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白及Bletilla striata为兰科Orchidaceae白及属Bletilla多年生草本植物，以其干燥块茎入药，具有止血[1]、促进伤口愈合[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]等药理作用。此外，白及块茎含较多的胶质多糖，具有抗衰老、美白和抗氧化[2]等功能，因此也被广泛应用于化妆品行业。白及的花色鲜艳美丽，具有较高的观赏价值[6]。由于白及种子无胚乳，自然萌发率低，白及的需求量与野生资源的缺乏产生了巨大的冲突[7]，因此开展白及资源的保护及种质资源的研究工作刻不容缓。随着生物技术的发展，除了形态标记[8]、细胞标记[9]、生理生化标记[10]等传统的标记技术外，遗传多样性研究出现了新的基于基因组DNA水平的标记技术——分子标记。分子标记是在群体中易于跟踪和量化的基因位点，并且可能与特定基因或性状相关[11]。与其他标记相比，分子标记具有多态性好、数量多以及高共显性、简单稳定、易于追溯等优点[12]。简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记是针对非特异性序列进行扩增的，因此对于白及这类基因组序列信息较为匮乏的物种而言是一种快速鉴定的方法[13]。邢佳鑫等[14]应用简单重复序列(SSR)和ISSR标记对外观较相似的白及样本进行遗传多样性分析，探索了快速鉴定白及组培苗真伪的新方法；洪建聪等[15]利用筛选出的15对SRAP引物组合将50份白及样本分成6个大类；陈锦等[16]利用ISSR和随机扩增多态性(RAPD)标记研究白及种质资源的遗传多样性，结果显示：白及种源间的遗传差异与地理距离相关，还发现ISSR不受时间和地点的限制，比RAPD有更高的多态性比率，结果相对更稳定可靠；孙宇龙等[17]通过SRAP标记将12个白及野生种源聚类成3支系，并发现遗传距离和地理距离间有显著正相关性，为白及野生资源的就地保护和迁地保护提供了理论依据；WANG等[18]使用ISSR标记分析了白及再生植株的克隆保真度，结果发现：再生植株与母株的相似度接近100.0%，表明通过愈伤组织和原球茎培养的再生植株在遗传上是稳定的。
目前，同时应用2种分子标记技术在分子水平上对白及种质资源进行的相关研究较少。本研究采用ISSR和SRAP分子标记技术，对从浙江省、云南省、贵州省和四川省搜集的32个白及种源进行亲缘关系及遗传多样性的初步分析，揭示白及个体间与种源间的遗传分化，为白及资源的保护和利用提供参考。
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2020年6—7月在浙江、云南、贵州、四川等22个地区采集32个白及种源，并将采集到的白及叶片洗净擦干，经液氮速冻后放置−80 ℃超低温冰箱备用。种源基本信息见表1。
表 1 白及种源信息
Table 1. Source information of B. striata samples
编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 1 浙江温州泰顺 9 云南丽江永胜 17 四川乐山沐川(2) 25 四川汶川水磨(2) 2 浙江台州天台 10 云南普洱思茅 18 四川雅安石棉 26 四川汶川水磨(3) 3 浙江衢州江山 11 云南曲靖会泽 19 四川内江东兴(1) 27 四川都江堰虹口(1) 4 浙江金华磐安 12 贵州遵义正安 20 四川内江东兴(2) 28 四川都江堰虹口(2) 5 浙江宁波象山 13 贵州黔西南安龙 21 四川内江东兴(3) 29 四川成都大邑 6 浙江杭州临安 14 贵州遵义赤水 22 四川内江东兴(4) 30 四川成都彭州(1) 7 云南红河蒙自(1) 15 贵州毕节大方 23 四川内江东兴(5) 31 四川成都彭州(2) 8 云南红河蒙自(2) 16 四川乐山沐川(1) 24 四川汶川水磨(1) 32 四川甘孜康定 -
主要仪器：JXFSTPRP-24L组织快速研磨仪(中国上海净信实业发展有限公司)、TU-100恒温金属浴(中国上海一恒科技有限公司)、Colibri超微量分光光度计(德国Titertek Berthold公司)、Centrifuge 5415 R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、Mini-P25微孔板离心机(中国杭州奥盛仪器有限公司)、T100 Thermal Cycler PCR仪、PowerPac HC高电流电泳仪[伯乐生命医学产品(中国上海)有限公司]、JY04S-3C凝胶成像系统(中国北京君意东方电泳设备有限公司)、B2042BluEye TM蓝光切胶仪(中国苏州宇恒生物科技有限公司)。
主要试剂：植物基因组DNA快速抽提试剂盒(中国上海生工生物股份有限公司)、2×Flash PCR MasterMix(中国北京康为世纪生物科技有限公司)、10 × loading buffer、DL 15000 DNA Marker、DL 2000 DNA Marker(日本TAKARA公司)。β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙醇、氯仿、异戊醇等均为中国上海国药集团化学试剂有限公司生产；ISSR引物和SRAP引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
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取洁净干燥的白及嫩叶，采用植物基因组DNA快速抽提试剂盒提取样本DNA，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳法检测完整性，选择条带清晰明亮且无拖尾与杂带的DNA，用超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，结合DNA浓度及电泳的结果，将较优的DNA样品液用双蒸水(ddH2O)稀释至20 mg·L−1，放置冰箱−20 ℃保存备用。
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本研究采用的ISSR引物为哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列；SRAP引物为参考前人[19-20]设计的238对SRAP引物组合，共包含14条上游引物(Me1~Me14)和17条下游引物(Em1~Em17)。引物的筛选经过初筛和复筛2个步骤：从32个供试材料中选取4个表型性状差异较明显的材料作为样本DNA，对引物进行初筛，选出扩增产物主带明显、条带清晰的引物。经过引物的初筛后，选择所有样本DNA作为模板，针对初筛后的引物进行复筛，选择多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物作为本研究的引物。根据每条引物的退火温度(Tm) ± 5 ℃的范围，设置8个温度梯度进行聚合酶链式反应(PCR)；根据条带得出每个引物的最适退火温度。
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ISSR-PCR扩增体系(20 μL)：1 μL DNA模板、1 μL引物(20 mg·L−1)、10 μL 2×Flash PCR MasterMix、8 μL ddH2O；ISSR-PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s；退火(每个引物的退火温度不同)15 s，72 ℃延伸15 s；共35个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
SRAP-PCR扩增体系(20 μL)：1 μL DNA模板、1 μL引物(20 mg·L−1)、10 μL 2×Flash PCR MasterMix、7 μL ddH2O；SRAP-PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s；退火(每个引物的退火温度不同)15 s，72 ℃延伸15 s；共38个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
PCR扩增产物在含有Gelred核酸染料的质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，130 V，电泳50 min后，经凝胶成像系统(JY04S-3C)拍照保存。
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人工读取电泳结果数据，并进行统计处理。将条带中清晰可见以及可重复的标记为“1”，同一位置上条带缺失或者弱带标记为“0”，形成“0、1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及综合两者(SSR+SRAP)的数据。通过Excel表格，统计每个引物或每对引物组合扩增的条带以及多态性条带数，计算多态位点百分率(PPB)，利用Popgene 32.0软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、种源总基因多样性(Ht)、种源内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst = 1−Hs/Ht)和基因流(Nm)等遗传多样性参数，并计算种源间的遗传距离和遗传一致性，使用OmicStudio工具(
https://www.omicstudio.cn/tool )对遗传距离进行主坐标(PCoA)分析，利用NTSYS-pc 2.10e软件对种源进行聚类分析，并绘制非加权组平均法(UPGMA)树状图。 -
提取白及基因组DNA后，经琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并通过超微量分光光度计检测其浓度、纯度，均符合要求，可进行下一步试验。
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经过2次筛选，共获得11条条带清晰、多态性高且重复性好的引物(表2)。11条引物共扩增出188条条带，多态性条带有174条，PPB为92.20%。11条引物平均扩增条带数为17.09条，平均多态性条带数为15.82条。扩增位点数最多的引物是UBC876，扩出了25条条带；其次是引物UBC868和UBC881，均扩增出20条条带；扩增条带最少的引物是UBC855，只扩增出9条条带，PPB为64.71%~100.00%，其中，引物UBC827、UBC842、UBC855、UBC876、UBC879和UBC881的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的54.55%；UBC880的PPB最低，为64.71%。以引物UBC876为例，它对所采集白及样本的ISSR-PCR的扩增结果见图1。
表 2 ISSR引物信息及扩增结果
Table 2. ISSR primer information and amplification results
引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 UBC823 (TC)8C 15 12 80.00 8 UBC876 (GATA)2(GACA)2 25 25 100.00 2 UBC826 (AC)8C 18 17 94.44 9 UBC879 C(TTCAC)3 15 15 100.00 3 UBC827 (AC)8G 16 16 100.00 10 UBC880 (GGAGA)3 17 11 64.71 4 UBC842 (GA)8(C/T)G 18 18 100.00 11 UBC881 (GGGTG)3 20 20 100.00 5 UBC855 (AC)8(C/T)T 9 9 100.00 合计 188 174 6 UBC866 (CTC)6 15 12 80.00 平均 17.09 15.82 92.20 7 UBC868 (GAA)6 20 19 95.00 
图 1 引物UBC876对所采集白及样本的ISSR-PCR扩增结果
Figure 1. Amplification results of B. striata with primer UBC876 of ISSR
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经过2次筛选，共获得11对条带清晰、多态性高且重复性好的引物组合(表3)。11对引物组合共扩增出216条条带，多态性条带有202条，多态性比率占93.52%，11对引物平均扩增条带数为19.64条，平均多态性条带数为18.36条。引物组合Me13-Em9扩增位点数最多，扩出28条条带；其次为引物组合Me3-Em2和Me11-Em10，均扩增出22条条带；扩增条带最少的引物组合为Me12-Em6，仅扩增出16条条带。引物的PPB为83.33%~100.00%，其中，引物组合Me9-Em13、Me11-Em10和Me12-Em6的PPB最高，均为100.00%，占总引物的25.93%；引物组合Me11-Em12的PPB最低，为83.33%。以引物组合Me9-Em13为例，它对部分白及基因组DNA的ISSR-PCR的扩增结果见图2。
表 3 SRAP引物信息及扩增结果
Table 3. SRAP primer information and amplification results
引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 Me1-Em12 BATA DCAT 19 17 89.47 8 Me11-Em12 BACG DCAT 18 15 83.33 2 Me3-Em2 BAAT DTGC 22 20 90.91 9 Me12-Em6 BAAA DGCA 16 16 100.00 3 Me5-Em5 BAAG DAAC 18 17 94.44 10 Me12-Em7 BAAA DCAA 17 16 94.12 4 Me6-Em2 BACT DTGC 19 16 84.21 11 Me13-Em9 BAAC DCGA 28 27 96.43 5 Me9-Em13 BACA DCTA 18 18 100.00 合计 216 202 6 Me9-Em14 BACA DCTC 19 18 94.74 平均 19.64 18.36 93.52 7 Me11-Em10 BACG DCAG 22 22 100.00 说明：B表示TGAGTCCAAACCGG；D表示GACTGCGTACGAATT 
图 2 引物组合Me9-Em13对所采集白及样本的SRAP-PCR扩增结果
Figure 2. Amplification results of B. striata with primer combination Me9-Em13 of SRAP
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利用Popgene 32.0软件对32个白及种源的遗传距离和遗传一致度进行计算，表明在ISSR研究中，遗传一致度为0.5745~0.8989，遗传距离为0.1065~0.5543。遗传一致度最高的是21号四川内江东兴(3)和22号四川内江东兴(4)种源，为0.8989；它们的遗传距离最小，为0.1065，说明其亲缘关系较近。遗传一致度最低的是13号贵州黔西南安龙和25号四川汶川水磨(2)种源，它们的遗传一致度均为0.5745；它们的遗传距离最大，为0.5543，说明其亲缘关系较远。在SRAP研究中，遗传一致度为0.5231~0.8102，遗传距离为0.2105~0.5231。遗传距离最小的是2号浙江台州天台和3号浙江衢州江山种源；遗传距离最大的是4号浙江金华磐安和30号四川成都彭州(1)种源。综合ISSR和SRAP数据，遗传一致度为0.5668~0.8119，遗传距离为0.2084~0.5677；遗传距离最小的是25号四川汶川水磨(2)和32号四川甘孜康定种源，遗传距离最大的是4号浙江金华磐安和11号云南曲靖会泽种源。
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将32个种源按地区划分为4个群体(浙江、云南、贵州和四川)，使用Popgene 32.0软件分析种源的遗传多样性指数(表4)。在ISSR研究中，32个种源在物种水平上，Na为1.9255，Ne为1.4619，H为0.2819，I为0.4327，PPB为92.55%。在群体水平上，Na为1.5000~1.7926；Ne为1.3176~1.4393；H为0.1824~0.2607；I为0.2717~0.3940；PPB为50.00%~79.26%。可见，相对于物种水平而言，群体间的遗传多样性水平较低。在SRAP研究中，变异水平也是物种大于群体，与ISSR研究结果相似。综合ISSR和SRAP数据，32个种源在物种水平上，Na为1.9307，Ne为1.4988，H为0.2971，I为0.4509，PPB为93.07%。在群体水平上，Na为1.5000~1.8342，平均为1.6349；Ne为1.3281~1.4660，平均为1.3888；H为0.1877~0.2756，平均为0.2256；I为0.2780~0.4163，平均为0.3369；PPB为50.00%~83.42%，平均为63.49%，也是群体间的遗传多样性水平更低。其中，从ISSR、SRAP及综合ISSR和SRAP的研究结果来看，Na、Ne、H、I及PPB数值最小的均是贵州省种源，浙江省种源次之，各数值最大的均是四川种源，说明四川白及种源具有较高的遗传多样性，贵州白及种源遗传多样性较低。
表 4 白及的遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of B. striata
研究方法 种源地 Na Ne H I PPB/% 浙江 1.5000 1.3215 0.1841 0.2729 50.00 ISSR 云南 1.6489 1.4042 0.2328 0.3473 64.89 贵州 1.5000 1.3176 0.1824 0.2717 50.00 四川 1.7926 1.4393 0.2607 0.3940 79.26 群体水平 1.6104 1.3707 0.2150 0.3215 61.04 物种水平 1.9255 1.4619 0.2819 0.4327 92.55 SRAP 浙江 1.5833 1.3753 0.2153 0.3191 58.33 云南 1.6713 1.4163 0.2432 0.3631 67.13 贵州 1.5000 1.3373 0.1923 0.2835 50.00 四川 1.8704 1.4891 0.2886 0.4357 87.04 群体水平 1.6563 1.4045 0.2349 0.3504 65.63 物种水平 1.9352 1.5309 0.3103 0.4667 93.52 ISSR+SRAP 浙江 1.5446 1.3503 0.2007 0.2976 54.46 云南 1.6609 1.4107 0.2384 0.3558 66.09 贵州 1.5000 1.3281 0.1877 0.2780 50.00 四川 1.8342 1.4660 0.2756 0.4163 83.42 群体水平 1.6349 1.3888 0.2256 0.3369 63.49 物种水平 1.9307 1.4988 0.2971 0.4509 93.07 -
利用NTSYS-pc 2.10e软件将32个种源的标记结果进行聚类分析，得到相应的UPGMA树状图(图3)。ISSR的UPGMA树状图显示：32个种源的种质资源遗传相似系数为0.650~0.900，变幅为0.250。其中，在遗传相似系数为0.680时，可将32个白及种源分为4个类群：Ⅰ类群包括26个种源，其中浙江种源6个，云南种源2个、贵州种源3个，四川种源15个；Ⅱ类群包括2个云南红河蒙自种源；Ⅲ类群仅包括13号贵州黔西南安龙种源，Ⅳ类群包括11号云南曲靖会泽种源、17号四川乐山沐川(2)种源和24号四川汶川水磨(1)种源共3个。在遗传相似系数为0.738时，Ⅰ类群又可分为4个类群(ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ类群) (图3A)。SRAP的UPGMA树状图显示：遗传相似系数为0.630~0.810，变幅为0.180。其中，在遗传相似系数为0.658时，可将样本分为3个类群：Ⅰ类群包括浙江种源6个和贵州种源4个；Ⅱ类群包括云南种源4个和四川种源10个；Ⅲ类群包括云南曲靖会泽种源和四川种源7个(图3B)。ISSR+SRAP的UPGMA树状图显示：遗传相似系数为0.660~0.810，变幅为0.150。其中，在遗传相似系数为0.688时，可将样本分为5个类群：Ⅰ类群包括浙江种源6个和贵州种源4个；Ⅱ类群包括云南种源2个和四川种源7个；Ⅲ类群包括2个云南红河蒙自种源；Ⅳ类群包括云南曲靖会泽种源和四川种源7个；Ⅴ类群包括四川种源3个(图3C)。使用OmicStudio工具将ISSR+SRAP的标记结果进行PCoA分析(图4)，结果与UPGMA聚类结果基本一致。
图 3 32个白及种源的UPGMA聚类图
Figure 3. UPGMA cluster map of 32 provenance of B. striata
图 4 综合ISSR和SRAP标记数据的PCoA分析
Figure 4. PCoA analysis of ISSR and SRAP markers data
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陈锦等[16]、周天华等[21]、和志娇等[22]、吴劲松[23]、孙宇龙等[17]分别应用RAPD、SSR、ISSR、扩增片段长度多态性(AFLP)和SRAP等单一分子标记技术研究了白及种质资源的遗传多样性，其中每个引物最少扩增得到1条多态性条带，最多的有19条，PPB最低为46.10%，最高则达90.48%。本研究综合了ISSR和SRAP等2种标记方法对32个白及种源进行了分析，筛选出的11条ISSR引物，共扩增出188条条带，多态性条带174条，平均每条引物15.82条，最多的达25条(UBC876)，PPB为92.20%；筛选出的11对SRAP引物组合，共扩增出216条条带，多态性条带有202条，平均每对引物19.64条，最多达27条(Me13-Em9)，PPB为93.52%。结果充分体现了供试白及种源在分子水平上具有丰富的遗传多样性，同时也验证了ISSR和SRAP标记技术在白及种源多态性检测方面的高效率，且SRAP的检测效率略高于ISSR。综合ISSR和SRAP数据分析白及遗传多样性指数发现：四川省白及种源的Na、Ne、H、I及PPB最大，云南种源次之，贵州种源最小，说明四川白及种源的遗传多样性水平最高，适应环境能力较强。
和志娇等[22]采用ISSR标记对不同种源的野生白及进行遗传多样性评价，发现不同地理位置和不同海拔采集到的白及个体的遗传距离有差异；孙宇龙等[17]也发现：遗传距离和地理距离间有显著正相关性；洪建聪等[15]和GUO等[24]则发现：白及个体的遗传距离与地理距离无直接关联。本研究综合了ISSR和SRAP标记数据发现：21号四川内江东兴(3)种源与22号四川内江东兴(4)种源、2号浙江台州天台种源与3号浙江衢州江山种源、25号四川汶川水磨(2)种源与32号四川甘孜康定种源的遗传距离较小，亲缘关系较近；13号贵州黔西南安龙种源与25号四川汶川水磨(2)种源、4号浙江金华磐安种源与11号云南曲靖会泽种源和30号四川成都彭州(1)种源遗传距离较大，亲缘关系较远。总体上同省的样品间遗传距离相对较小，这些在UPGMA聚类图和PCoA分析图上也有比较直观的体现。UPGMA聚类显示：聚为一类的白及种源大多来自同一省份，而在PCoA分析图中，云南种源与四川种源的亲缘关系较近，浙江种源与贵州种源的亲缘关系较近。整体上各个种源间的遗传距离与地理位置呈现出一定的相关性，但又不完全按照地理位置的远近聚类，有些甚至有所交叉。
物种的遗传特性主要受到生态环境、生物学特征、繁殖方式以及各种人为活动的影响[25]，野生白及由于长期的异花授粉和自然选择，其遗传背景复杂[24]；人工栽培白及则多是从山上采挖假鳞茎进行种植，品种混杂，品质参差不齐。又由于白及对生境的依赖性较高，因此生境的破坏和片段化都会影响其遗传多样性，所以在保护物种多样性时，首先应保护生态环境。本研究的某些白及种源可能是来自不同地区的引种，在土壤、养分、温度和水分等环境条件的作用下，导致地理距离较近的种源遗传性状产生了相似的变异，从而使不同种源间的遗传距离与地理距离存在一定的重合性。总的来说，本研究32个白及种源的遗传多样性水平较高。
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本研究综合利用ISSR和SRAP等2种分子标记技术，对浙江、云南、贵州、四川32个白及种源进行遗传多样性分析。结果显示：种源间具有较高的遗传多样性，且ISSR和SRAP技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系，运用2种分子标记技术也使得研究的可信度更高。
Genetic diversity analysis of Bletilla striata germplasm by ISSR and SRAP markers
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摘要:
目的 采用简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)等2种标记技术分析不同种源白及Bletilla striata样本的遗传多样性水平和遗传关系，为白及种质的鉴定、分类、保护和开发提供理论依据。 方法 从100个ISSR引物和238对SRAP引物组合中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，用Popgene 32.0计算来自浙江、云南、贵州和四川等省32个不同种源白及的遗传多样性参数和遗传距离，用NTSYS-pc 2.10e进行聚类分析。 结果 从100个ISSR引物中筛选出11个多态性较好的引物，共扩增出188个条带，平均每个引物扩增出17.09个条带，其中多态性位点174个，占总扩增片段的92.20%；从238对SRAP引物组合中筛选出11对多态性较好的引物组合，共扩增出216个条带，平均每个引物扩增出19.64个条带，其中多态性位点202个，占总扩增片段的93.52%。综合ISSR和SRAP的标记结果发现：四川白及种源的遗传多样性水平最高，贵州最低；非加权组平均法(UPGMA聚类)和主坐标分析(PCoA分析)结果显示：聚为一类的白及种源大多来自同一省份，云南省与四川省白及种源的遗传距离较近，浙江省和贵州省白及种源的遗传距离较近，说明遗传距离与地理距离存在一定的重合，但并不呈正相关。 结论 本研究所选白及种源间具有较高的遗传多样性，ISSR和SRAP标记技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系。图4表4参25 -
关键词:
- 白及 /
- 遗传多样性 /
- 简单重复序列间扩增(ISSR)标记 /
- 相关序列扩增多态性(SRAP)标记
Abstract:Objective The objective is to analyze the genetic diversity and genetic relationship of 32 Bletilla striata samples from different provenances by ISSR and SRAP markers, so as to provide theoretical basis for identification, classification, conservation and development of B. striata germplasm. Method Primers with high polymorphism, clear amplification bands and good repeatability were selected from 100 ISSR primers and 238 pairs of SRAP primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification. Genetic diversity parameters and genetic distance of B. striata from 32 different provenances in Zhejiang, Yunnan, Guizhou and Sichuan were calculated by Popgene 32.0, and cluster analysis was performed by NTSYS-PC 2.10e. Result 11 highly polymorphic primers were screened from 100 ISSR primers, and a total of 188 bands were amplified, with an average of 17.09 bands per primer, among which 174 were polymorphic loci, accounting for 92.20% of the total amplified fragments. 11 pairs of highly polymorphic primer pairs were screened from 238 pairs of SRAP primer pairs, and a total of 216 bands were amplified, with an average of 19.64 bands per primer, including 202 polymorphic loci, accounting for 93.52% of the total amplified fragments. Based on ISSR and SRAP markers, the genetic diversity level of B. striata population in Sichuan Province was the highest, while that in Guizhou Province was the lowest. UPGMA and PCoA analysis showed that the clustered B. striata samples were mostly from the same province. The genetic distance of B. striata population between Yunnan Province and Sichuan Province was relatively close, and that between Zhejiang Province and Guizhou Province was relatively close, indicating that there was a certain overlap between genetic distance and geographical distance, but there was no positive correlation. Conclusion B. striata provenances selected in this study have high genetic diversity. Both ISSR and SRAP markers can effectively reveal the genetic diversity and genetic relationship of B. striata. [Ch, 4 fig. 4 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Bletilla striata /
- genetic diversity /
- ISSR marker /
- SRAP marker
-
乐昌含笑Michelia chapensis为木兰科Magnoliaceae含笑属Michelia常绿大乔木，已被列入中国《国家二级保护植物名录》，具有生长快、树干挺拔、花色优雅、四季葱郁、木材易于加工等优良特性，是中国南方优良的乡土阔叶树种[1−2]。自20世纪80年代起，乐昌含笑树种逐渐得到重视，早期多应用于园林绿化中，近些年在森林康养、生态公益林、碳汇林建设中得到广泛应用[2−4]。种源选择是树种改良的重要方法之一，在林业生产中具有重要作用。但由于林木的生长周期长，且不同生长期所表达的基因不同，给林木育种策略的科学制定带来困难[5]。根据目标性状的遗传力和幼林期与成熟林期性状相关性随年龄增长的变化趋势，可确定种源的早期选择年龄，进而加速林木遗传改良的进程[5−9]。但乐昌含笑树种研究起步较晚，较多研究集中在种群分布、苗木繁育、栽培技术等方面，在遗传改良方面的研究，尤其是早期选择适宜林龄的研究较少[10]。广东省于2003年启动乐昌含笑良种选育研究工作，并先后在广东省内多个区域布置了种源和家系试验林[11]。目前，早期营建的试验林已达近熟林期，了解此期间林木主要生长性状的变异特征，以及生长性状的早晚期相关性，对推进乐昌含笑遗传改良进程具有重要意义。本研究根据早期营建的乐昌含笑种源试验林的多年度观测数据，分析乐昌含笑生长性状的年度变化模式及性状间的早晚期相关性，为解析乐昌含笑种源的生长变异规律以及开展早期选择提供理论依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
以广东省韶关市国有曲江林场和国有九曲水林场为研究地。其中，曲江林场试验林(QJ06)地处24°41′N，113°36′E，年均气温为20.5 ℃，年均积温为6 559.5 ℃，年均降水量为1 751 mm，位于山坡下部，海拔约180 m。九曲水林场试验林(JQS06)地处24°22′N，114°05′E，年均气温为20.3 ℃，年均积温为6 570.7 ℃，年均降水量为1 787 mm，位于山坡下部，海拔约250 m。2片试验林均为花岗岩成土，红壤，土层厚1 m以上，肥力中等。
1.2 材料
曲江林场试验林参试种源15个，九曲水林场试验林参试种源12个(表1)。2004年采集种子，2005年培育苗木，所有造林苗木均为1年生容器苗，出圃规格为苗高≥35 cm，地径≥0.5 cm。
表 1 参试种源信息Table 1 Information of tested provenance造林号 种源号 来源地 经纬度 试验林 曲江林场 九曲水林场 1 HNLL 湖南醴陵县王仙镇 27.663°N，113.455°E 有 有 2 HNTD 湖南通道县草坪镇 26.216°N，109.732°E 有 有 3 HNZX 湖南资兴县黄草镇 25.934°N，113.452°E 有 有 4 HNGD 湖南桂东县红星镇 25.982°N，113.893°E 有 有 5 HNSN 湖南遂宁县黄桑镇 26.713°N，110.196°E 有 有 6 JXCY 江西崇义县茶滩镇 25.677°N，113.452°E 有 有 7 JXSY 江西上犹县陡水镇 25.935°N，114.392°E 有 有 8 JXLN 江西龙南县九连山 24.856°N，114.512°E 有 有 9 LCJF 广东乐昌县九峰镇 25.243°N，113.244°E 有 有 10 MZF 广东南雄县帽子峰镇 25.184°N，114.366°E 有 有 11 NXJT 广东南雄县江头镇 25.183°N，114.376°E 有 有 12 RHCJ 广东仁化县长江镇 25.203°N，113.767°E 有 有 13 SXLJ 广东始兴县刘家山 24.847°N，114.099°E 有 无 14 JXQN 江西全南县龙下镇 24.854°N，114.517°E 有 无 15 JXAY 江西安远县车头镇 25.233°N，115.384°E 有 无 1.3 方法
试验林采用随机完全区组设计，18株小区(3株×6株或2株×9株)，4次重复。2005年底完成试验林整地，植穴规格为50 cm×40 cm×35 cm，每穴施250 g磷肥为基肥。试验林四周栽植2行木荷Schima superba作隔离行。2006年3月造林，造林当年及第2年每年抚育2次，第3年抚育1次，均未追肥。2007年11月调查试验林2年生的保存率，2008年11月、2011年11月、2016年11月、2019年11月分别对试验林进行每木调查，其中树高用塔尺测量，胸径用胸径尺测量，测量位置为树干根部往上1.3 m处。
1.4 数据分析
利用SAS 9.1统计软件[12]对数据进行分析。在Proc Means过程中进行数据特征描述，应用限制最大似然(REML)方法在Proc Mixed 过程估算各效应方差分量，应用SIN方法在Proc Cluster过程进行聚类分析，以小区平均值为数据运用Proc GLM过程进行单地点方差分析，分析模型为：Yij=μ+Bi+Fj+Eij。其中：Yij为i区组j种源的小区平均值，μ为性状的群体均值，Bi为i区组效应，Fj为第j个种源效应，Eij为j种源i区组的小区均值离差。单株材积、表型相关系数、遗传相关系数、种源遗传力等估算公式参照文献[11]。
2. 结果与分析
2.1 不同林龄种源生长表现分析
从图1可见：2片乐昌含笑试验林的保存率均较高，其中，在林龄2 a时，保存率曲江林场试验林为85.19%，九曲水试验林为95.02%。曲江林场和九曲水试验林的保存率变化趋势较相似，在林龄3~11 a间保存率均变化不大，分别为80.56%~81.51%和89.24%~94.44%；在林龄11~14 a间保存率有较明显下降，在林龄14 a时，曲江林场试验林为77.96%，九曲水林场试验林为80.79%。
图 1 曲江林场(A)和九曲水林场(B)试验林不同林龄的保存率Figure 1 Preservation rate of different ages of two testing forests in Qujiang forest farm (A) and Jiuqushui forest farm (B)由乐昌含笑种源不同林龄生长表现(表2)可知：曲江林场试验林树高速生期出现在林龄3 a之前和11~14 a，年均生长量分别为0.79和0.81 m·a−1；胸径速生期出现在林龄3~6 a和11~14 a，年均生长量分别为1.20和1.05 cm·a−1。九曲水林场试验林树高的速生期出现在林龄3 a之前和6~11 a，年均生长量分别为0.98和0.63 m·a−1；胸径速生期出现在林龄3~6 a和6~11 a，年均生长量分别为0.95和0.80 cm·a−1。2片试验林单株材积生长速生期均在林龄11~14 a。随着林龄的增大，3个生长性状在种源间的分化也不断增大，各性状的变异系数随林龄的增长呈逐渐增大后减小的趋势，从大到小依次为单株材积变异系数、胸径变异系数、树高变异系数。
表 2 不同林龄种源的生长表现Table 2 Growth performance of provenances at different ages试验林 林龄/a 树高 胸径 单株材积 均值/m 变幅/m 变异系数 均值/cm 变幅/cm 变异系数 均值/m3 变幅/m3 变异系数 曲江林场 3 2.36 1.20~4.40 12.37 1.68 0.20~5.50 22.53 3.93×10−4 2.17×10−6~4.37×10−3 48.98 6 4.04 1.40~7.60 17.19 5.28 0.50~14.90 24.32 6.38×10−3 1.00×10−5~5.85×10−2 58.77 11 7.31 2.20~13.50 15.59 9.48 2.00~25.00 18.95 3.47×10−2 5.20×10−4~2.78×10−1 52.87 14 9.73 2.40~17.50 11.58 12.64 2.50~30.50 15.37 8.10×10−2 6.10×10−4~4.54×10−1 36.49 九曲水林场 3 2.94 1.00~6.20 9.72 2.88 0.50~8.40 17.34 1.24×10−3 1.00×10−5~1.22×10−2 38.08 6 4.76 1.50~11.00 10.24 5.73 0.70~16.50 13.72 8.39×10−3 2.00×10−5~1.08×10−1 41.27 11 7.93 2.50~18.10 10.65 9.74 2.20~23.50 13.92 3.54×10−2 6.10×10−4~3.22×10−1 42.91 14 9.37 2.80~16.20 11.64 11.09 2.40~34.20 13.78 6.27×10−2 8.50×10−4~6.76×10−1 34.90 2.2 不同林龄种源生长性状方差分析
方差分析结果(表3)显示：不同林龄的树高、胸径、单株材积在参试种源间均达到极显著水平(P＜0.01)，说明不同种源的生长性状存在很大差别，从种源试验林中筛选丰产型优良种源以及开展种源早期选择是可行的。由方差分量占比分析结果还可知：在不同林龄时，遗传效应、环境效应以及遗传和环境互作效应都对乐昌含笑生长性状的变异有影响。在遗传方面，树高、胸径和单株材积生长性状的遗传模式比较一致，总体表现为随林龄增大遗传效应逐渐增强或趋于平稳的趋势；不同林龄遗传效应的影响总体大于遗传和环境互作效应的影响，这种差异在林龄为14 a时尤其明显。此外，环境效应对生长性状的影响也不容忽视，其中，曲江林场试验林中环境效应表现为随林龄增加影响逐渐减少的趋势，在九曲水林场试验林中不同林龄的环境效应则表现相对稳定，这也说明了在种源试验过程中控制环境变异并提高测量准确性是十分必要的。
表 3 不同林龄生长性状的方差分析Table 3 Variance analysis of growth traits at different ages性状 林龄/a 曲江林场试验林 九曲水林场试验林 自由度 F 方差分量占比/% 自由度 F 方差分量占比/% 种源 种源×区组 误差 种源 种源×区组 误差 树高 3 14 3.64** 30.02 27.80 42.18 11 5.58** 40.89 23.41 35.70 6 14 4.40** 31.31 31.81 36.88 11 8.25** 53.51 16.98 29.51 11 14 5.68** 37.78 29.93 32.29 11 7.12** 43.90 25.50 30.60 14 14 9.94** 56.29 18.53 25.18 11 6.74** 41.25 21.35 37.40 胸径 3 14 4.52** 36.28 22.46 41.26 11 3.19** 24.45 30.86 44.69 6 14 4.54** 32.88 29.97 37.15 11 7.97** 53.32 16.09 30.59 11 14 6.52** 42.62 26.50 30.88 11 7.12** 46.22 23.58 30.20 14 14 9.11** 57.16 14.64 28.20 11 7.37** 55.43 9.76 34.81 单株材积 3 14 5.41** 44.65 14.85 40.50 11 3.79** 30.47 25.80 43.73 6 14 3.55** 33.32 25.97 40.71 11 4.71** 36.64 23.89 39.47 11 14 4.24** 32.42 30.23 37.35 11 4.52** 32.38 30.79 36.83 14 14 6.93** 48.02 19.61 32.37 11 6.30** 51.19 10.21 38.60 说明：**表示性状方差分析差异极显著(P＜0.01) 2.3 不同林龄种源生长性状遗传参数估算
由表4表明：树高、胸径、单株材积3个性状的种源遗传力均属中上水平，变幅为0.69~0.90。其中，曲江林场试验林树高、胸径的种源遗传力随林龄增加呈逐渐增大后趋于稳定的趋势，到林龄14 a时分别为0.90和0.89；而九曲水林场试验林不同林龄各性状的种源遗传力表现相对稳定，为0.82~0.88。
表 4 不同林龄生长性状的种源遗传力估算值Table 4 Estimation of provenance heritability of growth traits at different ages林龄/a QJ06遗传力估算值 JQS06遗传力估算值 树高 胸径 单株材积 树高 胸径 单株材积 3 0.73 0.78 0.82 0.82 0.69 0.74 6 0.77 0.78 0.72 0.88 0.88 0.79 11 0.82 0.85 0.76 0.85 0.86 0.78 14 0.90 0.89 0.86 0.82 0.86 0.84 说明：QJ06为曲江林场试验林；JQS06为九曲水林场试验林 2.4 幼林期和近熟林期性状相关分析
利用不同林龄参试种源的树高、胸径、单株材积分别与14 a的单株材积做相关分析可知(表5)：2片试验林不同林龄各性状间的表型相关系数为0.22~0.44，遗传相关系数为0.83~1.00。遗传相关系数均大于表型相关系数，并在林龄为3 a以上时，呈极显著正相关关系(P＜0.01)。表明乐昌含笑单株材积的早期选择在林龄为3 a后开展是可行的。随着林龄的增大，曲江林场试验林各性状间的表型和遗传相关系数均相对稳定，而九曲水林场试验林各性状间的表型和遗传相关系数则有逐渐增大后趋于稳定的趋势，而且不同林龄的胸径与14 a的单株材积间的相关系数均大于树高与其的相关系数，到林龄6 a时，其胸径、单株材积和14 a的单株材积间的遗传相关系数均达到1.0并趋于稳定。由此推测，根据幼林期胸径或单株材积的生长选择乐昌含笑丰产型优良种源，其效果应优于根据树高的选择效果，而且选择林龄越晚，选择效果将会越好。
表 5 幼林期和近熟林期生长性状相关系数Table 5 Correlation coefficients of the main growth traits between the juvenile and mature age性状 林龄/a QJ06试验林14 a
单株材积JQS06试验林14 a
单株材积表型相
关系数遗传相
关系数表型相
关系数遗传相
关系数树高 3 0.42** 0.98** 0.29** 0.83** 6 0.35** 0.95** 0.29** 0.92** 11 0.41** 0.96** 0.38** 0.95** 胸径 3 0.38** 0.97** 0.30** 0.98** 6 0.36** 0.97** 0.31** 1.00** 11 0.40** 0.98** 0.41** 1.00** 单株材积 3 0.37** 1.00** 0.22** 0.90** 6 0.36** 0.97** 0.35** 1.00** 11 0.37** 0.96** 0.44** 1.00** 说明：QJ06为曲江林场试验林；JQS06为九曲水林场试验林。**表示两两性状间极显著相关(P＜0.01) 2.5 种源的分类评价
种源分类评价方法有综合指标法和单指标法。综合指标法利用胸径、树高、单株材积3个指标的聚类分析结果进行种源分类评价；单指标法依据单株材积1个指标的大小进行种源分类评价。根据聚类分析结果，可把种源分为3类(表6)。其中：综合指标法的分类标准为：Ⅰ类种源总体生长表现最好，其树高、胸径、单株材积3个指标与群体均值相比均有明显增益，为丰产型种源；Ⅱ类种源总体生长表现较好，树高、胸径、单株材积3个指标与群体均值相比差异不明显，为普通型种源；Ⅲ类种源总体生长表现较差，树高、胸径及单株材积均明显小于群体均值，为低产型种源。单指标法的分类标准为：Ⅰ类丰产型种源，单株材积生长表现最好，与群体均值相比现实增益≥15%；Ⅱ类普通型种源，单株材积生长表现较好，与群体均值相比现实增益为0~15%；Ⅲ类低产型种源，单株材积生长表现较差，与群体均值相比无增益。在不同林龄时，曲江林场试验林采用2种评价方法筛选所得丰产型Ⅰ类种源的数量占比均为33%~40%，九曲水林场试验林采用综合指标法筛选所得Ⅰ类种源的数量占比为17%~42%，单指标法所得Ⅰ类种源的数量占比为25%~33%，而且2种评价方法各类群所归类的种源个体总体差异不明显，表明2种方法对Ⅰ类种源的分类结果较一致，但单指标法在操作上相对来说更简单。此外，表6还表明：2片试验林中绝大多数种源的早晚期生长表现较一致，如造林号为8、10、11、14、15的种源在各林龄时均属于Ⅰ类种源，具有良好的持续生长特性；而在林龄3、6 a时属于Ⅲ类的种源，绝大部分在林龄11、14 a时仍属于Ⅲ类。这说明乐昌含笑生长性状具有较好的稳定性。
表 6 各林龄参试种源分类评价Table 6 Clustering analysis of provenances at different ages试验林 类群 林龄3 a的种源 林龄6 a的种源 林龄11 a的种源 林龄14 a的种源 综合指标 单指标 综合指标 单指标 综合指标 单指标 综合指标 单指标 曲江林场 Ⅰ 7、8、10、11、14、15 7、8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 7、8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 Ⅱ 9、13 9、13 7、9 7、9 7、9 9 7、9、13 7、9、13 Ⅲ 1、2、3、4、5、6、12 1、2、3、4、5、6、12 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12 1、2、3、4、5、6、12 九曲水林场 Ⅰ 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 8、10、11 7、8、10、11 Ⅱ 2、6、9、12、 2、4、9、12 2、4、9、12 4、9 4、7、9 4、9 Ⅲ 1、3、4、5 1、2、3、4、5、6、9、12 1、3、5、6 1、2、3、4、5、6、9、12 1、3、5、6 1、2、3、5、6、12 1、2、3、5、6、12 1、2、3、5、6、12 说明：表中数字为参试种源对应的造林号，具体种源信息见表1 2.6 早期选择风险评估
作为一般用材林经营时，软阔类树种龄级划分标准为：林龄≤5 a为幼龄林，6~10 a为中龄林，11~15 a为近熟林，16~25 a为成熟林[13]。据此可知，本研究乐昌含笑种源试验林已是近熟林。若分别以综合指标和单指标法进行种源分类评价，以林龄14 a的近熟林Ⅰ类种源选择结果为标准，进一步对不同林龄筛选出的Ⅰ类种源进行风险评估(表7)。由表7可知：采用2种分类评价方法开展Ⅰ类种源选择，在林龄3、6 a时，曲江林场试验林Ⅰ类种源的选对率分别为83%、100%，漏选率均为0；九曲水林场试验林则以单指标法选对率更高，在林龄3、6 a的选对率均为100%，而综合指标法的选对率均为75%，2种方法的漏选率均为0。由此可知，2种分类评价方法的早期选择风险存在一定差异，总体上以单指标法开展早期选择的风险更低，但采用2种分类评价方法在林龄为3、6 a时开展Ⅰ类种源的早期选择，所得Ⅰ类种源中均能包含14 a时入选Ⅰ类种源的100%。
表 7 乐昌含笑种源不同林龄选择风险评估Table 7 Selection risk of M. chapensis provenances at different ages评价
方法林龄/
a曲江林场试验林 九曲水林场试验林 入选数/
个选对数/
个选对率/
%错选数/
个错选率/
%漏选数/
个漏选率/
%入选数/
个选对数/
个选对率/
%错选数/
个错选率/
%漏选数/
个漏选率/
%单指标 3 6 5 83 1 17 0 0 4 4 100 0 0 0 0 6 5 5 100 0 0 0 0 4 4 100 0 0 0 0 11 6 5 83 1 17 0 0 4 4 100 0 0 0 0 14 5 5 100 0 0 0 0 4 4 100 0 0 0 0 综合指标 3 6 5 83 1 17 0 0 4 3 75 1 15 0 0 6 5 5 100 0 0 0 0 4 3 75 1 15 0 0 11 5 5 100 0 0 0 0 4 3 75 1 15 0 0 14 5 5 100 0 0 0 0 3 3 100 0 0 0 0 3. 讨论和结论
3.1 讨论
本研究的2片乐昌含笑种源试验林林木保存率随着林龄的增大以及个体间竞争的加大而逐渐降低，尤以林龄11~14 a的保存率下降速度较快。据观察，死亡的个体多为林冠内中、下层林木，这些矮小林木的死亡，会对参试种源生长量评价及遗传参数估算产生不利影响。因此，在现有3 m×3 m的造林密度下，在已郁闭且林木尚未大量死亡前作评价，结果是相对可靠的；当死亡植株大量增加时，评价结果将产生较大偏差。若要比较准确评价参试种源在达到轮伐期时的现实生产力，则在造林时适当加大株行距以增大种植空间可能更合适。
性状的遗传变异是林木遗传改良的前提，丰富而有效的遗传变异奠定了林木的改良潜力[5, 14]。丘作忠等[15]对九曲水林场试验林的研究表明：林龄为6 a时，树高、胸径、单株材积生长性状和树干通直度、冠幅、树冠密度等性状在种源间均有极显著差异，生长性状的种源遗传力为0.79~0.88，若以单株材积为选择目标时，可筛选出优良种源4个，材积现实增益达27.78%~84.43%。王润辉等[11]进一步对在2006年春季造林的九曲水林场试验林、曲江林场试验林、八一林场试验林(已在2015年被砍伐) 3片乐昌含笑种源试验林林龄为6 a的调查表明：种源、地点及种源和地点互作效应均对树高、胸径、单株材积有显著或极显著影响，3个生长性状的种源遗传力为0.70~0.80，结合多地点种源年生长量指标综合表现，可筛选出优良种源6个，材积现实增益达11.95%~41.03%。本研究表明：在林龄为3~14 a，乐昌含笑胸径、树高、单株材积在参试种源间均存在极显著差异，表明生长性状在种源间存在丰富变异，这与之前的研究结果相似[11, 15]。性状的遗传力是从亲代传递给子代的能力上得以体现，本研究中，乐昌含笑种源不同林龄的树高、胸径、单株材积的种源遗传力为0.69~0.90，均在中等以上水平。而且随着林龄的增加，各性状的遗传力表现为上升并趋于稳定的趋势，说明乐昌含笑种源生长性状有较为稳定的遗传特性，也进一步表明乐昌含笑种源早期选择的可行性。
早期选择是缩短林木育种周期、提高遗传改良效率的重要手段，对林业生产和林木育种工作具有重要意义[16−17]。林木生长性状的早晚相关性为早期选择提供了理论基础[18]，但不同树种由于不同的生长规律、木材用途及培育目标，其早期选择年龄存在较大的差异。相关研究多集中在杉木Cunninghamia lanceolata、马尾松Pinus massoniana等传统针叶用材树种上。如叶培忠等[6]指出：在林龄为6~7 a时进行杉木家系早期选择可以增大年度效益；王章荣等[7]研究认为：马尾松在林龄为9~10 a时开展选择的可靠性较高。钟伟华[19]基于火炬松Pinus taeda子代林近20 a的测定结果，提出林龄为6 a时是火炬松材积早期选择的最佳林龄。近些年，有学者陆续对木兰科树种开展遗传改良研究工作，并取得阶段性进展。如陈清根[20]对灰木莲Manglietia conifera开展家系选择发现：在林龄为8 a时入选的8个优良家系中，有5个与林龄3 a时入选的家系相同，但由于试验林尚未达到成熟期，2个林龄的选对率以及灰木莲早期选择的最佳林龄等问题仍需进一步确定。王云鹏等[5]对木荷优树自由授粉家系在林龄为3、5、10 a的生长性状研究表明：在林龄为5 a时以胸径作为早期选择性状的选择效率更高，但早期选择最佳林龄还需持续观测后确定。本研究表明：乐昌含笑种源的生长性状在早晚年度间存在极显著的遗传相关和表型相关，表明开展早期选择是可行且有效的。进一步结合2片试验林的种源分类评价结果发现：当以丰产型的Ⅰ类种源为选择目标时，在林龄为3、6 a时开展早期选择，无论是采用综合指标法还是单指标法所得Ⅰ类种源中都能包含14 a时入选Ⅰ类种源的100%。这一方面可能是因为树高、胸径2个生长性状与单株材积间具有密切相关性，另一方面可能也说明了乐昌含笑树高、胸径、单株材积性状具有良好的遗传稳定性。而且，本研究的种源试验林已是近熟林，所得结果可靠性较高。但由于试验林尚未到轮伐期，分析所得早期选择的适宜林龄仍需后续的进一步验证。
3.2 结论
乐昌含笑的树高、胸径、材积生长性状在种源间差异达极显著水平(P＜0.01)，各林龄3个生长性状的种源遗传力为0.69~0.90，属于中上水平；参试种源在林龄为3、6、11 a的树高、胸径、单株材积分别与14 a时的单株材积间有极显著相关关系(P＜0.01)，其中表型相关系数为0.22~0.44，遗传相关系数为0.83~1.00，并且各林龄的遗传相关系数均大于表型相关系数。当以丰产型种源为选择目标时，乐昌含笑种源早期选择的适宜林龄为3~6 a，在此期间开展单株材积的早期选择，选对率较高，漏选率较低，入选的种源中能包含林龄14 a时入选种源的100%。
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图 1 引物UBC876对所采集白及样本的ISSR-PCR扩增结果
Figure 1 Amplification results of B. striata with primer UBC876 of ISSR
图 2 引物组合Me9-Em13对所采集白及样本的SRAP-PCR扩增结果
Figure 2 Amplification results of B. striata with primer combination Me9-Em13 of SRAP
表 1 白及种源信息
Table 1. Source information of B. striata samples
编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 1 浙江温州泰顺 9 云南丽江永胜 17 四川乐山沐川(2) 25 四川汶川水磨(2) 2 浙江台州天台 10 云南普洱思茅 18 四川雅安石棉 26 四川汶川水磨(3) 3 浙江衢州江山 11 云南曲靖会泽 19 四川内江东兴(1) 27 四川都江堰虹口(1) 4 浙江金华磐安 12 贵州遵义正安 20 四川内江东兴(2) 28 四川都江堰虹口(2) 5 浙江宁波象山 13 贵州黔西南安龙 21 四川内江东兴(3) 29 四川成都大邑 6 浙江杭州临安 14 贵州遵义赤水 22 四川内江东兴(4) 30 四川成都彭州(1) 7 云南红河蒙自(1) 15 贵州毕节大方 23 四川内江东兴(5) 31 四川成都彭州(2) 8 云南红河蒙自(2) 16 四川乐山沐川(1) 24 四川汶川水磨(1) 32 四川甘孜康定 
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表 2 ISSR引物信息及扩增结果
Table 2. ISSR primer information and amplification results
引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 UBC823 (TC)8C 15 12 80.00 8 UBC876 (GATA)2(GACA)2 25 25 100.00 2 UBC826 (AC)8C 18 17 94.44 9 UBC879 C(TTCAC)3 15 15 100.00 3 UBC827 (AC)8G 16 16 100.00 10 UBC880 (GGAGA)3 17 11 64.71 4 UBC842 (GA)8(C/T)G 18 18 100.00 11 UBC881 (GGGTG)3 20 20 100.00 5 UBC855 (AC)8(C/T)T 9 9 100.00 合计 188 174 6 UBC866 (CTC)6 15 12 80.00 平均 17.09 15.82 92.20 7 UBC868 (GAA)6 20 19 95.00
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表 3 SRAP引物信息及扩增结果
Table 3. SRAP primer information and amplification results
引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 Me1-Em12 BATA DCAT 19 17 89.47 8 Me11-Em12 BACG DCAT 18 15 83.33 2 Me3-Em2 BAAT DTGC 22 20 90.91 9 Me12-Em6 BAAA DGCA 16 16 100.00 3 Me5-Em5 BAAG DAAC 18 17 94.44 10 Me12-Em7 BAAA DCAA 17 16 94.12 4 Me6-Em2 BACT DTGC 19 16 84.21 11 Me13-Em9 BAAC DCGA 28 27 96.43 5 Me9-Em13 BACA DCTA 18 18 100.00 合计 216 202 6 Me9-Em14 BACA DCTC 19 18 94.74 平均 19.64 18.36 93.52 7 Me11-Em10 BACG DCAG 22 22 100.00 说明：B表示TGAGTCCAAACCGG；D表示GACTGCGTACGAATT
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表 4 白及的遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of B. striata
研究方法 种源地 Na Ne H I PPB/% 浙江 1.5000 1.3215 0.1841 0.2729 50.00 ISSR 云南 1.6489 1.4042 0.2328 0.3473 64.89 贵州 1.5000 1.3176 0.1824 0.2717 50.00 四川 1.7926 1.4393 0.2607 0.3940 79.26 群体水平 1.6104 1.3707 0.2150 0.3215 61.04 物种水平 1.9255 1.4619 0.2819 0.4327 92.55 SRAP 浙江 1.5833 1.3753 0.2153 0.3191 58.33 云南 1.6713 1.4163 0.2432 0.3631 67.13 贵州 1.5000 1.3373 0.1923 0.2835 50.00 四川 1.8704 1.4891 0.2886 0.4357 87.04 群体水平 1.6563 1.4045 0.2349 0.3504 65.63 物种水平 1.9352 1.5309 0.3103 0.4667 93.52 ISSR+SRAP 浙江 1.5446 1.3503 0.2007 0.2976 54.46 云南 1.6609 1.4107 0.2384 0.3558 66.09 贵州 1.5000 1.3281 0.1877 0.2780 50.00 四川 1.8342 1.4660 0.2756 0.4163 83.42 群体水平 1.6349 1.3888 0.2256 0.3369 63.49 物种水平 1.9307 1.4988 0.2971 0.4509 93.07
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[1] CHEN Zhiyan, CHENG Lizeng, HE Yichen, et al. Extraction, characterization, utilization as wound dressing and drug delivery of Bletilla striata polysaccharide: a review [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 120: 2076 − 2085. [2] DONG Jianwei, ZHAO Lixing, CAI Le, et al. Antioxidant activities and phenolics of fermented Bletilla formosana with eight plant pathogen fungi [J]. Journal Bioscience and Bioengineering, 2014, 118(4): 396 − 399. [3] WANG Lining, HE Yongzhi, ZHAO Qiduo, et al. Phenolic compounds from Bletilla striata [J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2017, 19(10): 981 − 986. [4] DIAO Huajia, LI Xin, CHEN Jiangning, et al. Bletilla striata polysaccharide stimulates inducible nitric oxide synthase and proinflammatory cytokine expression in macrophages [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 105(2): 85 − 89. [5] ZHANG Guangyuan, QIAO Jin, LIU Xin, et al. Interactions of self-assembled Bletilla striata polysaccharide nanoparticles with bovine serum albumin and biodistribution of its docetaxel-loaded nanoparticles[J/OL]. Pharmaceutics, 2019, 11(1): 43[2022-09-01]. doi:10.3390/pharmaceutics11010043. [6] PRIDGEON A M, CRIBB P J, CHASE M W, et al. Genera Orchidacearum, Volume 4, Epidendroideae (Part 1)[M]. New York: Oxford University Press, 2005. [7] CHUNG M Y, CHUNG M G. Pollination biology and breeding systems in the terrestrial orchid Bletilla striata [J]. Plant Systematics and Evolution, 2005, 252: 1 − 9. [8] JIAO Jie, JIA Xiangrong, LIU Pei, et al. Species identification of polygonatirhizoma in China by both morphological and molecular marker methods [J]. Comptes Rendus Biologies, 2018, 341(2): 102 − 110. [9] MALLARD B W, TIRALONGO J. Cancer stem cell marker glycosylation: nature, function and significance [J]. Glycoconjugate Journal, 2017, 34(4): 441 − 452. [10] 聂新辉, 尤春源, 张大伟, 等. 棉花抗低温生理指标和分子标记鉴定体系研究[J]. 新疆农业科学, 2013, 50(1): 8 − 14. NIE Xinhui, YOU Chunyuan, ZHANG Dawei, et al. Study on the physiological indexes and identifiable system of molecule marker about cotton cold resistance [J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2013, 50(1): 8 − 14. [11] HAYWARD A C, TOLLENAERE R, DALTON-MORGAN J, et al. Molecular marker applications in plants [J]. Methods in Molvcular Biology, 2015, 1245: 13 − 27. [12] HADIPOUR M, KAZEMITABAR S K, YAGHINI H, et al. Genetic diversity and species differentiation of medicinal plant persian poppy (Papaver bracteatum L. ) using AFLP and ISSR markers[J/OL]. Ecological Genetics and Genomics, 2020, 16: 100058[2021-09-01]. doi:10.1016/j.egg.2020.100058. [13] 金亮, 郭方其, 付曼曼, 等. 中药材白及分子鉴定研究进展[J/OL]. 分子植物育种, 2021-07-14[2021-09-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210713.1319.003.html. JIN Liang, GUO Fangqi, FU Manman, et al. Progress on molecular authentication of Bletilla striata [J/OL]. Molecular Plant Breeding, 2021-07-14[2021-09-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210713.1319.003.html. [14] 邢佳鑫, 陈玲, 张希, 等. SSR和ISSR法对白芨的真伪鉴定[J]. 热带农业科学, 2019, 39(10): 42 − 47. XING Jiaxin, CHEN Ling, ZHANG Xi, et al. Authenticity identification of Bletilla striata by SSR and ISSR [J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2019, 39(10): 42 − 47. [15] 洪建聪, 郭艳, 翟利娜, 等. 野生白及资源遗传多样性的SRAP分析[J]. 中草药, 2019, 50(8): 1966 − 1971. HONG Jiancong, GUO Yan, ZHAI Lina, et al. Genetic diversity of wild Bletilla striata based on SRAP markers [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(8): 1966 − 1971. [16] 陈锦, 杨侃侃, 王志伟, 等. 利用RAPD、ISSR标记分析白芨种质资源遗传多样性的研究[J]. 中国农学通报, 2017, 33(12): 137 − 142. CHEN Jin, YANG Kankan, WANG Zhiwei, et al. Study on genetic diversity of Bletilla striata germplasm resources using RAPD and ISSR markers [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2017, 33(12): 137 − 142. [17] 孙宇龙, 侯北伟, 耿丽霞, 等. 基于SRAP标记的白芨遗传多样性和遗传结构评价[J]. 药学学报, 2016, 51(1): 147 − 152. SUN Yulong, HOU Beiwei, GENG Lixia, et al. Evaluation of genetic diversity and population structure of Bletilla striata based on SRAP markers [J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2016, 51(1): 147 − 152. [18] WANG C X, TIAN M. Callus-mediated and direct protocorm-like body formation of Bletilla striata and assessment of clonal fidelity using ISSR markers [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2014, 36(9): 2321 − 2330. [19] FERRIOL M, PICÓ B, NUEZ F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers [J]. Theoretical and Applied of Genetics, 2003, 107(2): 271 − 82. [20] BUDAK H, SHEARMAN R C, PARMAKSIZ I, et al. Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers [J]. Theoretical and Applied of Genetics, 2004, 108: 328 − 334. [21] 周天华, 黎君, 丁家玺, 等. 白及种质资源及其近缘种的SSR指纹图谱研究[J]. 西北植物学报, 2017, 37(4): 673 − 681. ZHOU Tianhua, LI Jun, DING Jiaxi, et al. SSR fingerprints of Bletilla striata Rchb. f. germplasm and its relatives or congeners [J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2017, 37(4): 673 − 681. [22] 和志娇, 吕丽芬, 杨丽云, 等. 白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西南农业学报, 2008, 21(4): 1081 − 1085. HE Zhijiao, LÜ Lifen, YANG Liyun, et al. Gennetic diversity of Bletilla Rchb. f. germplasms by ISSR analysis [J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2008, 21(4): 1081 − 1085. [23] 吴劲松. 白及属植物AFLP遗传多样性分析及鉴定研究[D]. 南京: 南京师范大学, 2014. WU Jinsong. Analysis and Identification of AFLP Genetic Diversity of Bletilla Rchb. f. [D]. Nanjing: Nanjing Normal University, 2014. [24] GUO Yan, ZHAI Lina, LONG Hao, et al. Genetic diversity of Bletilla striata assessed by SCoT and IRAP markers [J/OL]. Hereditas, 2018, 155: 35[2021-09-01]. doi:10.1186/s41065-018-0074-4. [25] HAMRICK J L, GODT M J W. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species [J]. Transaction of the Royal Society of London Series B, 1996, 351: 1291 − 1298. 期刊类型引用(3)
1. 张怡，王润辉. 育苗基质对乐昌含笑林分早期生长的影响. 林业与环境科学. 2024(06): 40-45 . 
百度学术2. 朱报著，王海华，徐放，李祥彬. 广东含笑属检索表及树种应用研究. 林业与环境科学. 2023(04): 61-67 . 百度学术3. 胡辉群. 新丰县乐昌含笑嫁接育苗技术及抚育管理措施. 南方农业. 2023(18): 143-145 . 百度学术其他类型引用(0)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210690
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