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白及Bletilla striata为兰科Orchidaceae白及属Bletilla多年生草本植物，主产于安徽、浙江、江西、贵州等地[1]，以干燥块茎入药，又名甘根、白给、白芨等[2]。具有收敛止血，消肿生肌的功效，对于咯血、吐血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等有效[3]。因白及以其干燥块茎入药，故国内外对白及花的研究较少。白及花期为每年4−5月，花序具花3~10朵，花色为紫红色、粉红色[4]，具有较高的观赏价值，还富含多种花青素等活性成分，其水提物具有较好的抗氧化能力，可作为饮品进行开发利用[5]。花青素(anthocyanidins)为水溶性天然色素，属于多酚化合物中的类黄酮化合物，是由花色苷水解得到的有颜色的苷元[6−7]，但在自然界中很少以游离的苷元而多以糖苷的形式存在[8]。花青素不仅是植物中的主要呈色物质，还具有抗氧化[9]、降血脂[10]、抗癌[11]、抑制神经炎症、改善血管功能[12]、平衡肠道微生物群落[13]、减缓与肝功能及结构有关的衰老恶化[14]与改善轻度至中度痴呆老年人的特定认知结果[15]等功效。花青素稳定性差，在提取纯化过程中易发生降解[16]。微波法对天然色素的提取具有色素产率高、色价高、节省溶剂、节省时间等优点[17]。pH示差法和高效液相色谱法(HPLC)是定量测定花青素的常用方法，两者具有很高的相关性[18]，其中pH示差法被农业化学家协会(AOAC)正式作为研究实验室和食品工业中各种水果和蔬菜总花青素的基本测量方法[19−20]。本研究采用微波法进行响应面优化白及花花青素提取，并采用pH示差法测定白及总花青素，以期为白及花中花青素的综合开发提供理论依据。
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白及花采于浙江省湖州市安吉县上墅乡白及基地。采摘盛花期的白及花，去除花茎部分后，于烘箱50 ℃烘干至恒量(±0.005 g)，打粉后过24目筛。于−20 ℃避光储存，备用。氯化钾(西陇化工股份有限公司)、无水乙酸钠(西陇化工股份有限公司)、盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司)、无水甲醇(浙江汉诺化工科技有限公司)均为分析纯。pH计FE20[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]，AK-1000A 500克摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)，DHG-9031A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，FA2204电子分析天平(上海力辰仪器科技有限公司)，NJL07-3型实验微波炉(南京杰全微波设备有限公司)，RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，TDL-50C低速离心机(上海安亭科学仪器厂)，Epoch2酶标仪(美国BioTek仪器有限公司)。
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取白及花粉末加入甲醇溶液(以体积分数为1%盐酸作溶剂)进行微波萃取，离心取上清液，残渣进行再次提取，合并2次上清液于35 ℃旋蒸1 h后用提取剂定容至10 mL，−20 ℃避光保存直至测定。
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因深色花色苷在可见光区的吸收波长范围为465~560 nm[7]，所以取花青素提取液0.2与0.6 mL的pH 1.0缓冲液混匀，于450~600 nm波长范围内以步长5 nm进行扫描，以确定最大吸收波长。
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分别取花青素提取液0.2与0.6 mL的pH 1.0缓冲液或pH 4.5缓冲液混匀，室温下避光反应0~120 min，每隔10 min测定D(530)、D(700)，以确定最佳平衡时间。
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精确称取样品，在料液比为1∶40(料单位为g，溶液单位为mL)、体积分数为80%的甲醇溶液(以体积分数为1%盐酸稀释)、微波功率400 W的条件下提取10 min，冷却至室温后4 000 r·min−1离心15 min，取上清液于35 ℃旋蒸，用提取剂定容至10 mL，为第1次提取液。将残渣重复上述操作，为第2次提取液。共进行4次提取，按2.4分别进行总花青素质量浓度测定，以确定最佳提取次数。
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参考李文峰等[21]总花青素质量浓度测定方法并略作调整。取0.2 mL花青素提取液，分别与0.6 mL的pH 1.0氯化钾缓冲液、pH 4.5醋酸钠缓冲液混匀。室温下避光静置80 min后测定D(530)、D(700)。3次重复，取平均值。总花青素(TAC)质量分数以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的含量为标准进行计算，计算公式[22]为：TAC= {[D(530)pH1.0− D(700)pH1.0]−[D(530)pH4.5−D(700)pH4.5]}MWDF/(εL)。其中，TAC青素质量浓度(g·L−1)，D为各pH值下不同波长对应的吸光度，MW为C3G的分子量(449.2)，DF为稀释倍数，ε为C3G的克分子吸光率常数(26 900)，L为比色皿光程(1 cm时，L=1)。再将总花青素质量浓度换算成质量分数进行对比分析。
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以微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比为单因素，分别进行参数范围的确定，考察不同因素对总花青素提取量的影响。精确称取样品，在甲醇体积分数为80%、料液比(溶质单位为g，溶剂单位mL)1∶40、提取20 min的条件下，进行微波功率(160、240、320、400、480、560、640 W，误差为±5 W)的范围确定；在微波功率560 W、料液比1∶40、提取20 min的条件下，确定甲醇体积分数(20%、40%、60%、80%、100%)的区间范围；在微波功率560 W、甲醇体积分数80%、料液比1∶40的条件下，考察微波时间(2、5、10、20、30 min)的影响；在微波功率560 W、提取20 min、体积分数为80%甲醇的条件下，进行料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的范围确定。按2.4分别进行总花青素提取量的计算。
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为获得白及花中花青素的最佳提取工艺条件，在单因素结果的基础上，以总花青素提取量为响应值，选取微波功率(A)、甲醇体积分数(B)、微波时间(C)和料液比(D)为自变量，应用Design-Expert.V8.0.6.1软件，按照Box-Behnken中心组合设计原理，设计4因素3水平的响应面实验。设计因素与水平如表1所示。
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1. Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design
水平 微波功率
A/W甲醇体积
分数B/%微波时间
C/min料液比
D−1 480 70 10 1∶30 0 560 80 20 1∶40 1 640 90 30 1∶50 -
由图1所示：溶液吸光度在450~530 nm区间逐渐升高，在530 nm处达最大值(0.37)，当波长继续增加溶液吸光度逐渐下降。因此白及花中花青素在可见光谱范围内的最大吸收波长为530 nm。
图 1 白及花中花青素的可见光图谱
Figure 1. Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers
由图2所示： D(530)随着时间的延长而降低，50 min后吸光度变化平稳，并在80~100 min范围内最为平稳；在pH 4.5缓冲液中，随着时间的增加，D(530)逐渐降低，在80~90 min时，吸光度相对处于稳定状态。因此，80 min为花青素在缓冲液中的平衡时间。
图 2 白及花中花青素在缓冲液中随时间的吸光度变化
Figure 2. Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution
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由图3所示：白及花中花青素随提取次数增加而降低。第1次提取所得总花青素的提取量最大，第2次提取的提取量约为第1次的16.90%，第3、4次提取的提取量约为第1次的0.70%、0.17%。因此，为尽可能对样品提取完全，且提高提取效率不造成溶剂浪费，选择对样品进行2次提取。
图 3 白及花中花青素不同提取次数的提取量差异
Figure 3. Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution
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由图4所示：当微波功率为160~560 W时，总花青素的提取量随着微波功率的增大而提高；微波功率为560 W时出现顶点，而后随着功率增大出现了下降趋势。这是因为在一定范围内，随着微波功率的增大对细胞的破坏力也逐步增强，花青素溶出物增多；但功率过高使得温度升高，对花青素造成了一定程度的破坏，使得提取量降低。因此依据结果选择微波功率480、560和640 W进行响应面实验。
图 4 微波功率对总花青素提取量的影响
Figure 4. Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图5所示：当甲醇体积分数为20%~60%时，总花青素的提取量没有明显变化；当甲醇体积分数为60%~80%时，提取量随着甲醇体积分数的增加而提高，在80%处达到最大值，随后逐渐下降。说明在一定范围内，提高甲醇体积分数有利于花青素的提取。因此依据实验结果选择甲醇体积分数为70%、80%和90%进行响应面实验。
图 5 甲醇体积分数对总花青素提取量的影响
Figure 5. Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图6所示：在微波时间为2~20 min时，总花青素的提取量随微波时间的延长而提高，在20 min时达到最大值；继续加长提取时间，提取量则下降。这是由于在一定的微波功率下，微波时间越长，对细胞的破坏越彻底，花青素溶出物越多；但微波时间过长会使高温对花青素破坏速度大于花青素浸出速度，花青素总提取量降低。因此依据结果选择微波时间为10、20和30 min进行响应面实验。
图 6 微波时间对总花青素提取量的影响
Figure 6. Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图7所示：在料液比为1∶10 ~ 1∶40时，总花青素的提取量随着溶剂量的加大逐渐提高；当料液比为1∶40时，提取量达到最大，而后缓慢下降。这是因为增加溶剂量有利于花青素的溶出，但溶剂增加比溶质增加倍数过大会稀释提取液并浪费资源，故提取量下降。依据研究结果选择料液比1∶30、1∶40和1∶50进行响应面实验。
图 7 料液比对总花青素提取量的影响
Figure 7. Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins
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在单因素实验结果的基础上，设计4因素3水平的响应面实验，以总花青素提取量(Y)为响应值，微波功率(A)、甲醇体积分数(B)、微波时间(C)和料液比(D)为自变量，共进行29次实验，其中5次为验证实验。将结果运用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行多元回归拟合，得到回归方程模型：Y=−10.774 63− 0.017 17A+0.153 27B+0.382 88C+0.175 19D+0.000 78AB+0.000 19AC+0.000 78AD−0.002 40BC+0.001 45BD+0.000 23CD−0.000 06A2−0.003 45B2−0.006 70C2−0.008 43D2。
从表2可知：模型项为极显著，其中单项因素A、B、C、D与交叉项AB、AD及二次项C2、D2对总花青素提取量的影响达到极显著水平(P＜0.01)，二次项A2、B2达到显著水平(P＜0.05)，其余项因素不显著(P＞0.05)。该模型失拟项不显著，表明该模型建模成功。其中决定系数R2为0.95，校正系数R2Adj为0.90，表明建立的模型与实际情况拟合度较好，可用来进行分析与预测。由表2中F值可知：4个自变量在本研究实验范围内对提取量影响从大到小依次为A(微波功率)、D(料液比)、B(甲醇体积分数)、C(微波时间)。
表 2 回归模型方差分析
Table 2. Analysis of variance (ANOVA) of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 样本 30.65 14 2.19 19.85 ＜0.000 1 *** A 11.98 1 11.98 108.61 ＜0.000 1 *** B 2.89 1 2.89 26.18 0.000 2 *** C 1.52 1 1.52 13.83 0.002 3 ** D 4.16 1 4.16 37.70 ＜0.000 1 *** AB 1.56 1 1.56 14.16 0.002 1 ** AC 0.09 1 0.09 0.80 0.387 2 AD 1.57 1 1.57 14.19 0.002 1 ** BC 0.23 1 0.23 2.09 0.170 3 BD 0.08 1 0.08 0.76 0.398 2 CD 0.00 1 0.00 0.02 0.892 0 A2 0.97 1 0.97 8.83 0.010 1 * B2 0.77 1 0.77 6.99 0.019 3 * C2 2.91 1 2.91 26.42 0.000 2 *** D2 4.61 1 4.61 41.81 ＜0.000 1 *** 残差 1.54 14 0.11 失拟项 1.19 10 0.12 1.35 0.413 3 纯误差 0.35 4 0.09 总离差 32.19 28 R2=0.95 R2Adj=0.90 说明：*表示显著(P＜0.05)，**表示极显著(P＜0.01)，***表示极显著(P＜0.001) -
由图8可知：微波功率对提取量的影响最为显著。微波功率与甲醇体积分数和料液比，两两之间交互作用较强，表现为响应面坡度较陡。随着微波功率的增大，花青素的提取量逐渐增加。其余因素间，交互作用相对较弱，即响应面坡度较缓。根据所建立的响应面拟合方程进行参数最优分析，所得预测最佳工艺条件为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22.14 min，料液比1∶48.10，在此条件下总花青素提取量为6.83 mg·g−1。结合模型预测最佳条件和实际情况，采用优化条件：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min，料液比1∶48。进行3组平行验证试验，其平均提取量为(6.68 ±0.13) mg·g−1，与理论预测值6.83 mg·g−1基本一致，表明模型与实际拟合情况较好。因此响应面法对白及花中花青素提取工艺的优化具有可行性。
图 8 各因素交互作用对总花青素提取量影响的响应面图
Figure 8. Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction
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本研究采用微波萃取法进行白及花中花青素的提取。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法进行提取条件的优化，并建立了微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比对总花青素提取量的二次回归方程模型。得到最佳的提取工艺条件为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22.14 min，料液比1∶48.10。结合实际情况调整参数为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min，料液比1∶48。在此条件下，白及花中总花青素的提取量为(6.68±0.13) mg·g−1，与预测值6.83 mg·g−1基本吻合。
Optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Bletilla striata flowers
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摘要:
目的 采用响应面法对白及Bletilla striata花中花青素的提取方法进行优化。 方法 采用微波萃取和pH示差法提取和测定白及花中花青素，在通过单因素法获得微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比4个单因素最佳参数的基础上，利用响应面分析法建立二次回归方程，优化花青素最佳提取参数。 结果 所得优化模型条件与实际提取拟合度良好。pH示差法调整为：测定波长530 nm，溶液平衡时间80 min。本研究范围内，4个因素对提取量影响从大到小顺序为微波功率、料液比、甲醇体积分数、微波时间。在微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min和料(g)液(mL)比1∶48的条件下，白及花中总花青素提取量为6.68 mg·g−1，与理论预测值6.83 mg·g−1基本一致。 结论 优化所得方法可用作白及花中花青素的提取制备，为日后白及花的综合开发利用提供依据。图8表2参22 Abstract:Objective This study is aimed at the optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Bletilla striata flowers. Method With anthocyanins in B. striata flowers determined and extracted via microwave-assisted extraction and pH Differential Method and the optimum parameters of the four single factors of microwave power, methanol concentration, extraction time and solid-liquid ratio obtained, the study has managed to obtain the optimal extraction parameters of anthocyanins with the quadratic regression equation model established using the Response Surface Methodology (RSM). Result (1) The conditions of the optimal model fit well with actual extraction; (2) The pH differential method was adjusted to a measured wavelength of 530 nm and a solution equilibration time of 80 min; (3) The impact of the four factors of microwave power, material to liquid ratio, methanol concentration and microwave time on the amount of extraction decrease in a progressive order; (4) With the microwave power at 640 W, the methanol concentration as 90%, the microwave time set for 22 min, and the ratio of material (g) to liquid (mL) adjusted as 1∶48, the total anthocyanin extraction in B. striata flower was 6.68 mg·g−1, which was basically consistent with the theoretical prediction value of 6.83 mg·g−1. Conclusion The optimized method can be employed for the extraction and preparation of anthocyanins in B. striata flowers, providing a basis for the comprehensive development and utilization of B. striata flowers. [Ch, 8 fig. 2 tab. 22 ref.] -
香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是红豆杉科Taxaceae榧树属Torreya的优质品种，其种子可食用，是著名的特色干果[1]；种仁含油率较高[2]，具有很高的经济价值[3]。随着各类栽培技术的开发，中国的香榧种植产业规模也在不断扩大，对于香榧植株及干果[4]的有关研究已经比较成熟，但对于香榧愈伤组织培养的研究还处在相对落后的阶段。
植物愈伤细胞的悬浮培养是一种通过调控细胞生长，快速获得大量细胞以及目的产物的技术，不受各类局限进行周年生产。建立好的培养体系以及优化培养条件，可以超过原有的生产方式[5]。王沐兰等[6]通过建立红豆杉Taxus chinensis高产悬浮细胞系，提高了紫杉醇的产量；赵文佳[7]诱导青钱柳Cyclocarya paliurus红色愈伤系，并利用细胞悬浮培养技术建立了花青素的生产体系。此外，国槐Sophora japonica[8]、南方红豆杉Taxus wallichiana[9]和落叶松Larix gmelinii[10]等植物的悬浮培养体系也已经建立。然而在香榧悬浮培养体系中，细胞生长动力学规律及最佳培养条件尚不清晰。
悬浮细胞的培养过程中需添加各类激素以促生长。赤霉素(GAs)是植物体内的一种重要激素，已被发现较多的种类，并按顺序命名为赤霉素A1 (GA1)、赤霉素A3 (GA3)等，在植物生长的各个环节都不可缺少[11−12]。在非生物胁迫或生物刺激下，外施赤霉素可以增加防御酶的数量或活性，进而影响植物抗性[13]。赤霉素还可对植物愈伤组织增殖过程中的褐化情况进行抑制，促进愈伤组织增殖[14]。
鉴于此，本研究通过优化香榧胚性愈伤组织悬浮培养基，探究其动力学特性，筛选最适合的培养条件，同时探究GA3处理下香榧胚性愈伤组织生长及差异基因表达的规律，为香榧愈伤组织的生长和遗传转化体系的构建提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料及培养条件
以浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室培育的香榧胚性愈伤组织为试验材料。使用SH液体培养基，其中添加脱落酸(ABA) 1.0 mg·L−1、水解酪蛋白(CH) 500.0 mg·L−1、蔗糖30.0 g·L−1、活性炭2.0 g·L−1和GA3 0.5 mg·L−1，设置pH 5.7，摇床转速为110 r·min−1，25 ℃暗培养。
1.2 悬浮培养细胞生长曲线及活力测定
在100 mL的锥形瓶中添置30 mL的SH液体培养基(配方同1.1)，香榧胚性愈伤组织接种量为30 g·L−1，设置pH 5.7，转速为110 r·min−1，每3 d取样测定细胞鲜质量及细胞活力(氯化三苯四氮还原法，TTC)，即波长为485 nm处的吸光度。
1.3 悬浮培养条件优化
1.3.1 培养条件筛选
在100 mL锥形瓶中添置30 mL的SH液体培养基(配方及培养条件同1.1)，设置转接愈伤组织接种量为10、20、30、40、50 g·L−1；pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9；摇床转速为70、90、110、130、150 r·min−1。25 ℃摇床中振荡暗培养。每个处理设置3个重复，21 d时统计鲜质量，计算细胞增长率，细胞增长率=(收获量−接种量)/接种量×100%。
1.3.2 抗氧化酶活性测定
超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[15]。
1.4 测序RNA提取
将香榧胚性愈伤组织接种于SH液体培养基中(配方及培养条件同1.1)，设置对照组(ck)和实验组(GA3+)，对照组培养基中不添加GA3，实验组培养基中施加GA3。18 d后收集材料，使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按说明书提取RNA，分别设置3个生物学重复，使用分光光度计检测浓度与纯度。
1.5 转录组测序
测序工作由北京诺禾致源科技有限公司完成，采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行测序。由于香榧没有参考基因组，将聚类分析结果中最长的转录本作为参考序列单基因簇进行后续分析。
1.6 差异表达基因的筛选及功能注释
采用RSEM软件将每个样品过滤后的数据(clean reads)在参考序列上做比对。采用DESeq分析差异表达基因(DEG)，以|log2Fc|＞1 (Fc为表达量的差异倍数)且P＜0.005为筛选条件[16]。将差异表达基因注释到基因本体论数据库(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)，并进行GO和KEGG富集分析。
1.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证
使用Primer 3.0 input在线软件设计引物(表1)，以TgActin为内参基因[16]。用Takara生物科技有限公司的反转录试剂将提取的RNA反转录成cDNA进行RT-qPCR验证，每个样品3个生物学重复。反应体系为10.0 μL，包括5.0 μL的TB GREEN，0.2 μL的上下游引物，0.4 μL的模板cDNA，4.2 μL的ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s共39个循环。
表 1 差异表达基因RT-qPCR的特异性引物信息Table 1 Gene-specific primer information for RT-qPCR引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_024662224.1 TCCAAGGGAAGGGGAACATC TCCCCGGATTGCAGAAGATT XM_027242615.1 TGTACCCTCCACCCTTTTCC TCTATCAGGGAGGGAGCAGA XM_020665027.1 TACGACCAGTCAGAGGCTTG AAACACCCACCGTCTTTGAC XM_002991298.2 CACGCCCAATTTTCACGAGA CGAAAACTAGGCAGGGCATC XM_022920293.1 TCGACCTTGAGACCTGGAAC TGATGGTGCAGCAAATCAGG TgActin TGGCATCTCTCAGCACATTCCA TGCCAACATCTCAAGCAAGCAC 1.8 数据分析
使用Excel处理数据，采用SPSS 26进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05，使用GraphPad Prism 9软件作图。
2. 结果与分析
2.1 香榧胚性愈伤组织悬浮培养的动力学
香榧胚性愈伤组织悬浮培养时，细胞鲜质量变化呈“S”型曲线。在0~6 d鲜质量增加缓慢；7~18 d鲜质量快速增加；18 d时达到最高值，为44.81 g；18~21 d进入稳定期，鲜质量基本不再增加；21 d后细胞进入衰退期，鲜质量下降。同时，在培养周期内香榧胚性细胞活力在0~3 d时快速增长，并在3 d时达到最高值(0.32)，之后持续下降，并且随着培养时间的延长，变化趋势趋向平缓(图1)，表明9~12 d为香榧胚性愈伤组织悬浮培养的最佳继代时期。
图 1 培养过程中细胞鲜质量和活力的变化Figure 1 Changes in fresh weight and viability of cells during incubation2.2 香榧胚性愈伤组织悬浮培养条件优化
2.2.1 接种量对香榧悬浮细胞的影响
随着接种量的增加，胚性愈伤组织增长率呈先上升后下降的趋势。当愈伤组织接种量为10 g·L−1时，细胞增长率最低(21.78%)；当接种量为30 g·L−1时，细胞增长率显著升高(P＜0.05)，达到最高值，为49.94%。SOD、POD和CAT活性均随接种量的增加而呈先升高后降低的趋势。当接种量为30 g·L−1时，SOD、POD和CAT活性均最高，显著高于其他接种量时的酶活性(P＜0.05)(图2A)。
图 2 不同培养条件对香榧胚性愈伤组织液体悬浮培养的影响Figure 2 Effect of different culture conditions on the liquid suspension culture of embryogenic callus of T. grandis ‘Merrillii’2.2.2 pH对香榧悬浮细胞的影响
随着pH的增加，香榧悬浮细胞增长率呈先上升后下降的趋势。当培养基pH为5.7时，细胞鲜质量增殖效果最佳，细胞增长率最大，为22.95%，显著高于其他处理(P＜0.05)。SOD、POD和CAT活性均随接种量的增加而呈先升高后降低的趋势。在pH为5.7时，悬浮细胞SOD、POD和CAT活性均最大，显著高于其他处理(P＜0.05)(图2B)。
2.2.3 转速对香榧悬浮细胞的影响
随着转速的增加，香榧悬浮细胞增长率呈逐渐上升的趋势，当转速为70 r·min−1时，细胞增长率较低，为20.33%；当转速达110 r·min−1时，细胞增长率最大，为50.84%，显著高于其他处理(P＜0.05)。SOD、POD和CAT活性均随摇床转速的增加而呈先升高后降低的趋势。当转速为110 r·min−1时，SOD、POD和CAT活性最大，显著高于其他处理(P＜0.05)(图2C)。
2.3 外源GA3对香榧胚性愈伤组织的影响
2.3.1 外源GA3处理下香榧胚性愈伤组织的转录组测序分析
所有检测样品纯净碱基数均达6.66 Gb以上，质量为Q20 (每项碱基质量大于20的碱基数占总碱基数的比例)的碱基比例均大于97.47%，达Q30 (每项碱基质量大于30的碱基数占总碱基数的比例)以上的碱基比例大于92.70%，每个样本碱基GC含量为43.53%~44.45%，较为一致，且测序碱基平均错误率均在0.1%以下，表明转录组数据较为准确。
2.3.2 差异表达基因分析
本研究共筛选到428个差异表达基因，其中236个基因上调表达，192个基因下调表达(图3A)。对照组与实验组共有表达的基因数为46 831个，对照组特有表达的基因数为10 580个，实验组特有表达的基因数为8 308个(图3B)。
2.3.3 差异基因GO注释及富集分析
GO功能注释与分类统计发现：差异表达基因被归类到2个功能分类组中，其中：分子功能中有17个基因涉及水解邻糖基化合物的水解酶活性；生物过程中细胞壁组织或生物合成过程注释到10个差异基因(图3C)。
2.3.4 差异基因KEGG注释及富集分析
将差异表达基因进行KEGG通路富集分析，对富集较多的前20个通路进行散点图绘制。差异基因富集最多的通路为苯丙烷生物合成；其次为淀粉和蔗糖代谢；再次为角质、木栓质和蜡的生物合成。而氰基氨基酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、丙酮酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等通路富集较少(图3D)。
本研究有8个与苯丙烷生物合成相关的差异基因被富集到且呈上调表达，4个与过氧化物酶(POX)相关；2个与莽草酸-O-羟基肉桂酰转移酶(HCT)相关；2个与咖啡酸-O甲基转移酶(COMT)相关(图4)。本研究表明：GA3处理会使得香榧胚性愈伤组织细胞增加对苯丙氨酸的合成与利用，调控HCT、COMT、POX活性的基因上调表达，促进了对香豆酰辅酶A参与合成咖啡酰莽草酸、愈创木酰木质素等产物的过程，同时生成酚类物质参与其他途径物质合成。该过程产生的酚类物质还可能参与清除部分愈伤组织和培养基产生的有害活性氧，提高香榧胚性愈伤组织的抗性[17−19]。
图 4 苯丙烷生物合成与木栓质合成相关通路及差异表达基因Figure 4 Pathways and differentially expressed genes related to phenylpropanoid biosynthesis and suberin synthesis本研究有3个与木栓质生物合成相关的差异基因被富集到且呈上调表达，其中1个与脂肪酸ω-羟化酶(CYPB6B1)相关，2个与脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)相关(图4)。与对照组相比，GA3处理会使FAR与CYPB6B1上调表达，参与ω-羟基脂肪酸下游α,ω-二羧酸和α,ω-二醇合成途径，促进下游单酰基甘油酯的合成，共同参与形成木栓质单体或低聚物，同时产生酚类物质[20]。该过程可结合苯丙烷合成途径产生的酚类物质，促进木栓质单体或低聚物的合成，应对环境变化并进行调整[21−22]。
2.3.5 GA3处理下香榧胚性愈伤组织差异表达基因RT-qPCR验证
RT-qPCR验证结果(图5)表明：5个基因与转录组测序结果呈现相同的表达趋势，2个基因上调表达，3个基因下调表达，说明转录组测序结果可靠。
3. 讨论
植物细胞悬浮培养是一个持续变化的过程。在悬浮细胞培养过程中，接种量直接影响细胞的生长。细胞需要足够的空间和营养物质支持其增殖，选择适当的接种量对于细胞的生长至关重要。已有研究表明：落叶松胚性愈伤组织的最佳接种量为4 g·L−1[6]。油茶Camellia oleifera愈伤细胞悬浮培养的最佳初始接种量为33 g· L−1[23]。本研究中，胚性愈伤组织接种量为30 g·L−1，有利于香榧悬浮细胞的生长，此时细胞增长率最大。在细胞生长过程中，细胞内部很多起关键调控作用的酶对pH有一定的要求。陈继光等[24]研究表明：青钱柳在pH为5时细胞活力较强，细胞质量增量达最大，当pH达6时，细胞活力和质量增量都开始下降。本研究中，pH为5.7时，香榧胚性愈伤组织悬浮细胞抗逆性最强，细胞增长率最大。悬浮培养中摇床转速对细胞生长也有较大的影响。较低的转速会使愈伤组织堆积导致褐化[4]；转速较高时会使细胞间产生碰撞导致破裂死亡，只有合适的转速才能使得细胞快速增殖生长[25]。本研究表明：转速为110 r·min−1时，香榧悬浮细胞生长最快。悬浮培养过程中对多种条件进行优化，能显著提升细胞的生长能力及抗性。
植物细胞在离体悬浮培养过程中，还须通过外施激素来促进细胞的生长。赤霉素在植物体的生命过程中起着重要的作用。当植物体处于胁迫条件时，外源赤霉素可以有效缓解胁迫的危害[26]。有研究表明：加入外源GA3可以有效缓解牡丹Paeonia × suffruticosa愈伤组织的褐化，并且提高愈伤组织诱导率[14]。本研究表明：在差异基因的GO富集分析中，GA3处理后上调表达基因主要参与催化活性、氧化还原过程、氧化还原酶活性等过程，说明活性氧的清除是香榧胚性愈伤组织增殖发育时的一个重要过程。在代谢通路中，差异表达基因主要富集在苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、木栓质合成等途径中。KEGG通路富集结果表明：苯丙烷生物合成途径中注释的差异表达基因最多，说明GA3处理后，香榧胚性愈伤组织的次级代谢途径产生了一定的变化。
苯丙烷代谢途径是植物体内多种防御性次生代谢产物(如黄酮类、木质素及水杨酸等)的主要来源[27]。有关木栓质相关合成途径的研究集中于植株根系以及部分受创伤部位[28]，对于其在植物愈伤组织内的合成与作用研究较少。本研究中，木栓质合成途径也有7个差异基因被显著富集，且呈上调表达。已有研究表明：细胞色素P450单加氧酶(CYP)家族与FAR主要参与木栓质的合成[29]。木栓质大分子的酚类组分已证明主要有阿魏酸、香豆酸等物质，通过苯丙烷生物合成途径产生，可继续生成木栓质单体中相应的底物物质，在一定程度上促进了木栓质单体的合成，影响细胞生长，以应对环境的胁迫[30]。这与本研究结果相似，推测外源GA3处理下香榧愈伤组织苯丙烷生物合成途径所产生的酚类物质不仅参与了活性氧的清除，还参与了木栓质单体的合成，对愈伤组织的生长及胁迫适应性产生一定的影响[31]。
4. 结论
香榧胚性愈伤组织悬浮细胞生长曲线呈“S”型，接种后9~12 d为最佳继代时期，设置接种量为30 g·L−1，pH为 5.7，摇床转速为110 r·min−1，可获得生长良好的香榧胚性愈伤组织细胞，同时也可以提高悬浮细胞的抗氧化能力。通过转录组分析发现：外源GA3处理下香榧胚性愈伤组织细胞苯丙烷生物合成、木栓质生物合成等相关代谢通路为差异基因的主要参与部分，且其中部分调空愈伤组织形成、生长和发育的关键基因表达量产生变化，可能在香榧愈伤组织的生长发育、适应环境变化以及应对胁迫相关过程中发挥重要作用。
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图 1 白及花中花青素的可见光图谱
Figure 1 Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers
图 2 白及花中花青素在缓冲液中随时间的吸光度变化
Figure 2 Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution
图 3 白及花中花青素不同提取次数的提取量差异
Figure 3 Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution
图 4 微波功率对总花青素提取量的影响
Figure 4 Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins
图 5 甲醇体积分数对总花青素提取量的影响
Figure 5 Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins
图 6 微波时间对总花青素提取量的影响
Figure 6 Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins
图 7 料液比对总花青素提取量的影响
Figure 7 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins
图 8 各因素交互作用对总花青素提取量影响的响应面图
Figure 8 Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1. Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design
水平 微波功率
A/W甲醇体积
分数B/%微波时间
C/min料液比
D−1 480 70 10 1∶30 0 560 80 20 1∶40 1 640 90 30 1∶50 
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表 2 回归模型方差分析
Table 2. Analysis of variance (ANOVA) of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 样本 30.65 14 2.19 19.85 ＜0.000 1 *** A 11.98 1 11.98 108.61 ＜0.000 1 *** B 2.89 1 2.89 26.18 0.000 2 *** C 1.52 1 1.52 13.83 0.002 3 ** D 4.16 1 4.16 37.70 ＜0.000 1 *** AB 1.56 1 1.56 14.16 0.002 1 ** AC 0.09 1 0.09 0.80 0.387 2 AD 1.57 1 1.57 14.19 0.002 1 ** BC 0.23 1 0.23 2.09 0.170 3 BD 0.08 1 0.08 0.76 0.398 2 CD 0.00 1 0.00 0.02 0.892 0 A2 0.97 1 0.97 8.83 0.010 1 * B2 0.77 1 0.77 6.99 0.019 3 * C2 2.91 1 2.91 26.42 0.000 2 *** D2 4.61 1 4.61 41.81 ＜0.000 1 *** 残差 1.54 14 0.11 失拟项 1.19 10 0.12 1.35 0.413 3 纯误差 0.35 4 0.09 总离差 32.19 28 R2=0.95 R2Adj=0.90 说明：*表示显著(P＜0.05)，**表示极显著(P＜0.01)，***表示极显著(P＜0.001)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190581
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