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蚁巢伞属Termitomyces是一类与白蚁共生的真菌，隶属担子菌门Basidiomycota伞菌亚纲Agaricomycetidae离褶伞科Lyophyllaceae[1]，常于雨季自白蚁菌圃内破土而出，俗称鸡枞菌，其味道鲜美、经济价值高，但目前尚未开发出可行的人工栽培模式。白蚁菌圃内细菌种类相对丰富，主要有拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicute、放线菌门Actinobacteria、变形菌门Proteobacteria、螺旋体门Spirochaetes等，这些细菌在菌圃中超过85%[2]。白蚁菌圃由上层至中层，纤维素及半纤维素的相对含量保持稳定，自下层起，约69%不溶碳水化合物消失，并伴随可溶性单糖及寡糖增加[3-4]。PAULY等[5]研究表明：仅依靠白蚁自身难以完全降解木质纤维素，推测菌圃微生物也参与了木质纤维素的降解[6]。
蚁巢伞是白蚁菌圃内优势共生真菌，通过高通量测序手段证实菌圃内其他杂菌占比仅0.03%，杂菌中常见的有枝孢属Cladosporium、木霉属Trichoderma和伞状霉属Umbelopsis等[7]。菌圃开始消亡后，炭角菌属Xylaria及其他真菌会快速取代蚁巢伞占领整个菌圃[8]。但也有研究证实：菌圃中存在助益蚁巢伞的真菌，如云南地白蚁Hypotermes makhamensis菌圃中的真菌Gigantropanus sp.[9]、胖身土白蚁Odontoterme obesus后肠中的构巢曲霉Aspergillus nidulans[10]，两者均能与蚁巢伞协同降解木质纤维素。本研究参考SAWHASAN等[9]的对峙培养手段，探讨了菌圃细菌与蚁巢伞的互作关系，并使用高效液相色谱法分析了菌圃细菌降解木质纤维素能力与相应生成产物，旨在用“以菌促菌”的新思路探索蚁巢伞生长出菇的奥秘。
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供试黑翅土白蚁Odontotermes formosanus蚁巢采自福建省三明市大田县，室内26 ℃避光饲养。供试蚁巢伞分自黑翅土白蚁蚁巢，为实验室留存蚁巢伞菌株，经分子鉴定为Termitomyces heimii，GenBank登录号为KF302100[11]。菌圃外源细菌分离自铁皮石斛Dendrobium officinal，为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
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1/5 LB固体培养基：胰蛋白胨2.000 g、酵母提取物1.000 g、氯化钠2.000 g、琼脂粉14.000 g、蒸馏水1 L，pH 5；1/10 LB固体培养基：除琼脂粉外，其余依照1/5 LB培养基，配方减半，pH 5。
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1/5 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯40.000 g、葡萄糖4.000 g、琼脂粉14.000 g、蒸馏水1 L，pH 5；1/10 PDA：除琼脂粉外，其余物质依照1/5 PDA培养基，配方减半，pH 5；1/5 改良马丁固体培养基：蛋白胨1.000 g、酵母提取物0.400 g、葡萄糖4.000 g、磷酸氢二钾0.250 g、七水硫酸镁0.125 g、琼脂粉14.000 g、蒸馏水1 L，pH 5；1/10改良马丁固体培养基：除琼脂粉外，其余物质依照1/5 改良马丁固体培养基，配方减半，pH 5。倒平板时，向上述培养基中添加无菌水稀释后的氨苄青霉素和卡那霉素，至两者在培养基中终质量浓度分别为20.000和50.000 mg·L−1。
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玉米麸皮纤维素液体培养基：玉米粉20.000 g、麸皮10.000 g (玉米粉及麸皮煮熟后过4层纱布过滤)、磷酸氢二钾1.000 g、七水硫酸镁0.500 g、纤维素粉末5.000 g、蒸馏水1 L，pH 5；玉米麸皮双倍琼脂固体培养基同上述配方配制，不加纤维素粉末、琼脂粉28.000 g，pH 5。
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取上、中、下层菌圃各0.050 g混合。制备菌圃悬液：取0.010 g混合菌圃于2 mL离心管，加入1 mL无菌水，涡旋3次，每次30 s，静置5 min，取上清液。同时，将菌圃悬液系列梯度稀释为100、10−1、10−2、10−3用于后续试验。
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取300 μL稀释梯度为10−1、10−2、10−3的菌圃悬液，加入1/5 LB固体培养基与1/10 LB固体培养基后涂布均匀，设3组重复，28 ℃避光普通环境下培养2~3 d，并统计该培养条件下菌圃细菌的数量，菌株纯化2次后4 ℃保存。
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取小块菌圃，于1/5 PDA培养基、1/10 PDA培养基、1/5 改良马丁培养基和1/10 改良马丁培养基上，菌圃块间距为2 cm，设3组重复。取300 μL稀释梯度为100、10−1、10−2的菌圃悬液，分别加入上述培养基后均匀涂布，设3组重复，培养条件同1.2.2的细菌，同时统计该培养条件下菌圃真菌的数量。
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提取菌株DNA，选取通用引物27F和1492R扩增细菌16S rRNA基因片段，扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃ 5 min。聚合酶链式反应(PCR)产物送浙江尚亚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov )在线比对、鉴定菌株。 -
纯化后真菌培养5 d后送浙江尚亚生物技术有限公司，提取真菌基因组DNA，以其为模版，选取通用引物ITS1与ITS4扩增真菌ITS序列，测序后通过BLAST (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov )在线比对、鉴定菌株。 -
将分离菌圃细菌及贝莱斯芽孢杆菌分别接种至玉米麸皮纤维素液体培养基，于28 ℃、150 r·min−1普通环境下避光摇培24~28 h后，使用分光光度计调整细菌菌液浓度，选取吸光度D(600)为0.15时的细菌菌液作为种子液。取1 mL种子液分别加入100 mL培养基中，条件同上摇培5 d后，8 000 r·min−1离心10 min，取上清液备用。
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在直径60 mm培养皿中加入5 mL灭菌后菌液上清液，再加入5 mL玉米麸皮双倍琼脂固体培养基，摇晃至培养基均匀凝固。接种：灭菌打孔器取直径为5 mm的蚁巢伞菌饼接入玉米麸皮细菌菌液固体培养基中，于28 ℃普通环境下避光培养15 d，不同实验组设3组重复。阳性对照：将灭菌菌液替换为灭菌葡萄糖溶液(20 g·L−1)；阴性对照：将灭菌菌液替换为无菌水；中性对照：将灭菌菌液替换为灭菌后、过滤后玉米麸皮纤维素液体培养基；杂菌对照：将灭菌菌液替换为过滤后贝莱斯芽孢杆菌灭菌菌液。
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蚁巢伞菌丝生长速率测定：蚁巢伞在不同玉米麸皮细菌菌液固体培养基中培养至15 d时，十字交叉法记录菌丝直径，并计算生长速率。蚁巢伞生长形态观察：蚁巢伞在玉米麸皮细菌菌液固体培养基中培养至20 d时，照相记录生长形态。
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可溶性糖类物质标准品溶液：6种可溶性糖标准品经过(45±1) ℃干燥恒量后，分别称取1.000 g (精度0.100 mg)至100 mL容量瓶中，完全溶解后用少量无菌水定容，过0.22 μm水系滤头过滤。待测样品：取灭菌后细菌上清液，过0.22 μm水系滤头过滤。中性对照：取灭菌后玉米麸皮液体培养基，过0.22 μm水系滤头过滤。
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将可溶性糖类物质标准品溶液、待测样品及中性对照送浙江大学化学分析测试平台，使用高效液相色谱-示差折光检测仪(HPLC-RID)检测糖类物质种类与含量。仪器及检测条件如下：色谱仪为Waters 1525型液相色谱仪；检测器为Waters 2414示差折光检测器(美国Waters公司)；糖柱为BENSON 2000-0 BP-OA Organic Acid Column (7.8 mm×300.0 mm，日本)；流动相为去离子水；进样量为50 μL；柱温为80 ℃；检测器温度为40 ℃；流速为0.8 mL·min−1。
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将100 mm 1/5改良马丁培养基分为2个半圆区域，将直径为5 mm的蚁巢伞菌饼接种于一侧中心，28 ℃避光培养10 d后接种杂菌至另一侧，相同条件对峙培养20 d，设3组重复。
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移除菌圃内蚁王蚁后，在环境湿度为100%，温度为28 ℃避光放置，每隔24 h拍照记录。
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本研究从白蚁蚁巢菌圃中共分离19株细菌，分属厚壁菌门与变形菌门，在1/5 LB固体培养基中，菌圃中可培养细菌数为1.3×108 个·g−1。BLAST比对细菌16S rRNA基因序列，其中15株属于厚壁菌门，分别为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium (4株)、阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai (3株)、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus (3株)、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides (1株)、土杨芽孢杆菌Bacillus toyonensis (4株)；另外4株属于变形菌门，分别为Burkholderia sp. (待定) (2株)、Burkholderia sp. (1株)和Cupriavidus sp. (1株)。
本研究从蚁巢中分离出7个属，共12种真菌杂菌，在1/5 改良马丁培养基中，菌圃中可培养真菌数为2.8×104 个·g−1。通过BLAST比对真菌ITS序列，并结合形态学特征，分离的真菌分别为短密木霉菌Trichoderma brevicompactum、暗孢节菱孢菌Arthrinium phaeospermum、绿木霉菌Trichoderma virens、Penicillium pimiteouiense、小孢产丝齿菌Hyphodontia microspora、Coniochaeta fasciculata、歧皱青霉菌Penicillium steckii、枝状枝孢菌Cladosporium cladosporioides、Cladosporium velox、Paecilomyces sp. 和Ophiostomatales sp.、短密青霉菌Penicillium brevicompactum。
本研究发现：使用菌圃碎片进行真菌分离时，木霉属菌丝快速铺满培养基(图1A)。当菌圃悬液稀释至100再涂布后，培养基中分离得到的杂菌占比较大(图1B)，稀释至10−1时，培养基中分离到的蚁巢伞占比提高(图1C)，而稀释至10−2时，培养基中仅存在蚁巢伞分离株(图1D)，且对照组中未分离到杂菌(图1E)。菌圃杂菌仅在菌圃碎片及100菌圃悬液分离培养基中出现，推测菌圃内杂菌孢子占比较小；菌圃悬液大量稀释再涂布仍能分离到蚁巢伞，推测菌圃内蚁巢伞孢子占比较大。
图 1 黑翅土白蚁菌圃内真菌的分离
Figure 1. Fungi separated from the fungus-combs of O. formosanu
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从表1可知：除巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌外，所有的厚壁菌门细菌发酵液均可极显著提升蚁巢伞菌丝生长速率，最高可使生长速率提升0.033 cm·d−1 (P＜0.01)。变形菌门细菌Burkholderia sp. (待定)、Burkholderia sp. 对蚁巢伞存在轻微抑制作用，但差异不显著。
表 1 不同菌圃细菌处理对蚁巢伞菌丝体生长的影响
Table 1. Effects of different bacterium treatments on the mycelium growth of T. heimii
菌圃细菌处理组 蚁巢伞菌落直径/cm 菌丝生长速率/(cm·d−1) 菌圃细菌处理组 蚁巢伞菌落直径/cm 菌丝生长速率/(cm·d−1) 巨大芽孢杆菌 2.50±0.18 0.167±0.012 Burkholderia sp. (待定) 2.13±0.02 0.142±0.002 阿氏芽孢杆菌 2.57±0.02* 0.171±0.002* Burkholderia sp. 2.08±0.16 0.139±0.011 蜡样芽孢杆菌 2.62±0.09** 0.174±0.006** Cupriavidus sp. 2.57±0.02** 0.171±0.002** 蕈状芽孢杆菌 2.68±0.12** 0.179±0.008** 对照组 2.18±0.09 0.146±0.006 土杨芽孢杆菌 2.68±0.12** 0.179±0.008** 说明：*表示与对照相比差异显著(P＜0.05)；**表示与对照相比差异极显著(P＜0.01) -
菌圃厚壁菌门细菌菌液均能在一定程度上促进蚁巢伞生长。其中巨大芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌发酵菌液加入培养基后可促使蚁巢伞菌丝纠结凸起，呈现圆弧状纽结(图2A、图2B和图2C)。而其余厚壁菌门细菌蕈状芽孢杆菌和土杨芽孢杆菌发酵菌液加入后，菌丝虽无凸起(图2D和图2E)，但菌丝生长面积扩大。
图 2 不同菌液处理下蚁巢伞形态变化
Figure 2. Morphological changes of T. heimii under fungus-combs bacterial fermented broths treatment
菌圃变形菌门细菌菌液可在一定程度上抑制蚁巢伞生长。Burkholderia sp. (待定)细菌菌液对蚁巢伞生长有明显抑制作用，表现为培养基中蚁巢伞菌丝层几乎消失(图2F)。而Burkholderia sp. 和Cupriavidus sp. 细菌菌液加入后，蚁巢伞菌丝层仅仅轻微变薄(图2G和图2H)。
厚壁菌门细菌对蚁巢伞生长有促进作用，这与加入葡萄糖溶液的阳性对照组相似(图2I)，较中性对照(图2J)和蒸馏水的阴性对照(图2K)生长更旺盛。与菌圃内源性细菌菌液表现有所不同，外源厚壁菌门细菌贝莱斯芽孢杆菌菌液既不抑制也不促进蚁巢伞的生长，但对其有强致畸作用，表现为蚁巢伞菌丝畸变，完全无法生长(图2L)，推测菌圃外源细菌对蚁巢伞生长产生不利影响，白蚁对其有一定选择作用。
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由于蚁巢伞利用木质纤维素能力较低，偏好利用简单糖类物质[8]，故本研究选取了6种组成相对简单的可溶性糖类物质，测定高效液相色谱出峰时间。表2表明：单糖及双糖出峰时间集中在6~8 min。
表 2 6种常见的简单糖类物质高效液相色谱出峰时间
Table 2. Retention time of six simple carbohydrates by high performance liquid chromatography (HPLC)
糖种类 出峰时间/min 糖类别 糖种类 出峰时间/min 糖类别 甘露醇 7.871 单糖 乳糖 7.585 单糖 果糖 7.958 单糖 蔗糖 6.818 双糖 葡萄糖 7.593 单糖 麦芽糖 6.864 双糖 使菌丝纽结凸起的巨大芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌菌液在6~8 min有明显出峰(图3A、图3B和图3C)，对照表2各糖类物质的出峰时间可判断菌圃细菌菌液中生成了大量可溶性简单糖类物质，如单糖和双糖，推测这些简单糖类物质对促进蚁巢伞菌丝纽结凸起有一定作用。而能促进蚁巢伞生长、却无法促其菌丝纽结的蕈状芽孢杆菌和土杨芽孢杆菌菌液在6~8 min有轻微出峰，同时在4~5 min有显著出峰(图3D和图3E)，推测出峰时间为4~5 min的新生成可溶性糖类物质仅能促进蚁巢伞菌丝生长而无法促进菌丝纽结。综上，出峰时间为6~8 min的糖类物质更易被蚁巢伞利用，出峰时间为4~5 min的糖类物质次之。前者能助益蚁巢伞菌丝纽结凸起，在蚁巢伞出菇方面有一定的促进作用。
变形菌门细菌Burkholderia sp. (待定)、Burkholderia sp. 和Cupriavidus sp. 发酵菌液在4~5 min和6~8 min均有出峰(图3F、图3G和图3H)，本应促进蚁巢伞生长，但却在一定程度上抑制了菌丝生长，具体表现为菌丝层变薄，甚至几乎不生长。可推测这3种细菌菌液中均生成了一定的抑制物质，其中Burkholderia sp. (待定)发酵菌液中生成的强抑制物质在灭菌后仍有抑制活性，较为稳定。
总体而言，菌圃细菌发酵菌液的色谱峰总面积均显著高于中性对照(图3I)，说明菌液中可溶性糖含量增加，证实菌圃细菌可降解培养基中的木质纤维素，并转化生成可溶性糖类物质。
图 3 菌圃细菌菌液高效液相色谱分析图
Figure 3. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis of bacterial fermentation broths in the termite fungus-combs
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蚁巢伞自身抗杂菌能力较弱，无法抑制其他菌圃杂菌的生长(图4)。此外，菌圃杂菌也无法促进蚁巢伞的生长，这与SAWHASAN等[9]的结果相悖，可能是采用不同培养基所导致的。生长速度越快的杂菌对蚁巢伞影响越大，表现为蚁巢伞快速被杂菌侵染，无法正常生长；生长速度较慢的杂菌对蚁巢伞生长影响较小，但与对照相比杂菌仍产生了一定的抑制作用。
图 4 蚁巢伞与黑翅土白蚁菌圃内其他真菌对峙培养试验
Figure 4. Antagonistic culture of T. heimii with other fungi separated from the fungus-combs
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菌圃消亡后杂菌将快速侵占菌圃(图5)。自菌圃消亡后，菌圃内幼蚁的活动能力降低，在蚁巢消亡后生长速度较快的真菌如青霉属Penicillium和木霉属Trichoderma对蚁巢的威胁和影响最大，它们将快速生长、入侵直至菌圃完全被包裹。这些杂菌在自然界中普遍存在，但在有白蚁活动的菌圃内却受到抑制、无法生长，而自巢群消亡开始，杂菌迅速占领菌圃，推测菌圃的低含水量以及白蚁分泌的部分抑菌物质是抑制杂菌生长的两大主要原因。
图 5 菌圃消亡后5 d内菌圃中真菌类杂菌生长情况
Figure 5. Fungi growth in 5 days after deaid termite fungus-combs
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厚壁菌门为菌圃中的五大主要细菌类群之一，在不同时期菌圃内该门类细菌占比会发生一定变化[12]。在无蚁巢伞子实体生长的黑翅土白蚁蚁巢中，厚壁菌门细菌占比较有蚁巢伞子实体生长的蚁巢更大[13]，推测厚壁菌门细菌对蚁巢伞出菇有促进作用。本研究也证实：菌圃厚壁菌门细菌菌液确对蚁巢伞菌丝生长及纽结有利，而同属厚壁菌门的外源细菌贝莱斯芽孢杆菌对蚁巢伞有强致畸作用，推测为了保证蚁巢伞正常生长，白蚁对菌圃内微生物有一定选择性。目前共发现330种大白蚁亚科Macrotermitinae菌培白蚁[14]，其低龄工蚁以菌圃内植物材料以及菌丝瘤(蚁巢伞菌丝及分生孢子纠集而成)为食[8]，菌丝瘤的存在能调节白蚁食物组成的碳氮比[15]。作为食物的菌丝瘤若不加以调控，可能会无休止地生长，影响白蚁自身生存，因此推测白蚁可能通过调控菌圃内细菌种群来控制菌丝瘤大小，使其不过度生长，易于白蚁食用。
白蚁对菌圃微生物有一定的选择性[6, 12]，而Burkholderia sp. (待定)虽能强烈抑制蚁巢伞生长，但由于存在于菌圃内，并不会被“排外”，加之其抑制蚁巢伞生长的代谢产物非常稳定，故Burkholderia sp. (待定)或其代谢产物可考虑为一种生物防治手段，通过抑制蚁巢伞的生长，阻碍蚁巢存续。
木质纤维素在历经白蚁肠道微生物作用之后，由菌圃内微生物继续降解，并最终生成可溶性多糖，供蚁巢伞和白蚁利用[8]。本研究采用pH 5的玉米麸皮纤维素培养基在模拟菌圃环境的同时还为菌圃细菌提供了一定养分，木质纤维素的加入则更有利于探索菌圃细菌降解木质纤维素的能力以及相关代谢产物对蚁巢伞生长的影响。蚁巢伞自身缺少独立降解木质纤维素的能力，且其分泌的木质纤维素降解酶种类也较为有限[16]，反观菌圃内细菌却能通过产生大量木质纤维素降解酶的方式参与协同高效降解木质纤维素[17]。LI等[3]研究发现：上、中、下层菌圃分别失去了13%、45%、60%的木质素，而葡糖糖却相应地增加了14%、28%、42%。以上研究均与本研究结果相吻合：菌圃细菌具有降解木质纤维素、生成可溶性单糖和寡糖的能力，菌圃细菌和蚁巢伞在降解木质纤维素方面有上下游协同作用，且生成的简单可溶性糖类物质如葡萄糖等对蚁巢伞生长有促进作用。
OTANI等[7]通过高通量测序证实：菌圃内蚁巢伞占菌圃真菌的99.90%，而其余20个属真菌仅占0.07%。本研究也表明：菌圃中蚁巢伞孢子数量确实远大于其他真菌，菌圃中存在部分常见的霉菌，在菌圃消亡后将对菌圃造成一定威胁。同时OTANI等[7]发现：大部分杂菌与鸡纵菌共培养后生长受到抑制，但本研究结果却与之相悖，蚁巢伞几乎无法抑制杂菌生长。KATARIYA等[18]研究表明：白蚁能够分泌抗菌肽抑制菌圃杂菌，这与本研究推测结果相吻合，即相比蚁巢伞，白蚁才是外来杂菌的主要防御者。
本研究初步分析了菌圃中单个微生物对蚁巢伞生长的影响。今后需要从多个菌圃微生物对蚁巢伞生长的影响为切入点，深入研究“以菌促菌”的思路，以促进人工条件下大量培育蚁巢伞。
Impact of microorganisms of Odontotermes formosanus fungus-combs on the growth of Termitomyces heimii
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摘要:
目的 探明黑翅土白蚁Odontotermes formosanus菌圃微生物对优势真菌蚁巢伞Termitomyces heimii生长的影响，可为深入研究白蚁菌圃微生态提供实验参考，对人工栽培蚁巢伞也具有重要参考意义。 方法 使用寡营养培养基分离菌圃微生物。细菌方面，通过探究细菌发酵液对蚁巢伞生长的影响，采用高效液相色谱法测定发酵菌液中新生成的可溶性糖类物质，初步明确菌圃细菌对蚁巢伞生长的影响；真菌方面，采用对峙培养手段探明蚁巢伞与其他菌圃真菌的互作情况。 结果 从黑翅土白蚁菌圃中共分离8种细菌及12种真菌杂菌，发现菌圃内存在大量蚁巢伞孢子。菌圃厚壁菌门Firmicutes细菌促进蚁巢伞生长，在其影响下蚁巢伞菌丝呈现纽结凸起，菌丝生长速率相比对照组极显著提高，最高提升0.033 cm·d−1(P＜0.01)。而菌圃变形菌门Proteobacteria细菌抑制蚁巢伞生长，Burkholderia sp. (待定)抑制效果最为显著，使得蚁巢伞几乎无法生长。通过高效液相色谱分析发现：菌圃细菌发酵液新生成大量可溶性糖类物质，表明菌圃细菌具备降解木质纤维素并将其转化为寡糖的能力。蚁巢伞与菌圃真菌杂菌的对峙培养表明：菌圃内真菌杂菌抑制蚁巢伞生长，一旦菌圃开始消亡，真菌杂菌(如多种霉菌)将快速占领菌圃。 结论 分离的78.9%菌圃细菌可促进蚁巢伞生长，而分离的所有真菌杂菌均抑制蚁巢伞生长，可见，菌圃微生物对蚁巢伞存在明显调控作用。图5表2参18 Abstract:Objective This study, with an investigation into how Odontotermes formosanus fungus-combs microorganisms influence the growth of Termitomyces heimii, is aimed to provide an experimental reference for further research on the micro-ecology of the termite combs, and make contribution to the artificial cultivation of Termitomyces. Method First, oligotrophic medium was employed to separate microorganisms in the fungus-combs. As for bacterium, with an exploration conducted of how bacterial fermentation broth influences the growth of T. heimii, high performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the newly formed soluble carbohydrates in the fermentation broths to clarify the relationship between bacterium and T. heimii. In terms of fungi, co-culture was used to detect the interaction between T. heimii and other fungi in the combs. Result Eight species of bacteria and 12 species of fungi were isolated from the fungus-combs where a large number of spores of T. heimii were distributed. Firmicute separated promoted the growth of T. heimii, under the influence of which, knots were formed in the hyphae and the growth rate of the hyphae partly increased by 0.033 cm·d−1 (P＜0.01). By contrast, Proteobacteria inhibited the growth of T. heimii, with a significant inhibitory effect displayed by Burkholderia sp. (undetermined) under the influence of which, T. heimii could hardly grow. As was shown in the HPLC analysis, a large amount of soluble carbohydrates were newly produced in the bacterial fermentation broths, indicating that the bacterium in the fungus-combs had the ability to degrade lignocellulose and convert it into oligosaccharides. Other fungi in the fungus-combs inhibited the growth of T. heimii and once the fungus-combs died out, fungi such as mold quickly occupied the combs. Conclusion 78.9% of the bacterium isolated from termite combs benefits T. heimii, while all the fungi isolated inhibit its growth, implying that the microorganisms of O. formosanus fungus-combs have a significant effect on T. heimii. [Ch, 5 fig. 2 tab. 18 ref.] -
随着环境保护要求的不断提高，环保型木材防腐剂越来越受到重视，此类防腐剂多以高效低毒的有机农药为主成分，配合其他助剂制备成有机型或水基型防腐剂[1-2]。三唑类杀菌剂，如丙环唑、戊唑醇、环丙唑醇、氟环唑和苯醚甲环唑等，既可以单独使用，又可以与铜制剂复配[3-4]，是目前常用的木材防腐剂；这些三唑类杀菌剂杀菌谱不尽相同，作用机制也有所差异，应用较广泛的是丙环唑和戊唑醇[5-6]。常见的木材防霉剂有异噻唑啉酮类如卡松、1,2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)、4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮(DCOI)等，有机碘类如碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)，三唑类等[7]，杀菌谱也不尽相同；常用的仓储水果防霉剂如溴菌腈和抑霉唑[8-9]，防霉活性较高，但较少应用于木材防霉。菊酯类杀虫剂是常见的防治白蚁的药剂，具有用量少、成本较低、废弃物易回收、环境相对友好等优点；高效氯氟氰菊酯在菊酯类杀虫剂中活性较高、稳定性较强、耐雨水冲刷性能较好。因含有大量羟基等亲水基团[10]，木材变色、发霉、腐朽、变形等问题频发，品质降低[11-13]，常用亚麻油、桐油、豆油、核桃油等含甘油三脂肪酸酯的植物油[14]和沥青、石蜡等含长链烷烃的矿物油用作木材防水；现代工业多将植物油与动植物蜡等复配成木蜡油[15]，用作木材的表面防水处理剂。如马红霞等[16]使用56号石蜡制备木材防水剂，当石蜡质量浓度为5%时，防水效率可达54%；由此可见，石蜡可作为良好的木材防水剂。液体石蜡是经原油分馏得到的无色无味的液态烃类混合物，室温下为液态，用作防水剂时可省去加热融化环节，节约了能源和时间。木材在使用过程中需要多重保护，如防腐、防霉、防虫和防水等，存在工序繁琐、成本高昂等问题，为满足木材不同生物危害防治需要，本研究拟制备一种同时具有防腐、防霉、防虫和防水多项功能的水基型有机木材保护复合制剂，通过室内抑菌圈法筛选不同杀菌剂的抑菌活性，从中挑选活性较好、杀菌谱互补的防腐成分与防霉成分进行复配，并筛选两者的最佳配比；将其与杀虫成分和防水成分复配，制备成可以兑水自动乳化的乳油制剂。制备的复合制剂稳定性好，兼具防水、防腐、防霉、防白蚁等性能，同时处理工序简单，可达到常规生物危害防治要求的目的，为木材保护提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 杀菌剂、杀虫剂和防水剂
杀菌剂包括氟环唑(FCZ)、戊唑醇(TEB)、丙环唑(PPZ)、苯醚甲环唑(DCZ)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)、溴菌腈(BMN)、抑霉唑(IMZ)。杀虫剂为高效氯氟氰菊酯(CLT)。防水剂为液体石蜡(化妆品级)。以上试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.2 测试菌种
木材腐朽菌有褐腐菌密粘褶菌Gloeophyllun trabeum、白腐菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor。木材混合霉菌有黑曲霉Aspergillus sp.、木霉Trichoderma sp.、青霉Penicillium sp.。木材变色菌可可球二孢Botryodiplodia theobromae。所有菌株均为实验室保存的生物测试标准用菌株。
测试树种为辐射松Pinus radiata。
1.2 试验方法
预实验通过满细胞法确定辐射松边材吸液(水)量为750~850 kg·m−3；根据三唑类药剂防腐有效载药量(200.0~400.0 g·m−3)[17]，换算药剂质量浓度为150.0~300.0 mg·L−1，确定试验用药质量浓度为200.0 mg·L−1。
1.2.1 防腐、防霉成分及配比筛选
通过室内抑菌效果普筛挑选出效果较好且杀菌谱互补的杀菌剂作为防腐和防霉成分。将挑选出的防腐和防霉成分按照不同配比混合进行复配，再次测试室内抑菌效果，确定效果较好的复配比例作为药剂配伍。
1.2.2 室内抑菌圈测试
参照《中华人民共和国药典》的“抗生素微生物检定法”测试抑菌圈。将5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ、IPBC)统一配制成质量分数为5.00%的乳油，分别加水稀释到200.0 mg·L−1；防霉剂IMZ配制为400.0 mg·L−1，BMN分别配制为400.0、600.0和800.0 mg·L−1。在各涂满真菌孢子液的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，分别摆放4个装有0.3 mL待测药液的牛津杯。随着药液的扩散，培养基上的真菌菌丝会受到抑制形成抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明药剂抑菌效果越好。
1.2.3 制剂性能测试
乳液稳定性测试。参照GB/T 1603—2001《农药乳液稳定性测定方法》，在100.0 mL室温标准硬水中慢慢加入不同体积样品，边加入边搅拌，加完后继续搅拌30 s；然后在30 ℃恒温水浴中静置1 h，观察不同稀释倍数下样品乳状液分离情况。无浮油、沉淀或沉油则视为乳液稳定性合格。
防水性能测试。将含液体石蜡质量分数为40.00%的复合制剂分别兑水，稀释液体石蜡质量分数为2.00%、4.00%、8.00%，满细胞法处理试块。辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，室温平衡21 d后称质量，然后蒸馏水浸泡30 min，取出试块，称质量，参照GB/T 1934.1—2009《木材吸水性测定方法》计算吸水率；测量弦向尺寸变化，参照GB/T 29901—2013《木材防水剂的防水效率测试方法》计算防水效率。
室内防腐性能测试。参照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能第1部分：天然耐腐性实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍备用，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组6块试块，经真空−0.09 MPa处理10 min，常压浸渍10 min，参照标准测试防腐性能。试块质量损失率＜10%，属于Ⅰ级强耐腐；质量损失率为11%~24%，属于Ⅱ级耐腐；质量损失率为25%~44%，属于Ⅲ级稍耐腐；质量损失率＞45%，属于Ⅳ级不耐腐。
室内防霉性能测试。参照GB/T 18261—2013《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，参照标准方法处理试块，测试防霉性能。试块表面无菌丝、霉点时，定义侵染值为0；试块表面感染面积＜1/4，定义为1；试块表面感染面积1/4~1/2，定义为2；试块表面感染面积1/2~3/4，定义为3；试块表面感染面积＞3/4，定义为4。
室内防白蚁测试。参照GB/T 18260—2015《木材防腐剂对白蚁毒效实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组5块试块，参照标准方法处理试块，测试室内防白蚁性能。试块蚁蛀程度为完好无损，定义试样完好等级为10；微痕蛀蚀，定义为9.5；轻微蛀蚀，截面面积＜3%的蛀蚀，定义为9；中等蛀蚀，截面面积3%~10%的蛀蚀，定义为8；中等蛀蚀，截面面积10%~30%的蛀蚀，定义为7；严重蛀蚀，截面面积30%~50%的蛀蚀，定义为6；非常严重蛀蚀，截面面积50%~75%的蛀蚀，定义为4；试块几乎完全被蛀毁，定义完好等级为0。
2. 结果与分析
2.1 有效成分筛选
从表1可以看出：5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ和 IPBC)对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)均具有较好的抑制效果，但FCZ、TEB和PPZ对变色菌(可可球二孢)和混合霉菌几乎没有抑制作用，只有DCZ对可可球二孢有抑制效果，因此优选DCZ作为防腐成分。IPBC和IMZ对所测试菌种均有较好的抑制效果，BMN和IMZ虽然对混合霉菌和变色菌有抑制作用，但抑菌圈均小于IPBC。因此，优先IPBC作为防霉成分。
表 1 各杀菌剂的室内抑菌效果Table 1 Result of inhibition zones test by bactericide杀菌剂 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌FCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 TEB 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 PPZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 34.6 21.9 BMN 800.0 37.2 35.4 12.8 10.6 600.0 38.1 29.0 9.0 9.4 400.0 26.8 31.8 8.3 7.1 IMZ 400.0 39.2 41.6 26.9 12.7 将DCZ和IPBC按质量比1∶1、1∶3、3∶1的比例配制混合药剂，测试DCZ+IPBC复配药剂对腐朽菌和霉菌的抑制效果；将其他3种三唑类防腐药剂(FCZ、TEB和PPZ)与IPBC按照质量比1∶1配制复配药剂，作为对照测试抑菌效果。由表2可以看出：DCZ+IPBC复配药剂对木材腐朽菌、变色菌和混合霉菌的抑制效果较好，其中按照1∶1比例复配的药剂效果最高。相其他三唑类与IPBC的复配药剂，抑菌效果亦有所提高。由此确认防腐/防霉复配药剂，DCZ和IPBC按照1∶1进行配制。
表 2 不同三唑类药剂与IPBC复配的抑菌效果Table 2 Result of inhibition zones test by compounded of different preservatives组分 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 DCZ+IPBC 150.0+50.0 ＞45.0 ＞45.0 22.4 15.1 DCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 31.0 23.6 DCZ+IPBC 50.0+150.0 ＞45.0 ＞45.0 29.1 23.7 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 30.6 21.9 FCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.7 21.8 PPZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.8 22.5 TEB+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 24.0 21.0 为探索CLT对白蚁的防治效果，设计含梯度载药量的辐射松边材室内抗白蚁效果测试，拟定辐射松边材载药量分别为5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 g·m−3。由表3可知：试块中CLT载药量达10.9 g·m−3以上时，白蚁蛀蚀完好值＞8.0，质量损失率＜11%，而未添加药剂处理的对照木材，完好值仅4.6，质量损失率＞40%。因此，设计的复合制剂中防虫成分的目标载药量为7.5~30.0 g·m−3。
表 3 不同CLT载药量木材的白蚁蛀蚀结果Table 3 Result of lab anti-termite test of cyhalothrin载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%− 4.6 42.9±14.6 15.5 8.0 10.5±1.4 5.3 8.0 11.3±0.7 21.8 9.1 5.2±1.4 10.9 8.6 5.9±1.5 32.1 8.4 5.1±1.9 说明：−表示未添加药剂 综上，本研究设计制备了含苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯、液体石蜡等多种有效成分的木材保护复合制剂，通过调试乳化剂和助溶剂的用量和配比，最终配制出稳定、均相、透明、入水可自乳化的乳油制剂。制剂制备时按比例称取原药和乳化剂，加入助溶剂，充分溶解混匀后加入液体石蜡，搅拌均匀即可。测试使用的制剂为乳油，组成成分质量分数为0.20%苯醚甲环唑、0.20%碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%高效氯氟氰菊酯和40.00%液体石蜡。
2.2 制剂性能测试
2.2.1 乳液稳定性测试
制剂兑水稀释250倍，制剂呈乳白色，初入水时呈乳白色团雾状，可自动扩散，摇匀后呈均匀的乳状液，静置1 h未见分层、析油和沉淀，稳定性可保持3~4 h；过夜后破乳，药液表面有大量浮油，颠倒摇匀后可恢复乳液状，不影响正常使用。
2.2.2 防水性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，经水浸泡30 min后测试试块的吸水率和防水效率。由表4可知：未添加药剂处理的木材，吸水率为54.7%；随着制剂中石蜡质量分数升高，木材试块中石蜡含量相应增加，试块吸水率依次降低，从43.5%下降到26.6%，木材防水效率则随之增强，从44.4%提升到了77.8%。
表 4 防水剂处理后试块的防水性能Table 4 Efficiency of waterproof稀释
倍数制剂中液体石
蜡质量分数/%试块中液体石
蜡含量/(kg·m−3)吸水
率/%防水效
率/%5 8 49.1 26.6±7.4 77.8±19.1 10 4 19.4 35.0±17.3 68.9±22.1 20 2 10.5 43.5±15.1 44.4±20.6 − 0 0 54.7±5.8 0 说明：−表示未添加药剂 2.2.3 室内耐腐性能测试
由表5可知：未处理木材受白腐菌侵染后质量损失率达75.7%，受褐腐菌侵染质量损失率为19.4%，而所有处理试块质量损失率均低于6%，达到强耐腐。制剂稀释20倍后处理试块，试块中DCZ和IPBC载药量超过71.1 g·m−3，试块质量损失率可达1%，达到Ⅰ级强耐腐。值得注意的是，稀释20倍的药液处理后，试块质量损失率低于稀释5倍的药液，原因是高质量浓度制剂处理后，试块内含有大量的液体石蜡，在长达3个月的试验期内，液体石蜡自动扩散到培养基，试块质量损失增加。但取样现场也发现：高质量浓度制剂处理的试块无腐朽菌菌丝附着生长，说明添加防水剂实际进一步提升了制剂的防腐性能。
表 5 制剂处理后试块的室内耐腐性能Table 5 Result of lab sand block test on sapwood P. radiate稀释
倍数彩绒革盖菌 密粘褶菌 试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%5 311.2+311.2 5.5±0.6 320.6+320.6 3.6±0.3 10 150.9+150.9 2.7±0.2 139.0+139.0 3.4±0.4 20 71.2+71.2 0.6±0.1 71.1+71.1 1.0±0.2 − 0 75.7±4.3 0 19.4±2.1 说明：−表示未添加药剂 2.2.4 室内防霉性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，测试室内防霉效果。由表6可知：未处理木材的霉菌和变色菌侵染值为4，该制剂稀释5倍时，试块表面的DCZ和IPBC含量均达0.165 g·m−2，处理试块变色菌和混合霉菌侵染值均为0，防治效果优良。在实际使用中可根据木材树种的天然耐腐性及所处环境适当增减制剂的用量，以达到理想的防霉效果。
表 6 室内防霉测试结果Table 6 Result of lab mildew proof test稀释
倍数可可球二孢 混合霉菌 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 5 0.165+0.165 0 0.202+0.202 0 10 0.106+0.106 1.5 0.148+0.148 0.5 20 0.045+0.045 4.0 0.048+0.048 3.3 − 0 4.0 0 4.0 说明：−表示未添加药剂 2.2.5 室内抗白蚁测试
由表7可知：不同稀释倍数的制剂处理后，试块质量损失率均＜3%，而未添加抗虫剂的对照试块，质量损失率为42.9%；制剂稀释5倍时，试块载药量达29.1 g·m−3，试块白蚁蛀蚀完好值为9.6；稀释20倍时，试块载药量为7.6 g·m−3， 试块白蚁蛀蚀完好值为8.9，而未处理木材的白蚁蛀蚀后完好值仅为4.7，质量损失率达42.9%，显示该制剂的防治白蚁效果优良。结合表3可知：相比单用高效氯氟氰菊酯时，复合制剂处理材在同等载药量下对白蚁的防治效果要好得多；当高效氯氟氰菊酯质量浓度为15.0、30.0 g·m−3时，该复合制剂防治白蚁的效果远远优于单剂，由此可知其他组分的加入起到了增效作用。
表 7 室内抗白蚁测试结果Table 7 Result of lab anti-termite test稀释
倍数木材中高效氯氟氰菊酯
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%白蚁蛀蚀
完好值5 29.1 2.8±0.5 9.6 10 14.7 2.6±0.3 9.2 20 7.6 2.5±0.7 8.9 − 0 42.9±14.6 4.7 说明：−表示未添加药剂 3. 讨论
针对不同的木材败坏防治需求，本研究制备了一种具有防腐、防霉、防虫、防水多功能的复合制剂，类型为乳油，有效成分为苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯和液体石蜡。
该制剂兑水稀释后呈乳液状，稳定性可保持3~4 h，符合GB/T 1603—2001 《农药乳液稳定性测定方法》的规定。石蜡作为常见的防水剂被广泛应用，多数所使用的时熔点较高的固体石蜡[18]，而该制剂以液体石蜡为防水组分，优点是室温下即为液体，无需加热融化，缺点是液体石蜡密度较小，相较常规药剂，兑水稀释后稳定性差，药液兑水约 4 h 后就会分层破乳；不过，稍微搅拌即可恢复乳状，基本不影响正常使用。该制剂防水性能较好，然而应注意的是防水剂含量很大，大剂量液体石蜡的使用，存在一定的消防隐患，后期应配合表面阻燃处理。石蜡基防水剂的主要防水机制是通过石蜡的疏水作用[19]，石蜡的使用同时增强了木材的尺寸稳定性[20]，石蜡分子量较大，不易进入木材内部，因此需要将其乳化成细小的乳状液，然而，乳化剂的过量使用可能会有石蜡的疏水性降低的风险，需要在以后的开发中引起重视。结合室内耐腐试验菌丝生长状况可以发现：防水剂液体石蜡的加入，可以明显增加药剂的防腐性能，而木材中石蜡的含量很高，当木材与环境中土壤或者水体接触时，石蜡会从木材中自由扩散到环境中，可能会增加药剂流失的风险。
室内防霉测试结果来看，将制剂稀释 5 倍使用，即辐射松试块苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯载药量均为 0.165 g·m −2 时，混合霉菌的生长才能被完全抑制，这与李晓文等[21]的IPBC防霉效果结论一致。室内防霉测试所选的温湿度条件适合霉菌生长，且霉菌的孢子液人为接种，因此，通常可以通过室内防霉测试的药剂，在实际生产中的防霉效果也会很好。
室内防白蚁测试结果可知：制剂稀释 20 倍后，试块受白蚁蛀蚀程度仍较低，质量损失率较小，防蚁性能优异。同时，比较单独使用高效氯氟氰菊酯和添加防水剂后的防白蚁效果可以看出：防水剂的添加明显增加了药剂的防白蚁效果。分析原因可能是石蜡是一种化石能源，白蚁不喜食。
4. 结论
为满足木材不同生物危害防治需要，本研究制备出一种含石蜡水基型有机多功能木材防腐剂，可以一次处理基本满足木材常规保护的要求。该木材保护复合制剂同时具有防腐、防霉、防虫、防水多功能，剂型为乳油，质量分数分别为0.20%的苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%的高效氯氟氰菊酯和40.00%的液体石蜡。
当环境中生物危害较轻时，可将该复合制剂稀释20倍使用，当生物危害较重时，可将复合制剂稀释5倍甚至直接使用。将制剂稀释5到10倍处理木材，即木材中液体石蜡为25.0~50.0 kg·m−3，苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯为150.0~300.0 g·m−3，高效氯氟氰菊酯载药量为15.0~30.0 g·m−3，可满足多大多数生物危害的防治需求。
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图 2 不同菌液处理下蚁巢伞形态变化
Figure 2 Morphological changes of T. heimii under fungus-combs bacterial fermented broths treatment
图 3 菌圃细菌菌液高效液相色谱分析图
Figure 3 High performance liquid chromatography (HPLC) analysis of bacterial fermentation broths in the termite fungus-combs
图 4 蚁巢伞与黑翅土白蚁菌圃内其他真菌对峙培养试验
Figure 4 Antagonistic culture of T. heimii with other fungi separated from the fungus-combs
图 5 菌圃消亡后5 d内菌圃中真菌类杂菌生长情况
Figure 5 Fungi growth in 5 days after deaid termite fungus-combs
表 1 不同菌圃细菌处理对蚁巢伞菌丝体生长的影响
Table 1. Effects of different bacterium treatments on the mycelium growth of T. heimii
菌圃细菌处理组 蚁巢伞菌落直径/cm 菌丝生长速率/(cm·d−1) 菌圃细菌处理组 蚁巢伞菌落直径/cm 菌丝生长速率/(cm·d−1) 巨大芽孢杆菌 2.50±0.18 0.167±0.012 Burkholderia sp. (待定) 2.13±0.02 0.142±0.002 阿氏芽孢杆菌 2.57±0.02* 0.171±0.002* Burkholderia sp. 2.08±0.16 0.139±0.011 蜡样芽孢杆菌 2.62±0.09** 0.174±0.006** Cupriavidus sp. 2.57±0.02** 0.171±0.002** 蕈状芽孢杆菌 2.68±0.12** 0.179±0.008** 对照组 2.18±0.09 0.146±0.006 土杨芽孢杆菌 2.68±0.12** 0.179±0.008** 说明：*表示与对照相比差异显著(P＜0.05)；**表示与对照相比差异极显著(P＜0.01) 
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表 2 6种常见的简单糖类物质高效液相色谱出峰时间
Table 2. Retention time of six simple carbohydrates by high performance liquid chromatography (HPLC)
糖种类 出峰时间/min 糖类别 糖种类 出峰时间/min 糖类别 甘露醇 7.871 单糖 乳糖 7.585 单糖 果糖 7.958 单糖 蔗糖 6.818 双糖 葡萄糖 7.593 单糖 麦芽糖 6.864 双糖
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