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MYB蛋白质家族成员数量庞大，功能多样，存在于绝大多数真核生物中。大多数MYB蛋白作为转录因子发挥作用，MYB结合域有结合DNA的能力[1−2]，在植物生长发育、次生代谢及抗逆胁迫等方面具有重要作用[3]。R2R3-MYB作为家族中成员最多的一类，对植物生长发育意义重大[4−7]。
MYB基因家族根据MYB结构域的数量和类型分为4类：1R-MYB (或MYB相关)、2R-MYB (R2R3-MYB)、3R-MYB (R1R2R3-MYB)和4R-MYB[8]。2R-MYB类是植物特有的，并且是最大的亚家族，已在许多植物中进行了全基因组注释。R2R3-MYB家族成员数量各不相同，拟南芥Arabidopsis thaliana[9]有126个，水稻Oryza sativa[10]有102个，葡萄Vitis vinifera[11]有108个，甜橙Citrus sinensis[12]有100个，苹果Malus domestica[13]有222个，毛果杨Populus trichocarpa[14]有192个，玉米Zea mays[15]有200多个。LI等[16]在黄瓜Cucumis sativus中仅鉴定出55个R2R3-MYB基因，而黄瓜基因组V2版本中鉴定出69个R2R3-MYB基因[17]。通过最新版黄瓜基因组数据库可知：黄瓜基因组V3版本基因组数量为24 317个，较V2版本(23 248个)增多。鉴于此，本研究对黄瓜基因组数据库V3版本中的R2R3-MYB亚家族进行鉴定，分析黄瓜CsMYB基因家族成员，为研究黄瓜CsMYB家族功能提供参考。
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全基因组序列来源于黄瓜基因组数据库(
http://www.cucurbitgenomics.org/organism/20 )。序列中的MYB结合域(PF00249)使用PFam数据库(http://pfam.xfam.org/ )的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件进行识别和确认，该配置文件用作对先前注释的黄瓜MYB序列的查询，通过HMMER SEARCH进一步识别并使用默认参数手动筛选(目标序列的期望值E≤1.2×10−8)[17]。应用HMMER SEARCH建立黄瓜MYB (CsMYB)基因家族特异性模型[18]，使用黄瓜MYB特异性HMM选择E低于0.001的所有黄瓜MYB蛋白。CsMYB家族的候选基因根据黄瓜特异性MYB HMM确定。以上最初获得的所有候选CsMYB基因均通过保守域数据库(conserved domain database，CDD)[19]和简单模块化架构研究工具(simplemodular architecture research tool，SMART)使用默认参数E≤0.010[20]。根据MYB序列内的特征性保守结构域，分离黄瓜R2R3-MYB基因。 -
通过ClustalW对模式植物拟南芥、木本植物杨梅Morella rubra[21]和草本植物黄瓜[1]的R2R3-MYB序列进行比对，采用MEGA-11软件的邻接法(neighbor-joining，NJ)，设置自展法系数(bootstrap)为1 000次，其余参数按系统默认构建进化树[22]。
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通过筛选结果得到的黄瓜R2R3-MYB基因的序列信息，利用TBtools将其定位于染色体上。采用ExPASy-ProtParam (
https://www.expasy.org/resources/protparam )在线预测黄瓜R2R3-MYB蛋白的氨基酸数量、分子量、理论等电点、不稳定指数及脂肪系数；使用Plant-mPLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )预测亚细胞定位。 -
利用TBtools中的Gene Location Visualize功能绘制黄瓜R2R3-MYB家族成员的染色体定位图，并通过MCscanX将黄瓜R2R3-MYB亚家族成员基因与拟南芥同源基因进行共线性分析。
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利用TBtools对黄瓜R2R3-MYB亚家族成员的基因结构进行可视化分析，并对其蛋白的保守基序进行分析，限值为15，绘制结果图。
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利用TBtools提取黄瓜R2R3-MYB亚家族成员上游1 500 bp的序列，通过PlantCARE 数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )获得启动子顺式作用元件，利用Excel筛选结果，再利用TBtools对其最终结果进行可视化。 -
通过网站STRING (
https://www.string-db.org/ )对黄瓜R2R3-MYB蛋白成员之间进行互作预测分析，研究黄瓜R2R3-MYB蛋白成员之间的作用关系。 -
将黄瓜基因组数据与拟南芥进行比对，根据HMM模型进行搜索，取其交集，筛选鉴定其具有特殊结构域的序列，最终获得黄瓜99个R2R3-MYB基因家族成员。参照DUBOS等[23]的分类方法，将鉴定出的成员进一步分为30个亚组。为了探索系统发育关系，通过ClustalW进行序列比对，使用黄瓜99个CsMYB蛋白、拟南芥125个AtMYB蛋白和杨梅122个MrMYB蛋白构建了系统发育树(图1)。按照染色体定位结果，分别命名为Cs2RMYB1~Cs2RMYB99 (表1)。根据蛋白质序列的相似性和聚类结果的高自举性，将CsMYB进一步分为30个进化枝(指定为C1~C30)，黄瓜R2R3-MYB基因家族成员被分成30个亚组。其中，C16、C20和C23亚组的家族成员数量最多，有21个成员；C18亚组成员数为16个；C14、C24和C27亚组家族成员数均为15个；C10和C28亚组家族成员数量等同，为4个；C9亚组成员数最少，仅3个。黄瓜R2R3-MYB亚家族的进化树聚类方式与拟南芥有一定的相似性。
图 1 黄瓜与拟南芥、杨梅R2R3-MYB亚家族成员的系统进化树构建
Figure 1. Phylogenetic tree construction of C. sativus, A. thaliana and M. rubra R2R3-MYB subfamily members
表 1 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员信息
Table 1. Cucumber R2R3-MYB subfamily member information
基因命名 氨基酸
数量/个分子量/kDa 等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置基因命名 氨基酸
数量/个分子量/
kDa等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置Cs2RMYB1 360 40.91 6.44 52.41 57.17 Chr 1 Cs2RMYB51 268 30.01 8.59 54.65 64.40 Chr 3 Cs2RMYB2 471 54.88 5.91 42.84 66.43 Chr 1 Cs2RMYB52 217 25.13 7.21 55.75 65.21 Chr 3 Cs2RMYB3 367 41.94 5.83 59.22 75.50 Chr 1 Cs2RMYB53 195 22.67 8.37 72.59 73.54 Chr 3 Cs2RMYB4 331 37.60 9.02 65.15 61.90 Chr 1 Cs2RMYB54 355 39.21 6.25 54.46 82.96 Chr 3 Cs2RMYB5 277 31.19 5.90 78.88 66.21 Chr 1 Cs2RMYB55 305 34.19 6.19 45.79 74.52 Chr 3 Cs2RMYB6 232 26.59 8.83 57.26 66.51 Chr 1 Cs2RMYB56 253 28.52 9.10 49.09 65.53 Chr 3 Cs2RMYB7 326 36.76 6.42 53.91 67.94 Chr 1 Cs2RMYB57 313 35.05 4.97 68.24 75.97 Chr 4 Cs2RMYB8 288 32.50 6.31 71.30 64.03 Chr 1 Cs2RMYB58 314 36.06 6.10 62.98 58.06 Chr 4 Cs2RMYB9 377 42.09 6.46 50.23 66.71 Chr 1 Cs2RMYB59 322 35.68 6.14 54.46 67.55 Chr 4 Cs2RMYB10 337 37.92 5.74 45.24 71.19 Chr 1 Cs2RMYB60 377 40.50 5.41 39.90 73.24 Chr 4 Cs2RMYB11 299 33.99 9.17 58.17 61.64 Chr 1 Cs2RMYB61 353 39.81 6.22 60.28 59.92 Chr 4 Cs2RMYB12 372 42.33 6.12 54.32 67.63 Chr 1 Cs2RMYB62 229 25.19 9.29 58.90 61.70 Chr 4 Cs2RMYB13 277 32.11 5.83 63.46 79.96 Chr 1 Cs2RMYB63 263 29.14 8.34 61.14 67.15 Chr 4 Cs2RMYB14 337 38.24 8.66 52.38 59.08 Chr 1 Cs2RMYB64 280 31.51 8.92 59.53 72.11 Chr 4 Cs2RMYB15 370 41.15 6.13 51.97 61.95 Chr 1 Cs2RMYB65 260 28.84 5.00 38.86 76.54 Chr 5 Cs2RMYB16 364 41.75 9.54 55.58 69.81 Chr 1 Cs2RMYB66 323 36.41 6.00 53.24 72.45 Chr 5 Cs2RMYB17 327 37.06 7.68 62.31 69.48 Chr 2 Cs2RMYB67 258 29.46 5.84 45.28 67.67 Chr 5 Cs2RMYB18 295 32.99 9.07 45.41 70.10 Chr 2 Cs2RMYB68 236 26.98 6.71 53.48 74.83 Chr 5 Cs2RMYB19 222 25.74 6.00 53.86 72.43 Chr 2 Cs2RMYB69 284 31.23 6.41 56.18 72.46 Chr 5 Cs2RMYB20 264 29.98 8.97 58.24 63.14 Chr 2 Cs2RMYB70 300 33.77 5.29 55.23 71.50 Chr 5 Cs2RMYB21 265 31.42 9.64 54.52 67.02 Chr 2 Cs2RMYB71 337 38.25 7.69 55.10 66.59 Chr 5 Cs2RMYB22 286 32.59 5.60 58.72 59.69 Chr 2 Cs2RMYB72 210 24.43 5.19 51.25 60.38 Chr 5 Cs2RMYB23 228 26.87 10.27 58.08 65.44 Chr 2 Cs2RMYB73 464 52.29 6.82 66.09 66.85 Chr 5 Cs2RMYB24 256 29.15 8.24 48.25 79.22 Chr 2 Cs2RMYB74 369 41.40 6.61 50.68 56.34 Chr 5 Cs2RMYB25 210 23.54 10.31 65.32 59.48 Chr 2 Cs2RMYB75 307 34.25 7.51 48.64 64.59 Chr 5 Cs2RMYB26 230 26.32 8.83 57.64 63.65 Chr 2 Cs2RMYB76 398 44.52 6.49 53.56 62.29 Chr 5 Cs2RMYB27 204 23.04 8.44 43.78 67.94 Chr 2 Cs2RMYB77 202 23.93 8.25 43.61 58.37 Chr 5 Cs2RMYB28 338 38.46 8.56 58.00 68.99 Chr 2 Cs2RMYB78 294 33.13 8.72 52.07 70.41 Chr 5 Cs2RMYB29 290 31.80 9.23 59.33 65.93 Chr 2 Cs2RMYB79 286 32.77 6.40 64.03 65.17 Chr 6 Cs2RMYB30 297 33.70 9.97 55.65 69.97 Chr 2 Cs2RMYB80 552 61.13 5.50 52.51 61.54 Chr 6 Cs2RMYB31 301 32.30 8.19 55.90 64.15 Chr 2 Cs2RMYB81 301 34.40 5.56 70.97 65.08 Chr 6 Cs2RMYB32 308 34.86 5.93 48.47 84.90 Chr 2 Cs2RMYB82 269 31.33 6.45 45.95 63.42 Chr 6 Cs2RMYB33 519 57.03 7.46 59.70 57.53 Chr 3 Cs2RMYB83 334 38.24 4.96 46.95 59.85 Chr 6 Cs2RMYB34 305 34.64 5.70 57.58 70.72 Chr 3 Cs2RMYB84 286 32.92 5.80 56.50 54.58 Chr 6 Cs2RMYB35 248 29.14 9.10 56.61 66.49 Chr 3 Cs2RMYB85 291 33.53 6.63 61.70 46.94 Chr 6 Cs2RMYB36 259 29.98 6.50 48.74 59.54 Chr 3 Cs2RMYB86 277 32.26 9.35 51.45 59.49 Chr 6 Cs2RMYB37 296 33.70 5.35 56.27 67.20 Chr 3 Cs2RMYB87 301 32.45 9.32 50.91 64.82 Chr 6 Cs2RMYB38 219 25.25 6.32 59.79 70.32 Chr 3 Cs2RMYB88 319 35.85 6.53 48.51 65.49 Chr 6 Cs2RMYB39 354 40.50 9.20 58.22 77.40 Chr 3 Cs2RMYB89 344 38.44 6.12 57.72 80.00 Chr 6 Cs2RMYB40 267 30.10 5.59 55.70 69.33 Chr 3 Cs2RMYB90 387 44.36 5.81 54.93 61.01 Chr 6 Cs2RMYB41 245 28.13 5.75 48.70 62.57 Chr 3 Cs2RMYB91 289 33.19 6.45 53.15 70.17 Chr 6 Cs2RMYB42 224 25.60 7.64 65.43 74.87 Chr 3 Cs2RMYB92 248 27.74 9.11 46.24 76.73 Chr 7 Cs2RMYB43 275 31.61 8.71 39.67 79.75 Chr 3 Cs2RMYB93 500 54.62 5.89 55.46 57.82 Chr 7 Cs2RMYB44 316 36.22 5.63 58.87 56.52 Chr 3 Cs2RMYB94 254 29.45 5.36 74.13 75.63 Chr 7 Cs2RMYB45 312 34.71 6.99 55.70 62.79 Chr 3 Cs2RMYB95 271 31.90 5.56 53.17 62.66 Chr 7 Cs2RMYB46 248 29.70 8.46 52.73 69.60 Chr 3 Cs2RMYB96 254 29.40 5.02 43.86 79.49 Chr 7 Cs2RMYB47 348 39.13 8.86 46.82 64.77 Chr 3 Cs2RMYB97 280 32.36 5.20 59.21 68.86 Chr 7 Cs2RMYB48 294 32.66 6.17 57.40 64.42 Chr 3 Cs2RMYB98 285 32.82 5.32 58.47 64.70 Chr 7 Cs2RMYB49 233 26.13 9.33 51.33 65.41 Chr 3 Cs2RMYB99 248 27.78 6.24 44.80 65.28 Scaffold 72 Cs2RMYB50 313 35.13 5.95 54.63 65.50 Chr 3 说明：Cs2RMYB48基因定位于叶绿体，其他基因定位于细胞核。 -
表1表明：黄瓜R2R3-MYB亚家族成员编码195~552个氨基酸，分子量为22.67~61.13 kDa，理论等电点为4.96~10.31，59个R2R3-MYB蛋白的等电点小于7，40个R2R3-MYB蛋白的等电点大于7，超过半数的蛋白为酸性。除Cs2RMYB43、Cs2RMYB60、Cs2RMYB65外，其余CsR2R3-MYB亚家族成员蛋白质不稳定指数为42.84~78.88，大于40.00，为不稳定蛋白。所有成员的脂肪系数相对较高，说明黄瓜R2R3-MYB亚家族成员适应环境的多样性。Plant-mPLoc 2.0网站预测结果显示：除Cs2RMYB48定位于叶绿体，其他成员均定位于细胞核。
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黄瓜R2R3-MYB亚家族成员映射于1~7号染色体上，Cs2RMYB99的染色体定位结果未知(图2)。每条染色体上的基因分布相对不均匀，1、4、5、7号染色体上基因大多分布在上下两端，而剩下的染色体上基因分布较为均匀。3号染色体上数量最多，可以定位到24个R2R3-MYB亚家族成员；1、2号染色体各有16个R2R3-MYB亚家族成员；5、6号染色体分别为14和13个R2R3-MYB亚家族成员；7号染色体上最少，为7个R2R3-MYB亚家族成员。此外，2号染色体上的Cs2RMYB27和Cs2RMYB28、3号染色体上的Cs2RMYB45和Cs2RMYB46、5号染色体上的Cs2RMYB71和Cs2RMYB72、7号染色体上的Cs2RMYB94和Cs2RMYB95均在各自染色体上形成基因簇。根据进化树分析可知：形成基因簇的成员之间同源性较高，推测成员间功能相对保守。
图 2 黄瓜R2R3-MYB亚家族染色体定位图
Figure 2. Chromosome location map of C. sativus R2R3-MYB subfamily
为揭示黄瓜R2R3-MYB亚家族成员在整个黄瓜基因组中的连锁关系，对黄瓜与拟南芥MYB基因进行共线性分析(图3)，结果表明：25对基因表现出共线性和保守的连锁关系，即表明2个物种之间MYB基因家族存在高同源性。
图 3 黄瓜R2R3-MYB亚家族与拟南芥共线性分析图
Figure 3. Analysis of the collinearity between C. sativus R2R3-MYB subfamily and A. thaliana
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利用TBtools对黄瓜R2R3-MYB亚家族进行保守基序分析(图4)。结果显示：在99个R2R3-MYB蛋白中鉴定出10个不同的基序，其中Motif 3、Motif 7、Motif 2和Motif 4是高度保守的基序，所有成员均含有Motif 3，导致成员间功能相似。表明这些黄瓜R2R3-MYB亚家族成员间拥有特有或相同的基序，导致了它们之间具有特定的或者相似的功能。
图 4 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白保守基序和基因结构
Figure 4. Protein conservative motifs and gene structure of R2R3-MYB subfamily in C. sativus
通过Jalview对黄瓜R2R3-MYB亚家族进行序列比对(图5)。结果显示：2R重复序列中有3个色氨酸残基(W)及3R重复序列中有3个色氨酸残基，形成疏水结构，此为鉴定MYB家族典型的结构域特征。除保守的W外，2R重复序列的末端还存在12个高度保守的氨基酸残基，如精氨酸(R)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、亮氨酸(L)等，3R重复序列中的谷氨酸(E)、G、丙氨酸(A)、R、苏氨酸(T)等。
图 5 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白序列比对图
Figure 5. Sequence comparison of C. sativus R2R3-MYB subfamily proteins
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为了进一步研究黄瓜R2R3-MYB亚家族成员启动子区的顺式作用元件，通过PlantCARE在线网站分析了该亚家族上游1 500 bp区域(图6)。其启动子元件多与激素、抗逆及厌氧诱导相关，大部分黄瓜R2R3-MYB亚家族成员含雌激素响应(ERE)作用元件。从元件类型来看，ERE元件最多，分布于绝大多数成员的启动子区域上。从单个元件的具体分布来看，约68%家族成员启动子区含ERE元件，约60%成员启动子区含脱落酸应答元件(ABRE)。从单个基因家族成员来看，Cs2RMYB92启动子只有TCA-element激素调控相关元件；Cs2RMYB98有MYB结合位点，并富含激素响应与厌氧诱导元件，例如ABRE、ERE、茉莉酸甲酯相关元件(CGTCA)和MYB结合位点元件(MBS)。Cs2RMYB5、Cs2RMYB7和Cs2RMYB8等基因上有ABRE元件，说明这些基因可能与脱落酸响应有关；Cs2RMYB2、Cs2RMYB6和Cs2RMYB9等基因上含ERE元件，说明这些基因可能响应乙烯的调控；Cs2RMYB1、Cs2RMYB16和Cs2RMYB25等基因上有CGTCA元件，说明这些基因可能与茉莉酸甲酯响应有关；Cs2RMYB12、Cs2RMYB25、Cs2RMYB33和Cs2RMYB34等基因启动子元件上都含MBS元件，说明这些基因可能响应干旱胁迫的调控。
图 6 黄瓜R2R3-MYB亚家族上游顺式元件预测
Figure 6. Prediction of upstream homeopathic elements of C. sativus R2R3-MYB subfamily
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为深入了解黄瓜R2R3-MYB亚家族成员蛋白的互作情况，对99个成员进行蛋白质互作预测(图7)，结果表明：Cs2RMYB25、Cs2RMYB3、Cs2RMYB84、Cs2RMYB98、Cs2RMYB6、Cs2RMYB6均与Cs2RMYB44存在互作关系；Cs2RMYB96、Cs2RMYB22、Cs2RMYB31、Cs2RMYB41、Cs2RMYB56、Cs2RMYB75、Cs2RMYB7、Cs2RMYB4、Cs2RMYB50均与Cs2RMYB90存在互作关系，且有较强的关联性。此外，部分成员间虽存在互作相关性，但各成员之间的具体机制并不明晰，仍需进一步深入研究。
图 7 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员蛋白的互作预测
Figure 7. Prediction of protein interactions among R2R3-MYB subfamily members in C. sativus
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本研究共鉴定出99个黄瓜R2R3-MYB亚家族成员，约占黄瓜总MYB数的60%，数量多于西瓜(89个)[4]，少于拟南芥(126个)[9]、水稻(102个)[10]和玉米(200个)[15]。黄瓜的基因组大小为224.8~251.1 Mb[24]，而拟南芥、水稻、玉米和西瓜的基因组大小分别为125.0、430.0、2 300.0和365.1 Mb[25−28]，R2R3-MYB亚家族成员数量与植物的基因组大小并没有直接的相关性。
作为MYB家族最大的亚家族，R2R3-MYB家族成员具有典型的模式结构，在植物发育、新陈代谢、信号转导及响应生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用[29]。为了研究黄瓜基因组进化过程中功能保守的R2R3-MYB基因功能，构建其系统进化树并进行分析，结果表明：黄瓜Cs2RMYB 30个亚组中大多数包含来自拟南芥和杨梅R2R3-MYB成员，然而，C28亚组仅拥有黄瓜和拟南芥R2R3-MYB成员，表明它们可能来自共同的祖先。同时，外显子和内含子的结构分析有利于研究基因家族内部的进化关系，通过分组可以初步推测其功能，聚类较近的基因存在功能相似性，如在C30亚组中，拟南芥AtMYB42和AtMYB85被证明参与木质素生物合成代谢调控[30]，黄瓜Cs2RMYB72和Cs2RMYB73与其表现出较近的亲缘关系，可能与木质素生物合成代谢有关；在C15亚组中，AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114过量表达会促进植物花青素的积累[31]，与黄瓜Cs2RMYB19同属于C15亚组；在C22亚组中，AtMYB93是其分支上唯一一个影响拟南芥侧根发育的负调控因子[32]，而黄瓜Cs2RMYB89与AtMYB93进化关系最近；宫思宇等[33]研究表明：AtMYB94通过调节拟南芥表皮的蜡质含量提高植株耐旱性，而C22亚组中的Cs2RMYB48是其同源基因，可能具有类似功能，同一分支亚家族转录因子可能存在功能相似性[23, 34]。
基序分析结果发现：所有的CsR2R3-MYB基因都有共同的保守基序，但也有独特的基序，这为CsR2R3-MYB亚家族成员的分类提供参考，且可能与CsR2R3-MYB基因的功能分化相关。此外，启动子序列上的顺式作用元件是转录因子识别并发挥转录调控作用的重要识别位点[35]。本研究发现：黄瓜CsR2R3-MYB亚家族成员启动子上的顺式作用元件种类繁多，绝大多数CsR2R3-MYB基因家族成员基因启动子区都含有ERE元件，暗示其可能参与黄瓜性别分化等生长发育过程；富含ABRE和CGTCA等激素响应顺式作用元件，表明CsR2R3-MYB基因家族在黄瓜应答逆境胁迫中发挥重要作用。由于CsR2R3-MYB基因调控元件的不同功能，启动子区域中这些高度多样化的顺式调控元件也可能反映了转录水平上的功能分歧[36]。本研究初步预测了MYB家族CsR2R3-MYB基因与植物生长发育及逆境胁迫响应相关，可为后续该亚家族成员基因功能深入研究提供参考。
Identification and bioinformatics analysis of R2R3-MYB subfamily in cucumber
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摘要:
目的 深入研究黄瓜Cucumis sativus R2R3-MYB亚家族成员的相关功能。 方法 利用生物信息学手段分析黄瓜全基因组，鉴定R2R3-MYB亚家族成员，对其系统进化关系、蛋白理化性质、染色体定位、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白质互作进行分析。 结果 黄瓜全基因组中含99个具有典型结构域的R2R3-MYB转录因子，蛋白序列含195~552个氨基酸，有保守基序及氨基酸位点；基因在染色体上分布不均匀；大部分亚家族成员蛋白质的不稳定指数大于40，属于不稳定蛋白。顺式作用调控元件分析发现：大部分基因启动子区所含元件与激素调节、MYB结合位点、胁迫密切相关。 结论 通过黄瓜全基因组鉴定，获得黄瓜基因组99个R2R3-MYB家族成员，分为30个亚组，映射于7条染色体上，该家族成员的上游启动子区含逆境相关作用元件。图7表1参36 Abstract:Objective This study is aimed to conduct an in-depth study of the functions associated with members of the R2R3-MYB subfamily in cucumber (Cucumis sativus). Method First, an analysis was conducted of the whole cucumber genome so as to identify R2R3-MYB subfamily members. Then, bioinformatics was employed to analyze their phylogenetic relationships, physicochemical properties of proteins, chromosomal localization, gene structure, conserved motifs, and cis-acting elements, as well as the protein interactions. Result The whole cucumber genome contained 99 R2R3-MYB transcription factors with typical structural domains, and the protein sequences contained amino acids ranging from 195 to 552, with conserved motifs and amino acid sites. They were unevenly distributed on chromosomes. They were unstable proteins with the instability index of most subfamily members being greater than 40. As was shown by the analysis of cis-acting regulatory elements, most of the elements contained in the promoter regions of genes were closely related to hormone regulation, MYB binding sites, and stress. Conclusion The R2R3-MYB family members were obtained through whole cucumber genome identification, which were divided into 30 subgroups and mapped on 7 chromosomes and the upstream promoter region of this family members contained stress-related action elements. [Ch, 7 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- Cucumis sativus /
- R2R3-MYB /
- transcription factor /
- whole genome identification
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梅Prunus mume隶属于蔷薇科Rosaceae李属Prunus，原产中国南方，距今已有 3 000 多年的栽培历史[1]。目前，食用花卉的风潮日益兴起，花茶越来越受到欢迎，百合Lilium、菊花Chrysanthemum×morifolium、桂花Osmanthus fragrans等食用花卉已被应用于较多产业[2] ，梅花茶等相关制品具有巨大的开发前景和市场。梅花营养丰富，主要包括黄酮类、苯丙烷类、有机酸类、挥发性物质等化学成分，其中绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷质量分数较高[3]。以异槲皮苷、金丝桃苷为代表的黄酮类化合物具有抗炎、抗抑郁等药理作用，以绿原酸为代表的苯丙烷类化合物具有抗氧化、抑制黑色素形成等作用[4−5]。采摘后的梅花鲜花容易发生虫蛀、霉变，干燥加工能有效避免鲜花变质[6]。在干燥过程中，花茶的色、香、味和活性成分易受影响，干燥方式是梅花花茶品质最关键的影响因素。目前国内对梅花干燥制茶方面的研究相对缺乏，不同干燥方法对梅花花茶各方面品质的影响的研究报道甚少。
自然干燥、热风干燥、微波干燥等传统干燥方式[7]操作简单、成本低、耗时短，但存在品质差等缺陷。真空冷冻干燥是将物料降温冻结，在真空条件下使物料中的水分由冰直接升华为水蒸气被排除的技术[8]。它可使干制品最大限度地保持原有的色、香、味品质及营养成分，但设备投资大、能耗高、干燥时间长[9]。吴一超等[10]采用5种干燥方式对丹参Salvia miltiorrhiza茎叶干燥，得出真空冷冻干燥有利于保存丹参茎叶的酚酸及抗氧化活性成分，但成本高，仅适用于生产高品质的产品，40 ℃烘干法简便、高效、成本低，适合丹参茎叶的规模化加工。复合干燥是将多种干燥方式结合起来，优化干燥工艺，实现优势互补[11]。商涛等[12]采用微波热风联合干燥与热风干燥、微波干燥对比，结果表明：干燥时间、总色差值最小，黄芩苷质量分数和综合质量评分最高。WANG 等[13]采用不同温度热风干燥和微波结合热风干燥处理菊花，结果表明微波 30 s 与热风 75 ℃联合干燥后的菊花含有较高活性成分，整体构象变化小。由上述研究结果可知：真空冷冻干燥与复合干燥相较于其他干燥方式具有明显优势，但这2种方法的优劣以及对梅花进行干燥处理的效果未见报道。
本研究采用热风干燥法、微波干燥法、复合干燥法、真空冷冻干燥法对不同品种的梅花鲜花进行处理，测定了不同干燥处理后梅花的收缩率、花色表型等外在特征，以及花色成分、挥发性成分、抗氧化能力、绿原酸等指标。进一步使用熵权与变异系数组合赋权法计算耦合权重系数进行综合评分，并利用加权逼近理想解排序法(weighted approximation ideal solution ranking method，TOPSIS)验证评价模型[14]，获得最优的干燥方式，为梅花花茶的制作提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学梅花种质资源库选择‘东方朱砂’‘Dongfang Zhusha’、‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’、‘晓红宫粉’‘Xiaohong Gongfen’、‘粉皮宫粉’‘Fenpi Gongfen’、‘粉台玉蝶’‘Fentai Yudie’、‘月光玉蝶’‘Yueguang Yudie’、‘久观绿萼’‘Jiuguang Lve’、‘素玉绿萼’‘Suyu Lve’等8个品种盛开期花朵作为试验材料。所有梅花花朵性状正常，花色鲜艳均匀，采摘时环境温度为0~15 ℃。
1.2 干燥处理
梅花干燥处理采用包括热风干燥法、微波干燥法、复合干燥法及真空冷冻干燥法。热风干燥法：将新鲜的花朵置于60 ℃热风烘箱中，烘干3 h。微波干燥法：将样品置于微波炉中，设置功率为300 W，干燥20 min。复合干燥法：首先将样品置于功率为300 W的微波炉中，干燥10 min，然后取出样品置于60 ℃热风烘箱中，时间1 h。真空冷冻干燥法：将真空冷冻干燥机设置温度为−66 ℃、气压为4 Pa，取鲜样置于其中干燥22 h。对照组(ck)为鲜样梅花样品。
1.3 色表型测定
使用英国皇家园艺协会比色卡(RHSCC)进行比对测定。用色差仪(COLOR READER CR-10 PLUS)测定梅花花瓣的色差参数，包括亮度(L*)、红度(a*)、黄度(b*)、彩度(C*)值和色调角(h)。根据滕彩玲等[15]的方法计算色差值，公式如下：$ \Delta E = \sqrt {{{\left( {L - {L_0}} \right)}^2} + {{\left( {a - {a_0}} \right)}^2} + {{\left( {b - {b_0}} \right)}^2}} $。其中：∆E表示总色差，L、a、b分别表示样品的亮度值、红绿值、黄蓝值，L0、a0、b0分别表示对照样品的亮度值、红绿值、黄蓝值。
1.4 失水率与收缩率
根据刘盼盼等[16]的方法计算失水率。用游标卡尺测量梅花干燥前后最大直径，取平均值，6次生物学重复。收缩率计算公式为S=(dg−dt)/dg。其中：S为收缩率；dg和 dt分别为新鲜样品和干制样品的最大直径(cm)。
1.5 抗氧化性测定
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力根据TURKOGLU等[17]的方法测定。2,2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力根据THANA等[18]的方法测定并做调整。根据不同浓度与相应的清除率分别计算半数抑制质量浓度(IC50)，比较抗氧化能力强弱。
1.6 挥发性成分分析
每次取3 朵梅花花朵放入22 mL的采样瓶，密封瓶盖平衡10 min。将固相微萃取SPME纤维头插入采样瓶中，置于花朵上方2 cm，吸附30 min，重复3 次。色谱条件与质谱条件根据ZHANG等[19]和HAO等[20]的方法并做调整。
1.7 花色成分分析
称取0.3 g花瓣并研磨成粉末，加入提取液(三氟乙酸∶甲醇∶甲酸∶水=1∶70∶2∶27，体积比)中，置于 4 ℃ 冰箱内提取24 h，使用超声波设备超声处理20 min，使用转速为4 000 r·min−1的离心机离心10 min，将上清液用0.22 μm 孔径的尼龙微孔滤器过滤后，用于花青素苷与类黄酮的定性及定量分析。采用UPLC-Triple-TOF/MS液质联用仪进行测定，色谱柱为waters HISS-SB C18 (100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，进样量为2 μL，柱温为25 ℃，流速为 0.4 mL·min−1。流动相组成为A：体积分数为0.1%甲酸水，B：体积分数为0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度为0~11.0 min，0~95%B；11.0~12.0 min，95%B；12.0~12.1 min，95%~5%B；12.1~15.0 min，5%B。在 520、350 nm波长下获得色谱图。
1.8 营养成分分析
可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250法测定[21]；新绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷与金丝桃苷质量分数根据1.7成分分析方法测定。
1.9 熵权-变异系数法计算及 TOPSIS 法验证
使用熵权与变异系数组合赋权法计算耦合权重系数，进行综合评分，比主观权重更加可靠客观[22]，可避免单一客观权重分配不合理的问题。选择失水率、收缩率、色差值、DPPH和ABTS自由基清除能力、总黄酮质量分数等作为评价指标，根据LIU等[23]的方法计算熵权法权重(wj1)。根据李叶贝等[24]的方法计算评价指标的变异系数法权重(wj2)。根据拉格朗日乘子法，得到优化后的耦合权重(wj)。为了避免评价的主观性[25]，以原始数据和耦合权重的乘积作为评价数据，计算得到不同干燥方法与最优方案和最劣方案的距离C+和C−，以及待评价方案与正理想解的相对接近程度C，根据C的大小评价不同干燥方式的优劣。
2. 结果与分析
2.1 干燥后梅花表型变化
不同品种的梅花经不同方法干燥处理后，其外观特征如图1所示。比色卡测定结果(表1)表明：8个不同品种的梅花花色范围为 61B~155C，分为白色、粉红色、紫红色等3个色系。经干燥处理后，白色系品种梅花，转变为黄绿色系，花色范围为2D~N199D；粉红色和紫红色系品种梅花转变为紫红色系，花色范围为64A~84C。白色系‘粉台玉蝶’‘月光玉蝶’‘久观绿萼’‘素玉绿萼’，紫红色系‘骨红朱砂’的色差值测定结果(图2)表明：微波干燥后花色色差值最大，最大值为真空冷冻后的 3.49 倍；粉红色系‘晓红宫粉’‘粉皮宫粉’在热风干燥后花色色差值最大，色泽变化最大。对比其他3种干燥方法，真空冷冻干燥在‘东方朱砂’‘晓红宫粉’‘粉台玉蝶’‘月光玉蝶’‘久观绿萼’品种上保持色泽和形态上表现最佳，色差值显著低于其他3种干燥方法。
图 1 不同干燥方法处理后梅花的形态Figure 1 Morphology of P. mume flowers after different drying methods表 1 不同干燥方法处理后梅花花色变化Table 1 Changes of flower color after different drying methods品种 花色 对照 热风
干燥微波
干燥复合
干燥真空冷
冻干燥‘东方朱砂’ 61B N79B N79A 79N N79B ‘骨红朱砂’ N66C 64A N79D 70B 64 ‘晓红宫粉’ 65A N75A 84C N80D N75B ‘粉皮宫粉’ 65C N74C 84C 77D 75A ‘粉台玉蝶’ NN155B 155A N199D 150D 155A ‘月光玉蝶’ NN155C N155C 157B N155D NN155B ‘久观绿萼’ 155C 4D 2D 155C 155A ‘素玉绿萼’ NN155B 155A 8D 4D 155A 
图 2 不同干燥方法处理后梅花的色差值Figure 2 Color difference of P. mume flowers after different drying metheds由图3A可知：真空冷冻干燥后梅花的失水率为70.1%~79.7%，表明失水率较低且干燥效率低，其余3种干燥方法失水率均在79.3%以上，其中复合干燥后梅花的失水率显著高于其他3种干燥方法(P＜0.05)，最大失水率为84.7%。图3B 结果表明：真空冷冻干燥后梅花的收缩率显著小于其他3种干燥方式(P＜0.05)，为7.2%~28.7%，微波干燥后梅花的收缩率最大，为39.7%~47.4%。低温干燥特性能够更好地保持梅花的原有形态。
图 3 不同干燥方法处理后梅花的失水率(A)及收缩率(B)变化Figure 3 Changes of water loss rate (A) and shrinkage rate (B) of P. mume flowers after different drying metheds2.2 干燥后花色主要成分变化
2.2.1 总黄酮质量分数变化
不同干燥方法处理后，梅花总黄酮质量分数出现了不同程度的损失(图4)。相较于其他干燥方法，真空冷冻干燥对黄酮的保留效果最好，其总黄酮质量分数为 6.46~9.10 mg·g−1，显著高于热风干燥与微波干燥(P＜0.05)，微波干燥后梅花总黄酮损失量达到74.5%。复合干燥的保留效果也较好。说明真空冷冻干燥对于保留梅花中的黄酮成分效果较好，并且相对于微波干燥，保留了更多的黄酮化合物，可能是高温对黄酮类化合物造成影响。
图 4 不同干燥方法处理前后梅花总黄酮质量分数Figure 4 Total flavone content of P. mume flowers before and after different drying metheds2.2.2 花青苷质量分数变化
仅在‘东方朱砂’‘骨红朱砂’‘晓红宫粉’和‘粉皮宫粉’中共检测出了6种花青苷，包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)、矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3Ru)、芍药花素-3-O-葡萄糖苷(Pn3G)、芍药花素-3-O-芸香糖苷(Pn3Ru)、飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷(Dp3Ruh)、矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷(Pt3Ru5h)。4个白色系品种中未检测到花青苷。由图5可知：梅花鲜样颜色越深花青苷总质量分数越高。梅花在不同干燥方法处理后花青苷总质量分数有显著差异(P＜0.05)。‘东方朱砂’真空冷冻干燥后的花青苷质量分数最高，达到2.63 mg·g−1，这可能是由于低温干燥技术有效减少了花青苷的热降解。与之相比，热风干燥和微波干燥的花青苷损失较大。花青苷质量分数与总黄酮质量分数变化趋势一致，温度越高、干燥时间越长对类黄酮和花青苷质量分数的影响越明显。推测温度和干燥时间可能对梅花中类黄酮和花青苷质量分数变化具有较大的影响。
图 5 不同干燥方法处理前后梅花的总花青苷质量分数Figure 5 Total anthocyanin content of P. mume flowers before and after different drying metheds表2表明：‘东方朱砂’检测到 6 种花青苷，其余3个品种中，检测出除Pt3Ru5h外的 5种花青苷。紫红色系‘东方朱砂’所含的6种花青苷中，Cy3G、Cy3Ru、Pn3G占总花青苷比例较大，是主要的花青苷组成成分，其中，Cy3Ru质量分数最高，且在复合干燥后的梅花中质量分数显著高于其他干燥方法(P＜0.05)。Cy3G和Pn3G质量分数分别在‘晓红宫粉’‘骨红朱砂’‘粉皮宫粉’中最高，均在真空冷冻干燥保留率最高。Pt3Ru5h只在‘东方朱砂’中被检测出，且在真空冷冻干燥后梅花中保留率最高。
表 2 不同干燥方法处理前后梅花花青苷组成及质量分数Table 2 Composition and content of anthocyanin in P. mume flowers before and after different drying methods品种 干燥方法 花青苷/(μg·g−1 ) Cy3G Cy3Ru Pn3G Pn3Ru Pn3Ru Pt3Ru5h ‘东方朱砂’ 对照 841.71±34.39 a 1 027.57±23.45 a 961.74±18.22 a 227.72±29.11 a 130.19±1.09 a 192.58±1.46 a 热风干燥 400.75±5.87 d 723.73±15.10 c 509.53±5.24 d 158.79±5.02 b 113.67±12.52 ab 127.39±5.79 c 微波干燥 464.20±15.80 c 617.52±7.30 d 508.77±15.26 d 100.32±10.42 c 92.19±20.83 b 126.93±6.97 c 复合干燥 571.18±14.74 b 840.66±16.28 b 692.89±44.69 c 145.47±5.46 b 126.78±0.93 a 160.19±17.22 b 真空冷冻干燥 575.79±5.60 b 827.60±9.85 b 775.04±13.32 b 157.75±21.72 b 117.91±15.1 a 174.76±1.24 b ‘骨红朱砂’ 对照 564.92±13.66 a 496.45±3.02 a 774.52±19.56 a 63.51±1.61 a 63.32±0.70 a － 热风干燥 424.35±15.82 c 357.86±29.59 c 493.59±15.76 c 47.37±2.21 c 51.91±1.49 c － 微波干燥 352.38±26.86 d 275.21±37.52 d 462.78±19.02 d 46.43±0.20 c 50.58±2.90 c － 复合干燥 452.85±6.76 b 428.39±12.83 b 555.72±14.56 b 51.09±2.53 b 56.97±2.22 b － 真空冷冻干燥 478.79±12.68 b 401.86±5.03 b 585.24±19.34 b 52.87±0.62 b 59.45±2.44 b － ‘晓红宫粉’ 对照 94.87±12.12 a 56.21±8.51 a 89.89±13.31 a 57.87±1.65 a 60.02±1.89 a － 热风干燥 57.85±2.58 c 35.28±2.90 b 68.27±1.29 b 33.03±1.68 c 42.12±0.85 d － 微波干燥 29.93±1.58 d 21.17±0.30 c 42.66±4.48 c 22.80±1.63 d 27.43±2.01 e － 复合干燥 69.90±2.39 b 37.63±4.39 b 64.46±3.00 b 37.62±1.74 b 47.27±1.58 c － 真空冷冻干燥 71.37±2.64 b 39.72±2.76 b 75.04±1.53 b 40.09±2.65 b 50.79±1.18 b － ‘粉皮宫粉’ 对照 77.44±6.27 a 38.79±1.36 a 88.49±3.42 a 39.86±0.70 a 51.80±1.71 a － 热风干燥 52.84±3.36 c 23.81±1.81 b 52.65±1.74 d 23.92±1.11 c 24.04±1.25 c － 微波干燥 47.59±1.50 c 19.84±1.56 c 48.16±1.92 e 21.87±1.27 d 22.96±0.32 c － 复合干燥 72.49±3.47 b 26.32±1.66 b 57.47±3.32 c 25.47±0.98 c 32.95±1.96 b － 真空冷冻干燥 68.73±3.34 b 25.92±1.69 b 64.74±0.33 b 28.90±0.57 b 35.09±2.47 b － 说明：同列不同字母表示同一品种不同干燥方法间差异显著(P＜0.05)。Cy3G. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷； Cy3Ru. 矢车菊素-3-O-芸香糖苷； Pn3G. 芍药花素-3-O-葡萄糖苷；Pn3Ru. 芍药花素-3-O-芸香糖苷；Pn3Ru. 飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷；Pt3Ru5h. 矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷。－表示未检测到该成分。 2.3 干燥后挥发性成分变化
从8个梅花品种中鉴定出27种挥发物，这些挥发性成分主要包括醛类、酯类、有机酸、醇类和脂肪类化合物。酯类化合物在梅花花香成分中质量分数最高，苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯等是梅花挥发物的主要成分[26]。由挥发性成分测定结果可知(图6)：复合干燥和真空冷冻干燥在保留挥发性成分上具有明显优势，特别是在保留醛类和酯类这2类主要香气成分方面，这2种干燥方法表现出更佳的效果，复合干燥组的总保留率最高，达到50%以上。热风干燥组梅花的香气成分保留结果不稳定，部分梅花品种在热风干燥后挥发性成分保留少。8个梅花品种鲜样挥发性成分中除了‘粉皮宫粉’中检测到壬醛，其余品种只在干燥后检测到壬醛，说明在干燥处理后产生壬醛，梅花香气特征可能发生了改变。
图 6 不同干燥方法处理前后梅花挥发性成分相对含量Figure 6 Relative contents of volatile components of P. mume flowers before and after different drying metheds2.4 干燥后梅花抗氧化活性变化
表3和表4结果对比表明：干燥后梅花提取液对2种自由基清除能力一致。不同干燥方法处理后的梅花提取液清除DPPH和ABTS自由基的IC50均有所增加，并且存在显著差异(P＜0.05)，说明梅花提取液在干燥后对自由基的清除能力降低，并且不同干燥方法对自由基清除能力影响不同。
表 3 不同干燥方法处理前后梅花清除DPPH自由基的IC50Table 3 IC50 values of DPPH free radical scavenging of P. mume flowers before and after different drying methods品种 清除DPPH自由基的IC50/(mg·L−1) 对照 热风干燥 微波干燥 复合干燥 真空冷冻干燥 ‘东方朱砂’ 180.40±1.79 d 238.26±2.42 b 269.67±6.88 a 230.03±3.19 b 191.17±7.67 c ‘骨红朱砂’ 176.99±4.79 c 233.66±5.16 b 269.69±7.17 a 223.33±9.63 b 221.11±4.24 b ‘晓红宫粉’ 193.60±6.25 d 236.42±7.01 b 271.22±4.34 a 214.05±2.44 c 204.24±3.71 c ‘粉皮宫粉’ 186.91±7.98 d 242.91±7.63 b 292.69±3.39 a 222.02±1.34 c 197.54±6.29 d ‘月光玉蝶’ 171.70±2.90 d 241.20±7.81 b 273.73±9.35 a 229.67±1.03 b 208.39±6.02 c ‘粉台玉蝶’ 183.50±2.91 e 232.37±3.88 b 257.62±8.40 a 209.38±2.37 c 197.30±3.15 d ‘素玉绿萼’ 168.43±3.62 e 221.55±0.82 b 234.17±7.48 a 208.39±6.12 c 193.95±4.62 d ‘久观绿萼’ 155.31±5.20 d 229.09±6.76 b 249.32±12.28 a 190.41±4.72 c 189.24±1.65 c 说明：同行不同字母表示同一品种不同干燥方法间差异显著(P＜0.05)。 表 4 不同干燥方法处理前后梅花清除ABST自由基的IC50Table 4 IC50 value of ABST free radical scavenging of P. mume flowers before and after different drying methods品种 清除ABST自由基的IC50/(mg·L−1) 对照 热风干燥 微波干燥 复合干燥 真空冷冻干燥 ‘东方朱砂’ 431.89±1.85 c 528.86±2.95 a 520.90±6.88 a 464.79±5.46 b 454.21±11.33 b ‘骨红朱砂’ 430.89±9.98 c 464.71±6.51 b 494.48±17.93 a 463.13±2.78 b 457.54±5.77 b ‘晓红宫粉’ 436.85±4.07 d 521.48±7.59 b 536.05±9.34 a 470.58±7.23 c 473.88±3.00 c ‘粉皮宫粉’ 423.26±3.85 d 470.38±7.51 b 519.48±5.67 a 463.42±4.80 bc 458.63±6.59 c ‘月光玉蝶’ 435.44±0.87 d 523.76±3.58 b 537.67±7.33 a 467.46±4.29 c 468.04±5.26 c ‘粉台玉蝶’ 434.56±1.98 d 471.71±1.28 c 520.86±5.47 a 469.50±4.63 c 478.67±3.32 b ‘素玉绿萼’ 428.30±5.57 d 490.43±7.95 b 510.52±18.91 a 454.54±5.22 c 452.54±7.60 c ‘久观绿萼’ 410.93±4.46 d 470.38±7.51 b 519.48±5.67 a 459.79±10.02 b 447.29±4.69 c 说明：同行不同字母表示同一品种不同干燥方式间差异显著(P＜0.05)。 除‘骨红朱砂’外，与其他干燥方法相比，真空冷冻干燥后的梅花提取液清除DPPH、ABST自由基的IC50值显著低于热风干燥与微波干燥(P＜0.05)，与复合干燥差异小。真空冷冻干燥后的梅花提取液对DPPH自由基的清除能力是微波干燥后的1.2~1.5倍。复合干燥与真空冷冻干燥后梅花提取液清除ABTS自由基的IC50约为447.29~478.67 mg·L−1。真空冷冻干燥与复合干燥后的梅花提取液对DPPH、ABST自由基清除能力较强。可能由于真空冷冻干燥低温和缺氧的特点，有效减少了抗氧化物的降解，从而保持了更高的抗氧化活性。
2.5 有效成分分析
2.5.1 可溶性蛋白质量分数分析
由图7可知：不同干燥方法处理对梅花可溶性蛋白的保留有显著影响。‘月光玉蝶’‘粉台玉蝶’中复合干燥组可溶性蛋白损失显著小于其他干燥方法(P＜0.05)，损失量分别为26.08、7.92 mg·g−1，‘东方朱砂’‘骨红朱砂’‘晓红宫粉’‘粉皮宫粉’‘久观绿萼’‘素玉绿萼’中，真空冷冻干燥组可溶性蛋白质量分数损失小于其他3种干燥方法，损失量分别为4.91、31.86、3.34、5.38、5.26、3.70 mg·g−1。
图 7 不同干燥方法处理前后梅花的可溶性蛋白质量分数损失量Figure 7 Difference in soluble protein content of P. mume flowers before and after treatment with different drying methods2.5.2 新绿原酸、绿原酸、金丝桃苷、芦丁与异槲皮苷的质量分数变化
新绿原酸、绿原酸是梅花鲜花的主要酚类物质，其质量分数高于黄酮类化合物芦丁、异槲皮苷与金丝桃苷。由图8可知：真空冷冻干燥在所有干燥方法中保留效果最佳，尤其是大部分品种的绿原酸和异槲皮苷质量分数均显著高于除对照外的其他干燥方法(P＜0.05)。复合干燥虽然保留效果略低于真空冷冻干燥，但显著高于热风干燥和微波干燥。
图 8 不同干燥方法处理前后梅花中新绿原酸(A)、绿原酸(B)、芦丁(C)、金丝桃苷(D)及异槲皮苷质量分数(E)的变化Figure 8 Changes of contents of neochlorogenic acid (A), chlorogenic acid (B), rutin (C), hyperoside (D) and isoquercitrin (E) in P. mume flowers before and after different drying methods2.6 综合评价
由上述分析可知：不同干燥方法处理对梅花品质指标的影响不同。熵权-变异系数综合评分和TOPSIS法计算结果如表5和表6所示：4种干燥方法的熵权-变异系数综合评分由高到低依次为真空冷冻干燥法、复合干燥法、热风干燥法和微波干燥法。通过TOPSIS排序法进行验证，结果与熵权-变异系数法分析结果基本一致，TOPSIS排序法中C越大排名越高，真空冷冻干燥法与复合干燥法品质优于热风干燥法和微波干燥法。综合来说真空冷冻干燥法干燥后梅花品质最优，复合干燥法干燥后次之。
表 5 不同干燥方法处理后熵权-变异系数法各梅花指标权重Table 5 Weights of indexes of the P. mume flowers entropy weight-coefficient of variation method after different drying methods品种 指标名称 wj1 wj2 wj 品种 指标名称 wj1 wj2 wj ‘东方朱砂’ 失水率 0.074 6 0.054 0 0.079 8 ‘骨红朱砂’ 失水率 0.072 3 0.054 0 0.079 5 收缩率 0.081 6 0.033 4 0.065 7 收缩率 0.100 3 0.022 4 0.060 3 色差值 0.094 2 0.026 8 0.063 2 色差值 0.072 5 0.050 3 0.076 8 DPPH 0.078 3 0.037 4 0.068 0 DPPH 0.072 7 0.051 2 0.077 6 ABST 0.086 1 0.038 5 0.072 4 ABST 0.072 5 0.050 4 0.076 9 总黄酮 0.078 5 0.040 0 0.070 5 总黄酮 0.076 2 0.043 2 0.073 0 总花青素 0.087 0 0.032 2 0.066 5 总花青素 0.080 9 0.036 9 0.069 5 挥发性分成保留率 0.080 5 0.039 2 0.070 6 挥发性分成保留率 0.094 7 0.028 5 0.066 1 新绿原酸 0.077 0 0.044 9 0.073 9 新绿原酸 0.073 1 0.045 9 0.073 7 绿原酸 0.079 8 0.041 8 0.072 6 绿原酸 0.072 9 0.046 8 0.074 3 芦丁 0.080 2 0.042 9 0.073 7 芦丁 0.075 8 0.042 0 0.071 8 金丝桃苷 0.082 2 0.033 0 0.065 5 金丝桃苷 0.082 9 0.035 8 0.069 3 异槲皮苷 0.075 9 0.050 0 0.077 4 异槲皮苷 0.078 2 0.039 5 0.070 7 可溶性蛋白 0.074 4 0.055 0 0.080 4 可溶性蛋白 0.101 8 0.022 2 0.060 5 ‘晓红宫粉’ 失水率 0.076 6 0.063 7 0.081 2 ‘粉皮宫粉’ 失水率 0.076 1 0.041 3 0.072 4 收缩率 0.083 6 0.037 0 0.064 6 收缩率 0.075 4 0.037 6 0.068 8 色差值 0.079 4 0.043 2 0.068 1 色差值 0.081 3 0.032 7 0.066 6 DPPH 0.078 4 0.050 6 0.073 2 DPPH 0.074 0 0.042 9 0.072 7 ABST 0.084 2 0.046 3 0.072 6 ABST 0.072 5 0.051 6 0.079 0 总黄酮 0.082 3 0.042 3 0.068 5 总黄酮 0.073 6 0.048 8 0.077 4 总花青素 0.077 2 0.054 3 0.075 2 总花青素 0.078 1 0.040 3 0.072 4 挥发性分成保留率 0.080 2 0.045 3 0.070 1 挥发性分成保留率 0.072 5 0.050 4 0.078 1 新绿原酸 0.080 4 0.043 7 0.068 9 新绿原酸 0.092 8 0.027 4 0.065 1 绿原酸 0.079 1 0.048 8 0.072 2 绿原酸 0.089 6 0.027 1 0.063 6 芦丁 0.093 8 0.030 4 0.062 0 芦丁 0.072 4 0.052 3 0.079 5 金丝桃苷 0.084 5 0.045 8 0.072 3 金丝桃苷 0.079 9 0.039 6 0.072 6 异槲皮苷 0.076 7 0.061 3 0.079 6 异槲皮苷 0.098 4 0.023 6 0.062 2 可溶性蛋白 0.077 9 0.048 6 0.071 5 可溶性蛋白 0.090 3 0.032 3 0.069 7 ‘月光玉蝶’ 失水率 0.081 1 0.046 8 0.081 0 ‘粉台玉蝶’ 失水率 0.080 1 0.047 6 0.079 2 收缩率 0.100 3 0.026 2 0.067 4 收缩率 0.106 4 0.025 4 0.066 7 色差值 0.082 8 0.038 1 0.073 9 色差值 0.082 2 0.045 0 0.078 0 DPPH 0.080 6 0.043 4 0.077 8 DPPH 0.082 1 0.045 5 0.078 5 ABST 0.087 6 0.043 7 0.081 4 ABST 0.079 1 0.057 0 0.086 2 总黄酮 0.088 7 0.038 3 0.076 6 总黄酮 0.102 1 0.036 9 0.078 8 含量花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 挥发性分成保留率 0.083 2 0.040 0 0.075 8 挥发性分成保留率 0.082 2 0.041 1 0.074 6 新绿原酸 0.080 6 0.046 1 0.080 1 新绿原酸 0.094 8 0.036 2 0.075 2 绿原酸 0.080 8 0.049 1 0.082 8 绿原酸 0.085 5 0.044 6 0.079 3 芦丁 0.092 0 0.040 4 0.080 1 芦丁 0.083 0 0.045 2 0.078 6 金丝桃苷 0.093 0 0.037 5 0.077 6 金丝桃苷 0.085 1 0.045 1 0.079 5 异槲皮苷 0.092 5 0.031 1 0.070 5 异槲皮苷 0.094 7 0.032 3 0.071 0 可溶性蛋白 0.097 6 0.033 2 0.074 9 可溶性蛋白 0.084 5 0.039 8 0.074 5 ‘素玉绿萼’ 失水率 0.083 7 0.061 3 0.082 2 ‘久观绿萼’ 失水率 0.083 6 0.055 6 0.080 1 收缩率 0.087 1 0.046 4 0.073 0 收缩率 0.089 1 0.042 4 0.072 2 色差值 0.084 2 0.058 4 0.080 5 色差值 0.086 5 0.045 9 0.074 0 DPPH 0.089 1 0.045 1 0.072 8 DPPH 0.088 0 0.052 5 0.079 8 ABST 0.088 6 0.053 3 0.078 9 ABST 0.083 3 0.056 8 0.080 8 总黄酮 0.090 3 0.050 6 0.077 6 总黄酮 0.086 7 0.046 0 0.074 2 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 挥发性分成保留率 0.088 6 0.046 2 0.073 4 挥发性分成保留率 0.106 5 0.045 3 0.081 6 新绿原酸 0.093 3 0.045 8 0.075 0 新绿原酸 0.084 4 0.054 7 0.079 8 绿原酸 0.086 9 0.050 0 0.075 7 绿原酸 0.087 3 0.052 8 0.079 8 芦丁 0.090 0 0.051 5 0.078 2 芦丁 0.089 6 0.039 7 0.070 0 金丝桃苷 0.088 0 0.050 1 0.076 3 金丝桃苷 0.089 8 0.050 4 0.079 0 异槲皮苷 0.095 7 0.047 4 0.077 3 异槲皮苷 0.086 6 0.048 9 0.076 4 可溶性蛋白 0.084 3 0.055 9 0.078 8 可溶性蛋白 0.087 0 0.043 8 0.072 5 表 6 不同干燥方法处理后梅花熵权-变异系数综合评分和TOPSIS排序结果Table 6 Comprehensive score and TOPSIS ranking results of entropy-coefficient of variation of P. mume after different drying motheds品种 干燥方法 熵权-变异系数
综合排名TOPSIS排名 品种 干燥方法 熵权-变异系数
综合排名TOPSIS排名 综合评分 排名 C 排名 综合评分 排名 C 排名 ‘东方朱砂’ 热风干燥法 783.50 3 0.501 0 3 ‘骨红朱砂’ 热风干燥法 952.51 3 0.367 5 4 微波干燥法 619.09 4 0.392 3 4 微波干燥法 735.31 4 0.416 1 3 复合干燥法 975.78 2 0.649 3 1 复合干燥法 1276.55 2 0.581 2 1 真空冷冻干燥法 1049.36 1 0.595 0 2 真空冷冻干燥法 1340.41 1 0.552 8 2 ‘晓红宫粉’ 热风干燥法 723.16 3 0.508 3 3 ‘粉皮宫粉’ 热风干燥法 783.50 3 0.378 6 3 微波干燥法 564.06 4 0.413 6 4 微波干燥法 619.09 4 0.417 8 4 复合干燥法 912.86 2 0.598 5 1 复合干燥法 975.78 2 0.565 1 2 真空冷冻干燥法 1045.04 1 0.582 4 2 真空冷冻干燥法 1049.36 1 0.626 6 1 ‘月光玉蝶’ 热风干燥法 590.06 3 0.393 3 4 ‘粉台玉蝶’ 热风干燥法 722.06 3 0.283 0 4 微波干燥法 501.93 4 0.450 8 3 微波干燥法 707.76 4 0.422 5 3 复合干燥法 852.84 2 0.620 7 1 复合干燥法 975.07 2 0.555 4 2 真空冷冻干燥法 953.14 1 0.550 9 2 真空冷冻干燥法 1016.84 1 0.586 4 1 ‘素玉绿萼’ 热风干燥法 812.27 3 0.432 2 3 ‘久观绿萼’ 热风干燥法 877.24 3 0.423 7 3 微波干燥法 713.61 4 0.435 2 4 微波干燥法 706.09 4 0.505 1 4 复合干燥法 1016.70 2 0.580 5 1 复合干燥法 1041.97 2 0.464 3 2 真空冷冻干燥法 1048.38 1 0.564 1 2 真空冷冻干燥法 1150.98 1 0.576 4 1 3. 讨论
梅花具有多种香气成分和气味品质、独特的花色花形以及药用价值，这些特点赋予梅花极大的开发潜力[27]。本研究应用热风干燥、微波干燥、复合干燥和真空冷冻干燥4种不同干燥方法处理梅花，综合考虑了表型、花色、花香成分等因素，对比分析了不同干燥方法对梅花品质的影响。结果显示：干燥方法对梅花的理化属性产生较大的影响。与 ZHANG等[28]的研究一致。真空冷冻干燥的梅花在保持色泽和细胞结构上表现最佳，具较强的清除DHHP和ABST自由基能力，显示出强大的抗氧化能力。复合干燥法能保留梅花活性成分，提升抗氧化能力。这与SHI等[29]的研究结果相符。本研究中，复合干燥法在保留挥发性物质方面表现最佳，不仅提高了梅花的香气质量，还缩短了干燥时间，减少了有效成分的降解。此外，真空冷冻干燥法和复合干燥法处理后的梅花在保留总黄酮、总花青素、绿原酸等有效成分方面均表现出优势。在评估不同梅花品种的质量时，‘绿萼’品种表现出最强的抗氧化能力且各营养成分较高，而‘朱砂’品种在保留花色方面最为突出，并且其花青素质量分数较高。综合评分结果显示：‘骨红朱砂’‘久观绿萼’评分最高，因此，这2个梅花品种适用于梅花花茶的开发。
4. 结论
本研究选取8个梅花品种，采用4种不同干燥方法对梅花鲜花进行研究发现：真空冷冻干燥后的梅花品质最优，复合干燥次之。真空冷冻干燥在品质保持方面表现最佳，但较高的设备成本和长时间的干燥过程限制了其大规模应用。相比之下，复合干燥结合了不同干燥方法的优点，不仅保持了梅花的品质，还缩短了加工时间，为大批量生产提供了可能。可以进一步拓展梅花品种的选择范围，优化复合干燥条件，以提升梅花茶的整体品质。此外，本研究选用了色差值、抗氧化能力和总黄酮质量分数等指标进行综合评价，可以考虑引入更多与梅花品质相关的生化和生理指标，构建更为全面的梅花品质评价体系。
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图 1 黄瓜与拟南芥、杨梅R2R3-MYB亚家族成员的系统进化树构建
Figure 1 Phylogenetic tree construction of C. sativus, A. thaliana and M. rubra R2R3-MYB subfamily members
图 2 黄瓜R2R3-MYB亚家族染色体定位图
Figure 2 Chromosome location map of C. sativus R2R3-MYB subfamily
图 3 黄瓜R2R3-MYB亚家族与拟南芥共线性分析图
Figure 3 Analysis of the collinearity between C. sativus R2R3-MYB subfamily and A. thaliana
图 4 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白保守基序和基因结构
Figure 4 Protein conservative motifs and gene structure of R2R3-MYB subfamily in C. sativus
图 5 黄瓜R2R3-MYB亚家族蛋白序列比对图
Figure 5 Sequence comparison of C. sativus R2R3-MYB subfamily proteins
图 6 黄瓜R2R3-MYB亚家族上游顺式元件预测
Figure 6 Prediction of upstream homeopathic elements of C. sativus R2R3-MYB subfamily
图 7 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员蛋白的互作预测
Figure 7 Prediction of protein interactions among R2R3-MYB subfamily members in C. sativus
表 1 黄瓜R2R3-MYB亚家族成员信息
Table 1. Cucumber R2R3-MYB subfamily member information
基因命名 氨基酸
数量/个分子量/kDa 等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置基因命名 氨基酸
数量/个分子量/
kDa等电点 不稳定
指数脂肪指数 染色体
位置Cs2RMYB1 360 40.91 6.44 52.41 57.17 Chr 1 Cs2RMYB51 268 30.01 8.59 54.65 64.40 Chr 3 Cs2RMYB2 471 54.88 5.91 42.84 66.43 Chr 1 Cs2RMYB52 217 25.13 7.21 55.75 65.21 Chr 3 Cs2RMYB3 367 41.94 5.83 59.22 75.50 Chr 1 Cs2RMYB53 195 22.67 8.37 72.59 73.54 Chr 3 Cs2RMYB4 331 37.60 9.02 65.15 61.90 Chr 1 Cs2RMYB54 355 39.21 6.25 54.46 82.96 Chr 3 Cs2RMYB5 277 31.19 5.90 78.88 66.21 Chr 1 Cs2RMYB55 305 34.19 6.19 45.79 74.52 Chr 3 Cs2RMYB6 232 26.59 8.83 57.26 66.51 Chr 1 Cs2RMYB56 253 28.52 9.10 49.09 65.53 Chr 3 Cs2RMYB7 326 36.76 6.42 53.91 67.94 Chr 1 Cs2RMYB57 313 35.05 4.97 68.24 75.97 Chr 4 Cs2RMYB8 288 32.50 6.31 71.30 64.03 Chr 1 Cs2RMYB58 314 36.06 6.10 62.98 58.06 Chr 4 Cs2RMYB9 377 42.09 6.46 50.23 66.71 Chr 1 Cs2RMYB59 322 35.68 6.14 54.46 67.55 Chr 4 Cs2RMYB10 337 37.92 5.74 45.24 71.19 Chr 1 Cs2RMYB60 377 40.50 5.41 39.90 73.24 Chr 4 Cs2RMYB11 299 33.99 9.17 58.17 61.64 Chr 1 Cs2RMYB61 353 39.81 6.22 60.28 59.92 Chr 4 Cs2RMYB12 372 42.33 6.12 54.32 67.63 Chr 1 Cs2RMYB62 229 25.19 9.29 58.90 61.70 Chr 4 Cs2RMYB13 277 32.11 5.83 63.46 79.96 Chr 1 Cs2RMYB63 263 29.14 8.34 61.14 67.15 Chr 4 Cs2RMYB14 337 38.24 8.66 52.38 59.08 Chr 1 Cs2RMYB64 280 31.51 8.92 59.53 72.11 Chr 4 Cs2RMYB15 370 41.15 6.13 51.97 61.95 Chr 1 Cs2RMYB65 260 28.84 5.00 38.86 76.54 Chr 5 Cs2RMYB16 364 41.75 9.54 55.58 69.81 Chr 1 Cs2RMYB66 323 36.41 6.00 53.24 72.45 Chr 5 Cs2RMYB17 327 37.06 7.68 62.31 69.48 Chr 2 Cs2RMYB67 258 29.46 5.84 45.28 67.67 Chr 5 Cs2RMYB18 295 32.99 9.07 45.41 70.10 Chr 2 Cs2RMYB68 236 26.98 6.71 53.48 74.83 Chr 5 Cs2RMYB19 222 25.74 6.00 53.86 72.43 Chr 2 Cs2RMYB69 284 31.23 6.41 56.18 72.46 Chr 5 Cs2RMYB20 264 29.98 8.97 58.24 63.14 Chr 2 Cs2RMYB70 300 33.77 5.29 55.23 71.50 Chr 5 Cs2RMYB21 265 31.42 9.64 54.52 67.02 Chr 2 Cs2RMYB71 337 38.25 7.69 55.10 66.59 Chr 5 Cs2RMYB22 286 32.59 5.60 58.72 59.69 Chr 2 Cs2RMYB72 210 24.43 5.19 51.25 60.38 Chr 5 Cs2RMYB23 228 26.87 10.27 58.08 65.44 Chr 2 Cs2RMYB73 464 52.29 6.82 66.09 66.85 Chr 5 Cs2RMYB24 256 29.15 8.24 48.25 79.22 Chr 2 Cs2RMYB74 369 41.40 6.61 50.68 56.34 Chr 5 Cs2RMYB25 210 23.54 10.31 65.32 59.48 Chr 2 Cs2RMYB75 307 34.25 7.51 48.64 64.59 Chr 5 Cs2RMYB26 230 26.32 8.83 57.64 63.65 Chr 2 Cs2RMYB76 398 44.52 6.49 53.56 62.29 Chr 5 Cs2RMYB27 204 23.04 8.44 43.78 67.94 Chr 2 Cs2RMYB77 202 23.93 8.25 43.61 58.37 Chr 5 Cs2RMYB28 338 38.46 8.56 58.00 68.99 Chr 2 Cs2RMYB78 294 33.13 8.72 52.07 70.41 Chr 5 Cs2RMYB29 290 31.80 9.23 59.33 65.93 Chr 2 Cs2RMYB79 286 32.77 6.40 64.03 65.17 Chr 6 Cs2RMYB30 297 33.70 9.97 55.65 69.97 Chr 2 Cs2RMYB80 552 61.13 5.50 52.51 61.54 Chr 6 Cs2RMYB31 301 32.30 8.19 55.90 64.15 Chr 2 Cs2RMYB81 301 34.40 5.56 70.97 65.08 Chr 6 Cs2RMYB32 308 34.86 5.93 48.47 84.90 Chr 2 Cs2RMYB82 269 31.33 6.45 45.95 63.42 Chr 6 Cs2RMYB33 519 57.03 7.46 59.70 57.53 Chr 3 Cs2RMYB83 334 38.24 4.96 46.95 59.85 Chr 6 Cs2RMYB34 305 34.64 5.70 57.58 70.72 Chr 3 Cs2RMYB84 286 32.92 5.80 56.50 54.58 Chr 6 Cs2RMYB35 248 29.14 9.10 56.61 66.49 Chr 3 Cs2RMYB85 291 33.53 6.63 61.70 46.94 Chr 6 Cs2RMYB36 259 29.98 6.50 48.74 59.54 Chr 3 Cs2RMYB86 277 32.26 9.35 51.45 59.49 Chr 6 Cs2RMYB37 296 33.70 5.35 56.27 67.20 Chr 3 Cs2RMYB87 301 32.45 9.32 50.91 64.82 Chr 6 Cs2RMYB38 219 25.25 6.32 59.79 70.32 Chr 3 Cs2RMYB88 319 35.85 6.53 48.51 65.49 Chr 6 Cs2RMYB39 354 40.50 9.20 58.22 77.40 Chr 3 Cs2RMYB89 344 38.44 6.12 57.72 80.00 Chr 6 Cs2RMYB40 267 30.10 5.59 55.70 69.33 Chr 3 Cs2RMYB90 387 44.36 5.81 54.93 61.01 Chr 6 Cs2RMYB41 245 28.13 5.75 48.70 62.57 Chr 3 Cs2RMYB91 289 33.19 6.45 53.15 70.17 Chr 6 Cs2RMYB42 224 25.60 7.64 65.43 74.87 Chr 3 Cs2RMYB92 248 27.74 9.11 46.24 76.73 Chr 7 Cs2RMYB43 275 31.61 8.71 39.67 79.75 Chr 3 Cs2RMYB93 500 54.62 5.89 55.46 57.82 Chr 7 Cs2RMYB44 316 36.22 5.63 58.87 56.52 Chr 3 Cs2RMYB94 254 29.45 5.36 74.13 75.63 Chr 7 Cs2RMYB45 312 34.71 6.99 55.70 62.79 Chr 3 Cs2RMYB95 271 31.90 5.56 53.17 62.66 Chr 7 Cs2RMYB46 248 29.70 8.46 52.73 69.60 Chr 3 Cs2RMYB96 254 29.40 5.02 43.86 79.49 Chr 7 Cs2RMYB47 348 39.13 8.86 46.82 64.77 Chr 3 Cs2RMYB97 280 32.36 5.20 59.21 68.86 Chr 7 Cs2RMYB48 294 32.66 6.17 57.40 64.42 Chr 3 Cs2RMYB98 285 32.82 5.32 58.47 64.70 Chr 7 Cs2RMYB49 233 26.13 9.33 51.33 65.41 Chr 3 Cs2RMYB99 248 27.78 6.24 44.80 65.28 Scaffold 72 Cs2RMYB50 313 35.13 5.95 54.63 65.50 Chr 3 说明：Cs2RMYB48基因定位于叶绿体，其他基因定位于细胞核。 
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