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耕地破碎化是影响粮食生产效率的重要因素之一。在同等要素投入的条件下，耕地破碎化程度越高粮食生产效率越低。耕地破碎化是影响中国农业生产效率和耕地质量的重要因素[1-3]，研究其时空分布以及变化趋势对于地区农业发展具有重要的实践意义，同时也有利于生态可持续发展[4]。耕地破碎化宏观上表现为耕地的连片度和连通性下降，即单一、均质和集中连片的耕地变为复杂、异质和分割成块的斑块状耕地，具体则包括耕地地块的面积、距离以及分布的景观变化。随着经济不断发展，城市化程度不断提高，一方面耕地抛荒情况普遍存在，另一方面由于道路等基础设施建设的需要，耕地破碎化程度也不断上升。国内外对耕地破碎化的驱动因素、测度方法以及耕地破碎化治理政策等各方面展开了研究。目前，耕地破碎化的研究已形成了较为成熟的指标体系，主要以核密度[5]和景观指数测算耕地的破碎化[6-7]，耕地破碎化的指标主要采用遥感数据计算景观指数判断耕地斑块的数量和面积变化[8-9]，在此基础上使用熵权法或变异系数法计算一个地区的耕地破碎化综合指数[10]。而景观指数的计算主要以斑块数量、斑块面积和斑块形状为特征指标[11]。在耕地破碎化驱动因素挖掘方面，基础设施的建设、地形地貌的限制以及人多地少的国情使得耕地破碎化愈发严重[5, 9-10]。但已有研究大多聚焦于城市化背景下耕地破碎化的程度，而在城市化背景下，政府也在不断干预耕地保护，如国家耕地保护政策的创新和试点，政府的干预对耕地的破碎化是否有影响？是否会延缓城市化背景下耕地破碎化的趋势？这都有待探讨。长期以来，耕地破碎化是制约浙江省嘉兴市现代农业发展和乡村空间资源高效配置的重要因素，2012年以来嘉兴市大规模开展了农村土地综合整治。研究其耕地破碎化的程度，并对比在大规模推进农村土地综合整治前后的耕地破碎化程度差异，有助于观察在城乡融合发展背景下，耕地破碎化程度在政府干预下的变化。这不仅在理论上有利于完善农村土地综合整治模式和机制，在实践中也有利于其他城市化发展较快的平原地区分析政府干预对耕地破碎化的影响。
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浙江省嘉兴市位于长江三角洲杭嘉湖平原，如表1所示：嘉兴市下辖2个市辖区(南湖区、秀洲区)、3个县级市(海宁市、平湖市、桐乡市)、2个县(嘉善县、海盐县)。2019年嘉兴市国内生产总值(GDP)为5 370.32亿元，常住人口为480.00 万人，国土面积为4 230 km2。嘉兴市耕地资源基础条件优良，耕地质量等级全省最高，但人均耕地面积较少，耕地面积不断减少，破碎化问题突出。2018年嘉兴市耕地面积为204 897 hm2，相较上年减少了458 hm2，人均耕地面积为427 m2·人−1，低于国际粮农组织公布的人均耕地面积标准533 m2·人−1。另一方面嘉兴市耕地保有量任务重，后备资源接近零，永久基本农田保护率全市平均超过85%，其中平湖市和嘉善县均超过90%。经济增长引致的用地需求与耕地保护矛盾突出。2012年以来，嘉兴市全面实施农村土地综合整治工程发展战略，大力推进耕地连片建设，全市每年复垦导致耕地碎片化的零星建设用地面积约700 hm2。增加耕地的同时，零星分布的耕地图斑明显减少，耕地破碎度情况总体有所好转，耕地利用效益和粮食产量稳步提升。
表 1 嘉兴市区域概况
Table 1. General context of Jiaxing City
市(区、县) 2019年土地面积/km2 2019年常住人口/万人 2019年GDP/亿元 2017年耕地面积/hm2 2018年耕地面积/hm2 嘉兴市 4 230 480.00 5 370.32 205 355 204 897 南湖区 439 68.29 765.37 22 379 22 142 秀洲区 548 62.90 676.35 29 089 28 961 嘉善县 507 59.20 626.81 26 618 26 571 海盐县 590 45.10 539.65 26 019 25 945 海宁市 863 87.83 1 026.57 32 981 33 117 平湖市 557 70.35 765.77 29 321 29 236 桐乡市 727 86.33 968.17 38 947 38 925 说明：数据来源于《嘉兴市2020年统计年鉴》；GDP为国内生产总值 -
本研究数据包括矢量数据以及统计数据两大类。首先本研究收集了嘉兴市2009−2018年(其中，2015年矢量数据缺失)的耕地矢量数据，为“第2次全国土地调查”及年度变更数据，提取了其中的耕地状况数据，包括耕地面积、耕地块数、耕地周长等信息；其次，土地利用数据以及社会经济数据来源于《中国国土资源年鉴》《中国国土资源统计年鉴》《浙江省统计年鉴》和《嘉兴市统计年鉴》等。
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已有耕地破碎化的研究大多采用景观指数描述耕地破碎化的程度[1，6，10，12 − 13]，一方面是由于耕地作为特殊的景观，其空间布局、分布和形态是反映其破碎化程度的具体指标。另一方面，景观指数所包含的数据信息量大且容易获取。参考已有研究[1，12-13]并结合嘉兴市的实际情况，用以下6个指标对耕地破碎化进行描述(表2)。
表 2 耕地破碎化指标体系
Table 2. Index system of farmland fragmentation
指标名称 公式 说明 单位耕地面积(UFA) AUF=AT/QT AUF为单块耕地面积，AT为区域内的耕地总面积，QT为区域内耕地的 总数量。单位耕地面积越大说明耕地的破碎化程度越低，区域内 的耕地越趋向规模经营 耕地密度(FD) DF=QT/AT DF为耕地密度，AT为区域内的耕地总面积，QT为区域内耕地的总数 量。耕地密度是指单位面积的耕地上拥有的耕地数量，耕地密度越大 说明耕地破碎化程度越高，耕地分割越严重 边界密度指数(ED) DE=PT/AT DE为边界密度指数，PT为区域内耕地斑块总周长，AT为区域内耕地总 面积。边界密度指数以单位面积内的耕地地块周长为表征，边界 密度越大说明区域内耕地被划分为更多地块，区域的耕地破碎化程 度越高 区域内地块形状指数(TSI) ITS=${\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{ {Q_{\rm{T}}} } {\left( {\dfrac{ {0.25{P_i} } }{ {\sqrt { {A_i} } } } } \right)} ({A_i}/{A_{\rm{T}}})}$ ITS为区域内地块形状指数，QT是区域内耕地总数量，Pi是区域内i地块周 长，Ai是第i地块面积，AT是耕地总面积。区域内地块形状指数 根据地块周长小的地块形状更规则的原理得到，形状规则的地块 更有利于规模经营。区域内地块形状指数越大，破碎化程度越高 地块数量破碎化指数(FIQ) IFQ=(NT−1)ATmin/AT IFQ为地块数量破碎化指数，NT是区域内耕地斑块总数，ATmin是区域 内最小的耕地斑块的面积，AT是区域内耕地斑块总面积。该指数的数 值为0~1，最小地块的面积越小、区域内耕地地块的数量越少，耕地 的破碎化程度越低。相反则耕地的破碎化程度越高 地块形状破碎化指数(FIS) IFS=1−1/IPS
IPS=${\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{ {Q_{\rm{T} } } } {\left( {\dfrac{ {0.25{P_i} } }{ {\sqrt { {A_i} } } } } \right)} /{Q_{\rm{T}}} }$IFS为地块形状破碎化指数，QT是区域内耕地总数量，Pi是区域内i地 块周长，Ai是第i地块面积，IPS是区域内地块形状指数的平均值。 区域内耕地地块周长越长，形状越不规则，地块的形状破碎化指数 越高 -
为进一步客观描述2009−2018年(2015年除外)嘉兴市的耕地破碎化情况，对耕地破碎化的各指标赋权后综合计算嘉兴市每年的耕地破碎化综合指数。熵值法可以根据各指标的离散程度，客观判断各指标对总指标的贡献度，减小人工赋权的主观性。指标的信息量越小，离散程度越大，熵值越大，则对总指标的评价影响越大。差异性越大的指标对总指标的评价越有影响。本研究拟采用熵值法测算6个指标对破碎化评价的重要性，并据此计算6个指标的权重。最后根据6个指标的权重，加权计算嘉兴市每年的耕地破碎化综合指数。可通过SPSSAU的功能来实现，具体步骤如下。
①在进行熵值法前，为规避6个指标的单位不同以及正负向不同的问题，先对6个指标进行标准化处理。在以上6个指标中，单块耕地面积越小，耕地破碎化程度越高，而耕地密度、边界密度指数、区域内地块形状指数、地块数量破碎化指数和地块形状破碎化指数均为数值越大，耕地破碎化程度越高。因此，对单位耕地面积进行逆向化处理，Pij=(Ximax−Xij)/(Ximax−Ximin)；而其他5个指标进行正向化处理，Pij=(Xij−Ximin)/(Ximax−Ximin)。其中，Xij是j县(市、区)i指标的值，Ximin是指标i的最小值，Ximax是指标i的最大值，Pij是j县(市、区)i指标标准化后的值。②测算每个指标的熵值：
${e_i} = - (1/{\rm{ln}}m)\displaystyle\sum\limits_{j = 1}^m {{P_{ij}}} {\rm{ln}}{P_{ij}}$ 。其中，ei是指标i的熵值，m是县的个数，Pij是j县(市、区)指标i标准化后的结果。③计算指标的权重：${W_i} = (1 - {e_i})\Big/\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {(1 - {e_i})}$ 。其中，$ {e}_{i} $ 是i指标的熵值，n是指标的个数，Wi是指标i的权重。④综合测算各县(市、区)的耕地破碎化综合指数：${F_{i\!j}} = \displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {{P_{i\!j}}} {W_i}$ 。其中，Fij为耕地破碎化综合指数，Pij是j县(市、区)指标i标准化后的结果，Wi是指标i的权重。 -
为从整体上分析嘉兴市耕地破碎化的情况，运用平均断点法将嘉兴市的耕地破碎化综合指数分为3级，一级为(0.60，0.67]，二级为(0.67，0.74]，三级为(0.74，0.81]。由图1可见：整体上各县(市、区)的耕地破碎度有明显的波动，2009−2012年呈现上升趋势，2013−2018年逐渐下降。分别就3个时间节点的各县(市、区)耕地破碎化的分级情况来看，2009年海盐县和海宁市为一级，其他县为二级；2013年海盐县、海宁市和嘉善县为二级，其他均为三级；直至2018年海宁市和嘉善县为一级，其他县为二级。具体地，位于嘉兴市中心位置的南湖区，耕地破碎化综合指数自2009年的0.679上升至2013年0.778后逐渐下降至2018年的0.699，2009−2013年的年均增长率约3.4%，2013−2018年年均增长率约−2.6%。从耕地的数量和面积来看，南湖区的耕地面积由2009年的24 925 hm2降低至2013年的24 404 hm2，而耕地数量则增加了3 762块；同时，南湖区的GDP由2009年257.56亿元增长至2013年的429.94亿元。究其根源，南湖区的耕地破碎化的加大是城市快速发展背后的土地需求，推动了耕地的面积减小和碎片化[14]。秀洲区2009−2013年耕地破碎化一直呈现增长的趋势，2014年后耕地破碎化减缓。嘉善县、海宁市和桐乡市的耕地破碎化综合指数从2009−2012年呈现波动式上涨后，2013−2018年波动下降。海盐县和平湖市耕地破碎化综合指数在2013年达到最大值后逐渐减小。
图 1 嘉兴市各县(市、区)耕地破碎化综合指数
Figure 1. Farmland fragmentation comprehensive index of different counties in Jiaxing
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从嘉兴市各县(市、区)耕地破碎化的空间差异(图2)可以看出：嘉兴市全域耕地破碎化程度呈先上升后下降的趋势。具体来看，2009年，嘉兴市耕地破碎化只有一级区和二级区，因此总体上耕地破碎化程度较轻；相对严重的二级区主要集中在嘉兴市北部，南部的海宁市和海盐县在2009年耕地破碎化程度较低，为耕地破碎化一级区。2013年，嘉兴市中部地区(包括桐乡市、秀洲区、南湖区和平湖市)耕地破碎化程度急剧上升，由二级区变为了三级区；同时南部的海宁市和海盐县也有所恶化，耕地破碎化程度由一级变为了二级。到2018年，中部4个地区(桐乡市、秀洲区、南湖区和平湖市)的耕地破碎化程度有所减缓，变为了二级区，同时北部的嘉善县和南部的海宁市，耕地破碎化程度也有所下降。因此，嘉兴市耕地破碎化情况整体上呈现由中部向外递减的趋势。
图 2 嘉兴市耕地破碎化时空演变示意图
Figure 2. Jiaxing’s farmland fragmentation and spatio-temporal change
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2009年，嘉兴市中部的南湖区、桐乡市和平湖市耕地破碎化程度较高，2009−2018年耕地破碎化综合指数平均值分别为0.709、0.727、0.716；秀洲区次之，平均值为0.701；嘉善县、海盐县和海宁市相对较好，平均值分别为0.683、0.678、0.654。2009−2013年，耕地破碎化程度总体加大，各县(市、区)的耕地破碎情况差异也逐渐增加，2009年各县(市、区)耕地破碎化综合指数的变异系数为0.040，且逐渐增加，至2014年为0.057。说明随着耕地破碎化程度的加剧，各县(市、区)的耕地破碎化情况差异逐渐显现。主要表现为南湖区、桐乡市和平湖市耕地破碎化情况更为严重，而相对较好的嘉善县、海盐县和海宁市，耕地进一步破碎的进程较缓。不难推测，由于产业发展的路径依赖，原本就是嘉兴市二、三产业重点发展地区的南湖区、桐乡市和平湖市随着经济的发展耕地破碎化情况不断恶化。
2012年，嘉兴市开始大规模推进农村土地综合整治，以此为平台和抓手，破解制约嘉兴城乡统筹发展的障碍，提出“耕地占补平衡有良方，土地节约集约有增量，农民安居乐业有保障，城乡统筹发展有希望”的发展目标，推动了嘉兴市经济社会可持续发展，为全省乃至全国树立了耕地保护的样板。大规模推进农村土地综合整治与耕地破碎化程度的减轻有着密切的联系。2013−2018年，全市耕地破碎化程度整体减缓，耕地破碎化情况严重的南湖区、桐乡市和平湖市耕地破碎化得到了明显改善，耕地破碎化的空间差异也逐渐减小，各县(市、区)耕地破碎化综合指数的变异系数降低至0.041。
从时间上可以看出，嘉兴市各县(市、区)耕地破碎化程度达到顶峰的时间在2009−2013年，此后，各县(市、区)的耕地破碎化情况均有所好转。而从空间上来看，2009−2013年耕地破碎化出现从中心向周边扩展的趋势，临近主城区南湖区的周边县(市、区)耕地破碎化较严重，相对较远的嘉善县和海宁市耕地破碎化加剧的程度较轻。2013年后，耕地破碎化情况整体上出现好转，这与大规模推进农村土地综合整治密不可分。可见，大规模推进农村土地综合整治是2013年后耕地破碎化程度整体降低的重要影响因素。
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本研究根据嘉兴市耕地矢量数据，运用熵值法计算嘉兴市各县(市、区)耕地破碎化综合指数后得出：①嘉兴市各县(市、区)地耕地破碎化在2009−2013年整体上呈显著上升趋势，2013−2018年嘉兴市耕地破碎化程度有所减缓，呈现下降趋势。②空间上，嘉兴市耕地破碎化呈现从中部向南北逐渐减少的趋势，2009−2013年耕地破碎化严重的县(市、区)耕地破碎化综合指数增长更快，各县(市、区)的耕地破碎化空间差异加大；2013年后耕地破碎化较严重的地区，耕地破碎化程度明显降低，耕地破碎化空间差异减小。③分析嘉兴市耕地破碎化变化的驱动因素可以发现，2009−2013年经济发展带来的建设用地占用耕地以及农民无序建房等行为是促使耕地破碎化加重的主要原因[15]，而在2013年嘉兴市大规模推进农村土地综合整治后，耕地破碎化程度有效减小。嘉兴市的耕地破碎化演变对于全国的耕地保护也具有一定借鉴意义，一方面各地应警惕城市扩张、经济发展带来的耕地破碎等影响耕地质量的因素[16-17]，积极推进农村土地综合整治，创新完善整治模式，注重耕地的连片性建设，以有效保护耕地质量，促进农业现代化发展[18]，提高耕地的连片度和耕种效率；另一方面，应创新完善耕地保护考核机制[19]，禁止任意占用导致的耕地破碎化[20]，将耕地的破碎化治理及耕地连片建设纳入耕地保护考核目标内容，以制度促进耕地破碎化的降低[21]。
Spatio-temporal variation of farmland fragmentation in water net plain area
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摘要:
目的 耕地破碎化是影响中国农业生产效率和规模化经营的重要因素，研究其时空分布以及变化趋势对于地区的农业发展、提高耕地保护水平具有重要的实践意义。 方法 以浙江省嘉兴市为研究对象，计算了2009−2018年嘉兴市7个县级单位的耕地破碎化综合指数，从时间和空间两方面分析各县(市、区)耕地破碎化变化趋势和时空演变特征，并就其变化的驱动因素进行了理论分析。 结果 空间上，嘉兴市耕地破碎化呈现由中部向南北逐渐递减的趋势。在时间上，2009年各县(市、区)耕地破碎度综合指数的变异系数为0.040，变异系数逐渐增加至2014年的0.057。2012年嘉兴市开始大规模推进农村土地综合整治，改变了各县(市、区)耕地破碎化空间差异，2018年各县(市、区)耕地破碎化综合指数的变异系数下降至0.041，同时也减小了各县(市、区)耕地破碎化的空间差异。 结论 需进一步推进农村土地综合整治，创新完善整治模式，并将耕地的破碎化治理及耕地连片建设纳入耕地保护考核目标内容，以制度降低耕地破碎化程度。图2表2参21 Abstract:Objective To promote regional agricultural development, this study is aimed to conduct an investigation of the temporal and spatial distribution and change trend of farmland fragmentation, an important factor that affects the agricultural production efficiency and large-scale management in China. Method With Jiaxing City of Zhejiang Province selected as the research area where the comprehensive index of farmland fragmentation of 7 county-level units in Jiaxing City from 2009 to 2018 was calculated, this paper makes an analysis of the change trend and spatio-temporal evolution characteristics of farmland fragmentation in different counties as well as a theoretical analysis of the driving factors. Result Spatially, the fragmentation of farmland in Jiaxing City has deomonstrated a gradual decrease from the middle to the North and South. In terms of time, the coefficient of variation of the comprehensive index of farmland fragmentation was 0.040 in 2009 and gradually increased to 0.057 in 2014. In 2012, Jiaxing promoted the comprehensive rural land consolidation on a large scale, which changed the trend increasing farmland fragmentation and reduced the spatial difference of farmland fragmentaion in each county, the coefficient of variation of the comprehensive index of farmland fragmentation decreased to 0.041 by 2018. Conclusion It is necessary to further promote the comprehensive consolidation of rural land, innovate and improve the renovation mode and include the control of fragmentation and the promotion of connectivity of farmland as part of farmland protection assessment so as to reduce the fragmentation of farmland. [Ch, 2 fig. 2 tab. 21 ref.] -
核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析运用
SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。1.2.2 植株的培养
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
1.2.3 核桃JrAMT2基因阳性鉴定
选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物Table 1 Primers引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
1.2.4 生长参数、铵态氮和硝态氮测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
1.2.5 植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
1.2.6 数据分析
利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
2.2 核桃JrAMT2过表达植株阳性验证
在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia2.3 核桃JrAMT2基因的生物学功能分析
2.3.1 核桃JrAMT2过表达植株生长表型分析
为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings2.3.2 核桃JrAMT2过表达植株对氮素吸收分析
为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
2.3.3 核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光特性分析
对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
3. 讨论
氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
4. 结论
JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
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图 1 嘉兴市各县(市、区)耕地破碎化综合指数
Figure 1 Farmland fragmentation comprehensive index of different counties in Jiaxing
图 2 嘉兴市耕地破碎化时空演变示意图
Figure 2 Jiaxing’s farmland fragmentation and spatio-temporal change
表 1 嘉兴市区域概况
Table 1. General context of Jiaxing City
市(区、县) 2019年土地面积/km2 2019年常住人口/万人 2019年GDP/亿元 2017年耕地面积/hm2 2018年耕地面积/hm2 嘉兴市 4 230 480.00 5 370.32 205 355 204 897 南湖区 439 68.29 765.37 22 379 22 142 秀洲区 548 62.90 676.35 29 089 28 961 嘉善县 507 59.20 626.81 26 618 26 571 海盐县 590 45.10 539.65 26 019 25 945 海宁市 863 87.83 1 026.57 32 981 33 117 平湖市 557 70.35 765.77 29 321 29 236 桐乡市 727 86.33 968.17 38 947 38 925 说明：数据来源于《嘉兴市2020年统计年鉴》；GDP为国内生产总值 
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表 2 耕地破碎化指标体系
Table 2. Index system of farmland fragmentation
指标名称 公式 说明 单位耕地面积(UFA) AUF=AT/QT AUF为单块耕地面积，AT为区域内的耕地总面积，QT为区域内耕地的 总数量。单位耕地面积越大说明耕地的破碎化程度越低，区域内 的耕地越趋向规模经营 耕地密度(FD) DF=QT/AT DF为耕地密度，AT为区域内的耕地总面积，QT为区域内耕地的总数 量。耕地密度是指单位面积的耕地上拥有的耕地数量，耕地密度越大 说明耕地破碎化程度越高，耕地分割越严重 边界密度指数(ED) DE=PT/AT DE为边界密度指数，PT为区域内耕地斑块总周长，AT为区域内耕地总 面积。边界密度指数以单位面积内的耕地地块周长为表征，边界 密度越大说明区域内耕地被划分为更多地块，区域的耕地破碎化程 度越高 区域内地块形状指数(TSI) ITS=${\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{ {Q_{\rm{T}}} } {\left( {\dfrac{ {0.25{P_i} } }{ {\sqrt { {A_i} } } } } \right)} ({A_i}/{A_{\rm{T}}})}$ ITS为区域内地块形状指数，QT是区域内耕地总数量，Pi是区域内i地块周 长，Ai是第i地块面积，AT是耕地总面积。区域内地块形状指数 根据地块周长小的地块形状更规则的原理得到，形状规则的地块 更有利于规模经营。区域内地块形状指数越大，破碎化程度越高 地块数量破碎化指数(FIQ) IFQ=(NT−1)ATmin/AT IFQ为地块数量破碎化指数，NT是区域内耕地斑块总数，ATmin是区域 内最小的耕地斑块的面积，AT是区域内耕地斑块总面积。该指数的数 值为0~1，最小地块的面积越小、区域内耕地地块的数量越少，耕地 的破碎化程度越低。相反则耕地的破碎化程度越高 地块形状破碎化指数(FIS) IFS=1−1/IPS
IPS=${\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{ {Q_{\rm{T} } } } {\left( {\dfrac{ {0.25{P_i} } }{ {\sqrt { {A_i} } } } } \right)} /{Q_{\rm{T}}} }$IFS为地块形状破碎化指数，QT是区域内耕地总数量，Pi是区域内i地 块周长，Ai是第i地块面积，IPS是区域内地块形状指数的平均值。 区域内耕地地块周长越长，形状越不规则，地块的形状破碎化指数 越高
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