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白菜Brassica campestris ssp. chinensis是十字花科Brassicaceae芸薹属Brassica 2年生草本植物，因成熟周期短、适应力强、营养价值高等特点，在中国农业生产中占据重要地位[1]。硫代葡萄糖苷简称硫苷，是十字花科植物中的一类含硫、氮次生代谢产物，基于衍生氨基酸的差异可分为脂肪族、吲哚族和芳香族三大类[2-3]。硫苷的生物合成可分为侧链延伸、核心结构形成和侧链修饰等3步，涉及大量的基因、酶和转录调节因子[4]。已有研究表明：硫苷不仅在抗癌[5]、十字花科植物特殊风味的产生[6-7]及硫元素的调节[8]中发挥着重要的作用，而且是十字花科植物抵御生物胁迫的主要防御物质[9-10]。研究表明：硫苷可以有效影响害虫的生长发育及产卵[11]，但不同类型的硫苷对不同种群植食性昆虫抗性不同[12-13]。如甘蓝夜蛾Mamestra brassicae幼虫在取食脂肪族和吲哚族硫苷含量较高的植物后生长缓慢，取食吲哚族硫苷含量较高的植物后发育时间也会延长[14]。作为一种防御相关植物次生代谢产物，硫苷存在于植物的整个生命周期中[15-16]，植食性昆虫的取食会使其含量显著提高[17-18]，硫苷含量的改变被证明与害虫胁迫下硫苷的合成、转运及降解相关基因的激活相关[19]。MEWIS等[20]发现拟南芥Arabidopsis thaliana受桃蚜Myzus persicae、甘蓝蚜Brevicoryne brassicae和甜菜夜蛾Spodoptera exigu幼虫取食后，脂肪族硫苷含量显著增加，AtMAM1和AtCYP79F1基因转录水平也显著上调。此前，KOORNNEEF等[21]发现特定硫苷生物合成基因的存在或缺失可以赋予某些植物特殊的抗性，如拟南芥Ler生态型AtMAM2的存在，使得其对甜菜夜蛾幼虫的抗性高于缺乏AtMAM2的拟南芥Col生态型。同样，蚜虫侵袭会使拟南芥吲哚族硫苷含量增加3倍[22]，PFALZ等[23]通过数量性状基因位点(QTL)定位结合转录组分析，发现吲哚族硫苷合成相关基因AtCYP81F2的表达有助于拟南芥抵抗桃蚜，但不能抵御小菜蛾Plutella xylostella 、欧洲粉蝶Pieris brassicae、粉纹夜蛾Trichoplusia ni、甜菜夜蛾等鳞翅目Lepidopteran害虫。在进化过程中，昆虫为应对植物硫苷-黑介子酶防御系统的防御作用，也形成了以解毒酶——细胞色素P450s和谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)等为基础的适应性机制[24−25]。
本研究以白菜为研究对象，通过高效液相色谱法(HPLC)和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)，探究白菜硫苷质量摩尔浓度及组分在甜菜夜蛾幼虫取食胁迫下的变化与潜在的分子调控机制，并通过检测取食前后甜菜夜蛾幼虫体内解毒酶活性的变化，探究白菜硫苷质量摩尔浓度的提高对幼虫体内解毒酶活性的影响，以期为白菜等十字花科作物应对害虫胁迫抗性的提高、品质和产量的改良提供依据。
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本研究所用白菜品种为‘美都黑油筒’B. campestris ssp. chinensis ‘Meiduheiyoutong’，培养条件为光照(28 ℃/14 h，30 000 lx)与黑暗(26 ℃/10 h)循环。挑选长势一致的“八叶一心”时期白菜的第5、6片真叶进行接虫处理。研究所用甜菜夜蛾3龄幼虫由浙江农林大学植物保护课题组提供，接虫前将甜菜夜蛾3龄幼虫饥饿处理4 h，每片叶接虫1头。
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剪取白菜叶片，去除大叶脉，于液氮中冷冻后放入−80 ℃冰箱中保存备用(接虫叶片在取样前用酒精棉将接虫叶片上的排泄物擦拭干净)。将取食后1、24、48和72 h的甜菜夜蛾幼虫放置在冰上冻僵，用解剖针取其中肠，保存在−20 ℃冰箱中备用。
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参考KRUMBEIN等[26]经过ZHU等[27]修改的方法提取硫苷。称0.25 g样品粉末，加入75 ℃预热的体积分数为70%甲醇溶液4 mL，同时加入200 μL 5 mmol·L−1的2-丙烯基硫苷作为内标，混匀后放在75 ℃水浴锅中水浴10 min，间隔震荡；6 000 r·min−1 离心10 min收集上清液，剩余沉淀则继续加入2次3 mL 75 ℃预热的体积分数为70%的甲醇提取、涡旋、离心，将3次收集的上清液合并倒入10 mL容量瓶中定容；滤纸进行粗过滤，取5 mL过滤液装载到DEAE Sephadex A25固相萃取柱，待滤液全部流完后，加6 mL纯净水清洗柱子，再加入250 μL硫酸酯酶，30 ℃反应12 h，5 mL纯净水洗脱，洗脱液用0.45 mm滤膜过滤后在−20 ℃下保存。HPLC分析进样量20 μL，C-18反相柱柱温30 ℃，流动相为超纯水和乙腈，1 mL·min−1，0~45 min内乙腈质量浓度线性梯度0%~20%，检测波长为229 nm。
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采用Trizol法提取白菜总RNA，提取过程中防止RNase污染。具体步骤为：取0.2 g植物组织材料快速研磨至粉末状，迅速将其移入装有1 mL预冷Trizol的离心管中，间隔震荡。4 ℃ 12 000 r·min−1离心10 min，取1 mL上清液，加入200 μL预冷氯仿，振荡混匀，冰上静置3 min；4 ℃ 12 000 r·min−1离心10 min，取500 μL上清液，加入100 μL预冷氯仿，振荡混匀，冰上静置3 min；4 ℃ 12 000 r·min−1离心10 min，取400 μL上清液至新的离心管，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，−20 ℃冰箱中静置30 min。4 ℃ 12 000 r·min−1离心10 min，弃上清液，加入1 mL预冷的体积分数为75%乙醇；4 ℃ 13 000 r·min−1离心5 min，弃上清液，加入20 μL 预冷的体积分数为0.1%的无核酸酶水溶解沉淀，−20 ℃保存备用。用NanoDrop 2000检测RNA样品的浓度后，用质量浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的质量。cDNA第1链的合成参照Takara公司的反转录试剂盒(Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)的说明书进行。
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以反转录获得的cDNA为模板，引物由Primer 5软件设计，以白菜BcUBC10基因[28]作为内参，基因的定量引物见表1。荧光定量PCR扩增体系为：2×SYBR Premix Ex-TaqTM 10 μL，10 ng·μL−1cDNA 1 μL，上下游引物各0.3 μL，无核酸酶双蒸水(RNase free ddH2O) 补足至15 μL。反应循环条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性34 s，共40个循环，每份3次重复。用
$2^{-\Delta\Delta C_{t}}$ 法计算其相对表达量[29]，琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。表 1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)表达分析引物序列
Table 1. Primer sequences for RT-qPCR analysis
基因名称 上游引物(5 ＇→3 ＇) 下游引物(5 ＇→3 ＇) BcMAM1 CCAGAGTACATACCGCACAA AGAGGACACCGGAAAACCAA BcCYP83A1 AGTTCTCCTCTTCTTCCTCT CCATTGTTTGACTTCCTATC BcCYP83B1 ACACTTCCTCTTTCGTCTCT CATCGTTTGTTGCCCCTTCA BcMYB28 GAGAATTTGCATTCCCTTGC TGGTGTCCCATCTTTGTTGG BcSOT16 GGGTTATGGGTTTAGTGCTG CTCCAACCTTCCCTTTCCTA BcUBC10 GGGTCCTACAGACAGTCCTTAC ATGGAACACCTTCGTCCTAAA BcAPK2 CAACACCGTCTGGGATCTGC AACCGACATCGACACCTGGA BcSUR1 GGCGTTATCTACATGCTGTTCG CAGGTGCGGAAGCAAGGGTA BcAOP2 TGGATTTGCACCAAAGGAAA AGATAGATCACTGGAAGTTG BcBCAT4 AAGCAACTCGACTCAAACACT CGATAAAACCCGAATCCTAAT -
根据GSTs试剂盒说明书（南京建成生物有限公司）进行。
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采用Excel 2020进行数据整理与分析，所有数据均是至少3次生物学重复的平均值±标准误；采用 SPSS 22.0进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著。
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在白菜中共检测到8种硫苷组分(表2)，其中：脂肪族3种、吲哚族4种、芳香族1种。如表3所示：甜菜夜蛾幼虫取食不同时间点(1、24、48、72 h)白菜硫苷质量摩尔浓度呈显著增加趋势(P＜0.05)，取食1和48 h时增幅最大，72 h达峰值(2.03 µmol·g−1)，是对照的1.8倍；吲哚族和脂肪族硫苷占总硫苷比例最高。甜菜夜蛾幼虫取食后两者显著增加(P＜0.05)，并分别在取食48和72 h时达到峰值，是对照的1.6和2.4倍；取食1和24 h时芳香族硫苷质量摩尔浓度也呈显著(P＜0.05)上升趋势。这一结果表明甜菜夜蛾幼虫的取食能够诱导白菜硫苷的合成，其中吲哚族硫苷变化最为剧烈，说明吲哚族硫苷可能在抵御鳞翅目昆虫甜菜夜蛾幼虫取食过程中发挥重要的作用。3-吲哚基甲基硫苷(GBC)和1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷(NEO)在甜菜夜蛾幼虫取食后不断增加，在取食72 h时达峰值，分别是对照的4.7和4.9倍；而4-戊稀基硫苷(GBN)、4-羟基吲哚-3-甲基硫苷(4OH)、2-羟基-3-丁烯基硫苷(PRO)和4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷(4ME)则呈先增后减趋势，其中GBN对甜菜夜蛾幼虫取食的响应最为强烈，48 h达峰值，是对照的1.9倍；3-丁烯基硫苷(GNA)和2-苯乙基硫苷(NAS)变化不明显，仅在初始时间点有所增加。
表 2 白菜硫苷组分
Table 2. Components of glucosinolate in B. campestris ssp. chinensis
化合物名称 缩写 所属类别 分子量 保留时间/min 2-羟基-3-丁烯基硫苷progoitrin PRO 脂肪族 388 7.790 3-丁烯基硫苷gluconapin GNA 脂肪族 372 14.480 4-羟基吲哚-3-甲基硫苷4-OH-glucobrassicin 4OH 吲哚族 463 17.067 4-戊烯基硫苷glucobrassicanapin GBN 脂肪族 386 22.087 3-吲哚基甲基硫苷glucobrassicin GBC 吲哚族 447 26.753 2-苯乙基硫苷gluconasturtiin NAS 芳香族 422 31.497 4-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷4-methoxy-glucobrassicin 4ME 吲哚族 477 32.433 1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷1-methoxy-glucobrassicin NEO 吲哚族 477 40.793 表 3 甜菜夜蛾幼虫取食对白菜硫苷质量摩尔浓度的影响
Table 3. Effects of feeding on the content of glucosinolate in B. campestris ssp. chinensis by S. exigua larvae
类型 化合物缩写 硫苷质量摩尔浓度/(µmol·g−1) 0 (ck) 1 24 48 72 h 脂肪族 GNA 0.154±0.010 b 0.174±0.005 b 0.220±0.003 c 0.132±0.003 a 0.132±0.002 a PRO 0.152±0.003 a 0.150±0.002 a 0.176±0.001 b 0.182±0.002 c 0.179±0.001 bc GBN 0.434±0.032 a 0.466±0.009 a 0.550±0.018 b 0.819±0.004 c 0.781±0.001 c 总脂肪族 0.724±0.009 a 0.792±0.001 b 0.959±0.008 c 1.132±0.002 e 1.116±0.004 d 吲哚族 4OH 0.157±0.012 a 0.177±0.003 b 0.222±0.004 c 0.257±0.006 d 0.234±0.004 c GBC 0.044±0.013 a 0.062±0.000 b 0.105±0.003 c 0.130±0.001 d 0.209±0.005 e 4ME 0.089±0.026 a 0.69±0.000 a 0.140±0.003 b 0.154±0.002 b 0.135±0.000 b NEO 0.054±0.011 a 0.067±0.001 b 0.092±0.001 c 0.162±0.003 d 0.263±0.001 e 总吲哚族 0.351±0.001 a 0.375±0.001 b 0.565±0.005 c 0.703±0.010 d 0.840±0.008 e 芳香族 NAS 0.096±0.004 ab 0.109±0.002 c 0.142±0.001 d 0.086±0.001 a 0.101±0.002 bc 总硫苷 1.154±0.003 a 1.277±0.002 b 1.664±0.014 c 1.921±0.011 d 2.032±0.014 e 说明：同行不同小写字母表示同一指标不同时间差异显著(P＜0.05) -
通过RT-qPCR对甜菜夜蛾幼虫取食后白菜硫苷合成相关基因表达情况进行分析。结果(图1)表明：甜菜夜蛾幼虫取食后，脂肪族硫苷合成相关基因BcBCAT4、BcMAM1、BcCYP83A1、BcMYB28、BcSUR1的表达量表现出相同的规律，即取食1 h其表达量显著上调(P＜0.05)，48 h基因表达水平达到最高，而白菜吲哚族硫苷合成相关基因BcCYP83B1表现出相反的变化趋势；脂肪族硫苷合成相关基因BcAOP2和吲哚族硫苷合成相关基因BcSOT16随取食时间的延长表达量逐渐增加，72 h达最高，分别是对照的4.2和3.7倍。此外，硫苷合成过程中的直接硫供体谷胱甘肽(GSH)合成相关基因BcAPK2转录水平呈显著增加趋势，72 h时比对照增加了4.7倍。
图 1 甜菜夜蛾幼虫取食对白菜硫苷代谢关键基因表达模式的影响
Figure 1. Effects of S. exigua larvae feeding on expression patterns of key genes related to glucosinolates metabolism in B. campestris ssp. chinensis
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由图2表明：甜菜夜蛾幼虫取食后，幼虫体内GSTs活性产生显著变化，取食1 h时酶活性增强不显著(P＞0.05)，但在随后的时间点酶活性显著增强(P＜0.05)，24 h增幅最为剧烈，72 h达峰值，为63.6 µmol·mg−1·min−1，比对照升高了1.5倍。可见，白菜硫苷质量摩尔浓度的增加诱导了甜菜夜蛾幼虫体内解毒酶GSTs活性的提高。
图 2 取食白菜后甜菜夜蛾幼虫GSTs活性的变化
Figure 2. Changes of GSTs activity in S. exigua larve after feeding on B. campestris ssp. chinensis
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已有研究发现：不同拟南芥群体硫苷的种类和含量有所差异，而这种差异影响着拟南芥对不同种群植食性昆虫的抗性[30-33]，如甘蓝夜蛾和菜青虫Pieris rapae在取食脂肪族和吲哚族硫苷含量较高的植株时，生长缓慢，取食吲哚族硫苷含量较高的植株时，发育时间也会增加[34]。随后，在研究拟南芥脂肪族硫苷的抗虫机制中，发现GS-Elong、GS-AOP、TGGs等位点与脂肪族硫苷的抗虫性相关[35-38]。SONTOWSKI等[19]发现：拟南芥被甜菜夜蛾幼虫取食后，GS-Elong位点硫苷合成相关基因AtMAM1、AtMAM2、AtMAM3转录水平显著增加，同时相关脂肪族硫苷含量也显著上升，说明脂肪族硫苷参与了拟南芥对甜菜夜蛾幼虫的防御反应。本研究发现：白菜被甜菜夜蛾幼虫取食后，脂肪族硫苷GS-Elong位点相关基因BcBCAT4、BcMAM1显著上调，脂肪族硫苷的合成也显著增加，GBN的响应尤为强烈，说明脂肪族硫苷尤其是GBN参与了白菜对甜菜夜蛾幼虫的防御反应。然而，BcBCAT4、BcMAM1的表达水平与相应脂肪族硫苷的质量摩尔浓度存在一定差异，说明除了硫苷生物合成基因的直接影响外，可能还涉及其他机制来参与十字花科芸薹属作物次级代谢产物硫苷的生物合成和积累。此外，吲哚族的4OH、NEO、GBC在甜菜夜蛾幼虫取食过程中显著增加，说明吲哚族硫苷可能在白菜抵御甜菜夜蛾幼虫取食过程中发挥着重要的作用。KUMAR等[39]在研究害虫的质量与芥菜Brassica juncea中硫苷各组分的关系时，发现棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫的增重与芥菜中GNA和GBN的含量呈负相关，而斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫的增重与GNA、GBN和黑介子硫苷酸钾(SIN)的含量呈负相关，进一步研究发现硫苷介导的芥菜对棉铃虫和斜纹夜蛾的抗性差异与BjuMYB28同源物在芥菜叶片中的差异表达相关。本研究中，甜菜夜蛾幼虫取食胁迫下，白菜4OH、NEO、GBC的增加与幼虫体内解毒酶GSTs活性及白菜硫苷合成相关基因BcSOT16呈正相关，说明BcSOT16活性的提高可能是甜菜夜蛾幼虫取食下白菜吲哚族硫苷合成增加的原因，进而提高了白菜对甜菜夜蛾的抗性。需进一步验证BcSOT16的生物学功能，以明确BcSOT16在白菜抵御甜菜夜蛾幼虫取食胁迫过程中所起到的重要作用。
在长期进化过程中，为抵御植食性昆虫的取食，植物形成了多种防御机制，如产生各种次级代谢物[40]。硫苷及其降解产物对昆虫具有阻食、影响其生长发育及繁殖，甚至毒杀的作用[11]，然而，硫苷也能诱导昆虫体内细胞色素P450s和GSTs等主要解毒酶系基因的表达，增强昆虫对硫苷等植物次生物质的代谢能力[23-24, 41]。如草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda幼虫的细胞色素P450s活性可以被吲哚族硫苷降解产物吲哚-3-甲醇所诱导[42]；食用含硫苷、异硫氰酸酯的饲料或直接取食十字花科植物时，桃蚜体内GSTs活性会被诱导增加[24]；与对照相比，取食含硫苷的桃蚜，食蚜蝇GSTs活性亦有所提高[43]。本研究中甜菜夜蛾幼虫取食白菜后，其体内GSTs活性不断增强，与白菜中总硫苷及吲哚类硫苷质量摩尔浓度增加趋势的一致性，表明了硫苷对甜菜夜蛾幼虫GSTs活性的诱导作用，也说明吲哚族硫苷可能在白菜抵御杂食性害虫甜菜夜蛾幼虫取食过程中发挥更为重要的作用。
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甜菜夜蛾幼虫取食能上调白菜BcSOT16、BcBCAT4、BcMAM1等硫苷合成关键基因的表达，从而促进白菜硫苷质量摩尔浓度的增加，提高白菜对甜菜夜蛾幼虫取食胁迫的抗性，吲哚族的4OH、NEO、GBC和脂肪族的GBN的反应尤为强烈，但硫苷质量摩尔浓度的升高又会诱导甜菜夜蛾幼虫体内GSTs活性的增强，提高甜菜夜蛾幼虫对硫苷的解毒能力。
Molecular mechanism of glucosinolate-mediated Brassica campestris ssp. chinensis against feeding stress of Spodoptera exigua larvae
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摘要:
目的 探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫取食对白菜Brassica campestris ssp. chinensis硫代葡萄糖苷质量摩尔浓度及组分的影响，初步明确硫苷介导的白菜抵御甜菜夜蛾幼虫取食胁迫的分子机制。 方法 使用高效液相色谱法检测甜菜夜蛾幼虫取食对白菜硫苷质量摩尔浓度和组分的影响，实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析硫苷代谢关键基因表达模式的变化，谷胱甘肽硫转移酶试剂盒检测取食白菜后甜菜夜蛾幼虫体内谷胱甘肽硫转移酶活性的变化。 结果 白菜中8种硫苷组分在甜菜夜蛾幼虫取食后显著增加(P＜0.05)，其中吲哚族的4-羟基吲哚-3-甲基硫苷(4OH)、1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷(NEO)、3-吲哚基甲基(GBC)和脂肪族的4-戊烯基硫苷(GBN)对甜菜夜蛾幼虫取食反应最为强烈；RT-qPCR结果显示：甜菜夜蛾幼虫取食后，白菜脂肪族硫苷合成相关基因BcBCAT4、BcMAM1的显著上调可能与脂肪族硫苷的增加有关(P＜0.05)，而BcSOT16的上调与4OH、NEO、GBC呈正相关；取食后，甜菜夜蛾幼虫体内谷胱甘肽硫转移酶活性显著增强(P＜0.05)，并呈现与总硫苷和吲哚族硫苷质量摩尔浓度变化规律的一致性。 结论 甜菜夜蛾幼虫的取食能诱导白菜硫苷的合成，而硫苷质量摩尔浓度的升高会诱导幼虫体内谷胱甘肽硫转移酶活性的增强。甜菜夜蛾幼虫取食胁迫下，白菜BcSOT16、BcBCAT4、BcMAM1等硫苷合成关键基因被激活，4OH、NEO、GBC和GBN显著增加，从而更好地抵御甜菜夜蛾幼虫取食胁迫。图2表3参43 Abstract:Objective With an investigation of the effects of Spodoptera exigua larvae feeding on the content and components of glucosinolates (GSLs) in Brassica campestris ssp. chinensis, this study is aimed to figure out the initial molecular mechanism of GSL-mediated resistance to the feeding stress of S. exigua larvae in B. campestris ssp. chinensis. Method The effect of larvae feeding on the content and components of GSLs in B. campestris ssp. chinensis ‘Meiduheiyoutong’was determined with the application of high performance liquid chromatography before an analysis was conducted of the expression patterns of key genes related to GSLs metabolism using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), after which the activity of glutathione S-transferase (GSTs) in larvae after eating B. campestris ssp. chinensis was detected by GSTs kit. Result (1) Of the eight GSLs that enjoyed a significant increase in B. campestris ssp. chinensis after S. exigua larvae’ s feeding, 4-hydroxy-glucobrassicin (4OH), 1-methoxy-glucobrassici (NEO), glucobrassicin (GBC) and glucobrassicanapin (GBN) were the four important GSLs responsive to the feeding; (2) The significant up-regulation of aliphatic GSL synthesis-related genes BcBCAT4 and BcMAM1 in B. campestris ssp. chinensis might be related to the increase of aliphatic GSLs, and the up-regulation of BcSOT16 was positively correlated with 4OH, NEO and GBC after feeding by S. exigua larvae; (3) After feeding, the activity of GSTs in the larvae of S. exigua was significantly enhanced (P＜0.05), and showed a consistency with the changes of the total GSLs and indole GSLs. Conclusion Feeding by S. exigua larvae can induce the synthesis of GSLs in B. campestris ssp. chinensis, and the increase of GSLs can induce the enhancement of GSTs activity in larvae. Under the feeding stress of S. exigua larvae, the activation of key GSLs synthesis genes such as BcSOT16, BcBCAT4 and BcMAM1in B. campestris ssp. chinensis may promote the increase of 4OH, NEO, GBC and GBN which will help better resist S. exigua larvae feeding stress. [Ch, 2 fig. 3 tab. 43 ref.] -
在遗传转化获得抗性植株时，转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂，使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性，使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性，以抗生素为选择标记进行抗性筛选，不能起到很好的筛选效果，且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度，消除转化体生理抗性对筛选结果的影响，克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低，并可在后代中稳定表达，因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种，随着水稻遗传转化技术的发展，大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系，并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳，愈伤组织诱导率低，继代过程易褐化且分化再生频率低，导致籼稻的遗传转化效率低，有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言，其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织，对转化体进行Southern印记杂交，结果表明：目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测，目的基因可在转化体中稳定表达。1994年，HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系，采用了“双超元”载体，并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法，推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前，虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道，但是转化效率低，还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此，本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料，利用农杆菌介导法，转入草甘膦抗性基因(CP4)，探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选，并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化，建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚；农杆菌菌株EHA105；含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳，进行消毒[13]，接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上，接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后，可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织，统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后，剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织，分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后，增殖并产生大量的胚性愈伤组织，可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1)，重复3次，设空白对照，接种20块·皿−1。15 d后，观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态，统计胚性愈伤组织褐化率，选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8，用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液，适当干燥后，用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上，20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织，用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次，直至清洗液澄清透明。适度干燥后，用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d，部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗，并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系，可将其从生根培养基中取出，小心洗净其根系附着的培养基，置于培养箱中炼苗，增强幼苗对环境的适应性，1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增，目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，统计阳性率。取阳性植株叶片，利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示：‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖，未发生褐化现象；在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中，绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖，褐化率低，仅为5.00%，未起到选择作用；在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%，选择效果不明显；在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中，褐化率为41.67%，且与200 mg·L−1相比差异显著(P＜0.05)，选择效果好，适合作为筛选压；在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中，大部分胚性愈伤组织发生褐化，少部分正常生长，褐化率为65.00%，选择效果明显；在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中，胚性愈伤组织基本发生褐化，褐化率为91.67%，显著高于其他质量浓度下的褐化率(P＜0.05)，说明选择压过大。结果表明：草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时，胚性愈伤组织褐化率约50%，具有很好的筛选效果。
图 1 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days
图 2 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化情况Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织，提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测，阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带，与预期相符，表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株，提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%(图3)。
图 3 籼稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR检测Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明：检测的43株PCR阳性植株中，有25株表现为CP4基因表达，表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示：对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导，约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B)，约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D)，一段时间后，抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后，抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养，约15~25 d，长出绿点(图5F)。1个月左右，长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d，幼苗长出大量的茁壮根系，将其从培养基中移出，小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗，炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测，保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
图 5 CP4基因转化籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织的各个阶段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低，草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性，植物体内蛋白质合成受阻，生长受到抑制，不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合，故能够进行正常的生长分化。因此，通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记，草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因，使受体植物获得除草剂抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异，选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，进一步分化、成苗，共获得67株再生植株，进行CP4基因的PCR检测，其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%，达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强，易形成大量优质胚性愈伤组织，但受季节的影响，水稻幼胚利用不便，且在组织培养过程中易受微生物污染，转化效率不高，因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用，不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高，通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织，发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高，并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象，影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代，可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题，有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率，本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养，淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因的整合，极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后，D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度，既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长，又具一定的侵染能力，提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短，目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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图 1 甜菜夜蛾幼虫取食对白菜硫苷代谢关键基因表达模式的影响
Figure 1 Effects of S. exigua larvae feeding on expression patterns of key genes related to glucosinolates metabolism in B. campestris ssp. chinensis
图 2 取食白菜后甜菜夜蛾幼虫GSTs活性的变化
Figure 2 Changes of GSTs activity in S. exigua larve after feeding on B. campestris ssp. chinensis
表 1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)表达分析引物序列
Table 1. Primer sequences for RT-qPCR analysis
基因名称 上游引物(5 ＇→3 ＇) 下游引物(5 ＇→3 ＇) BcMAM1 CCAGAGTACATACCGCACAA AGAGGACACCGGAAAACCAA BcCYP83A1 AGTTCTCCTCTTCTTCCTCT CCATTGTTTGACTTCCTATC BcCYP83B1 ACACTTCCTCTTTCGTCTCT CATCGTTTGTTGCCCCTTCA BcMYB28 GAGAATTTGCATTCCCTTGC TGGTGTCCCATCTTTGTTGG BcSOT16 GGGTTATGGGTTTAGTGCTG CTCCAACCTTCCCTTTCCTA BcUBC10 GGGTCCTACAGACAGTCCTTAC ATGGAACACCTTCGTCCTAAA BcAPK2 CAACACCGTCTGGGATCTGC AACCGACATCGACACCTGGA BcSUR1 GGCGTTATCTACATGCTGTTCG CAGGTGCGGAAGCAAGGGTA BcAOP2 TGGATTTGCACCAAAGGAAA AGATAGATCACTGGAAGTTG BcBCAT4 AAGCAACTCGACTCAAACACT CGATAAAACCCGAATCCTAAT 
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表 2 白菜硫苷组分
Table 2. Components of glucosinolate in B. campestris ssp. chinensis
化合物名称 缩写 所属类别 分子量 保留时间/min 2-羟基-3-丁烯基硫苷progoitrin PRO 脂肪族 388 7.790 3-丁烯基硫苷gluconapin GNA 脂肪族 372 14.480 4-羟基吲哚-3-甲基硫苷4-OH-glucobrassicin 4OH 吲哚族 463 17.067 4-戊烯基硫苷glucobrassicanapin GBN 脂肪族 386 22.087 3-吲哚基甲基硫苷glucobrassicin GBC 吲哚族 447 26.753 2-苯乙基硫苷gluconasturtiin NAS 芳香族 422 31.497 4-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷4-methoxy-glucobrassicin 4ME 吲哚族 477 32.433 1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷1-methoxy-glucobrassicin NEO 吲哚族 477 40.793
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表 3 甜菜夜蛾幼虫取食对白菜硫苷质量摩尔浓度的影响
Table 3. Effects of feeding on the content of glucosinolate in B. campestris ssp. chinensis by S. exigua larvae
类型 化合物缩写 硫苷质量摩尔浓度/(µmol·g−1) 0 (ck) 1 24 48 72 h 脂肪族 GNA 0.154±0.010 b 0.174±0.005 b 0.220±0.003 c 0.132±0.003 a 0.132±0.002 a PRO 0.152±0.003 a 0.150±0.002 a 0.176±0.001 b 0.182±0.002 c 0.179±0.001 bc GBN 0.434±0.032 a 0.466±0.009 a 0.550±0.018 b 0.819±0.004 c 0.781±0.001 c 总脂肪族 0.724±0.009 a 0.792±0.001 b 0.959±0.008 c 1.132±0.002 e 1.116±0.004 d 吲哚族 4OH 0.157±0.012 a 0.177±0.003 b 0.222±0.004 c 0.257±0.006 d 0.234±0.004 c GBC 0.044±0.013 a 0.062±0.000 b 0.105±0.003 c 0.130±0.001 d 0.209±0.005 e 4ME 0.089±0.026 a 0.69±0.000 a 0.140±0.003 b 0.154±0.002 b 0.135±0.000 b NEO 0.054±0.011 a 0.067±0.001 b 0.092±0.001 c 0.162±0.003 d 0.263±0.001 e 总吲哚族 0.351±0.001 a 0.375±0.001 b 0.565±0.005 c 0.703±0.010 d 0.840±0.008 e 芳香族 NAS 0.096±0.004 ab 0.109±0.002 c 0.142±0.001 d 0.086±0.001 a 0.101±0.002 bc 总硫苷 1.154±0.003 a 1.277±0.002 b 1.664±0.014 c 1.921±0.011 d 2.032±0.014 e 说明：同行不同小写字母表示同一指标不同时间差异显著(P＜0.05)
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