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桑Morus是一种重要的木本植物，具有28条染色体[1]，不仅可以作为家蚕的重要食物，还具有一定的经济、药用及生态价值。但是桑葚在成熟的过程中易脱落，使得桑葚变软变黑，影响其产业价值，因此，如何采用有效的手段对桑葚脱落进行调控十分重要。
果实脱落是植物正常发育过程中的一种常见现象，但是，在一定程度上会限制果树的产量。果实脱落主要受环境因素、酶、生理代谢共同调控[2]，其中，环境因素主要包括生物胁迫(如病虫害[3])和非生物胁迫(温度胁迫[4]、水分胁迫[5]、光胁迫[6]等)；生理代谢则包括一些激素代谢(如脱落酸[7]、乙烯[8]等植物激素)和糖代谢[9]；由于纤维素和果胶是植物细胞壁的主要组成成分，因此纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶[10]等与果实脱落相关[11]。
目前，桑葚脱落的分子机制还未见报道。本研究以白桑Morus alba为供试材料，对其进行转录组测序分析，探究桑葚在脱落过程中的生化成分代谢的分子机制，旨在为进一步了解桑葚果实脱落的分子机制提供参考。
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2021年4月在西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室桑树资源种质基地，选取无病害、健康状况较好的白桑幼果果柄。以落果果柄 (YD) 为实验组，取6个果柄为1份，设3个生物学重复，标记为YD1、YD2、YD3。正常果果柄 (YN) 为对照组，同样取6个果柄为1份，设3个生物学重复，标记为YN1、YN2、YN3。取材后立即在液氮中速冻并储存于−80 ℃冰箱保存。
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将正常果和脱落果果柄组织清洗后用质量分数为4%的多聚甲醛过夜固定，用包埋剂包埋材料。待包埋剂彻底凝固后进行冷冻切片。切片厚度为5 μm，将切片后的材料吸附于阳离子载玻片上，室温干燥30 min后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤样品，去除包埋剂后置于显微镜下观察。
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采用TRIzol法提取落果果柄和正常果果柄的总RNA，用分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度，以保证是否可以进行下一步测序分析。
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样品由华大基因进行测序及分析，利用华大智造测序平台BGISEQ测序，所得的原始数据为raw reads。过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。将clean reads比对到参考基因组上，再进行后续分析。
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将测序所得原始数据提交到美国国家生物技术信息中心(NCBI)的SRA数据库中，检索号为: PRJNA811258。
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使用DEseq2方法检测样品之间的差异表达基因(DEG)[12]。根据基因本体论数据库(GO)和京都基因与基金组百科全书(KEGG)注释结果以及官方分类，将差异基因进行功能分类，同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析。详细说明见Wiki网站
https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution 。校正后的P≤0.05为显著富集。 -
将桑葚幼果的落果果柄与正常果果柄RNA用PrimesciptTM RT reagent kit with gDNA Eraser (Takara)反转录，在primer premier 5.0软件设计定量引物(表1)，内参基因为 Actin，利用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein) 试剂盒进行荧光定量PCR。反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。用2−ΔΔCt算法处理数据，利用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。
表 1 转录组数据RT-qPCR验证引物序列
Table 1. Primer sequences used in RT-qPCR validation of transcriptome data
基因ID 基因名 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_010096892.1 GH3.6 ACACTAACTACACCAGCCCAAA ACTTAATAGCACGAATGAACCC XM_010102492.2 bHLH78 TATTACCTTCGTCGTCCCCTCCTA ACCACTCTTTTCGTTTCCTTCACC XM_010113436.1 SAUR15 TGAAGAAGCCGAGAAGGAGTA GGTGGTAGGAGAAGGGATAAC XM_024169608.1 PHO1 GCCAATAACGACAGGAAA AACAACCCGTGAACAAAC -
桑果是带果柄脱落，为了研究桑树正常果柄和脱落果柄的差异，对其进行冷冻切片并观察显微结构。从图1可知：正常幼果果柄与枝干相连的区域内细胞规则，形态一致，而脱落幼果果柄与枝干相连处细胞小且致密。
图 1 落果与正常果果柄纵切面显微结构图
Figure 1. Longitudinal section microscopic structures of abscised and normal surviving young fruit peduncles
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基于BGISEQ对桑葚幼果的落果与正常果果柄离区进行转录组测序，6个样品获得262.92 Mb的原始序列。原始测序数据经一系列质量控制后，每个样本获得超过6.3 Gb的高质量纯净测序数据量，每项碱基质量大于20的碱基数量占总碱基数量的比例 (Q20) 均大于96%，每项碱基质量大于30 的碱基数量占总碱基数量的比例 (Q30) 均大于91%。将每个样本的高质量纯净序列与测序并组装的桑树基因组序列进行比对，比对率均高于59%(表2)，表明本研究转录组测序数据质量较高，可用于后续的分析。
表 2 测序数据统计
Table 2. Statistics of sequencing data
样本
名称原始序列
数/Mb纯净序列
数/Mb纯净碱基
数/GbQ20/% Q30/% YD1 43.82 42.48 6.37 96.50 91.31 YD2 43.82 42.74 6.41 96.53 91.34 YD3 43.82 42.58 6.39 96.53 91.39 YN1 43.82 42.61 6.39 96.46 91.19 YN2 43.82 42.58 6.39 96.55 91.38 YN3 43.82 42.65 6.40 96.55 91.39 -
用每2个样品之间的Pearson相关系数以反映样本间基因表达的相关性(图2)。结果发现：Pearson相关系数为0.69~1.00，说明各样本间重复性和相关性较好。
图 2 落果与正常果果柄的相关性热图
Figure 2. Correlation heatmap of abscised and normal surviving young fruit peduncles
在桑葚幼果果柄组织中，共鉴定到25 293个基因(图3A)。其中，共表达的基因有23 203个，占91.7%。正常果果柄特有基因为1 164个，占4.6%，落果果柄组特有基因为926个，占3.7%。由此可见，落果果柄基因较正常果果柄基因少。根据差异筛选标准，在2组中共筛选到10 481个差异表达基因(图3B)，其中，5 239个差异表达基因上调表达，5 242个差异表达基因下调表达。
图 3 落果与正常果果柄的表达基因和差异表达基因
Figure 3. Expressed genes and differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
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本研究对差异表达基因进行GO功能富集分析，共发现37个显著性GO条目。生物过程共富集到7 064个基因，显著富集到19个条目，涉及生物调节、细胞过程、代谢过程、对刺激的反应等，其中富集到生物过程中最多的差异表达基因为细胞过程和代谢过程基因；细胞组分共富集到6 857个基因，显著富集到6个条目，涉及细胞解剖实体、细胞内、其他有机部分、含蛋白质复合物、病毒粒子等，富集到细胞组分最多的差异表达基因为细胞解剖实体和细胞内基因；分子功能共富集到9 842个基因，显著富集到12个条目，涉及催化活性、转运蛋白活性、转录调节活性、分子功能调节剂等，富集到分子功能最多的差异表达基因为催化活性和结合基因(图4)。
图 4 落果与正常果果柄的差异表达基因GO分类柱状图
Figure 4. Histogram of GO classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
GO富集分析结果显示：大多数差异基因集中在催化活性、膜的组成成分、氧化还原酶活性、膜的内在成分，分别为4 623、2 774、777、1 781个基因(图5)。其中，具催化活性的基因最多，说明在桑葚的落果过程中可能有很多重要的酶参与，从而发生一系列的催化反应。
图 5 落果与正常果果柄的差异表达基因GO富集气泡图
Figure 5. GO enrichment bubble chart of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
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在本研究中，细胞过程富集的基因为380个，富集到1个条目，为运输和分解代谢；环境信息处理共富集到653个基因，富集到2个条目，为膜运输和信号转导；遗传信息处理共富集到1 558个基因，包含4个条目，为折叠分类和降解、复制和修复、转录、翻译；代谢通路富集到5 315个基因，包含11个条目，为氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢等；有机系统共富集到427个基因，含1个条目(图6)。分析发现：代谢通路富集的基因最多，说明桑葚在脱落过程中代谢反应尤为明显。
图 6 落果与正常果果柄的差异表达基因KEGG分类柱状图
Figure 6. Histogram of KEGG classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
KEGG通路富集分析结果显示：大多数差异表达基因集中在MAPK信号通路、黄酮类生物合成、柠檬酸循环、植物激素信号转导、氨基酸的生物合成通路，分别含293、102、55、318、251个基因(图7)。其中，植物激素信号转导途径的差异表达基因数量最多，说明在桑葚果实脱落过程中植物激素起到了十分重要的作用。
图 7 落果与正常果果柄的差异表达基因的KEGG富集气泡图
Figure 7. KEGG enrichment bubble diagram of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
在桑树的代谢通路中，植物激素信号转导途径的差异表达基因数量最多，为318个基因，其中，落果果柄中有51.9% (156个)的差异表达基因的表达量高于正常果果柄(图8A)；在黄酮类生物合成途径中，有102个差异基因富集，其中有73.5% (75个)的差异基因在落果果柄中表达量高(图8B)；在氨基酸生物合成通路中，共有251个差异表达基因富集，其中有59.8% (150个)的差异表达基因在落果果柄中表达量更高(图8C)；在柠檬酸循环中，有55个差异表达基因富集，其中有74.5% (41个)的差异表达基因在落果果柄中表达量更高(图8D)。不难发现，落果果柄有超过一半的差异表达基因表达量高于正常果果柄。说明植物激素、黄酮类等次生代谢物以及柠檬酸等物质在桑葚脱落过程中发挥了重要的作用。
图 8 落果与正常果果柄的代谢途径的差异表达基因热图
Figure 8. Heat map of differentially expressed genes in metabolic pathways of abscised and normal surviving carpopodium
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由于植物激素对于落花落果以及保花保果都具有十分重要的作用，于是在植物激素信号转导途径中筛选4个差异十分显著的基因，分别为GH3.6 (XM_010096892.1)、bHLH78 (XM_010102492.2)、SAUR15 (XM_010113436.1)、PHO1 (XM_024169608.1)。将这4个基因的每千个碱基转录每百万映射读取的碎片值(FPKM)绘制直方图，GH3.6在落果组中的表达水平是正常果组的20多倍，bHLH78在落果组中的表达水平约为正常果组20倍，PHO1(磷转运蛋白)在落果组中的表达水平是正常果组的30多倍，SAUR15在落果组中的表达水平是正常果组的100多倍(图9A)。由此推测，这4个基因均参与了桑葚的果实脱落。为了验证转录组数据的准确性，对这4个基因进行RT-qPCR验证，结果发现：4个差异表达基因的荧光定量相对表达量的变化趋势与转录组表达趋势一致，说明该转录组数据可靠(图9B)。
图 9 4个差异表达基因的RT-qPCR验证
Figure 9. RT-qPCR validation of four differentially expressed genes
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近年来，为了提高果树产量，越来越多果实脱落的相关研究被报道，如番茄Lycopersicon esculentum[13]、荔枝Litchi chinensis[14]、扁桃Amygdalus communis[15]等。桑树作为一种具有重要经济价值的植物，其生理落果引起学者们的关注。2021年，有研究者对不同种类的长果桑Morus macroura的生理落果进行研究，发现高浓度的脱落酸(ABA)和乙烯(ETH)能够促进落果，而高浓度的赤霉素(GA3)和生长素(IAA)抑制落果[16]。但是，关于桑树果实脱落的分子机制还尚不清楚。
植物激素是植物生长发育过程中十分重要的物质，参与植物的落花落果，与落花落果常见的相关植物激素有IAA、GA3、细胞分裂素、ETH、ABA[17]。
IAA主要是促进植物的生长发育，抑制果实的脱落，如果生长素在运输途径中受到阻碍则会导致植物果实的脱落[18−19]。GH3.6是吲哚乙酸酰胺合成酶的基因，能够催化IAA氨基化，使生长素失活[20]，这与本研究的结论一致。Small auxin-up RNA (SAUR) 基因是一类生长素早期响应基因，SAUR15能够调控植物的生长发育并参与环境胁迫响应[21]。在本研究中，SAUR15的表达水平在落果组高于正常果组100多倍，说明SAUR15基因可能参与桑葚果实脱落；ABA主要是促进果实脱落[7]，这是由于ABA能够增加纤维素酶的活性进而促进果实脱落[22]。有学者通过研究无核荔枝ABA合成关键酶LcNCED与生理落果的关系，验证了ABA对于落果的作用[14]；GA主要是通过作用于IAA影响果实脱落[23]；ETH主要促进果实的成熟、衰老、脱落，这在多种植物中被报道，如番茄[13]等；细胞分裂素能够促进坐果，延迟果实的脱落[24]。
此外，在对落果的研究中还发现了大量的基因和转录因子的调控，如JOINTLESS[25]、LATERAL SUPPRESSOR(LS)[26]、MACROCALYX[27]主要调控离区的形成，MYB[28]、WRKY[29]、bHLH[30]、bZIP[31]等转录因子能参与植物的器官脱落。bHLH78属于bHLH转录因子，参与植物生长和代谢[32]，调节花青素的生物合成[33]。本研究中，bHLH78的表达水平在落果组较高，说明其可能参与桑葚的脱落。此外，还有一些重要的酶及蛋白调控植物的器官脱落，如纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、扩展蛋白等[34]。在本研究中，磷转运蛋白(PHO1)在落果果柄组的表达水平是正常果柄组的30多倍。此前研究表明：ABA调控依赖于PHO1的表达[35]，说明PHO1基因可能参与桑葚的脱落。
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本研究GO富集分析结果显示：有4 623个基因具有催化活性，说明在果实脱落过程中，有多种重要的酶发挥催化效应；KEGG通路富集分析结果显示：大多数差异表达基因集中在黄酮类生物合成、柠檬酸循环、植物激素信号转导、氨基酸的生物合成等通路中，说明在果实脱落过程中，植物激素、糖类、次生代谢物质等发挥了重要的作用，从而调控果实的脱落。本研究筛选了4个显著的差异表达基因，均在桑葚脱落过程中参与反应，可为今后进一步研究桑树的果实脱落提供参考。
Transcriptome analysis of abscised and normal surviving young fruit of Morus alba
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摘要:
目的 果实的脱落是一种常见的生理现象，会在一定程度上限制果实的产量。探究桑葚幼果在脱落过程中的代谢及生化反应，可为桑葚的脱落机制研究提供参考。 方法 通过高通量测序对白桑Morus alba幼果在落果和正常果的果柄离区进行转录组测序，筛选差异表达基因，并对其进行功能注释和代谢通路分析，采用实时荧光定量PCR技术对转录组数据进行验证。 结果 经华大基因转录组测序分析共计获得262.92 Mb的原始序列；桑葚幼果果柄在2种状态下共筛选到10 481个差异表达基因，其中，有5 239个差异表达基因上调表达，5 242个差异表达基因下调表达。经基因本体数据库(GO)功能富集分析，共发现37个显著性条目，大多数差异基因具有催化活性、膜的组成成分、氧化还原酶活性、膜的内在成分等功能；京都基因与基金组百科全书(KEGG)富集分析发现：大多数差异表达基因集中在柠檬酸循环、植物激素信号转导途径、黄酮类生物合成等代谢通路上。 结论 桑葚在脱落过程中受植物激素的调控，氨基酸、黄酮类次生代谢物和碳水化合物等物质也能调控果实脱落。图9表2参35 Abstract:Objective This study, with mulberry (Morus) fruits as the subjects, is aimed to conduct an investigation into its fruit abscission, a common physiological process which limits the yield of fruit so as to clarify the underlying abscission mechanism of the metabolism and biochemical reactions. Method High-throughput sequencing was employed to conduct transcriptome analysis of the young fruit of Morus alba in the abscission zone between the abscised and normal surviving mulberry fruits to screen the differentially expressed genes before they were subjected to functional annotation and metabolic pathway analysis, and the verification of transcriptome data using real-time quantitative PCR technology. Result A total of 262.92 Mb of raw reads and 10 481 differentially expressed genes were obtained by Beijing Genomics institution (BGI, Shenzhen, China), of which 5 239 were up-regulated, whereas 5 242 were down-regulated; As was shown by the GO functional enrichment analysis, a total of 37 significant items were found, and most of the differentially expressed genes were featured with catalytic activity, membrane composition, oxidoreductase activity and membrane intrinsic components. It was shown by the KEGG enrichment analysis that most differentially expressed genes were concentrated in metabolic pathways such as citric acid cycle, plant hormone signal transduction pathway, and flavonoid biosynthesis. Conclusion Mulberry is regulated by plant hormones and substances such as amino acids, flavonoid secondary metabolites and carbohydrates during the abscission process. [Ch, 9 fig. 2 tab. 35 ref.] -
Key words:
- Morus alba /
- fruit abscission /
- transcriptome
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GRF(general regulatory factor)蛋白质最先由MOORE等[1]在牛脑中发现，并根据淀粉凝胶电泳上的迁移特性命名。GRF蛋白质是一类高度保守的同源或异源的二聚体蛋白质，具有多种功能，广泛存在于真核生物中，如酵母Pichia guilliermondii、拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea等。已有研究[2]表明：GRF蛋白质家族通过与磷酸化的靶蛋白质相互作用参与植物信号传导、细胞定位、转录调控和应激反应等多种重要生命活动过程，在植物代谢调控和生物合成反应中发挥着重要作用，如拟南芥GRF蛋白质可以与感光系统中的蛋白质相互作用调节根系生长发育[3]；葡萄Vitis vinifera GRF蛋白质参与冷热应激反应[4]；木薯Manihot esculenta GRF蛋白质主要分布在细胞质中，作用于淀粉合成酶Ⅲ靶蛋白质，对淀粉的合成起到负调控作用[2]；菊花Dendranthema morifolium GRF蛋白质参与开花和周期调控，盐、冷等胁迫响应过程[5]；动物细胞中GRF蛋白质还可通过调节细胞周期，影响细胞凋亡，参与多种信号通路等方式来调控肿瘤进程[6]。GRF活化后可以使G2/M期阻滞从而起到负调控细胞周期，发挥抑制癌基因的作用[7]。在动物中GRF蛋白质的过表达可能转化为一种致癌因子，促进肿瘤的发生[8]，还可能与肿瘤细胞耐药性有关[9]。毛竹Phyllostachys edulis用途广泛，笋和叶具有食用、药用价值；竹材多用于建筑制造、工艺品制作。毛竹林是一种重要的经济林，具有重要生态价值，其固碳作用机制在不同的生长阶段有所差异[10]。毛竹基因组草图已公布，且大量转录组数据也可以从公共数据库中获取[11]。目前根据毛竹全基因组数据进行基因家族分析已取得了一定的成果，如ZF-HD基因家族[12]、B3基因家族[13]、APX基因家族[14]等，也分析了毛竹快速生长期的基因表达[15-16]。但对于毛竹GRF基因家族的全基因组数据分析尚未有相关报道。本研究通过毛竹公开的相关测序结果，利用生物信息学的方法，从基因组及转录组数据入手，对毛竹GRF基因进行全基因组的鉴定与表达分析，拟为进一步明确GRF基因家族在毛竹重要生长发育过程中的功能解析提供依据。
1. 材料与方法
1.1 基因家族来源、鉴定及理化性质分析
毛竹基因组序列、编码序列(CDS)、蛋白质序列和基因组GFF注释文件均从以下站点ftp://parrot.genomics.cn/gigadb/pub/10.5524/100001_101000/100498/[12]下载。从Pfam数据库[17]中下载隐马可夫模型(HMM) PF00244.17的结构域数据，并以此结构域数据为种子模型，用HMMER[18]检索本地毛竹蛋白质数据库。在Excel 2018中，将E-value设置为≤1E−20，对检索结果排序整理，去除重复，获得候选基因。进一步从毛竹全基因组数据库中提取得到GRF家族成员的基因、CDS、蛋白质序列以及基因结构和位置信息；利用在线工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)[19]以及SignalP 4.1[20]在线分析GRF家族各成员理化性质等。
1.2 家族进化分析
依据毛竹、拟南芥、水稻GRF家族成员蛋白质序列，分别通过ClustalW多重比对，用MEGA 7.0软件邻位连接(neighbor-Joining, NJ)法构建种内和种间系统进化树，自检值取1 000次抽样[21]。
1.3 基因结构、基序和保守结构域预测
根据毛竹全基因组的GFF注释文件基因位置信息，分析毛竹GRF家族的基因结构并绘制基因结构图；利用在线网站NCBI Conserve Domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和MEME(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对GRF家族成员的保守结构域(domain)和基序(motif)进行预测[22]，并通过TBtools[23]将结果可视化。
1.4 启动子分析
提取毛竹GRF基因上游1 500 bp序列作为启动子序列信息，通过在线预测软件PlantCare[24]预测毛竹GRF基因的顺式作用元件，并整理预测结果，富集顺式作用元件，利用TBtools上的Simple Biosequence viewer功能进行可视化分析。
1.5 染色体定位及共线性分析
利用MCScanX[25]获取GRF家族种内、种间共线性关系，并用TBtools软件Amazing Super Circos[26]和Multipe Synteny Plot分别对种内和种间的结果可视化。
1.6 基因表达分析
选取NCBI SRA数据库中毛竹不同组织器官：根(登录号为ERR105075、ERR105076)，花序(登录号为ERR105069、ERR105070、ERR105071)，叶(登录号为ERR105067、ERR105068、ERR105075)，鞭(登录号为ERR105073、ERR105074)和笋不同生长高度：0.2 m(登录号为SRR6131114、SRR131113、SRR6131115)，0.5 m(登录号为SRR131117、SRR6131118、SRR5710699)和1.0 m(登录号为SRR5710701、SRR5710702、SRR5710697)的转录组数据，分别计算毛竹GRF基因的TPM(transcripts per million reads)值表示基因的表达丰度。为方便统计，对每个表达数值取以2为底的对数(log2)，使用TBtools Amazing Heatmap绘制基因表达热图，用对数转换预处理数据，再用正态标准化的方法处理数据。
1.7 蛋白质三级结构同源模建
利用SWISSMODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在线软件[27]预测GRF蛋白质的3D结构。模建结果使用SAVES v5.0(https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)[19]进行评估。
2. 结果与分析
2.1 基因家族成员鉴定及理化特性分析
根据植物GRF隐马可夫模型(PF00244.17)搜索毛竹相关基因组数据，获得相关GRF家族成员，然后通过E-value(≤1E−20)筛选、保守结构域、基序特征分析，去除相同转录本重复，最终筛选得到13个GRF家族成员(表1)。将获得13个GRF家族成员按照其在scaffold的分布先后顺序命名为PeGRF01~PeGRF13。进一步对PeGRF作蛋白质特性分析，13个GRF蛋白质中长度最短的为PeGRF10(256个氨基酸)，最长的为PeGRF09(293个氨基酸)，平均长度266.8个氨基酸；各GRF蛋白质等电点最小的为4.70(PeGRF02)，最大的为5.29(PeGRF01)，平均等电点为4.82；各GRF蛋白质分子量最小的为PeGRF04(28.65 kD)，最大的为PeGRF09(32.41 kD)，平均分子量为29.79 kD。
表 1 毛竹GRF基因及其蛋白质理化特性Table 1 Characteristics of PeGRF family genes and their deduced proteins基因登录号 基因名称 等电点(pI) 平均分子量/kD 内含子数量/个 氨基酸数量/个 PH02Gene26029.t1 PeGRF01 5.29 32.20 5 286 PH02Gene21972.t1 PeGRF02 4.70 29.68 4 262 PH02Gene06378.t1 PeGRF03 4.79 29.14 4 263 PH02Gene19868.t1 PeGRF04 4.82 28.65 3 261 PH02Gene15394.t1 PeGRF05 4.76 31.08 4 274 PH02Gene31988.t1 PeGRF06 4.73 29.94 6 270 PH02Gene44376.t1 PeGRF07 4.79 29.15 4 263 PH02Gene09923.t1 PeGRF08 4.86 29.28 4 261 PH02Gene25395.t2 PeGRF09 4.72 32.41 5 293 PH02Gene13806.t1 PeGRF10 4.76 29.02 4 256 PH02Gene13908.t1 PeGRF11 4.82 29.15 4 260 PH02Gene26176.t1 PeGRF12 4.84 28.76 3 263 PH02Gene15240.t1 PeGRF13 4.75 28.77 4 256 2.2 GRF基因家族分类与进化树构建
利用MEGA 7.0对13个毛竹GRF、14个拟南芥GRF和8个水稻GRF的氨基酸序列比对后，采用NJ法进行系统聚类分析(图1)，绝大部分毛竹基因家族成员和水稻处于同一分支，表明毛竹与水稻的进化关系较近。
图 1 毛竹(Pe)、拟南芥(At)和水稻(Os)GRF家族系统进化树分析Figure 1 Phylogentic analysis of GRF gene family from Phyllostachys edulis (Pe), Arabidopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os)2.3 GRF家族基因结构、基序及保守结构域
对毛竹GRF基因结构分析发现：内含子数量存在差异，非ε组成员都包含4个外显子和3个内含子，它们在位置上高度保守。ε组成员都具有不同于非ε组的内含子-外显子结构，具有2个额外的N-末端内含子[21]。利用NCBI-CDD对毛竹GRF基因进行保守结构域分析，PeGRF蛋白质均包含14/3/3结构域，毛竹GRF基因家族14/3/3结构域存在一定的保守性，但该结构域的分布位置有一定分化。利用MEME在线工具对该基因家族的保守基序预测，基数设置为10，结果显示(图2)：Motif1~6在每个家族成员中均出现，属于高度保守结构，其余基序在家族成员中出现的频率及所在位置均存在一定的差异。
2.4 启动子特征
如图3所示：筛选出的部分典型的顺式调控元件，除核心启动子TATA-box(5个)和CAAT-box(16个)外，还有与激素相关的顺式调控元件，包括与赤霉素相关的GARE-motif(5个)、P-box(3个)，与生长素有关的AuxRR-core(3个)、TGA-element(6个)，与脱落酸有关的ABRE(42个)，与水杨酸有关的TCA-element(5个)；与外部条件有关的顺式调控元件，包括参与低温响应的LTR(2个)和光响应的G-box(48个)。推测毛竹GRF蛋白质家族可能参与激素和非生物胁迫响应，家族基因表达模式可能有所不同。
图 3 PeGRF基因家族启动子的上游顺式作用元件Figure 3 Upstream cis-acting elements of promotor from PeGRF gene family2.5 染色体分布及共线性分析
利用毛竹基因组GFF注释文件提取PeGRF在scaffold上的分布特征，结果显示：毛竹GRF基因在scaffold上分布不均匀，不同的scaffold基因分布密度不同，scaffold7、14、16、18和21仅包含1个PeGRF，scaffold3、13、15和22上分别包含2个。
利用TBtools工具，将毛竹GRF基因种内和种间的共线性关系进行了可视化分析。从图4A中可以看出：除PeGRF02、PeGRF03和PeGRF07不存在种内共线性关系外，其余家族基因成员间均有显著的共线性关系，说明GRF基因家族存在基因复制现象，推测在进化过程中GFR基因可能通过复制进行家族成员数量的扩张。但PeGRF不存在串联重复基因。物种间的共线性关系是反映不同物种来源于同一个祖先的现象。从图4B可以看出：毛竹与水稻的共线性关系要明显多于拟南芥，这可能与水稻和毛竹同属于禾本科Gramineae，进化关系较近有关。
图 4 毛竹PeGRF家族染色体分布(A)及共线性分析(B)Figure 4 Chromosomal distribution of PeGRF genes in Ph. edulis (A) and their collinear relationships (B)Sca表示scaffold；CHR和Chr表示染色体(chromosome)2.6 GRF家族基因表达模式
本研究基于毛竹RNA-Seq转录组数据，对毛竹不同组织(叶、花序、鞭及根)以及不同生长高度(0.2、0.5、1.0 m)的毛竹笋中的GRF表达量绘制热图。由图5可以看出：除PeGRF10，PeGRF09在不同组织和生长高度保持较低的表达量外，其他成员均有较高的表达量。在毛竹不同组织中，根和花序的表达量相对于叶和鞭要稍高；非ε组的GRF基因均有较高的表达。在竹笋的不同生长阶段，非ε组的GRF基因保持较高的表达水平；ε组不同的基因表达量有增有减，如PeGRF05在竹笋生长各个阶段均有较高的表达量，且随生长进程表达量不断增高；PeGRF06表达量随生长进程呈下降趋势。推测不同家族成员在参与组织器官发育的过程中发挥不同的作用，但其中的内在分子机制还值得进一步研究。
图 5 毛竹GRF基因家族表达水平热图分析Figure 5 Heatmaps of expression level of PeGRF family genes in Ph. edulis2.7 GRF家族蛋白质空间三级结构
由图6所示：毛竹GRF蛋白质由2个单体连接而成，每个单体由反向平行的9个α螺旋组成，每个单体都存在与配体(FSC3、FEC4)相互作用的结合位点，2个FSC配体均与壳梭孢素有关，单体间构成同源或异源二聚体，总体呈“W”型[28-29]。
图 6 毛竹GRF家族蛋白质SWISSMODEL同源模建的三维空间结构Figure 6 Predicted 3D protein structure of the GRF family from Ph. edulis by SWISSMODEL红色为α螺旋，黄色为配体(FSC3、FEC4)3. 讨论
物种基因组全序列的测定推动了生物信息学的迅速发展，在海量数据的基础上，利用生物信息学手段，对物种基因家族进行高效的统计分类和分析，预测基因家族的结构、功能及作用机制，将极大地推动相关功能基因的挖掘和农艺性状遗传的改良进程[30]。随着2018年第2版毛竹基因组数据的公布以及大量毛竹转录组数据的共享，毛竹GRF基因家族的生物信息学分析成为可能[11]。本研究通过全基因组数据分析发现：毛竹GRF家族成员共13个，数量多于水稻，可能的原因是毛竹染色体经过加倍，基因组数据远大于水稻；另外，共线性分析进一步证实：正是通过基因复制扩增，毛竹GRF在数量上有优势。毛竹GRF基因家族各成员间的理化性质存在一定的差异，但均含有14/3/3蛋白质结构域，其中有6种基序在每个成员中均出现。根据基因结构将PeGRF分为ε组和非ε组，其中ε组可能保留了祖先的蛋白质功能，这与PIOTROWSKI等[31]和WANG等[32]的研究结果相似。
大量研究表明GRF蛋白质参与激素信号的转导。如在拟南芥的研究中发现：GRF参与油菜素类激素(BR)调控细胞核发育的途径[33]；在烟草Nicotiana tabacum中，GRF参与赤霉素(GA)生物合成调控[34]；在水稻中，GRF表达同脱落酸(ABA)密切相关[35]。本研究发现：毛竹GRF顺式作用元件存在许多激素相关元件。由此可以推测毛竹GRF蛋白质可能介导激素信号的转导过程。但毛竹GRF同其他激素的相互关系还需进一步验证。
GRF蛋白质参与了植物的生长发育，特别是在花器官的发育中具有重要作用。PERTL等[36]证实随着百合Lilium brownii var. viridulum花粉管的生长，GRF蛋白质的表达量也明显增加。李兵娟[37]也证实雷竹Phyllostachys violascens GRF基因参与开花调控机制。本研究通过转录组数据分析发现：GRF蛋白质在花序组织中高表达，且表达量明显高于竹叶和竹鞭，这表明毛竹GRF基因可能参与花序的发育和调控。除此之外，在研究毛竹GRF顺式作用元件时还发现其启动子区域存在许多光响应元件，结合光周期对植物开花的作用机制以及在模式植物水稻上的研究[38]，GRF基因可能是通过光响应元件接受外界环境信号从而触发其高表达，最终影响毛竹花的发育。由于受毛竹花发育相关材料的限制，该假设将在后续实验验证。
毛竹GRF蛋白质是以一个螺旋结构为主的同源二聚体，二聚体界面内包着多个疏水残基和多个极性残基，外周则由盐桥连接，三级结构呈“W”型，每个单体分别含有2个凹槽，可能用于结合配体靶蛋白质。毛竹GRF蛋白质序列在进化谱系中高度保守，并且与配体结合的氨基酸残基极端保守，这同SEHNKE等[28]发现的结果相似。另外，虽然毛竹GRF蛋白质的N端和C端同源性较低，但可能通过碱性簇维持空间构象的稳定[28]。PAUL等[39]在研究拟南芥GRF蛋白质时发现，GRF蛋白质还可以通过结合磷酸化的蛋白质，参与重力反应等生理过程。GRF蛋白质在进化上高度保守，毛竹PeGRF可能也具有相似的分子作用机制。但毛竹GRF蛋白质生物学功能与上述空间结构之间的关系还需进一步的探索。
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图 1 落果与正常果果柄纵切面显微结构图
Figure 1 Longitudinal section microscopic structures of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 2 落果与正常果果柄的相关性热图
Figure 2 Correlation heatmap of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 3 落果与正常果果柄的表达基因和差异表达基因
Figure 3 Expressed genes and differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 4 落果与正常果果柄的差异表达基因GO分类柱状图
Figure 4 Histogram of GO classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 5 落果与正常果果柄的差异表达基因GO富集气泡图
Figure 5 GO enrichment bubble chart of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 6 落果与正常果果柄的差异表达基因KEGG分类柱状图
Figure 6 Histogram of KEGG classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 7 落果与正常果果柄的差异表达基因的KEGG富集气泡图
Figure 7 KEGG enrichment bubble diagram of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles
图 8 落果与正常果果柄的代谢途径的差异表达基因热图
Figure 8 Heat map of differentially expressed genes in metabolic pathways of abscised and normal surviving carpopodium
图 9 4个差异表达基因的RT-qPCR验证
Figure 9 RT-qPCR validation of four differentially expressed genes
表 1 转录组数据RT-qPCR验证引物序列
Table 1. Primer sequences used in RT-qPCR validation of transcriptome data
基因ID 基因名 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_010096892.1 GH3.6 ACACTAACTACACCAGCCCAAA ACTTAATAGCACGAATGAACCC XM_010102492.2 bHLH78 TATTACCTTCGTCGTCCCCTCCTA ACCACTCTTTTCGTTTCCTTCACC XM_010113436.1 SAUR15 TGAAGAAGCCGAGAAGGAGTA GGTGGTAGGAGAAGGGATAAC XM_024169608.1 PHO1 GCCAATAACGACAGGAAA AACAACCCGTGAACAAAC 
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表 2 测序数据统计
Table 2. Statistics of sequencing data
样本
名称原始序列
数/Mb纯净序列
数/Mb纯净碱基
数/GbQ20/% Q30/% YD1 43.82 42.48 6.37 96.50 91.31 YD2 43.82 42.74 6.41 96.53 91.34 YD3 43.82 42.58 6.39 96.53 91.39 YN1 43.82 42.61 6.39 96.46 91.19 YN2 43.82 42.58 6.39 96.55 91.38 YN3 43.82 42.65 6.40 96.55 91.39
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