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园林绿化废弃物资源化利用[1-2]已成为研究热点，其中堆肥化是一种比较理想的处理方式。由于园林绿化废弃物木质素含量较高、起始微生物数量较少等原因，堆肥效率较低，因此如何提高堆肥过程中的微生物数量成为推进园林绿化废弃物堆肥的关键[3-4]。添加微生物菌剂是提高堆体微生物数量最直接的方式之一。目前，针对木质素降解的菌剂较少，且多集中于液体菌剂。然而液体菌剂对无菌条件要求较高，运输及产品储存有诸多不便[5]。固体菌剂在生产和储存方面能弥补液体菌剂的不足，同时，固体菌剂生产成本更低、生产工艺也相对简单，对促进园林绿化废弃物堆肥化过程的优势更明显[6]。生产固体菌剂，除了设计固体发酵的培养基，还要优化其发酵条件，主要流程为试验设计、数学建模和优化设计3个部分[7]。合理的试验设计能用较少的试验数据进行建模，从而获取各因素范围内的最优解。已有研究对于固态发酵的优化多是使用响应面法[8-9]。但是有研究发现[10]：人工神经网络算法优化培养基比响应面法优化培养基验证结果更准确，误差更小。本研究拟采用单因素试验和正交试验确定作为固态发酵培养基碳源、氮源的较优种类和水平，然后根据碳氮源优化结果，通过单因素试验确定外加营养组分种类，最后采用均匀实验结合人工神经网络建模与优化，寻找2株木质素降解菌的外加营养组分接种量和最佳固体培养基发酵条件，以期得到最大发酵生物量，制作高效固体菌剂用于园林绿化废弃物堆肥。
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菌株A为构巢曲霉Aspergillus nidulans、菌株Q为栓菌属1种Trametes sp.，均由北京林业大学土壤生物学实验室分离并保藏。
PDA培养基：马铃薯浸汁(200.000 g土豆去皮去芽，切成小块，加蒸馏水1 L保持微沸30 min后过滤)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨15.000 g，琼脂 20.000 g，pH自然。PDB液体培养基：马铃薯浸汁(同PDA培养基)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨15.000 g，pH自然。以上所有培养基均121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
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①菌株活化。将接种环置于酒精灯上燃烧，待冷却后挑取PDA斜面上的少许菌株接种至PDA培养基，封口后置于恒温培养箱活化。②液体菌种培养。将活化后纯培养的目标菌株的PDA培养基接至放有玻璃碎片的PDB液体培养基的三角瓶中，在IS-RDD3台式恒温振荡器中以25 ℃、200 r·min−1条件下培养5 d。③固态发酵。以30.000 g麸皮为发酵基质，添加碳氮源以及外加营养组分，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后，冷却至室温备用。将液体菌种按20%的接种量(物料干质量)加入无菌水中混匀，接入物料，调节料水比，搅拌均匀后置于25 ℃条件下培养7 d，重复3次。
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①碳氮源筛选。采用单因素试验筛选固体发酵培养基的碳氮源种类。以麸皮为发酵基质，在米糠、木质素磺酸钠、玉米粉、蔗糖中筛选碳源，在豆饼粉、蛋白胨、酒石酸胺、尿素中筛选氮源，比较不同碳氮源对2株木质素降解菌生物量的影响，以选择能促进菌体生长发育的最佳碳氮源。采用L9(34)正交试验确定最佳添加量。根据最佳碳氮源的筛选结果，选择3个吸光度D(260)相对较高的添加量梯度进行L9(34)正交试验，探究碳氮源添加量对2株木质素降解菌生物量的影响，优化固态发酵基质配方。②外加营养组分筛选。采用单因素试验确定添加物质种类。以麸皮为发酵基质，在最佳碳氮源的基础上中添加营养组分：硫酸钙(CaSO4)、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、氯化钠(NaCl)进行外加营养组分筛选，重复3次，选择3个D(260)最大的作为外加营养组分的种类，确定外加钙盐、镁盐、磷酸盐等对菌株A和菌株Q生长的影响。③培养基配方优化。采用均匀实验设计结合人工神经网络建模，进一步优化固态发酵培养基的外加营养组分添加量及其他发酵条件。
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将液体菌种用纱布过滤，同时以无菌水充分洗涤过滤物，过滤物即为纯菌体，在65 ℃的条件下烘干至恒量，留存备用。精密称取纯菌体0.010、0.030、0.050、0.100、0.150和0.200 g，加入25.000 mL体积分数为5%三氯乙酸溶液，80 ℃恒温水浴中搅拌提取25 min，取出后冰浴冷却，在4 ℃、8000 r·min−1条件下离心15 min，稀释2倍，以体积分数为5%的三氯乙酸为对照，用分光光度计测定D(260)，构建标准回归曲线。发酵物置于65 ℃条件下烘干至恒量，取0.500 g烘干至恒量的固态发酵物测定D(260)(与上述提取纯菌体中核酸的方式相同)。同时，以发酵7 d但未接种种子液的固态发酵物作为空白对照，在260 nm处测定提取液的D(260)，通过标准回归曲线预测菌丝干质量。
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①数据采用Excel 2007和SPSS 22.0处理。碳氮源优化用单因素方差分析法，平均值多重比较用LSD最小显著性差异法(P＜0.05)。②采用均匀实验实现人工神经网络建模与优化。其一，基于Smooth L1损失函数的人工神经网络构建。该网络借鉴U-Net架构设计了编码器和解码器，添加了残差连接[11]，以缓解网络退化问题[12]，并采用Smooth L1损失函数[13]最小化观察值与模型预测值的误差。损失函数如下所示：SmoothL1(x)
$ = \left\{ {\begin{array}{*{20}{c}} {\begin{array}{*{20}{l}} {0.5{x^2}}\\ {|x| - 0.5} \end{array}}&{\begin{array}{*{20}{c}} {{\text{假如}}\;|x| {\text{＜}} 1}\\ {{\text{否则}}} \end{array}} \end{array}} \right.$ 。其二，基于AdamW算法[14]寻优。神经网络、AdamW算法基于Pytorch[15]实现。 -
由图1可知：2株木质素降解菌菌丝中的核酸量与菌丝干质量在测试的范围之内可呈现良好的线性关系，说明通过测定D(260)来确定2株木质素降解菌固态发酵生物量的方法可行。菌株Q的线性方程为yQ=4.349 3x+0.044 6，R2=0.998 6；菌株A的线性方程为yA=4.081 4x+0.046 3，R2=0.995 7。
图 1 菌丝中核酸量与菌丝干质量的关系
Figure 1. Relationship between the amount of nucleic acid in mycelium and the amount of mycelium
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由图2可知：菌株A的4种碳源处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但木质素磺酸钠的D(260)最高，分别较米糠、玉米粉和蔗糖处理高出14.900%、8.800%和8.200%。菌株Q的3种碳源处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但玉米粉的D(260)最高，分别较木质素磺酸钠、米糠和蔗糖处理高出6.900%、3.600%和0.900%。菌株A为构巢曲霉，分泌的木质素降解相关酶系降解木质素效果显著[16-17]，同时木质素磺酸钠是木质素磺化改性得到的衍生化产品，因此，相比其他3种碳源，木质素磺酸钠更有利于促进菌株A细胞的快速生长，获得较高的菌丝生物量[18]。菌株Q在以玉米粉为碳源时的生物量最高，可能是因为玉米粉中含有大量的糖分、淀粉、多种矿质元素和维生素, 这些营养物质有利于菌株Q的生长繁殖[19]。因此，选择木质素磺酸钠作为菌株A的碳源，选用玉米粉作为菌株Q的碳源。
图 2 碳源对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 2. Effect of carbon source on the biomass of two lignin-degrading bacteria
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由图3可知：菌株A的4种氮源处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但豆饼粉的D(260)最高，分别较蛋白胨、酒石酸胺和尿素处理高出4.300%、3.000%和15.600%。菌株Q的D(260)在以豆饼粉为氮源时最高，且与其他处理差异显著(P＜0.05)，分别较蛋白胨、酒石酸胺和尿素处理高出6.700%、8.200%和14.400%。豆饼粉含大量碳水化合物、蛋白质及少量异黄酮类物质和可溶性多糖，可作为发酵的氮源及生长因子，有利于生物量的积累[20-21]。同时，豆饼粉来源稳定，价格低廉，能够快速被微生物利用，因此，选用豆饼粉为后续实验中菌株A和菌株Q的氮源。
图 3 氮源对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 3. Effect of nitrogen source on the biomass of two lignin-degrading bacteria
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由图4所示：菌株A在以木质素磺酸钠为最佳碳源时，添加量为2.500%、5.000%、10.000%处理间的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但是数值相对较高。因此，菌株A的木质素磺酸钠选用2.500%、5.000%、10.000%添加量进行正交试验。菌株Q在以玉米粉为最佳碳源时，添加量为5.000%时D(260)值最高，与其他处理差异显著(P＜0.05)，0.625%、2.500%的D(260)也相对较高，因此，菌株Q的玉米粉选用0.625%、2.500%、5.000%添加量进行正交试验。菌株Q在添加量为5.000%时生物量达到最高，可能是由于在培养空间一定时，玉米粉的添加量越多，通气量降低，导致生物量的积累下降从而使菌株Q的生长受到了一定的抑制[16]。由图5可知：菌株A以豆饼粉为最佳氮源时，5种不同添加量处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)。添加量为10.000%时D(260)最高，但是从经济角度考虑，最终选择豆饼粉添加量为1.250%、2.500%、5.000%进行正交试验。菌株Q以豆饼粉为最佳氮源时，添加量为1.250%、5.000%、10.000%时的D(260)显著高于另外2个添加量，因此选择这3个梯度进行正交试验。
图 4 碳源添加量对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 4. Effect of carbon source addition on the biomass of two lignin-degrading bacteria
图 5 氮源接种量对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 5. Effect of nitrogen source inoculum on the biomass of two lignin-degrading bacteria
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由表1和表2可知：菌株A的碳氮源添加量为木质素磺酸钠5.000%、豆饼粉5.000%时D(260)最大，高达0.249。菌株Q的碳氮源添加量为玉米粉0.625%、豆饼粉10.000%时D(260)最大，高达0.261。因此选定菌株A的碳氮源添加量为木质素磺酸钠5.000%和豆饼粉5.000%，菌株Q的碳氮源添加量为豆饼粉10.000%和玉米粉0.625%。
表 1 菌株A正交设计试验L9(34)
Table 1. Orthogonal design experiment of strain A L9 (34)
处理 豆饼粉/% 木质素磺酸钠/% D(260) T1 1.250 2.500 0.228±0.009 T2 1.250 5.000 0.241±0.001 T3 1.250 10.000 0.207±0.018 T4 2.500 2.500 0.216±0.007 T5 2.500 5.000 0.213±0.008 T6 2.500 10.000 0.245±0.010 T7 5.000 2.500 0.237±0.010 T8 5.000 5.000 0.249±0.003 T9 5.000 10.000 0.241±0.007 表 2 菌株Q正交设计试验L9(34)
Table 2. Orthogonal design experiment of strain Q L9 (34)
处理 豆饼粉/% 玉米粉/% D(260) T1 1.250 0.625 0.101±0.003 T2 1.250 2.500 0.224±0.006 T3 1.250 5.000 0.214±0.005 T4 5.000 0.625 0.101±0.003 T5 5.000 2.500 0.162±0.008 T6 5.000 5.000 0.232±0.020 T7 10.000 0.625 0.261±0.003 T8 10.000 2.500 0.191±0.002 T9 10.000 5.000 0.102±0.003 -
由图6表明：菌株A的5种外加营养组分处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但外加CaSO4、MgSO4、KH2PO4时的D(260)值最大，因此，这3种被定为最佳外加营养组分。微生物除了碳源和氮源，还需要一定量的无机盐来调节其生长代谢。镁盐作为许多重要酶的激活剂能够影响蛋白质的合成以及基质氧化；磷则是核酸和蛋白质的重要组成成分，能够影响微生物的生长[22]，这与本研究结果一致。
图 6 菌株A和菌株Q在不同营养组分培养基上的生长
Figure 6. Growth of strain A and strain Q on the medium with different nutrient components
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在以2.2.4和2.3实验结果为前提的条件下，设计6因素5水平10组的均匀实验。再通过神经网络对所有数据进行预测，得到实测值与仿真值的对比(表3和表4)。结果发现：各观察值与测量值误差较小，基本相同。综上，该模型预测值具备参考性。
表 3 菌株Q均匀实验设计及结果
Table 3. Strain Q uniform test design and results
试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4110 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4109 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4500 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4499 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4800 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4801 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4430 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4431 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3860 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3859 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4620 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4619 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4630 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4635 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2930 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2929 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4450 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4453 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4230 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4231 表 4 菌株A均匀试验设计及结果
Table 4. Strain A uniform test design and results
试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) CaSO4 MgSO4 KH2PO4 接菌 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 -
如表5所示：按照人工神经网络算法模型预测的优化后固体发酵培养基进行实验验证，该优化条件下菌株Q的D(260)为0.6020，实测值为0.5960，误差为1.000%；预测得到菌株A的D(260)为0.4850，实测值为0.4780，误差为1.500%。
表 5 人工神经网络寻优结果
Table 5. Optimization results of artificial neural network
试验号 实际用量/% D (260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 菌株Q仿真值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.6020 菌株Q实测值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.5960 菌株A仿真值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4850 菌株A实测值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4780 -
本研究结果表明：人工神经网络算法优化后菌株Q的预测值为0.6020，实测值为0.5960，误差为1.000%；菌株A的预测值为0.485，实测值为0.478，误差为1.500%。基于人工神经网络构建的模型拟合度较好。
根据单因素试验和人工神经网络算法结果，确定了2株木质素降解菌的最优固体发酵条件。菌株Q：固体菌剂培养基基质为麸皮30.000 g作为基底，添加豆饼粉10.000%和玉米粉0.625%，外加营养组分为MgSO4 1.434%、KH2PO4 0.115%和FeSO4·7H2O 1.497%；接种条件为接菌量6.000%、料水比1.000∶0.992、保护剂1.000%。菌株A：固体菌剂培养基基质为麸皮30.000g作为基底，添加豆饼粉5.000%和木质素磺酸钠为5.000%，外加营养组分为MgSO4 0.123 %、KH2PO4 0.213 %、FeSO4·7H2O 1.280%；接种条件为接菌量21.000%、料水比1∶1、保护剂19.000%。
Preparation of two strains of lignin-degrading bacteria solid inoculum
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摘要:
目的 以2株不同的木质素降解菌[菌株A(构巢曲霉 Aspergillus nidulans) 、菌株Q(栓菌属1种 Trametes sp.)]为材料，分别制作应用于园林绿化废弃物降解或者堆肥的高效固体发酵菌剂。 方法 采用单因素试验确定固体发酵培养基的碳氮源和外加营养组分种类，再通过正交试验对碳氮源添加量进行优化，最后根据碳氮源优化结果，采用均匀实验结合人工神经网络算法寻找2株木质素降解菌的外加营养组分接种量和最佳固体培养基发酵条件。 结果 优化后的菌株Q固体菌剂培养基基质以麸皮30.000 g作为基底，添加豆饼粉3.000 g和玉米粉0.188 g；外加营养组分(按基质的质量比)为硫酸镁(MgSO4) 1.434%、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.115%和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)1.497%；接种条件为接菌量6.000%、料水比(质量比)1.000∶0.992、保护剂1.000%。优化后的菌株A固体菌剂培养基基质以麸皮30.000 g作为基底，添加豆饼粉1.500 g和木质素磺酸钠1.500 g；外加营养组分(按基质的质量比)为MgSO4 0.123%、KH2PO4 0.213%、FeSO4·7H2O 1.280%；接种条件为接菌量21.000%、料水比1∶1、保护剂19.000%。菌株Q和菌株A在优化培养基上发酵7~9 d获得最大发酵生物量，菌株Q的吸光度D(260)为0.596，菌株A的D(260)为0.478。 结论 2株木质素降解菌在优化后的发酵条件下制得的固体菌剂具有高生物量的特点，在降解园林绿化废弃物的木质素方面具有一定潜力。图6表5参22 Abstract:Objective With two different lignin-degrading bacteria, strain A (Aspergillus nidulans) and strain Q (Trametes sp.) used as materials, this study is aimed to research the production of high-efficiency solid fermentation inoculants for degradation or composting of garden greening wastes. Method First, a single factor experiment was employed to determine the types of carbon and nitrogen sources and additional nutrient components of the solid fermentation medium. Then, the orthogonal experiment design was adopted to optimize the amount of carbon and nitrogen sources to be added, based on which, efforts were made to figure out the inoculation amount of additional nutrient components and the best solid medium fermentation conditions of the two lignin-degrading bacteria using a uniform experiment combined with the artificial neural network algorithm. Result The optimized solid inoculum medium matrix (mass ratio) of strain Q was with 30.000 g bran as the base, 3.000 g soybean meal powder and 0.188 g corn flour added, with extra nutrients (based on the mass ratio of the matrix) being MgSO4 1.434%, KH2PO4 0.115%, FeSO4·7H2O 1.497% whereas the inoculation conditions being 6.000% of inoculation, with the ratio of material to water as 1.000∶0.992, and the protective agent as 1.000%. The optimized solid inoculum medium matrix (mass ratio) of strain A was with 30.000 g bran as the base, 1.500 g soybean meal powder and 1.500 g sodium lignosulfonate were added, with extra nutrients (based on the mass ratio of the matrix) being MgSO4 0.123%, KH2PO4 0.213%, FeSO4·7H2O 1.280% whereas the inoculation conditions being 21.000% inoculation amount with the ratio of material to water as 1∶1 and the protective agent as 19.000%. Strain Q and strain A were fermented on the optimized medium for 7−9 days to get the largest fermentation biomass with the D(260) value of strain Q being 0.596 and the D(260) value of strain A being 0.478. Conclusion The solid inoculum prepared by two lignin-degrading bacteria under optimized fermentation conditions were featured with high biomass and certain potential for degrading the lignin of landscaping wastes. [Ch, 6 fig. 5 tab. 22 ref.] -
Key words:
- lignin-degrading bacteria /
- optimization /
- solid inoculum /
- fermentation
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山麦冬Liriope spicata为百合科Liliaceae多年生草本植物，在园林绿化中多栽培于林下或林缘半阴处，掩饰裸露土壤，起到补充绿地改善不良景观的作用。山麦冬属Liriope植物只有8种，中国栽培6种，其中包含3个特有种，但山麦冬属植物分布广泛，除极寒地区及高海拔地区外，中国各省均有分布，其地理分布受人为栽培引种因素影响很大，没有特定的地理分布规律[1]。山麦冬成熟时果实表皮由绿转黑，9月结果后观果时期可长达整个冬季，且其花葶较长多矗立于叶子的上方，易于观察，具有很高的园林应用价值。目前，针对山麦冬成熟过程中呈色物质及调控基因尚未报道，但花青素合成途径在植物中是保守的，合成途径中上游合成基因是决定植物组织能否积累花青素的关键[2]，而下游修饰基因的表达常与花青素的积累一致，是加深果色花色的关键基因[3-5]。此外，花青素的积累还受转录因子的调控，其中以MYB转录因子与bHLH转录因子最为常见[6]。
用于基因表达定量分析的方法比较多，其中实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于定量准确、成本低且高通量，被广泛应用于基因表达水平研究。但其结果常受RNA质量、反转录效率、引物特异性、初始样品量及扩增效率等因素的影响[7-8]，需要引入1个或多个表达稳定的内参基因(reference genes, RGs)来评估目的基因的相对表达[9]。在植物学研究中，曾以肌动蛋白(actin，ACT)[10-12]、组蛋白(histone)[11]、蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP2A)[13]、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)[12]、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)[14-15]以及18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S)[16]等基因作为内参基因。但是常见的内参基因也并非适用于任何研究，且目前还未见山麦冬内参基因的报道。鉴于此，本研究基于山麦冬转录组数据，对山麦冬果实发育中稳定表达的内参基因进行研究，为提高果色转变关键基因RT-qPCR分析的准确性提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学资源圃，选取生长环境相同，且植株生长状况良好、长势整齐的山麦冬，随机均匀采集15~20株山麦冬植株的各一簇花葶的上、中、下部分果实，基于山麦冬果实生长特性，采集山麦冬幼果期(2020年9月)及成熟期(2020年11月) 2个时期样品，果实从花葶中取下后立即存于−80 ℃冰箱备用。设置3次生物学重复。
1.2 总RNA提取及cDNA合成
使用天根离心柱型RNA试剂盒(天根生物科技有限公司)从每个时期样本中提取总RNA。采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。总RNA的纯度和质量浓度采用NanoDrop ONE微量核酸蛋白浓度测定仪(Therm，美国)测定。总RNA样本质量浓度均高于4×10−5 ng·L−1以上，总RNA纯度[D(260)/D(280)]为1.9~2.1。cDNA的合成使用PrimerScript™ RT Master Mix cDNA (Perfect Real Time)反转录试剂盒，所有样本总RNA加入量按照3×10−5 ng·L−1稀释至同一质量浓度，cDNA置于−20 ℃冰箱保存。
1.3 候选内参基因的筛选及RT-qRCR
基于已获得的山麦冬转录组数据及京都基因与基因组百科全书(KEGG)注释，筛选了多条通路的基因作为内参基因参考库，包括参与山麦冬果实运输和分解代谢的基因(SLC36等)，参与代谢过程的基因(PP2C、MGL、PDP、G6PD等)，参与信号传导与转运的基因(AUX、GPR107、CNNM等)，参与细胞过程的基因(CFL等)，参与植物免疫的基因(Trx等)，参与遗传信息处理的基因(UGT、PP2A、EF1-α等)共1 648个，参考前人对内参基因的筛选阈值稍作修改后[11-13]，以每千个碱基转录每百万映射读取的片段(FPKM)高于5的基因(低表达的难以检测)、变异系数＜0.1、变化倍数＜0.2为筛选条件，得到前15个候选内参基因(表1)。
表 1 山麦冬15个候选的内参基因Table 1 15 candidate reference genes of L. spicata基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数SLC36 solute carrier family 36 0.003 0.001 CFL cofilin 0.061 0.178 PP2C protein phosphatase 2C 0.007 0.019 UGT UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase 0.064 0.184 Trx-1 thioredoxin 0.037 0.107 PP2A protein phosphatase 2A 0.064 0.185 MGL monoacylglycerol Lipase 0.043 0.123 EF1-α elongation factor 1-alpha 0.067 0.193 AUX auxin influx carrier 0.050 0.144 G6PD-1 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.068 0.197 GPR107 G protein-coupled receptor 107 0.056 0.161 G6PD-2 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.045 0.130 PDP pyruvate dehydrogenase phosphatase 0.058 0.169 Trx-2 thioredoxin 1 0.065 0.186 CNNM cation transport mediators 0.061 0.177 根据转录组获得的核酸序列信息，利用primer 5软件设计引物，并交由杭州有康生物技术有限公司合成(表2)。利用TB Green染料(Takara)预反应，体积20 μL，并使用LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)进行RT-qPCR。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火延伸30 s，40个循环。实验设置3次生物学重复。扩增效率(cDNA稀释浓度梯度为5−1、5−2、5−3、5−4、5−5)计算公式为E=[10(−1/K)–1]×100%，其中：E为扩增效率，K为斜率。15个候选内参基因的扩增效率为91.7%~108.0%(表2)。
表 2 15个候选内参基因的引物序列和扩增子特征Table 2 Primer sequences and amplicon characteristics of 15 candidate reference genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 SLC36 GTAAGTTTCGCCGAGTGCTT ACTGCAGTAGCAGACCAGTT 148 91.7 0.982 PP2C TGGGCCATGATGTTCCAGAT AGTACACGCAGTCTTCACCT 77 94.8 0.999 Trx-1 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 72 102.0 0.999 MGL AATGCCTTCACTGGAACAGC GCCGCCAAGTGAGTAAACAA 138 101.0 0.994 AUX TGCAGAGAAACCACCCTTCT CCGAATCCAAATCCGACCAC 99 91.7 0.949 GPR107 ACAGGTGATTGCGAACATCG CTTCGACGTCTCCTTCAACG 166 105.0 0.906 PDP GACGGAGGTCGGTTGGATTT CTGCACATGCATCATCACGA 124 96.2 0.976 CNNM GCTGCACTAACTCCAGCTTC GGCACAACTGTGGTCAACAT 86 96.8 0.999 CFL CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GTTGGATCGGTCGCTTGTAG 153 107.0 0.992 UGT TGGAAGCATCCTCACTTGACT TGTCTTCAAATTAGGGTTAGCGA 83 93.5 0.994 PP2A GAGTCGGAGAGGTCGAAGAG GCGGAGCAATTCCTACCATC 121 99.2 0.975 EF1-α CAAGCGTCCCACTGACAAG CCAGGCTTGAGGATACCAGT 111 101.0 0.998 G6PD-1 GATGCAACAGGCCAGAAGAG AGTGCAAACAGTGCAGGAAA 104 97.9 0.996 G6PD-2 ATAACGTTGCCCTCTCCACA ATCCAACTGCAATCCAAGCC 107 108.0 0.999 Trx-2 GTGGTGCACCGTCAGTAAAC CGCTGTGGTTGATGTCTCTG 113 96.0 0.992 1.4 内参基因的稳定性分析及验证
通过4种方法分析内参基因的稳定性：ΔCt值法[17]、geNorm[18]、NormFinder[19]和BestKeeper[20]。利用Excel 2010计算4种方法对候选内参基因几何平均数的排名，综合筛选最适的内参基因。同时根据前期转录组数据筛选了10种目的基因，涵盖花青素合成通路上下游基因以及调控基因。这10种基因在转录组数据加权共表达分析中属于中枢基因，表达量高、与花青素相关性强，且在果实成熟过程中显著上调。目的基因包括C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH，上述基因引物序列及扩增子特征见表3，最后利用SPSS 19.0与Graphpad Prism 8.0分析及作图。
表 3 10个目的基因的引物序列和扩增子特征Table 3 Primer sequences and amplicon characteristics of 10 target genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 C4H TCTTTGATCACGGCTTGCAG ATGAGATCGACACCGTCCTC 88 109.0 0.992 CHS-1 TGCATTGCACCAGTAGTAGC GCCCTCCTGATCTCCTCAAC 122 104.0 0.995 CHS-2 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 82 91.7 0.997 MT CCACCGAGAGCAAGAACAAC GGGTACACACTGGTCTCCAA 112 96.2 0.999 UFGT-1 AGCAAGGTGTTGAAGGAGGA AAATTCCGAACCGAGCTTCC 110 91.7 0.935 UFGT-2 CGACGGATCCCATTCGACTA CGCCGCTCCTCCTATTAAC 57 92.9 0.996 MYB-1 GCAAGATCAGGTCCTCCTCA CAAAGTACGTGGCGAAGGAG 162 107.0 0.975 MYB-2 ATGGGAAGATGGTGGCCTTT GAAGGGTGCACAGCTTCAG 70 91.7 0.986 MYB-3 CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GGTGCTTGTTGAGAGAGCTG 172 105.0 0.996 bHLH TGCTTAGCAATGGCAACAGG GGCTGCTGACCAGAAGATTG 123 101.0 0.998 2. 结果与分析
2.1 山麦冬候选内参基因的表达量分析
15个候选内参基因的溶解曲线均为单一峰(图1)，琼脂糖凝胶电泳检测后出现与预期大小一致的单一条带(图2)。该结果表明引物具有良好的特异性。
图 2 15个候选内参基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Figure 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of the fifteen reference genes根据原始循环阈值(Ct)分布发现：所有候选内参基因的Ct为15.53~28.81，Ct越高，基因的表达量越低，反之表达量越高。本研究中，EF1-α基因表达量最高，PP2C基因表达量最低，其余基因表达量介于两者之间。此外，由箱线图(图3)跨度可初步判定内参基因的稳定性。PP2C、Trx-1、AUX、PP2A、PDP基因的Ct跨度广，不稳定，而GPR107、CNNM、EF1-α、G6PD-2、Trx-2基因最为稳定，其中GPR107、CNNM、G6PD-2基因的Ct中位数与平均数接近，即上述基因相对表达量离散程度低，表达更稳定。然而对原始Ct分析内参基因稳定性的不足，还需引入其他的方法。
2.2 内参基因的稳定性分析
利用ΔCt法、geNorm、NormFider和BestKeeper对15个候选内参基因的稳定性进行分析(表4)。
表 4 4种方法评价15个候选内参基因表达的稳定性Table 4 Expression stability of 15 candidate reference genes evaluated by 4 methods内参基因 ΔCt geNrom NormFinder Beatkeeper 标准差 基因平均表达值 基因稳定值 标准差 变异系数 相关系数 SLC36 2.632 0.854 0.173 0.569 2.523 0.671 PP2C 2.321 0.927 0.416 0.828 3.070 0.824 Trx-1 2.663 1.130 0.510 0.852 3.964 0.832 MGL 2.673 1.007 0.493 0.885 3.918 0.918 AUX 2.652 1.094 0.598 1.063 4.430 0.882 GPR107 2.617 0.817 0.167 0.489 2.253 0.728 PDP 2.737 1.390 0.831 0.642 2.571 0.462 CNNM 2.615 0.847 0.157 0.468 2.015 0.721 CFL 2.274 1.094 0.346 0.532 3.038 0.781 UGT 2.613 0.923 0.237 0.517 2.418 0.651 PP2A 2.693 1.054 0.568 1.057 4.671 0.511 EF1-α 2.127 0.895 0.286 0.393 2.347 0.687 G6PD-1 2.763 1.204 0.692 0.469 2.065 0.009 G6PD-2 2.636 0.880 0.334 0.290 1.323 0.750 Trx-2 2.663 0.989 0.465 0.417 1.790 0.487 ΔCt法是在原始Ct值的基础上，计算每个基因所有样本与其他基因的Ct值之差，并计算其标准差。一般平均标准差越低，基因稳定性越高。该方法中，EF1-α、PP2C、CFL、CNNM是山麦冬果实发育阶段最稳定的内参基因；PDP、G6PD-1、PP2A是最不稳定的内参基因。
geNorm软件通过平均表达值来描述候选内参基因的稳定性，同时还能计算归一化因子之间的两两变异(Vn/n+1，其中n为可使RT-qPCR结果准确的最少基因数目)。该方法中，所有基因的平均表达值都在1.5以下(稳定内参基因的临界值)，即该方法判定下的所有基因都可作为内参基因，其中GPR107(0.817)与CNNM(0.847)基因的平均表达值最低，说明最稳定。同时PDP、G6PD-1基因的平均表达值最高，分别为1.390、1.204，最不稳定，这与ΔCt法判定结果一致。此外，利用geNorm计算2个归一化基因的Vn/n+1，确定适合量化果实生长过程的最优内参基因数目。geNorm首先计算2个最稳定的候选内参基因的归一化因子值，然后将剩余候选内参基因按其表达稳定性下降的顺序依次相加。如果基因之间的Vn/n+1大于或等于0.15，则进行RT-qPCR分析时应该再添加1个基因才能达到可靠的结果，一旦Vn/n+1低于0.15，就不需要添加额外的基因[21]。由图4可见：从V4/5开始Vn/n+1小于0.15，即需要使用4个内参基因才能得到可靠的RT-qPCR结果。
图 4 精确归一化的最佳内参基因数量Figure 4 Optimal number of control genes for accurate normalizationNormFinder软件可分析候选内参基因的两两变异性，其中稳定值越小，候选内参基因越稳定。CNNM与GPR107基因的稳定值最小，分别为0.157、0.167，即CNNM与GPR107基因最稳定，这与geNorm分析结果一致；此外，对最差的内参基因评价也与上述2种方法一致：PDP、G6PD-1、AUX是量化果实发育阶段最不适合的内参基因。
Bestkeeper与geNorm、NormFinder软件不同，需导入原始Ct值平均数，计算候选内参基因在所有样品中的标准差、变异系数、相关系数。一般地，稳定的内参基因拥有低的标准差、变异系数及高的相关系数。在Bestkeeper评价中，与geNorm、NormFinder分析结果一致，CNNM与PDP基因分别还是最稳定与最不稳定的内参基因。除此之外，还发现G6PD-2为该方法中最稳定的内参基因，其标准差与变异系数最低，分别为0.290、1.323，相关系数为0.750。
最后通过几何平均数对这4种方法的分析结果进行综合性排序(表5)。根据表5的排名与geNorm推荐的内参基因数目，筛选CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为标准化山麦冬果实RT-qPCR的最优内参组合，PDP为最差内参基因，通过4种算法得出的结果也与最初候选内参基因原始Ct值分布箱线图分析结果一致。
表 5 15个候选内参基因的综合排名Table 5 Comprehensive ranking of reference genes for normalization基因名 几何平均数 排名 基因名 几何平均数 排名 CNNM 2.340 1 PP2C 6.557 9 GPR107 2.913 2 MGL 8.572 10 EF1-α 3.162 3 AUX 10.602 11 G6PD-2 3.722 4 Trx-1 11.199 12 SLC36 5.350 5 G6PD-1 11.977 13 UGT 5.826 6 PP2A 12.368 14 CFL 5.925 7 PDP 14.491 15 Trx-2 6.160 8 2.3 内参基因稳定性的验证
为验证内参基因的有效性，选择10种花青素合成结构基因与调控基因作为目的基因。用单一内参基因：最优内参(CNNM)、最差内参(PDP)，及2种内参组合：排名前2位的内参基因(CNNM、GPR107)和排名前4位的内参基因(CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2)进行归一化。从图5可见：在山麦冬果实花青素合成过程中，使用4种内参方式归一化时，所有的目的基因都上调表达，但变化倍数稍有不同。在山麦冬果实成熟期，使用PDP基因作为内参时，所有目的基因相对表达量均显著高于其他3类，特别是对转录因子bHLH基因的量化时产生严重偏差，使用PDP基因与CNNM+GPR107+EF1-α+G6PD-2基因组合作为内参，bHLH基因的相对表达量分别为6.28与15.70，两者差异高达2.5倍。然而，当使用最优内参基因CNNM进行标准化时，除UFGT基因外，CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2内参组合无显著差异，使用CNNM基因标准化时，UFGT相较幼果期上调表达50.71倍，使用4种内参组合时，UFGT上调72.49倍。此外，本研究还分析了候选内参排名前2位的基因(CNNM、GPR107)作为目的基因的表达量，发现选用2种内参基因与geNorm软件推荐使用4种内参基因，在10个目的基因中均无显著差异。
图 5 不同内参基因归一化后10个目的基因的相对表达量Figure 5 Relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes从图6可见：利用最差内参PDP得到的目的基因表达量与4种内参基因组合得到的目的基因表达量相关系数为0.868 6 (P＜0.01)，当使用最优基因CNNM作为内参时，与4种内参组合相关系数可达0.991 6 (P＜0.01)。对2种内参组合与geNorm推荐的4个数目内参组合比较发现：通过这2种方法标准化得到的目的基因相关性可达0.999 9 (P＜0.01)，即仅使用CNNM、GPR107基因作为双内参也可达到geNorm软件推荐的4个内参数目组合的效果。
图 6 不同内参基因标准化后10种目的基因表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis for relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes3. 讨论
山麦冬作为一种优良的地被园林植物及药用植物，研究多集中于提高栽培技术及块茎产量，而针对园林观赏应用的研究较少。在本研究之前没有山麦冬内参的研究报道，作为沿阶草族植物，其近源种也仅有麦冬Ophiopogon japonicus抗逆性研究中曾以微管蛋白基因(tubulin)[22]及Actin [23]作为参考基因。但这2类基因在前期转录组筛选中由于变异系数及变化倍数在候选内参中就已经被排除。本研究根据几何平均数的综合排名，推荐使用内参基因CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为研究山麦冬花青素合成的最优内参组合。EF1-α、G6PD-2属于常见的内参基因，在植物生长发育、抗逆反应、代谢合成中已被广泛应用[24-25]。基于前期转录组数据，新型内参基因CNNM、GPR107也可作为RT-qPCR分析的内参基因，CNNM编码过渡金属转运蛋白，可参与多种金属吸收、排除及区分化[26]，GPR107编码G蛋白偶联受体107，广泛存在于细胞表面的膜蛋白，可参与植物体多种细胞信号转导及调控机制保守[27]。上述2种基因在山麦冬果实中表达稳定，其相对表达量平均值与中位数相近，离散程度低，且表达量适中，符合内参基因的标准。在观赏植物中，由于新型内参基因稳定性强于传统内参基因，常被选用标准化目的基因的表达。例如，在异型花柱连翘Forsythia suspensa中，转录组中变化微小的未知基因是研究花开放最适合的内参基因[28]；太行花Taihangia rupestris花器官有复杂的性别决定机制，鉴定两性花与雄性花的内参基因是编码铁硫簇组装蛋白、3-巯基丙酮酸硫转移酶与跨膜蛋白50的新型内参基因[11]。SmDnaJ基因在旱柳Salix matsudana各种非生物胁迫下表达最为稳定[29]。bHLH在观赏百合Lilium oriental×Trumpet hybrid体胚诱导、体胚发育中表达最稳定[30]，但bHLH是植物颜色育种中的重要靶基因，并不适合作为本研究的内参基因候选，这也证实了不同目标性状需采用不同的内参基因，没有一种内参基因是普适的。
花青素合成路径在植物中是保守的，其中MYB转录因子与bHLH转录因子可形成二元复合体，激活花青素合成酶基因[31-32]。大量研究表明：MYB、bHLH转录因子基因与花青素合成酶基因在紫色系植物组织发育过程中协同上调[3, 33-34]。为验证内参基因的结果，挑选了10个在山麦冬花青素合成调控网络的中枢基因(相关性强且表达量高)作为验证，其中包括转录因子与结构基因(C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH)，这10种基因在4种归一化方法下表达模式均显著上调，但趋势稍有不同，选用较差内参PDP标准化结果偏差最大，在山麦冬成熟黑果中所有基因都显著高于其他基因。尽管最优内参基因CNNM对目的基因的归一化可以达到与4种内参组合很高的相关系数，但对UFGT基因的量化存在显著差异，而UFGT基因作为花青素合成通路的下游修饰，对花青素积累至关重要，特别是在山麦冬这类组织颜色深即富含花青素的类型[2, 35]，例如在葡萄Vitis vinifera果皮[36]、玫瑰Rosa rugosa [37]、紫皮石刁柏Asparagus officinalis[33]中UFGT都被验证为关键基因，因此仅选用单一基因作为研究山麦冬果皮花青素积累的内参是不合适的，继而在CNNM基因基础上又引入GPR107来规避单内参基因的误差，该内参组合与geNorm推荐的内参组合相关系数最高，在10种目的基因的验证结果中与4种内参组合均无显著差异，且选用双内参组合比4种内参组合可操作性强，因此判定使用CNNM、GPR107作为双内参即可得到可靠的RT-qPCR结果。双内参组合联合使用可以减少实验因素对基因表达的影响，且结果更为准确。暴露于UV-B辐射下的番茄Lycopersicon esculentum幼苗不同组织都应选用特定的内参组合，例如叶中选用肌动蛋白基因与微管蛋白基因，而根中选用微管蛋白与UV-B抗性位点基因更加适合[38]；UBQ和EF1-α基因由于表达稳定，可作为内参基因用于鹅掌草Anemone flaccida各器官的不同发育阶段[39]。
4. 结论
本研究基于转录组数据筛选了15个候选内参基因，分析其在山麦冬果实不同时期的表达稳定性。经过10种目的基因验证后，表明以CNNM、GPR107基因作为组合是山麦冬果实花青素生物合成研究的最佳内参基因，而常用的内参基因却并不适用于本研究，这为筛选新型内参基因提供了新思路。
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图 1 菌丝中核酸量与菌丝干质量的关系
Figure 1 Relationship between the amount of nucleic acid in mycelium and the amount of mycelium
图 2 碳源对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 2 Effect of carbon source on the biomass of two lignin-degrading bacteria
图 3 氮源对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 3 Effect of nitrogen source on the biomass of two lignin-degrading bacteria
图 4 碳源添加量对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 4 Effect of carbon source addition on the biomass of two lignin-degrading bacteria
图 5 氮源接种量对2株木质素降解菌生物量的影响
Figure 5 Effect of nitrogen source inoculum on the biomass of two lignin-degrading bacteria
图 6 菌株A和菌株Q在不同营养组分培养基上的生长
Figure 6 Growth of strain A and strain Q on the medium with different nutrient components
表 1 菌株A正交设计试验L9(34)
Table 1. Orthogonal design experiment of strain A L9 (34)
处理 豆饼粉/% 木质素磺酸钠/% D(260) T1 1.250 2.500 0.228±0.009 T2 1.250 5.000 0.241±0.001 T3 1.250 10.000 0.207±0.018 T4 2.500 2.500 0.216±0.007 T5 2.500 5.000 0.213±0.008 T6 2.500 10.000 0.245±0.010 T7 5.000 2.500 0.237±0.010 T8 5.000 5.000 0.249±0.003 T9 5.000 10.000 0.241±0.007 
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表 2 菌株Q正交设计试验L9(34)
Table 2. Orthogonal design experiment of strain Q L9 (34)
处理 豆饼粉/% 玉米粉/% D(260) T1 1.250 0.625 0.101±0.003 T2 1.250 2.500 0.224±0.006 T3 1.250 5.000 0.214±0.005 T4 5.000 0.625 0.101±0.003 T5 5.000 2.500 0.162±0.008 T6 5.000 5.000 0.232±0.020 T7 10.000 0.625 0.261±0.003 T8 10.000 2.500 0.191±0.002 T9 10.000 5.000 0.102±0.003
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表 3 菌株Q均匀实验设计及结果
Table 3. Strain Q uniform test design and results
试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4110 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4109 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4500 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4499 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4800 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4801 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4430 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4431 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3860 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3859 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4620 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4619 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4630 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4635 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2930 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2929 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4450 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4453 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4230 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4231
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表 4 菌株A均匀试验设计及结果
Table 4. Strain A uniform test design and results
试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) CaSO4 MgSO4 KH2PO4 接菌 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210
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表 5 人工神经网络寻优结果
Table 5. Optimization results of artificial neural network
试验号 实际用量/% D (260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 菌株Q仿真值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.6020 菌株Q实测值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.5960 菌株A仿真值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4850 菌株A实测值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4780
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