高、色价高、节省溶剂、节省时间等优点[17]。pH示差法和高效液相色谱法(HPLC)是定量测定花青素的常用方法，两者具有很高的相关性[18]，其中pH示差法被农业化学家协会(AOAC)正式作为研究实验室和食品工业中各种水果和蔬菜总花青素的基本测量方法[19−20]。本研究采用微波法进行响应面优化白及花花青素提取，并采用pH示差法测定白及总花青素，以期为白及花中花青素的综合开发提供理论依据。
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白及花采于浙江省湖州市安吉县上墅乡白及基地。采摘盛花期的白及花，去除花茎部分后，于烘箱50 ℃烘干至恒量(±0.005 g)，打粉后过24目筛。于−20 ℃避光储存，备用。氯化钾(西陇化工股份有限公司)、无水乙酸钠(西陇化工股份有限公司)、盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司)、无水甲醇(浙江汉诺化工科技有限公司)均为分析纯。pH计FE20[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]，AK-1000A 500克摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)，DHG-9031A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，FA2204电子分析天平(上海力辰仪器科技有限公司)，NJL07-3型实验微波炉(南京杰全微波设备有限公司)，RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，TDL-50C低速离心机(上海安亭科学仪器厂)，Epoch2酶标仪(美国BioTek仪器有限公司)。
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取白及花粉末加入甲醇溶液(以体积分数为1%盐酸作溶剂)进行微波萃取，离心取上清液，残渣进行再次提取，合并2次上清液于35 ℃旋蒸1 h后用提取剂定容至10 mL，−20 ℃避光保存直至测定。
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因深色花色苷在可见光区的吸收波长范围为465~560 nm[7]，所以取花青素提取液0.2与0.6 mL的pH 1.0缓冲液混匀，于450~600 nm波长范围内以步长5 nm进行扫描，以确定最大吸收波长。
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分别取花青素提取液0.2与0.6 mL的pH 1.0缓冲液或pH 4.5缓冲液混匀，室温下避光反应0~120 min，每隔10 min测定D(530)、D(700)，以确定最佳平衡时间。
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精确称取样品，在料液比为1∶40(料单位为g，溶液单位为mL)、体积分数为80%的甲醇溶液(以体积分数为1%盐酸稀释)、微波功率400 W的条件下提取10 min，冷却至室温后4 000 r·min−1离心15 min，取上清液于35 ℃旋蒸，用提取剂定容至10 mL，为第1次提取液。将残渣重复上述操作，为第2次提取液。共进行4次提取，按2.4分别进行总花青素质量浓度测定，以确定最佳提取次数。
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参考李文峰等[21]总花青素质量浓度测定方法并略作调整。取0.2 mL花青素提取液，分别与0.6 mL的pH 1.0氯化钾缓冲液、pH 4.5醋酸钠缓冲液混匀。室温下避光静置80 min后测定D(530)、D(700)。3次重复，取平均值。总花青素(TAC)质量分数以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的含量为标准进行计算，计算公式[22]为：TAC= {[D(530)pH1.0− D(700)pH1.0]−[D(530)pH4.5−D(700)pH4.5]}MWDF/(εL)。其中，TAC青素质量浓度(g·L−1)，D为各pH值下不同波长对应的吸光度，MW为C3G的分子量(449.2)，DF为稀释倍数，ε为C3G的克分子吸光率常数(26 900)，L为比色皿光程(1 cm时，L=1)。再将总花青素质量浓度换算成质量分数进行对比分析。
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以微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比为单因素，分别进行参数范围的确定，考察不同因素对总花青素提取量的影响。精确称取样品，在甲醇体积分数为80%、料液比(溶质单位为g，溶剂单位mL)1∶40、提取20 min的条件下，进行微波功率(160、240、320、400、480、560、640 W，误差为±5 W)的范围确定；在微波功率560 W、料液比1∶40、提取20 min的条件下，确定甲醇体积分数(20%、40%、60%、80%、100%)的区间范围；在微波功率560 W、甲醇体积分数80%、料液比1∶40的条件下，考察微波时间(2、5、10、20、30 min)的影响；在微波功率560 W、提取20 min、体积分数为80%甲醇的条件下，进行料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的范围确定。按2.4分别进行总花青素提取量的计算。
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为获得白及花中花青素的最佳提取工艺条件，在单因素结果的基础上，以总花青素提取量为响应值，选取微波功率(A)、甲醇体积分数(B)、微波时间(C)和料液比(D)为自变量，应用Design-Expert.V8.0.6.1软件，按照Box-Behnken中心组合设计原理，设计4因素3水平的响应面实验。设计因素与水平如表1所示。
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1. Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design
水平 微波功率
A/W甲醇体积
分数B/%微波时间
C/min料液比
D−1 480 70 10 1∶30 0 560 80 20 1∶40 1 640 90 30 1∶50 -
由图1所示：溶液吸光度在450~530 nm区间逐渐升高，在530 nm处达最大值(0.37)，当波长继续增加溶液吸光度逐渐下降。因此白及花中花青素在可见光谱范围内的最大吸收波长为530 nm。
图 1 白及花中花青素的可见光图谱
Figure 1. Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers
由图2所示： D(530)随着时间的延长而降低，50 min后吸光度变化平稳，并在80~100 min范围内最为平稳；在pH 4.5缓冲液中，随着时间的增加，D(530)逐渐降低，在80~90 min时，吸光度相对处于稳定状态。因此，80 min为花青素在缓冲液中的平衡时间。
图 2 白及花中花青素在缓冲液中随时间的吸光度变化
Figure 2. Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution
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由图3所示：白及花中花青素随提取次数增加而降低。第1次提取所得总花青素的提取量最大，第2次提取的提取量约为第1次的16.90%，第3、4次提取的提取量约为第1次的0.70%、0.17%。因此，为尽可能对样品提取完全，且提高提取效率不造成溶剂浪费，选择对样品进行2次提取。
图 3 白及花中花青素不同提取次数的提取量差异
Figure 3. Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution
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由图4所示：当微波功率为160~560 W时，总花青素的提取量随着微波功率的增大而提高；微波功率为560 W时出现顶点，而后随着功率增大出现了下降趋势。这是因为在一定范围内，随着微波功率的增大对细胞的破坏力也逐步增强，花青素溶出物增多；但功率过高使得温度升高，对花青素造成了一定程度的破坏，使得提取量降低。因此依据结果选择微波功率480、560和640 W进行响应面实验。
图 4 微波功率对总花青素提取量的影响
Figure 4. Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图5所示：当甲醇体积分数为20%~60%时，总花青素的提取量没有明显变化；当甲醇体积分数为60%~80%时，提取量随着甲醇体积分数的增加而提高，在80%处达到最大值，随后逐渐下降。说明在一定范围内，提高甲醇体积分数有利于花青素的提取。因此依据实验结果选择甲醇体积分数为70%、80%和90%进行响应面实验。
图 5 甲醇体积分数对总花青素提取量的影响
Figure 5. Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图6所示：在微波时间为2~20 min时，总花青素的提取量随微波时间的延长而提高，在20 min时达到最大值；继续加长提取时间，提取量则下降。这是由于在一定的微波功率下，微波时间越长，对细胞的破坏越彻底，花青素溶出物越多；但微波时间过长会使高温对花青素破坏速度大于花青素浸出速度，花青素总提取量降低。因此依据结果选择微波时间为10、20和30 min进行响应面实验。
图 6 微波时间对总花青素提取量的影响
Figure 6. Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图7所示：在料液比为1∶10 ~ 1∶40时，总花青素的提取量随着溶剂量的加大逐渐提高；当料液比为1∶40时，提取量达到最大，而后缓慢下降。这是因为增加溶剂量有利于花青素的溶出，但溶剂增加比溶质增加倍数过大会稀释提取液并浪费资源，故提取量下降。依据研究结果选择料液比1∶30、1∶40和1∶50进行响应面实验。
图 7 料液比对总花青素提取量的影响
Figure 7. Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins
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在单因素实验结果的基础上，设计4因素3水平的响应面实验，以总花青素提取量(Y)为响应值，微波功率(A)、甲醇体积分数(B)、微波时间(C)和料液比(D)为自变量，共进行29次实验，其中5次为验证实验。将结果运用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行多元回归拟合，得到回归方程模型：Y=−10.774 63− 0.017 17A+0.153 27B+0.382 88C+0.175 19D+0.000 78AB+0.000 19AC+0.000 78AD−0.002 40BC+0.001 45BD+0.000 23CD−0.000 06A2−0.003 45B2−0.006 70C2−0.008 43D2。
从表2可知：模型项为极显著，其中单项因素A、B、C、D与交叉项AB、AD及二次项C2、D2对总花青素提取量的影响达到极显著水平(P＜0.01)，二次项A2、B2达到显著水平(P＜0.05)，其余项因素不显著(P＞0.05)。该模型失拟项不显著，表明该模型建模成功。其中决定系数R2为0.95，校正系数R2Adj为0.90，表明建立的模型与实际情况拟合度较好，可用来进行分析与预测。由表2中F值可知：4个自变量在本研究实验范围内对提取量影响从大到小依次为A(微波功率)、D(料液比)、B(甲醇体积分数)、C(微波时间)。
表 2 回归模型方差分析
Table 2. Analysis of variance (ANOVA) of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 样本 30.65 14 2.19 19.85 ＜0.000 1 *** A 11.98 1 11.98 108.61 ＜0.000 1 *** B 2.89 1 2.89 26.18 0.000 2 *** C 1.52 1 1.52 13.83 0.002 3 ** D 4.16 1 4.16 37.70 ＜0.000 1 *** AB 1.56 1 1.56 14.16 0.002 1 ** AC 0.09 1 0.09 0.80 0.387 2 AD 1.57 1 1.57 14.19 0.002 1 ** BC 0.23 1 0.23 2.09 0.170 3 BD 0.08 1 0.08 0.76 0.398 2 CD 0.00 1 0.00 0.02 0.892 0 A2 0.97 1 0.97 8.83 0.010 1 * B2 0.77 1 0.77 6.99 0.019 3 * C2 2.91 1 2.91 26.42 0.000 2 *** D2 4.61 1 4.61 41.81 ＜0.000 1 *** 残差 1.54 14 0.11 失拟项 1.19 10 0.12 1.35 0.413 3 纯误差 0.35 4 0.09 总离差 32.19 28 R2=0.95 R2Adj=0.90 说明：*表示显著(P＜0.05)，**表示极显著(P＜0.01)，***表示极显著(P＜0.001) -
由图8可知：微波功率对提取量的影响最为显著。微波功率与甲醇体积分数和料液比，两两之间交互作用较强，表现为响应面坡度较陡。随着微波功率的增大，花青素的提取量逐渐增加。其余因素间，交互作用相对较弱，即响应面坡度较缓。根据所建立的响应面拟合方程进行参数最优分析，所得预测最佳工艺条件为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22.14 min，料液比1∶48.10，在此条件下总花青素提取量为6.83 mg·g−1。结合模型预测最佳条件和实际情况，采用优化条件：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min，料液比1∶48。进行3组平行验证试验，其平均提取量为(6.68 ±0.13) mg·g−1，与理论预测值6.83 mg·g−1基本一致，表明模型与实际拟合情况较好。因此响应面法对白及花中花青素提取工艺的优化具有可行性。
图 8 各因素交互作用对总花青素提取量影响的响应面图
Figure 8. Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction
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本研究采用微波萃取法进行白及花中花青素的提取。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法进行提取条件的优化，并建立了微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比对总花青素提取量的二次回归方程模型。得到最佳的提取工艺条件为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22.14 min，料液比1∶48.10。结合实际情况调整参数为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min，料液比1∶48。在此条件下，白及花中总花青素的提取量为(6.68±0.13) mg·g−1，与预测值6.83 mg·g−1基本吻合。
Optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Bletilla striata flowers
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摘要:
目的 采用响应面法对白及Bletilla striata花中花青素的提取方法进行优化。 方法 采用微波萃取和pH示差法提取和测定白及花中花青素，在通过单因素法获得微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比4个单因素最佳参数的基础上，利用响应面分析法建立二次回归方程，优化花青素最佳提取参数。 结果 所得优化模型条件与实际提取拟合度良好。pH示差法调整为：测定波长530 nm，溶液平衡时间80 min。本研究范围内，4个因素对提取量影响从大到小顺序为微波功率、料液比、甲醇体积分数、微波时间。在微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min和料(g)液(mL)比1∶48的条件下，白及花中总花青素提取量为6.68 mg·g−1，与理论预测值6.83 mg·g−1基本一致。 结论 优化所得方法可用作白及花中花青素的提取制备，为日后白及花的综合开发利用提供依据。图8表2参22 Abstract:Objective This study is aimed at the optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Bletilla striata flowers. Method With anthocyanins in B. striata flowers determined and extracted via microwave-assisted extraction and pH Differential Method and the optimum parameters of the four single factors of microwave power, methanol concentration, extraction time and solid-liquid ratio obtained, the study has managed to obtain the optimal extraction parameters of anthocyanins with the quadratic regression equation model established using the Response Surface Methodology (RSM). Result (1) The conditions of the optimal model fit well with actual extraction; (2) The pH differential method was adjusted to a measured wavelength of 530 nm and a solution equilibration time of 80 min; (3) The impact of the four factors of microwave power, material to liquid ratio, methanol concentration and microwave time on the amount of extraction decrease in a progressive order; (4) With the microwave power at 640 W, the methanol concentration as 90%, the microwave time set for 22 min, and the ratio of material (g) to liquid (mL) adjusted as 1∶48, the total anthocyanin extraction in B. striata flower was 6.68 mg·g−1, which was basically consistent with the theoretical prediction value of 6.83 mg·g−1. Conclusion The optimized method can be employed for the extraction and preparation of anthocyanins in B. striata flowers, providing a basis for the comprehensive development and utilization of B. striata flowers. [Ch, 8 fig. 2 tab. 22 ref.] -
森林群落内包含着复杂的种间关系，如竞争、寄生、互利共生等[1]。生态位在研究群落物种组成、生物多样性和物种共存等方面有着重要作用[2]，它是植物群落中各种群所能利用各种资源的总和及其与相关种群之间的功能关系，体现了种群在群落中的地位、作用和重要性[3]，以生态位宽度和生态位重叠指数表征分别体现物种在群落中的地位和种间的联系[4]。种间联结是指不同物种在空间分布上的相互关联性，对生物多样性保护和自然植被的恢复具有一定的指导作用，对揭示群落内的种间关系、演替动态有着重要的理论意义和参考价值[5]。种间关系可分为正联结、无联结和负联结等3种。方庆等[6]认为可以保护与细果秤锤树Sinojackia microcarpa正联结性较高的物种，以期达到保护该濒危物种的目的；丁茂等[7]对落叶阔叶林进行动态监测后发现，种对间正关联数量有所增加，植被群落趋向于稳定的正演替方向发展，说明物种间的正联结性的增加能够提高森林群落的稳定性和物种多样性；杨春玉等[8]发现退化的喀斯特森林从乔灌阶段恢复到乔林阶段，物种种间正联结对数持续增加，直至形成顶级群落，解释了森林群落最终是朝着物种间互利共生和结构稳定的方向发展。但这些研究主要集中于低海拔区域，对于中高海拔地区亚热带森林群落的研究则较少。
浙江巾子峰国家森林公园拥有原生亚热带常绿阔叶林，平均海拔800 m以上，人为活动较少，使得该区域保存有较为丰富且处于不同演替阶段的植被群落，开展该区域森林群落生态位和种间联结的研究，对于中高海拔地区常绿阔叶林的生物多样性保护具有积极意义[9]。对于研究区周边植物群落的研究主要集中在常绿阔叶林种群结构与分布格局[10]、物种组成与群落结构[11]、甜槠Castanopsis eyrei种群特征[12]等，而该地区常绿阔叶林的生态位和种间联结性的研究还未见报道。因此，本研究选取浙江巾子峰国家森林公园境内百丈林区常绿阔叶林作为研究对象，在野外调查的基础上，采用Levins生态位宽度(BL)、Shannon生态位宽度(BS)、Pianka生态位重叠指数(Oik)、Schoener系数(Cik)、方差比率(VR)、卡方($ {\chi}^{2} $)检验、Pearson相关系数和Spearman秩相关系数等方法，研究常绿阔叶林群落的木本植物组成以及优势种的生态位和种间联结性的关系，旨在为亚热带常绿阔叶林生物多样性和植被的保护与恢复提供参考。
1. 研究区概况与研究方法
1.1 研究区概况
浙江巾子峰国家森林公园位于浙江省庆元县(27°27′~27°39′N，118°50′~119°06′E)，属武夷山系洞宫山脉，总面积为5 752 hm2[13]。年均气温为17.2 ℃，最热月平均气温为26.9 ℃，最冷月平均气温为7.0 ℃，年均降水量为1 689.0 mm，相对湿度为75.8%，年均无霜期为256 d，主要植被类型包括常绿阔叶林、常绿-落叶阔叶混交林、针阔混交林、针叶林、毛竹Phyllostachys edulis林等。样地所在地土壤为黄壤。
1.2 研究方法
参照美国热带森林研究中心(CTFS)的方法[14]，在浙江巾子峰国家森林公园境内的百丈林区(27°38′N，118°91′E)建立了1个1.4 hm2 (140 m×100 m)和6个0.4 hm2 (20 m×20 m)的常绿阔叶林长期监测样地。对样地内所有胸径(DBH)≥1 cm的木本植物进行每木检尺，并记录种名、胸径、树高、枝下高、空间坐标及生活状态等，样地基本情况如表1。
表 1 研究区常绿阔叶林群落样地基本情况Table 1 Basic situation of survey sites for broadleaf evergreen forest community survey in the study area样地号 类型 海拔/m 群落类型 样地面积/m2 坡位 密度/(株·hm−2) 平均胸径/cm 郁闭度 1 天然林 1 163 常绿阔叶林 14 000 上 3 698 7.20 75.8 2 天然林 1 163 常绿阔叶林 400 上 2 750 9.87 93.9 3 天然林 1 146 常绿阔叶林 400 中 4 775 8.39 94.5 4 天然林 1 136 常绿阔叶林 400 中 2 100 12.15 90.7 5 天然林 1 151 常绿阔叶林 400 中 4 150 6.25 88.2 6 天然林 1 121 常绿阔叶林 400 中 1 525 16.86 93.4 7 天然林 1 176 常绿阔叶林 400 上 2 300 11.82 94.0 1.3 数据处理
1.3.1 重要值计算
依据马克平等[15]的方法计算物种重要值确定优势种。
1.3.2 生态位宽度和生态位重叠值
依据王刚等[16]的方法计算木本植物优势种的Levins生态位宽度指数(BL)和Shannon生态位宽度指数(BS)。依据郭平平等[17]的方法计算Pianka生态位重叠指数(Oik)；依据SCHOENER[18]的方法计算Schoener系数(Cik)。
1.3.3 总体联结性和种间联结性计算
计算方法参照SCHLUTER[19]提出的方差比率法(VR)和检验统计量(W)。参照江常春等[20]的方法，卡方($ {\chi}^{2}) $检验采用YATES连续矫正公式；参照吕增伟等[21]的方法计算Spearman秩相关系数和Pearson相关系数。
1.4 数据分析
重要值、生态位和种间联结性采用R 4.3.1软件(“spaa”“corrplot”“ggplot”“psych”“vegan”“tidyverse”工具包)[22]和WPS 2021进行数据计算以及绘图。
2. 结果与分析
2.1 群落物种组成和木本植物优势种分析
调查样地中木本植物共有113种，隶属于31科62属。由表2可知：在该常绿阔叶林群落木本植物中，筛选出重要值$\geqslant $1%的优势种，共21种，重要值总和为80.32%。在木本植物优势种重要值大小排序中，木荷Schima superba的重要值最大，为14.30%，其次为甜槠和黄山松Pinus taiwanensis，分别为12.85%和12.23%。薄叶山矾Symplocos anomala和华中樱Cerasus conradinae的重要值最小，都为1.02%。这21个优势种的BL和BS平均值分别为17.38和3.03。木荷、甜槠、黄山松、锥栗Castanea henryi和野漆树Toxicodendron succedaneum的生态位宽度相对较大，且BL和BS分别大于20.00和3.30。
表 2 优势植物重要值与生态位宽度Table 2 Important value and niche breadth of dominant plant species编号 种名 个体数 分布频度 重要值/% Levins生态位宽度(BL) Shannon生态位宽度(BS) sp1 木荷 Schima superba 984 41 14.30 25.91 3.42 sp2 甜槠 Castanopsis eyrei 682 41 12.85 28.20 3.49 sp3 黄山松 Pinus taiwanensis 245 40 12.23 29.67 3.52 sp4 锥栗 Castanea henryi 261 38 6.02 21.39 3.30 sp5 马银花 Rhododendron ovatum 665 38 5.47 19.43 3.23 sp6 麂角杜鹃 Rhododendron latoucheae 500 35 4.30 18.47 3.19 sp7 大萼黄瑞木Adinandra glischroloma var. macrosepala 284 33 2.83 4.85 2.44 sp8 江南山柳 Clethra delavayi 189 35 2.45 17.07 3.17 sp9 野漆树 Toxicodendron succedaneum 112 33 2.21 24.31 3.32 sp10 浙江新木姜子 Neolitsea chekiangensis 157 28 1.91 11.83 2.79 sp11 微毛柃 Eurya hebeclados 152 27 1.87 12.21 2.89 sp12 短柄枹栎 Quercus glandulifera 115 27 1.86 19.59 3.11 sp13 江南越橘 Vaccinium mandarinorum 135 29 1.75 16.06 3.04 sp14 小叶青冈 Cyclobalanopsis gracilis 90 23 1.62 10.83 2.69 sp15 黄背越橘 Vaccinium iteophyllum 100 27 1.53 19.38 3.11 sp16 树参 Dendropanax dentiger 97 23 1.48 10.04 2.64 sp17 云山青冈 Cyclobalanopsis sessilifolia 72 22 1.37 14.64 2.84 sp18 红楠 Machilus thunbergii 50 22 1.15 13.30 2.82 sp19 吴茱萸五加 Gamblea ciliata var. evodiifolia 47 22 1.09 17.96 2.98 sp20 薄叶山矾 Symplocos anomala 43 20 1.02 14.11 2.81 sp21 华中樱 Cerasus conradinae 38 21 1.02 15.70 2.89 2.2 优势物种的生态位重叠值与生态位相似性系数
如图1A所示：浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林木本植物优势种共有210个种对，Oik为0.09~0.84。Oik≥0.5的共有89个种对，占总对数的42.4%，说明这些种对在资源不足时，可能会发生激烈的竞争。Oik＜0.5的共有121对，占总对数的57.6%。
如图1B所示：群落中木本植物优势种的Cik为0.17~0.74。Cik≥0.5的种对共50对，占总对数的23.8%，这些种对的生态习性较为相似。Cik＜0.5的种对共160对，占总对数的76.2%。
2.3 优势物种的总体联结性
对木本植物优势种总体关联性分析可知(表3)，方差比率(VR)= 2.84＞1，表明该常绿阔叶林木本植物优势种之间总体联结呈现正联结。卡方临界值χ2(0.95, 41)= 27.33，χ2(0.05, 41)= 56.94，检验统计量(W)= 116.73，不在临界值之间，表明木本植物优势种之间联结显著(P＜0.05)。该群落木本植物优势种种间总体呈现显著正联结(P＜0.05)，该群落处于稳定阶段。
表 3 优势植物总体关联性Table 3 Overall associations of dominant plant species方差比率(VR) 检验统计量(W) 卡方临界值(0.95, 41) 卡方临界值(0.05, 41) 检验结果 2.84 116.73 27.33 56.94 显著正联结 2.4 木本植物优势种种间相关性分析
通过卡方检验观察到的频数与期望频数之间的差异，结果如表4和表5所示。在21个木本植物优势树种组成的210个种对中，39个种对间无关联，占总对数的18.57%；112个种对间呈不显著正联结(P＞0.05)，占总对数的53.33%；49个种对间呈不显著负联结(P＞0.05)，占总对数的23.33%；2个种对间呈极显著正联结(P＜0.01)；8个种对间呈显著正联结(P＜0.05)。
表 4 主要优势树种χ2统计量检验Table 4 χ2 correlation test of dominant population of dominant tree species编号 sp1 sp2 sp3 sp4 sp5 sp6 sp7 sp8 sp9 sp10 sp11 sp12 sp13 sp14 sp15 sp16 sp17 sp18 sp19 sp20 sp2 0.00 sp3 0.00 0.00 sp4 0.00 0.00 2.75 sp5 0.00 0.00 2.75 0.42 sp6 0.00 0.00 1.03 3.24 3.24 sp7 0.00 0.00 0.61 0.02 1.92 2.20 sp8 0.00 0.00 1.03 0.01 0.01 4.11 0.13 sp9 0.00 0.00 0.61 0.02 0.02 6.75 0.87 2.20 sp10 0.00 0.00 0.16 0.34 0.34 0.15 0.00 2.30 0.67 sp11 0.00 0.00 0.11 0.36 0.36 1.83 2.16 1.83 0.04 0.00 sp12 0.00 0.00 0.11 3.48 0.36 10.34 5.29 1.83 5.29 0.00 1.43 sp13 0.00 0.00 0.21 0.67 4.57 0.52 3.50 0.06 0.02 0.26 0.19 3.02 sp14 0.00 0.00 0.02 0.05 0.05 0.59 0.00 0.59 0.00 0.02 0.81 0.06 1.50 sp15 0.00 0.00 0.11 0.36 3.48 1.83 2.16 1.83 0.41 2.13 1.43 3.57 6.07 0.06 sp16 0.00 0.00 0.02 0.97 0.05 0.01 0.00 0.01 0.62 0.02 0.06 0.81 0.73 0.79 0.06 sp17 0.00 0.00 0.01 0.02 1.15 1.29 0.03 0.06 0.03 0.10 0.00 0.43 1.78 1.35 0.00 0.53 sp18 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.41 0.39 0.06 0.39 0.10 0.00 3.96 1.78 0.28 1.77 0.53 0.04 sp19 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.41 2.01 0.06 2.01 0.10 1.77 3.96 0.42 0.01 3.96 1.86 2.10 0.19 sp20 0.00 0.00 0.00 0.00 1.34 1.59 0.10 0.14 0.22 0.01 0.77 0.05 0.86 0.03 0.05 1.17 0.02 0.02 0.02 sp21 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.26 0.22 0.26 0.22 0.61 0.20 0.05 1.28 0.21 0.05 0.21 0.60 0.02 0.02 0.03 说明：sp1. 木荷；sp2. 甜槠；sp3. 黄山松；sp4. 锥栗；sp5. 马银花；sp6. 麂角杜鹃；sp7. 大萼黄瑞木；sp8. 江南山柳；sp9. 野漆树；sp10. 浙江新木姜子；sp11. 微毛柃；sp12. 短柄枹栎；sp13. 江南越橘；sp14. 小叶青冈；sp15. 黄背越橘；sp16. 树参；sp17. 云山青冈；sp18. 红楠；sp19. 吴茱萸五加；sp20. 薄叶山矾；sp21. 华中樱。 表 5 主要优势树种的Spearman秩相关系数、Pearson相关系数检验结果比较Table 5 Comparison of the results of Spearman rank correlation and Pearson rank correlation test of dominant tree species检验方法 正联结(相关)/对 负联结(相关)/对 无联结/对 极显著 显著 不显著 总数 极显著 显著 不显著 总数 总数 χ2检验 2 8 112 122 0 0 49 49 39 Spearman秩相关系数 21 14 108 142 1 4 63 68 0 Pearson相关系数 25 14 89 128 1 2 79 82 0 说明：极显著P＜0.01；显著P＜0.05；不显著P＞0.05。 Spearman检验结果如图2A和表5所示。呈正联结的种对有142对，占总种对数的67.6%。其中，呈极显著正联结(P＜0.01)的种对有21对，显著正联结(P＜0.05)的种对有14对。呈负联结的种对有68对，占总种对数的32.4%。其中，呈现显著负联结(P＜0.01)的种对有1对，显著负联结(P＜0.05)的种对有4对。极显著和显著正、负联结比值为7∶1。Spearman秩相关系数分析仍保持与卡方检验相一致的结果。
Pearson检验结果如图2B和表5所示。在210个种对中，呈正联结的有128对，占总对数的60.96%；呈负联结的有82对，占总对数的39.04%。在正联结的128个种对中，呈极显著正联结(P＜0.01)的有25对，显著正联结(P＜0.05)的有14对；在负联结的82个种对中，呈极显著负联结(P＜0.01)的有1对，显著负联结(P＜0.05)的有2对。极显著和显著正、负联结比值为13∶1。Pearson相关系数分析发现，不显著联结(P＞0.05)的种对数仍保持较大一部分，这符合卡方检验结果。
2.5 木本植物优势种种间联结与生态位重叠的回归分析
木本植物优势种的Pearson相关系数与生态位重叠指数的回归分析如图3所示，木本植物优势种种间联结与生态位重叠呈极显著正相关(P＜0.01)。
图 3 主要优势树种Pearson与生态位重叠值的回归分析Figure 3 Regression analysis of Pearson rank correlation with niche overlap of dominant tree species3. 讨论
3.1 木本植物优势种的生态位特征和种间联结分析
在浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林中，木荷、甜槠和黄山松的重要值、生态位宽度较大。在一个群落中，某一物种的重要值与生态位宽度呈正相关，即重要值越大，其生态位宽度也越大[23]，但叶兴状等[24]研究发现，福建天台山半枫荷Semiliquidambar cathayensis群落中重要值排第2位的半枫荷，其生态位宽度却排第4位。本研究中，黄山松的生态位宽度最大，其次是甜槠和木荷；木荷虽然在该群落中的重要值最大，但其生态位宽度略低于黄山松和甜槠。大萼黄瑞木Adinandra glischroloma var. macrosepala的重要值虽然排在第7位，但其生态位宽度最小，结合实际野外调查，大萼黄瑞木高度聚集分布在同一个样方中，其重要值大小和生态位宽度在一定程度上受到分布频度的影响，这与刘雨婷等[25]的研究结果相似，表明它对该群落环境的适应性和资源的利用能力不全面，竞争性较弱，有可能发展为特化种。
生态位重叠指数和生态位相似比系数可以反映物种对资源的利用程度和环境的适应性[26]。物种的生态位宽度越大，则生态位重叠指数越大，对有共同需求的资源竞争压力也越大[27]。本研究发现，生态位宽度最大的黄山松与甜槠、锥栗、马银花Rhododendron ovatum、麂角杜鹃Rhododendron latoucheae、江南山柳Clethra delavayi、野漆树、短柄枹栎Quercus serrata、江南越橘Vaccinium mandarinorum、黄背越橘Vaccinium iteophyllum和薄叶山矾的生态位重叠指数和生态位相似比系数均超过0.50。吴友贵等[28]发现生态位宽度最大的多脉青冈Cyclobalanopsis multinervis、麂角杜鹃和窄基红褐柃Eurya rubiginosa之间的生态位相似比系数都大于0.7。本研究表明：生态位宽度较小的微毛柃Eurya hebeclados-大萼黄瑞木的生态位重叠值和生态位相似比系数均较大，其值分别为0.82 和0.52，与栾兆平等[29]研究结果相似，即生态位宽度较小的物种，其生态位重叠指数超过了0.90。
种间联结是物种在空间上的不同关系，是物种对环境的适应性和对资源利用相似性的体现[30]。浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林木本植物优势种总体呈显著正联结。结合卡方检验、Spearman秩相关系数和Pearson相关系数可以较好地判断群落中木本植物优势种种对间的联结性，发现呈正联结的种对数大于负联结的种对数，极显著或显著正联结的种对数也大于极显著或显著负联结的种对数，表明该群落属于演替中期，种间的竞争和协作逐渐平衡。可能与该样地海拔较高，人为活动较少有关[26]。张滋芳等[31]认为物种间有相似环境适应性和资源需求，往往会产生正向联系。本研究马银花与麂角杜鹃、黄背越橘，江南越橘与黄背越橘、麂角杜鹃均呈极显著正联结，因为4种植物均为杜鹃花科灌木，有着相似的生态习性；短柄枹栎与锥栗、吴茱萸五加Gamblea ciliataevodiifolia的生态位宽度在木本植物优势种中占据较高位置，也呈极显著正联结，这与张盟等[4]发现有着紧密正联结的物种往往占据较高生态位宽度相似。而红楠Machilus thunbergii-甜槠呈极显著负联结，可能是甜槠多为大径个体，红楠以小径个体为主，高大繁茂的甜槠限制了树高较小的红楠生长。短柄枹栎-木荷呈显著负联结，因为木荷为常绿树种，短柄枹栎为落叶树种，2个物种对光照、水分等需求不同，这与罗敏贤等[32]认为常绿树种和落叶树种生长所需光性不同，会导致物种间呈显著负联结相一致。
植物之间生态位重叠值与种间联结若呈正联结，表明其存在不同程度的生态位重叠，反之亦然[33]。在本研究发现，浙江巾子峰国家森林公园主要优势树种的Pearson相关系数与生态位重叠的回归分析呈极显著正相关，如马银花-麂角杜鹃种对间呈极显著正联结，种对间的Pianka重叠值为0.84，其Pearson相关系数为0.69，呈正向关系，这与郑俊鸣等[34]认为物种种间正联结越强，其生态位重叠指数也越大的研究结果相似。
3.2 自然植被恢复和生物多样性保护建议
浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林属于比较稳定的生态系统，可以选择具有较宽的生态位和适应性较强的树种，如木荷、甜槠、锥栗、马尾松、马银花、麂角杜鹃和短柄枹栎等作为自然植被恢复的优先树种；而对于小叶青冈Cyclobalanopsis gracilis、大萼黄瑞木、薄叶山矾、云山青冈Cyclobalanopsis sessilifolia和红楠等树种，其生态位重叠值和生态位相似系数较低，生态位宽度也较低，应在自然植被恢复和生物多样性保护中进行一定调控。
4. 结论
巾子峰国家森林公园常绿阔叶林群落物种多样性较丰富，部分物种对资源的需求有一定的相似性；物种总体呈显著正联结，种间关系较松散，各种对间的关联较弱，该群落逐渐趋于平衡阶段，各物种之间竞争较小。因此，在该地区可以选择有相似的生境需求和较宽生态位的优势乡土树种，调控生态位较小的树种，以期实现该地区群落正向演替。
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图 1 白及花中花青素的可见光图谱
Figure 1 Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers
图 2 白及花中花青素在缓冲液中随时间的吸光度变化
Figure 2 Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution
图 3 白及花中花青素不同提取次数的提取量差异
Figure 3 Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution
图 4 微波功率对总花青素提取量的影响
Figure 4 Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins
图 5 甲醇体积分数对总花青素提取量的影响
Figure 5 Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins
图 6 微波时间对总花青素提取量的影响
Figure 6 Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins
图 7 料液比对总花青素提取量的影响
Figure 7 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins
图 8 各因素交互作用对总花青素提取量影响的响应面图
Figure 8 Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1. Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design
水平 微波功率
A/W甲醇体积
分数B/%微波时间
C/min料液比
D−1 480 70 10 1∶30 0 560 80 20 1∶40 1 640 90 30 1∶50 
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表 2 回归模型方差分析
Table 2. Analysis of variance (ANOVA) of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 样本 30.65 14 2.19 19.85 ＜0.000 1 *** A 11.98 1 11.98 108.61 ＜0.000 1 *** B 2.89 1 2.89 26.18 0.000 2 *** C 1.52 1 1.52 13.83 0.002 3 ** D 4.16 1 4.16 37.70 ＜0.000 1 *** AB 1.56 1 1.56 14.16 0.002 1 ** AC 0.09 1 0.09 0.80 0.387 2 AD 1.57 1 1.57 14.19 0.002 1 ** BC 0.23 1 0.23 2.09 0.170 3 BD 0.08 1 0.08 0.76 0.398 2 CD 0.00 1 0.00 0.02 0.892 0 A2 0.97 1 0.97 8.83 0.010 1 * B2 0.77 1 0.77 6.99 0.019 3 * C2 2.91 1 2.91 26.42 0.000 2 *** D2 4.61 1 4.61 41.81 ＜0.000 1 *** 残差 1.54 14 0.11 失拟项 1.19 10 0.12 1.35 0.413 3 纯误差 0.35 4 0.09 总离差 32.19 28 R2=0.95 R2Adj=0.90 说明：*表示显著(P＜0.05)，**表示极显著(P＜0.01)，***表示极显著(P＜0.001)
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190581
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