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湿地是地球上物种最丰富、生产力最高、生态系统服务功能最强的生态系统，被誉为“地球之肾”，在维持物种多样性、净化水质、调节生态系统平衡等方面发挥重要作用[1−2]。近年来，全球变化及人为干扰导致湿地大面积退化[3]，引起湿地结构、功能及生态过程的一系列变化，并影响土壤质地、结构、养分状况、酸碱性及溶氧量，最终对土壤微生物群落组成、结构及多样性产生一系列的调控作用[4]。
细菌作为湿地生态系统中的重要组成部分，主要参与土壤形成、凋落物分解、养分供应及生态系统养分循环[5]，能够作为土壤生态系统变化的预警指标[6]，对湿地生态系统结构及功能的维持与稳定起着不容忽视的作用。前人研究表明：高寒湿地和鄱阳湖湿地退化，导致土壤蓄水保肥能力降低、养分流失、碳氮转化速率减慢，显著抑制土壤细菌群落多样性[7−8]。但也有一些研究表明：人为干扰引起湿地排干、水分流失、土壤酸化及土壤养分供给改变，能够导致湿地土壤细菌多样性增加[9−10]。另外，三江平原湿地退化引起的土壤酸碱度及含水量变化仅影响土壤细菌群落组成，而对细菌多样性无显著影响[11]。可见，土壤细菌群落对湿地土壤理化性质变化的响应，存在不确定性。这种不确定性可能与全球变化、区域气候、湿地类型及人为活动干扰密切相关。因此，探明“不同退化阶段—土壤理化环境—细菌群落结构和多样性”之间的耦合关系，对于理解全球气候变化和人为干扰引起的湿地退化对土壤细菌群落的影响机制，具有十分重要的科学意义。
纳帕海高原湿地地处青藏高原香格里拉县内，其特殊的闭合—半闭合地形孕育着丰富的生物多样性，是全球生物多样性保护的重点区域[12]。近20多年来，在喀斯特作用和人为干扰的叠加影响下，该区湖水外泄，湖面面积大幅度减小，沼泽湿地逐渐旱化为沼泽化草甸和草甸，导致湿地水文和理化环境发生改变，进而影响土壤细菌群落结构及多样性[13]。本研究选取纳帕海不同退化阶段高原湿地类型(沼泽湿地、沼泽化草甸和草甸)为研究对象，运用Illumina高通量测序技术，揭示不同退化阶段湿地的土壤细菌群落结构及多样性干湿季变化特征，并分析细菌群落结构及多样性与土壤理化性质变化之间的关系，从而阐明土壤细菌群落对纳帕海高原湿地退化过程的响应规律，以期为理解人为干扰及全球气候变化加剧背景下高原退化湿地的土壤微生物多样性保育提供关键数据支撑。
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纳帕海湿地(27°49′~27°55′N，99°37′~99°43′E)地处滇西北横断山区香格里拉县，面积为3100 hm2，海拔为3260 m[12]，是中国典型的高原季节性湿地，属于冷凉湿润的高原气候[14]。该区域年平均气温为5.4 ℃，最热月平均气温为13.2 ℃，最冷月平均气温为−3.8 ℃；干湿季节分明，雨季(5—10月)降雨量高达495.9 mm；干季(11月至翌年4月)降雨量仅占全年的20%[13]。在人为和自然因素的共同作用下，沼泽湿地(常年淹水)逐步向沼泽化草甸(季节性淹水)和草甸(无积水)退化。
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于2015年1月(干季)和8月(湿季)，在每种退化湿地样带中分别随机布设3个10 m×10 m样地(表1)，每个样地内按对角线法布设5个采样点(4个顶角和1个中心)，分别采集各点样品并混合为1个土样，共采集18份土壤样品。去除各样点地表2 cm厚的覆盖物，然后用土钻钻取0~20 cm土层土样，去除石砾、残根后混合，并用四分法取适量土壤装入无菌自封袋，贴好标签装入便携式冰箱尽快带回实验室(沼泽湿地常年淹水，用特质采样器采样[15])。将带回的土样约100 g用于测定土壤自然含水率，约1 kg经自然风干、磨细过100目和10目筛后用于测定土壤基本性质，约200 g于−70 ℃下冷冻保存，用于土壤DNA提取和细菌高通量测序。
表 1 样地基本信息
Table 1. Basic information of the sampling sites
湿地类型 经度(N) 纬度(E) 积水深度/cm 优势植物 沼泽湿地(SW) 27°50′43.46″ 99°39′07.86″ 8.5~23.0 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Myripophyllum spicatum、篦齿眼子菜
Potamogeton pectinatus沼泽化草甸(SM) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −19.3~5.5 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅薹草
Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis草甸(M) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −154.0~−123.0 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae -
土壤理化性质测定参照鲍士旦[16]方法，其中：土壤自然含水率采用烘干法；pH采用电位法(水土比为1.0∶2.5)；有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法；全氮采用硫酸-高氯酸消化开氏定氮法；全磷采用硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法；全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法；速效氮采用碱解扩散吸收法；速效磷采用0.030 mol·L−1氟化铵-0.025 mol·L−1盐酸浸提钼蓝比色法；速效钾采用1.000 mol·L−1中性醋酸铵浸提火焰光度法。
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用Soil DNA KIT试剂盒提取土壤总DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。每份混合土样各提取3个DNA，充分混合后送往上海生工生物有限公司完成细菌高通量测序。利用引物341F[CCCTACA2CGACGCTCTTCCGATTG(barcode)CCTACGGGGGAG]和805R[GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTATATC]对细菌V3~V4区进行扩增，扩增过程分2轮。第1轮：10×PCR缓冲液5.0 μL，10 mmol·L−1dNTPs 0.5 μL，DNA模板10 ng，上游、下游引物各0.5 μL，Plantium Taq (5×16.67 mkat·L−1) 0.5 μL；扩增条件为：94 ℃预变性3 min，5个循环(94 ℃变性30 s、45 ℃退火20 s、65 ℃延伸30 s)，20个循环(94 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。第2轮：DNA模板为20 ng，其他反应体系与第1轮一致；扩增条件为：95 ℃预变性30 s，5个循环(95 ℃变性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR扩增结束后，将纯化质检合格的扩增产物按1∶1等量混合，利用Miseq台式测序仪2×300 bp双端测序(paired-end)[13]。
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实验数据用Excel 2007整理。数据分析前用SPSS 26进行正态分析和方差齐性检验(P＜0.05)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各样地变量之间的差异显著性，成对样本t检验比较干湿季之间的差异显著性。利用Mothur软件将相似性大于97%的序列归为同一种可操作分类单元(OTU)，并计算Alpha多样性指数：丰富度指数(Richness)、香农指数 (Shannon)、艾斯指数(ACE)、赵氏指数(Chao1)、辛普森指数(Simpson)[13]。以理化因子为环境变量，细菌群落相对丰度为物种数据，采用Mantel分析理化因子对细菌群落结构的影响。
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高通量测序结果显示：在干季和湿季共检测到相对丰度＞1% 的细菌门主要有变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、厚壁菌门Firmicutes、绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、浮霉菌门Planctomycetes和未分类细菌门。其中，变形菌门是纳帕海高原湿地优势菌门，相对丰度高达35.92%，芽单胞菌门Gemmatimonadetes为干季特有菌门(图1)。
图 1 不同退化阶段土壤细菌门干季(A)、湿季(B)相对丰度
Figure 1. Composition of dry (A) and wet (B) season bacteria phylum in soil at different degradation stages
不同退化阶段土壤细菌门相对丰度差异显著(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加11.04%、49.10%和72.31%，绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少40.89%和55.50%；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度分别增加205.38%、260.76%、188.17%、135.31%和182.18%，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少30.34%、46.55%和67.16%。在湿季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门相对丰度分别增加17.98%、45.84%和223.54%，厚壁菌门和绿弯菌门相对丰度分别减少73.17%和35.39% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门相对丰度分别增加216.33%、194.30%、294.56%和624.73%，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少88.63%和52.65%。
不同退化阶段土壤细菌门相对丰度干湿季节存在显著差异(P＜0.05)。沼泽湿地的变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度为干季大于湿季，湿季分别减少了23.15%、23.89%和24.53%；厚壁菌门为湿季大于干季，是干季的3.70倍。沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和放线菌门相对丰度在湿季分别减少了18.35%、25.56%、42.39%和54.50%；拟杆菌门相对丰度在湿季显著增加(P＜0.05)，是干季的7.46倍。草甸的酸杆菌门相对丰度在湿季减少了21.17%；浮霉菌门相对丰度在湿季增加了1.79倍。
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在属水平上，共检测到相对丰度＞0.01%的细菌属有酸杆菌属(Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属Pseudomonas、芽单胞菌属Gemmatimonas、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Povalibacter、Subdivision、Spartobacteria和未分类菌属。除此之外，酸杆菌属(Gp1、Gp16)、Paenisporosarcina、芽孢杆菌属Bacillus和放线菌属Gaiella为干季特有菌属；梭菌属Clostridium、尼龙菌属Flavobacterium、溶杆菌属Lysobacter、地杆菌属Pedobacter、马塞菌属Massilia和出芽菌属Gemmata为湿季特有菌属。未分类菌属为纳帕海高原湿地优势菌属，相对丰度高达20.64% (图2)。
图 2 不同退化阶段土壤细菌属干、湿季群落组成
Figure 2. Composition of dry and wet season bacteria phylum in soil at different degradation stages
湿地退化显著影响土壤细菌属相对丰度(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的假单胞菌属、Paenisporosarcina属相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加9.34、455.50倍，Povalibacter属相对丰度显著减少77.29% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌属(GP16)、假单胞菌属、Spartobacteria属相对丰度分别增加409.35、9.54和30.86倍，Povalibacter属和未分类菌属相对丰度分别减少80.06%和41.25%。在湿季，沼泽化草甸的尼龙菌属、溶杆菌属、地杆菌属相对丰度分别增加5.87、228.50和197.98倍，梭菌属相对丰度显著减少76.28% (P＜0.05)；草甸的出芽菌属相对丰度显著增加116.75倍(P＜0.05)，未分类菌属和梭菌属相对丰度分别减少33.49%和99.34%。
不同退化阶段的共有菌属因干湿季节变化而存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的未分类菌属相对丰度均为干季大于湿季，在湿季分别减少21.59%和26.61%。沼泽化草甸中的假单胞菌属相对丰度在湿季减少79.75%；鞘氨醇单胞菌属相对丰度在湿季增加了95.78%。
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由表2可见：湿地退化显著影响土壤细菌群落多样性(P＜0.05)。在干季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地显著增加(P＜0.05)，沼泽化草甸与草甸间差异不显著(P＞0.05)；在湿季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地也显著增加，且沼泽化草甸显著高于草甸(P＜0.05)。不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数在季节变化上存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的丰富度指数、艾斯指数和Chao1指数均为湿季大于干季；草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数均为干季大于湿季，辛普森指数相反，且差异显著(P＜0.05)。
表 2 不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数
Table 2. Diversity index of soil bacterial community at different degradation stages
湿地
类型季节 丰富度
指数香农
指数艾斯
指数Chao1
指数辛普森
指数沼泽
湿地干季 4056 Bc 6.16 Ab 5668.94 Bb 5368.14 Bb 0.0135 Aa 湿季 4201 Ac 6.20 Ac 6095.66 Ac 5789.86 Ac 0.0118 Aa 沼泽化
草甸干季 5352 Bb 6.68 Aa 7046.88 Ba 6631.88 Ba 0.0061 Ab 湿季 5697 Aa 7.14 Aa 8095.30 Aa 8121.55 Aa 0.0049 Ab 草甸 干季 5451 Aa 6.83 Aa 7059.57 Aa 6655.28 Aa 0.0041 Bc 湿季 4915 Bb 6.27 Bb 6673.81 Bb 6398.10 Ab 0.0130 Aa 说明：表中数据为平均值。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 -
由表3可知：湿地退化显著改变土壤理化性质(P＜0.05)。湿地退化使土壤含水量以及有机质、全氮和速效氮质量分数显著减少(P＜0.05)。干季的沼泽化草甸分别减少77.77%、41.16%、46.53%和33.91%，草甸分别减少80.93%、64.81%、87.31%和50.79%；湿季的沼泽化草甸分别减少32.30%、25.01%、51.34%和7.32%，草甸分别减少78.31%、61.99%、70.62%和39.18%，且土壤逐渐酸化。土壤磷、钾养分及碳氮比的变化趋势有所差异。较沼泽湿地，在干季，沼泽化草甸土壤全磷、全钾、速效磷、速效钾质量分数分别增加46.88%、9.39%、15.34%和27.38%；草甸土壤全磷质量分数及碳氮比分别增加14.06%和176.80%，全钾、速效磷及速效钾质量分数分别减少31.41%、42.92%和40.97%。在湿季，沼泽化草甸土壤全钾质量分数和碳氮比分别减少14.35%和63.88%，速效磷及速效钾质量分数分别增加66.15%和108.66%；草甸土壤全磷、速效磷、速效钾质量分数及碳氮比分别减少30.09%、33.57%、49.88%和37.97%，全钾质量分数显著增加51.48% (P＜0.05)。
表 3 不同退化阶段土壤理化性质
Table 3. Soil physical and chemical characteristics at different degradation stages
湿地类型 干湿季 含水量/% 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 沼泽湿地 干季 106.15±0.47 Ba 138.20±4.29 Aa 9.22±0.20 Ba 0.64±0.01 Ac 10.76±0.36 Ab 湿季 117.15±0.60 Aa 144.40±2.52 Aa 11.98±0.29 Aa 0.57±0.01 Aa 9.13±0.20 Ab 沼泽化草甸 干季 23.60±1.52 Bb 81.31±1.45 Bb 4.93±0.31 Ab 0.94±0.02 Aa 11.77±0.29 Aa 湿季 79.31±0.91 Ab 108.28±1.37 Ab 5.83±0.31 Ab 0.56±0.02 Ba 7.82±0.15 Bc 草甸 干季 20.24±1.04 Bb 48.63±6.60 Bc 1.17±0.04 Bc 0.73±0.01 Ab 7.38±0.18 Ac 湿季 25.41±0.50 Ac 54.89±2.13 Ac 3.52±0.05 Ac 0.37±0.02 Bb 13.83±0.13 Aa 湿地类型 干湿季 碳氮比 pH 速效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 沼泽湿地 干季 8.75±0.37 Bb 7.92±0.01 Aa 627.75±2.29 Aa 6.78±0.16 Ab 176.76±0.93 Bb 湿季 14.59±0.55 Aa 7.87±0.02 Aa 494.61±7.02 Ba 7.15±0.20 Ab 297.36±9.03 Ab 沼泽化草甸 干季 9.81±0.47 Ab 6.97±0.04 Bb 414.85±1.37 Bb 7.82±0.14 Ba 225.16±1.29 Ba 湿季 5.27±0.13 Bc 7.82±0.11 Aa 458.39±3.36 Ab 11.88±1.21 Aa 620.46±4.70 Aa 草甸 干季 24.22±3.30 Aa 5.92±0.12 Ac 308.92±1.36 Ac 3.87±0.14 Bc 104.35±1.44 Ac 湿季 9.05±0.35 Bb 5.65±0.08 Ab 300.84±3.44 Ac 4.75±0.05 Ac 149.04±8.64 Ac 说明：表中数据为平均值±标准误。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 干湿季节变化显著影响土壤理化性质的变化规律(P＜0.05)。沼泽湿地土壤含水量以及全氮、碳氮比、速效钾质量分数均为湿季大于干季，湿季分别增加10.36%、29.93%、40.03%和68.23%；速效氮在湿季显著减少21.21%(P＜0.05)。沼泽化草甸土壤含水量以及有机质、速效氮、速效磷和速效钾质量分数在湿季比干季分别增加236.06%、33.17%、10.50%、51.92%和175.56%；全磷、全钾质量分数和碳氮比在湿季分别减少40.43%、33.56%和46.28%；湿季pH升高，土壤偏碱性。草甸土壤含水量以及有机质、全氮、速效磷质量分数在湿季比干季分别增加25.54%、12.87%、200.85%和22.74%；全磷质量分数和碳氮比分别减少49.32%和62.63%。
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干季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mantel分析结果如图3所示。门水平上，土壤全氮、全钾、速效钾质量分数及pH和土壤细菌门的曼特尔显著值最小(P＜0.01)，说明土壤pH以及氮和钾质量分数的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，全氮质量分数和pH与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门呈显著负相关(r=−0.93~−0.70，P＜0.05)，与变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门呈显著正相关(r=0.67~0.90，P＜0.05)。全钾和速效钾质量分数与变形菌门、厚壁菌门呈极显著正相关(r=0.85~0.98，P＜0.01)，与酸杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.97~−0.79，P＜0.05)。
图 3 干季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 3. Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in dry season
属水平上，土壤氮、磷、钾质量分数以及pH的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，全氮、速效氮质量分数以及pH与酸杆菌属(Gp1、Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属、芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.93~−0.67，P＜0.05)，与Gp16属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.72~0.91，P＜0.05)。速效磷、速效钾质量分数与酸杆菌属(Gp1、Gp4)、鞘氨醇单胞菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈极显著负相关(r=−0.97~−0.80)，与未分类菌属呈极显著正相关(r=0.81~0.96，P＜0.01)。
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湿季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mentel分析结果如图4所示。门水平上，有机质、氮和磷质量分数及含水量、pH的高低是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，含水量、pH以及有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.98~−0.74，P＜0.05)，有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量与厚壁菌门、绿弯菌门呈显著正相关(r=0.75~0.96，P＜0.05)。
图 4 湿季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 4. Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in wet season
属水平上，有机质、氮、磷质量分数以及pH、含水量、碳氮比是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数以及含水量、pH 与假单胞菌属、芽单胞菌属、Gp4属、Gp7属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.97~−0.71，P＜0.05)，与梭菌属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.79~0.96，P＜0.05)；碳氮比与尼龙菌属、Subdivision、溶杆菌属、地杆菌属、马塞菌属呈显著负相关(r=−0.90~−0.68，P＜0.05)，与梭菌属和Povalibacter呈显著正相关(r=0.76~0.78，P＜0.05)。
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对土壤理化因子与细菌多样性指数进行Pearson相关性分析，结果如表4所示。在干季，丰富度指数、香农指数、艾斯指数、Chao1指数与有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量呈极显著负相关(r=−0.99~−0.83，P＜0.01)。可见：土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量是影响干季土壤细菌多样性的主控因子，且对细菌多样性起抑制作用。
表 4 土壤主要理化因子与细菌群落多样性的相关性分析
Table 4. Correlation analysis between main soil physical and chemical factors and bacterial community diversity
项目 干季 湿季 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 含水量 −0.99** −0.92** −0.99** −0.99** 0.98** − − − − − 有机质 −0.87** −0.89** −0.85** −0.85** 0.93** − − − − − 全氮 −0.91** −0.90** −0.89** −0.89** 0.96** −0.67* − − − − 全磷 − − 0.71* 0.70* − − − − − − 全钾 − − − − − 0.72* 0.88** 0.83** 0.85** −0.84** 碳氮比 − − − − −0.70* −0.96** −0.79* −0.91** −0.90** − pH −0.86** −0.83** −0.83** −0.83** 0.91** − − − − − 速效氮 −0.96** −0.93** −0.95** −0.94** 0.99** − − − − − 速效磷 − − − − − − 0.88** 0.79* 0.81** −0.90** 速效钾 − − − − − 0.68* 0.91** 0.82** 0.84** −0.91** 说明：*表示显著相关(P＜0. 05)；**表示极显著相关(P＜0. 01)；−表示不相关(P＞0.05)。 在湿季，香农指数、艾斯指数、Chao1指数与土壤全钾、速效钾、速效磷质量分数呈显著正相关(r=0.79~0.91，P＜0.05)，与碳氮比呈显著负相关(r=−0.91~−0.79，P＜0.05)，是影响湿季土壤细菌多样性的主控因子。其中，全钾、速效钾、速效磷质量分数对细菌多样性起促进作用，而碳氮比起抑制作用。
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土壤细菌作为微生物群落中数量最丰富、种类最多、生物量最大的功能类群，能够对高原湿地退化引起的土壤微域环境变化产生敏感响应[17]。变形菌门是纳帕海湿地的主要优势类群，与李金业等[18]、李玉倩等[19]研究结果一致。变形菌门的生态幅广、适宜能力强，能在不同退化湿地环境中形成较为稳定的生态位，但其喜弱碱特性会影响其相对丰度的变化[20]。本研究中，在轻度退化的弱碱沼泽化草甸土壤中变形菌门相对丰度显著增加。酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度均随湿地退化程度的加深而增加。酸杆菌属嗜酸菌、寡营养类群，其胞外多糖与补偿溶质的产生与积累使其更适应于含水量低、酸性较强、养分较低的退化草甸土壤[21]；放线菌门、疣微菌门Spartobacteria属和浮霉菌门等属好气性细菌，喜欢通气良好的环境，湿地退化导致土壤含水量减少，土壤孔隙度、通气状况得到改善，促进其相对丰度的显著增加[22]；疣微菌门是高寒沙化草甸的特有菌群，主要通过磷来维持其群落机制和养分平衡[23]，故在磷分较丰富的退化草甸土壤中相对丰度较高。本研究发现：湿地退化会抑制绿弯菌门的生长繁殖，这是因为该菌门属兼性厌氧菌，在养分匮乏的条件下进行光能自养，但仍以无光或有光且缺氧条件下的化学能或光能异养生长为主[24]，湿地退化导致土壤水分减少而抑制其相对丰度增加。综上所述，湿地退化过程中土壤含水量减少，使得土壤通气透水性得到改善，促进好气性细菌类群大量繁殖。
干湿季节交替通过调节水分、温度以及细菌对土壤养分的利用关系从而改变土壤细菌群落组成[25]。本研究发现：厚壁菌门在沼泽湿地中为湿季大于干季，而在沼泽化草甸中为干季大于湿季。厚壁菌属厌氧快速生长型菌群，具有固碳作用，大多存在于动物肠道中[26]。湿季雨水冲刷，厚壁菌门随动物粪便流入沼泽湿地，相对丰度增加，同时动物粪便的输入可直接刺激其相对丰度的增加；而沼泽化草甸的有机底物相对较低，干季丰富的凋落物为厚壁菌门提供充足碳源，相对丰度较湿季增加。梭菌属为湿季特有菌属，在沼泽湿地中占优势，相对丰度高达22.60%。该菌属是来自厚壁菌门的专性厌氧铁还原菌，在严格厌氧条件下才能生存，主要通过还原铁获取生长能量[27]，沼泽湿地常年淹水，湿季适宜的温度和充足的有机底物可促进其快速生长；而在干季，养分较少、温度相对较低，有利于厌氧寡营养绿弯菌门聚集[28]。拟杆菌门(尼龙菌属)在湿季沼泽化草甸显著增加，这主要与其需氧特性和水生环境的生物学特性有关[29]。酸杆菌门具有降解植物残体多聚物的能力[21]，干季植物枯死，凋落物的分解为酸杆菌的繁殖及降解提供更好的养分条件[30]，故相对丰度呈现干季大于湿季的变化趋势。芽单胞菌门在干季相对丰度较低，在湿季则未检测到，进一步表明了芽单胞菌属好氧菌，适宜生存于较为干燥的环境中[31−32]。因此，干湿季更替显著影响好养厌养、需氧厌氧细菌群落分布格局。
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高原湿地退化通过影响水热条件、土壤结构、土壤养分，进而影响土壤细菌群落多样性[33]。本研究中，沼泽化草甸和草甸土壤的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数显著高于沼泽湿地，说明湿地退化会促进细菌多样性的增加。这可能是沼泽湿地有机底物常年积累，但由于其土壤处于厌氧状况，不利于微生物对养分的矿化，难为大多数细菌提供直接能量来源[34]，因此，细菌多样性较沼泽化草甸和草甸细菌低。另一方面，湿地在退化过程中，土壤孔隙度、通气状况得到改善，碱性减弱、凋落物分解加快，农药化肥的残留以及牛粪的输入为细菌生命活动提供物质源泉[35]，有利于好氧喜酸细菌大量繁殖，从而导致细菌多样性较沼泽湿地高。另外，湿地退化导致植被类型呈现挺水植物—湿中生植物—旱生植物的演替格局[12]，地上凋落物、根系分泌物的增加直接为土壤细菌提供可利用的碳氮及其他养分，细菌多样性增加[13]。
干湿季节更替引起的降雨量和温湿度变化，可能影响土壤理化性质及酶活性变化，进而调控土壤细菌群落多样性的干湿季变化[36]。本研究中，沼泽湿地和沼泽化草甸土壤细菌的丰富度指数、艾斯指数湿季显著高于干季，而草甸则为干季显著高于湿季。原因可能是沼泽湿地和沼泽化草甸淹水较多导致通气透水性差，抑制了需氧细菌对有机质的降解[24]。但在湿季，由于温度升高，细菌酶活性增强，溶解氧降低[37]，刺激细菌大量繁殖，导致湿季细菌多样性高于干季。相较于沼泽湿地和沼泽化草甸，草甸土壤含水量低，通气透水性好，为需氧细菌提供良好的微氧环境[34]。特别是湿季放牧和旅游增加，土壤细菌多样性会因牲畜和游客践踏引起的土壤板结和理化性质变化，而导致细菌多样性湿季低于干季[38]。因此，干湿季节更替使得纳帕海不同退化阶段土壤细菌群落多样性存在差异。
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湿地退化过程中土壤水分状况变化，直接或间接导致土壤环境厌氧-需氧界面通气性、酸碱性和养分状况的改变，进而显著影响土壤细菌群落结构及多样性[39−40]。纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤含水量是影响干季土壤细菌群落结构和多样性变化的主要因子，由于沼泽湿地—沼泽化草甸—草甸演替过程中，土壤含水量减少，土壤质地疏松和溶解氧增加，有利于土壤养分分解，从而促进需氧菌的繁殖，细菌多样性增加。牛佳等[41]指出：水分是影响土壤细菌群落结构的主要因子，通过调节土壤酸碱度及养分分布格局，进而影响细菌群落结构组成。本研究中，土壤含水量与全氮、有机质、速效氮质量分数以及pH呈显著正相关，并随湿地退化而显著减少。pH高低决定整个湿地生态系统元素循环反应体系的酸碱度[42]，显著影响细菌群落组成。湿地退化过程中，土壤酸化使得土壤碳氮磷养分有效性发生改变[43]，从而影响土壤细菌群落分布格局。Mantel分析结果显示：pH同土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量显著促进酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门和疣微菌门相对丰度增加，而抑制变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度增加。原因是变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门属于固碳微生物，具有好氧喜弱碱特性[44]，湿地退化，碳氮质量分数降低不利于细菌生长繁殖。这与林春英等[7]在高寒沼泽湿地退化研究中得出的结论相似。
不同退化阶段土壤碳氮比增加对湿季细菌多样性增加起抑制作用。李杰[45]研究得出：碳氮比通过调节微生物分解进程进而调节土壤养分有效性，高碳氮比抑制土壤微生物活性从而缓解有机质分解，而低碳氮比加快微生物对有机质的分解、转化。本研究中，高原湿地退化过程中，土壤碳氮比降低，细菌可利用养分转化速率加快[46]，细菌多样性增加；但湿地退化引起的土壤有机质减少也会导致土壤细菌可利用碳源减少，使得绝大部分共养厌氧细菌相对丰度下降(厚壁菌门、变形菌门)。Mantel分析结果显示：土壤含水量及碳、氮质量分数减少，显著抑制厚壁菌门、绿弯菌门和梭菌属相对丰度的增加；磷促进变形菌门、拟杆菌门(尼龙菌属)和地杆菌属相对丰度的增加。原因是湿地退化，土壤碳氮质量分数及含水量减少，厌氧需养菌受到抑制[47]；同时，湿地退化引起的土壤酸化可刺激铁铝氧化物释放磷元素，进而促进喜磷细菌(变形菌门、拟杆菌门以及尼龙菌属和地杆菌属)大量繁殖。综上所述，湿地退化引起土壤养分状况、含水量及酸碱度改变，通过影响土壤细菌的养分需求和代谢过程，进而调控纳帕海高原湿地土壤细菌多样性。
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纳帕海高原湿地退化显著影响土壤理化环境的时空异质性，进而调控土壤细菌群落结构及多样性。湿地退化引起土壤有机质、氮质量分数以及水分、pH减小，导致酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门、疣微菌门相对丰度显著增加，绿弯菌门相对丰度显著减少及变形菌门、厚壁菌门(梭菌属)和拟杆菌门(尼龙菌属)干湿季差异，进而导致退化湿地土壤细菌多样性较沼泽湿地显著增加。因此，湿地退化导致土壤水分、酸碱度及土壤养分供给状况发生改变，从而显著影响土壤细菌群落结构及多样性。
Response of soil bacterial community to wetland degradation in the Napahai Plateau
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摘要:
目的 探明高原退化湿地土壤细菌群落结构及多样性的时空动态特征，为理解土壤微生物群落对高原湿地退化的响应过程及机制提供关键数据支撑。 方法 以纳帕海高原不同湿地退化阶段(沼泽湿地、沼泽化草甸、草甸)为研究对象，采用Illumina高通量测序技术，探测土壤细菌群落组成及多样性的干湿季变化规律。 结果 ①共检测到土壤细菌10门21属，其中变形菌门Proteobacteria和未分类菌属为优势门和属，相对丰度分别达35.92%和20.64%。②相较于原生沼泽湿地，沼泽化草甸的变形菌门和酸杆菌门Acidobacteria相对丰度分别增加14.06%和47.72%，绿弯菌门Chloroflexi相对丰度显著减少38.54% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌门、放线菌门Actinobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia和浮霉菌门Planctomycetes相对丰度分别增加了210.15%、231.37%、229.55%和315.22%。上述菌门相对丰度均为干季大于湿季。沼泽化草甸的厚壁菌门Firmicutes相对丰度在干季显著增加72.38%，在湿季显著减少73.17% (P＜0.05)；而拟杆菌门Bacteroidetes相对丰度在干季显著减少55.50%，在湿季显著增加223.54% (P＜0.05)。③沼泽化草甸和草甸的Shannon指数较原生沼泽湿地显著增加(P＜0.05)，且沼泽湿地和沼泽化草甸表现为湿季大于干季，草甸则表现为干季大于湿季。④Mantel分析结果表明：干季细菌群落结构组成由土壤pH和氮、磷、钾质量分数调控，湿季则由含水量、有机质、氮磷及pH调控；Pearson相关性分析结果表明：含水量、有机质、氮和pH是影响干季土壤细菌多样性的主控因子；湿季则为磷、钾和碳氮比。 结论 高原湿地退化导致土壤含水量和pH减小，进而影响土壤碳、氮、磷和钾养分状况，最终调控土壤细菌群落组成和多样性的干湿季变化。图4表4参47 Abstract:Objective This study aims to explore the spatiotemporal dynamic characteristics of soil bacterial structure and diversity in plateau degraded wetlands, so as to provide key data support for understanding the response process and mechanism of soil microbial communities to plateau wetland degradation. Method Illumina high-throughput sequencing technology was used to detect the dry and wet seasonal changes of soil bacterial community composition and diversity during different wetland degradation stages (swamp wetlands, swamp meadows, and meadows) in the Napahai Plateau. Result (1) A total of 10 phyla and 21 genus of soil bacteria were detected, dominated by Proteobacteria and unclassified genera, with relative abundance of 35.92% and 20.64%, respectively. (2) Compared with native swamp wetlands, the relative abundance of Proteobacteria and Acidobacteria in swamp meadows increased by 14.06% and 47.72%, respectively, while that of Chloroflexi significantly decreased by 38.54% (P＜ 0.05). The relative abundance of Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia and Planctomycetes in meadows increased by 210.15%, 231.37%, 229.55% and 315.22%, respectively. The relative abundance of above phyla was greater in the dry season than in the wet season. The relative abundance of Firmicutes in swamp meadows significantly increased by 72.38% in the dry season and decreased by 73.17% in the wet season (P＜ 0.05). The relative abundance of Bacteroidetes in meadows significantly decreased by 55.50% in the dry season and increased by 223.54% in the wet season (P＜0.05). (3) The Shannon index of swamp meadows and meadows significantly increased compared with native swamp wetlands (P＜0.05). The Shannon indices in swamp wetlands and marsh meadows were higher in the wet season than in the dry season, while those in meadows showed an opposite pattern. (4) Mantel test indicated that the composition of bacterial community structure in the dry season was regulated by soil pH and the concentrations of nitrogen, phosphorus and potassium, while in wet season it was mainly regulated by soil water content, organic matter, nitrogen, phosphorus and pH. The Pearson correlation analysis showed that the controlling factors affecting bacterial diversity in the dry season were soil water content, organic matter, nitrogen and pH, while those in the wet season were soil phosphorus and potassium and carbon nitrogen ratio. Conclusion The degradation of plateau wetlands leads to a decrease in soil moisture and pH, which in turn affects the nutrient status of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and potassium, ultimately regulating the dry and wet season changes in soil bacterial community composition and diversity. [Ch, 4 fig. 4 tab. 47 ref.] -
Key words:
- Napahai /
- wetland degradation /
- soil bacteria /
- community diversity /
- dry and wet seasons
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近年来，土壤污染问题已成为公众和学者关注的焦点。超过90%的由人类活动所产生的污染最终沉积到土壤中，不仅危害作物生长，还可能通过食物链对人类健康造成影响[1]。根据2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》，中国土壤污染超标率高达16.1%，其中无机污染物占比高达82.8%[1]，土壤中砷和铅污染尤为严重。2016年，《土壤污染防治行动计划》将砷列为重点防控污染物，而铅因其强致癌性也被重点关注[2]。粤北某无机化工厂重金属(铅、砷)复合污染场地[3]和广东省韶关市某化工厂[4−5]等地区的土壤总砷、总铅质量分数均超过了二类用地的筛管值(砷为140 mg·kg−1，铅为800 mg·kg−1)。土壤中砷和铅的积累不仅会改变土壤中微生物群落的结构和活性，导致土壤肥力下降，还会减少生物量[6]。
生物质炭作为一种有效的土壤修复剂和改良剂，在修复污染土壤、治理污染水体及农业固碳减排等多个领域得到了广泛应用[7−8]。生物质炭施用于土壤后，不仅能够改良土壤质量，促进植物生长，还能有效降低重金属的生物有效性[5]，优化土壤微生物群落结构[6]。研究发现：施用水稻Oryza sativa秸秆生物质炭能够显著提高土壤pH，进而降低土壤中铅的生物有效性[9]。生物质炭的添加不仅改变了土壤环境，还会直接或间接地影响微生物的代谢和微生物群落结构的多样性[10]。韩光明等[11]研究发现：生物质炭的施用可以显著增加菠菜Spinacia oleracea根际的微生物数量，其中好氧自生固氮菌和反硝化细菌的数量分别比对照组提高了4.9和1.8倍。这些微生物在土壤中扮演着关键的生态角色，有助于促进土壤养分循环和植物对养分的吸收。
然而，生物质炭在稳定土壤中砷和铅的作用机理存在差异。研究表明：生物质炭的施用能够提高土壤pH，进而降低镉、铅等阳离子型重金属的移动性和生物有效性，但土壤pH的升高也会增加—OH，可能导致砷酸根等阴离子活化，增加其生态毒性[12]。因此，为实现生物质炭对镉、铅的同步钝化，众多研究致力于通过功能化改性，如铁、锰等元素的负载，来提升原始生物质炭对土壤重金属复合物污染土壤的修复效果[13]。特别是作为土壤重要组成部分的锰元素及其氧化物，具有独特的表面化学性质，显著影响土壤对重金属的吸附(沉淀)作用。这些改性通过优化土壤理化特性，改变重金属及类金属元素在土壤中的淋溶、移动和转化过程[14]。锰氧化物在环境中也广泛存在，表面活性较强，对重金属有络合和氧化作用，具有一定的吸附固定重金属的能力，且具有较强的氧化能力，可以将砷(Ⅲ)氧化为较易被吸附的砷(Ⅴ)。负载锰氧化物的生物质炭表面的羟基、羧基和酚羟基等官能团数量显著增加，从而增强了对土壤中重金属的吸附和固定能力[15]。近年来，锰氧化物作为改性材料成为研究热点，尤其是锰氧化物与活性炭复合材料在修复重金属复合污染土壤方面已取得显著效果[16]。LIANG等[17]采用二氧化锰(MnO2)对猪粪生物质炭进行改性研究，发现改性生物质炭不仅能通过静电吸附作用钝化铅离子，还能通过含氧官能团与重金属离子形成稳定络合物将其固定。梁欣冉[18]的研究表明：与原始生物质炭相比，锰改性生物质炭在钝化土壤中的砷和铅方面具有更显著的效果。这归因于锰氧化物对砷离子的强大吸附能力，能有效地将重金属固定在锰改性生物质炭上[15]。
基于上述研究，推测锰改性生物质炭在修复砷铅污染土壤方面的效果可能超越原始生物质炭。施入土壤的锰改性生物质炭不仅能有效提升土壤质量，促进作物生长，还能有效限制砷、铅等重金属元素被作物吸收和积累。因此，本研究采用稻壳生物质炭和锰改性生物质炭作为土壤改良剂，选用大蒜Allium sativum作为指示植物，并以砷铅复合污染土壤为试验对象，探究施用原始生物质炭和锰改性生物质炭后，大蒜对土壤中砷、铅的吸收状况，同时研究生物质炭施用比例对土壤中砷、铅的生物有效性及土壤酶活性的影响，旨在为使用锰改性生物质炭修复砷铅复合污染的农田土壤提供理论依据和科学支持。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤取自浙江省绍兴市上虞区的一块农田(30º00′N，120º79′E)，紧邻废弃的铅锌矿。该区域位于亚热带，气候温和湿润，四季分明，无霜期长达8~9个月。年平均气温为17.0 ℃，年平均降水量为1 319.7 mm。采用多点取样法采集0~20 cm表层土壤，充分混合后在自然条件下风干。在实验室内，去除土样中肉眼可见的植物根系和碎石等，并过2 mm筛后备用。土壤中砷和铅质量分数分别为99.73和447.84 mg·kg−1，超过中国农用地土壤污染风险筛选值(总砷为30 mg·kg−1，总铅为100 mg·kg−1)。土壤pH为5.6，碱解氮为96.3 mg·kg−1，速效钾为107.0 mg·kg−1，有效磷为4.9 mg·kg−1，有机质为3.9 g·kg−1。
供试植物为大蒜小瓣种，种子来源于杭州种业集团有限公司。原始生物质炭制备：供试原材料稻壳购自山东省栖霞泰宇生物工程有限公司。干燥的稻壳在650 ℃下进行2 h恒温缺氧热解处理(使用浙江宜可欧环保科技有限公司的ECO-8-10型小型炭化设备)，制得原始生物质炭(RB)。随后，该生物质炭被研磨过2 mm筛以备用。
锰改性生物质炭制备：基于现有文献[13−18]的方法进行改进和优化。将过筛后的原始生物质炭与0.2 mol·L−1高锰酸钾溶液按炭锰质量比为1∶10混合，搅拌0.5 h以确保均匀混合。在16 ℃、40%超声功率下震荡1 h，使混合物进一步均匀，静置12 h。滤出生物质炭，在70 ℃下烘干至恒量，制得锰改性生物质炭(MB)。在此基础上，对改性过程进行细微调整和优化，以提高效果和适应性。
1.2 实验设计
称取3 kg过筛土装进塑料盆中(直径为23.5 cm，高为14.0 cm)，以不添加生物质炭的土壤为对照(ck)。此外，设置4个生物质炭处理，分别加入10和30 g·kg−1的原始生物质炭(RB1、RB3)及锰改性生物质炭(MB1、MB3)，共计5个处理：ck、10 g·kg−1RB、30 g·kg−1RB、10 g·kg−1MB和30 g·kg−1MB。每个处理设置4个重复。为降低外界环境对实验的影响，所有盆随机排列，并每周按顺时针方向调换位置1次。初次浇水至田间持水量的70%，基肥采用尿素和磷酸二氢钾(施肥量参照当地农业生产标准)。根据大蒜生长需求，氮(N)、 五氧化二磷(P2O5)、氧化钾(K2O)的施用量分别为0.259、0.329和0.200 g·kg−1，以颗粒状施入盆栽并与土壤充分混合[1]。施肥后静置3 d，在每盆中均匀播种7~8颗大蒜种子，发芽7 d后进行间苗，每盆保留5株生长状况相同的植株。实验期间定期浇水、松土及防治病虫害，隔3 d记录1次植株的生长情况。为了研究大蒜各个器官对砷、铅的吸收情况，在大蒜成熟后，分别收集生长60 d后的第1茬大蒜地上部分，以及再次生长60 d后的第2茬大蒜地上部分和地下部分样品。同时，采集根系附近1~2 cm的根际土壤(鲜样)用于测定土壤酶活性；其他土壤样品经风干后过10目筛备测。对于收集的大蒜地上部分和地下部分样品分别记录鲜质量后，用自来水和去离子水清洗干净，先在105 ℃烘箱内杀青30 min，再在65 ℃下烘干至恒量。记录干质量后，将植物样品研磨备测。
1.3 土壤理化性质测定
供试土壤理化性质参照《土壤农业化学分析方法》[19]测定。土壤pH采用FE20型酸度计测定(土水质量比为1.0∶2.5)。土壤有机碳质量分数采用重铬酸钾外加热法测定。土壤有效磷质量分数采用盐酸-氟化铵(HCl-NH4F)法提取，分光光度计(UVA132122)测定。碱解氮质量分数采用碱解氮扩散法测定。速效钾质量分数采用乙酸铵-火焰分光光度计(FP6431)法测定。土壤阳离子交换量经三氯化六氨合钴浸提后，采用同一分光光度计进行比色测定。土壤有效态砷和有效态铅分别经0.5 mol·L−1磷酸二氢铵(NH4H2PO4)法和0.004 mol·L−1二乙烯三胺五乙酸(DTPA)法浸提，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定质量分数。土壤全砷和全铅先采用硝酸-氢氟酸-高氯酸消解法，再用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定。
1.4 生物质炭性质测定
生物质炭pH使用FE20型酸度计测定(炭水质量体积比为1∶20)。生物质炭中的灰分百分比根据ASTM D 1726—84《炭化学分析标准试验方法》测定。比表面积在77 K氮气环境下采用比表面积分析仪(TristarⅡ3020)测定。主要元素组成则采用元素分析仪(Flash EA1112)测定。生物质炭的表面形貌特征采用扫描电镜(SU-8010)分析。表面官能团采用傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS10)测定。生物质炭的矿质元素组成利用X射线能量色谱仪(pK-Alpha+)测定。
1.5 土壤酶活性测定
土壤酶活性采用微孔板荧光法进行分析。该方法基于底物和酶的水解反应释放4-甲基伞形酮酰，进行荧光检测[20]。具体参考包建平等[21]的方法：首先，称取2 g新鲜土样放入50 mL离心管中，加入30 mL pH为5的醋酸钠溶液。随后，在25 ℃下以180 r·min−1振荡30 min，之后用70 mL的醋酸钠溶液(pH为5)多次洗涤并转移到烧杯中，用磁力搅拌器制备成土壤悬浊液。随后，取200 μL土壤悬浊液放入96孔微孔板中，并加入50 μL的反应底物。将微孔板放入25 ℃培养箱中避光孵育3 h后，加入15 μL 0.5 mol·L−1氢氧化钠并终止反应。使用多功能酶标仪(SynergyTM H1)在365 nm的荧光激发光和450 nm的检测光波长下测定反应液的荧光值，从而测得土壤中的β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性。
1.6 大蒜样品检测
大蒜样品的分析测定依据《土壤农业化学分析方法》[19]进行。将研磨的大蒜样品使用硫酸-双氧水法消解；大蒜样品中的碱解氮、有效磷和速效钾质量分数分别采用奈氏比色法、钼锑抗比色法和火焰光度计法测定。大蒜样品中的砷和铅质量分数通过硫酸-双氧水消解法提取，并使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定。
1.7 数据分析
采用SPSS 26对试验数据进行处理和分析。不同处理间的数据差异显著性通过单因素方差分析和Duncan多重比较分析(P＜0.05)，使用Origin Pro 2021作图。
2. 结果与讨论
2.1 生物质炭的基本理化特性
锰改性生物质炭的pH和灰分百分比高于原始生物质炭(表1)，这主要是引入锰氧化物的结果。另外，灰分百分比的增加与pH升高有密切联系[16]。锰改性过程中，锰氧化物在生物质炭表面形成均匀的覆盖层。尽管大部分的中、微孔隙被锰氧化物填充，部分孔隙被转化为较大的孔隙，导致比表面积降低，但是平均孔径显著增加。这不仅增强了对锰氧化物的负载，也提升了生物质炭表面的吸附和氧化特性[15]。扫描电镜图像(图1A)显示：原始生物质炭表面为管状结构，孔隙丰富；而锰改性生物质炭表面更为粗糙和疏松，明显可见锰氧化物颗粒的附着[22]。锰改性增加了生物质炭表面新的氧化还原活性位点，提升了其电子传递能力和催化性能；同时，也形成了新的化学键和结构，加强了其稳定性[22]。傅里叶红外光谱图(图1B)揭示，原始生物质炭在3 739、1 649、1 398、1 083、790和565 cm−1处有明显峰值，而锰改性后在3 400 cm−1附近的峰通常是水分子中的—OH伸缩振动[23]，1 094 cm−1处的峰值则指示C—O伸缩振动，表明生物质炭中的羰基、芳环结构和碱性基团增多。549和560 cm−1处的峰值分别对应氧化锰(MnO)和氧化亚铁(FeO)的振动峰[24]，表明锰已成功负载至生物质炭。X射线能谱分析(图1C~D)显示：碳元素下降，氧和锰元素上升。
表 1 供试生物质炭的基本理化性质Table 1 Physicochemical properties of the biochars生物质炭 pH 灰分/% 比表面积/(m2·g−1) 孔径/nm 原始生物质炭 10.8 37.1 68.1 24.7 锰改性生物质炭 11.2 39.5 46.8 120.8 
图 1 改性前后生物质炭的扫描电镜图(A)、傅里叶红外光谱图(B)以及原始生物质炭X射线能谱分析图(C)和锰改性生物质炭X射线能谱分析图(D)Figure 1 Scanning electron microscopy images (A), Fourier transform infrared spectroscopy spectra (B), X-ray energy spectrum analysis diagrams of the original biochar (C), and manganese-modified biochar (D)2.2 生物质炭对土壤理化特性及养分质量分数的影响
土壤pH作为一项重要的理化性质，不仅影响土壤中养分的有效性和结构，还是影响重金属形态变化的关键因素。根据图2A的数据，除了RB1和MB1处理外，其余施炭处理均使土壤pH相比对照显著提高(P＜0.05)。尤其在MB3处理下，土壤pH较对照提高了8.9%，显示出30 g·kg−1施炭处理的pH高于10 g·kg−1施炭处理。由于生物质炭本身呈碱性，改性后其表面吸附了大量阳离子，能够与土壤中的H+进行交换[25]，从而提高土壤pH，降低酸度。刘玉学等[26]通过田间试验发现：高剂量的稻草炭和竹炭显著提高土壤pH，而低剂量添加的效果与本研究结果不符。添加RB3处理比对照提高了阳离子交换量，而锰改性生物质炭处理则降低了阳离子交换量(图2B)。这可能是因为原始生物质炭表面有更丰富的含氧官能团，提升了其阳离子交换能力[27]，而经锰改性后的生物质炭可能与土壤中的阳离子(如钙离子、镁离子、钾离子等)竞争吸附，从而降低阳离子交换量。添加生物质炭后，土壤中的有效磷质量分数均显著高于对照(P＜0.05)，特别是MB1处理的有效磷质量分数最高(提升了46.7%，图2C)。在所有处理下，土壤有机质质量分数随生物质炭添加量的增加而增加，与高凤等[28]的研究结果相符。锰改性处理生物质炭导致土壤有机质质量分数低于原始生物质炭处理(图2D)。除了RB1处理外，其他3个施炭处理与对照相比均显著降低了土壤中的碱解氮质量分数(P＜0.05，图2E)。这可能是因为生物质炭增加了土壤中的有机质质量分数，导致土壤碳氮比上升，从而降低了土壤中的有效氮质量分数[29]。与对照相比，所有施炭处理均显著提高了土壤中速效钾质量分数(P＜0.05)，其中RB1和MB1处理分别使土壤速效钾质量分数比对照提高了64.3%和94.3%，而RB3和MB3处理的提升率分别为143.5%和178.7%(图2F)。这是由于锰改性后生物质炭中钾元素质量分数增加，易于释放并溶解于土壤水溶液中，进而增加了土壤速效钾质量分数[30]。
图 2 生物质炭对土壤理化特性及养分质量分数的影响Figure 2 Effect of biomass charcoal on the physical and chemical characteristics of the soil and the quality fraction of the nutrients2.3 生物质炭对土壤中有效态砷和DTPA可提取态铅的影响
图3A显示：相较于对照，MB1处理显著降低了土壤中有效态砷质量分数，减少了11.5%，而其他施炭处理对有效态砷质量分数没有显著影响。MB处理减少了有效态砷，这可能是因为锰改性后的生物质炭改变了土壤表面电荷，增强了对含氧砷离子的吸附，从而减少了砷的有效性和移动性[15, 22]。此外，二氧化锰颗粒的强氧化性能将土壤中的砷(Ⅲ)转化为毒性更低、更易固定的砷(Ⅴ)，加之锰改性生物质炭本身较强的吸附能力，进一步降低了土壤中有效态砷质量分数[18]。除RB1处理外，其他施炭处理均显著降低了土壤中DTPA可提取态铅的质量分数(P＜0.05)，尤其是MB3处理最为显著，比对照降低了28.3% (图3B)。土壤pH与土壤有效态砷变化呈正相关关系，但未达显著水平(图4)，MB1处理虽然降低了有效态砷，但MB3未达显著水平，这可能因为土壤pH的上升导致砷酸根的溶出，增加了土壤中砷的活性和生态风险[31]。与RB相比，MB更显著提高了土壤pH，增加了土壤颗粒表面的负电荷，进而减弱与砷阴离子(AsO4 3−和AsO3 3−)的静电作用，提高了砷的移动性和生物有效性[31]。聂天宏[32]的研究表明：土壤pH的升高增加了土壤表面的活性电位，增强了对铅的吸附和钝化。土壤pH的上升还促进了OH−与铅形成难溶的重金属沉淀[33]。此外，施用MB后土壤中有效磷质量分数升高，铅与磷酸根形成难溶性磷酸盐[34]。总体而言，相比RB，MB更有效地降低了土壤中铅的活性。MB丰富的孔隙结构为表面或界面反应提供了丰富的活性位点[22]，有助于吸附土壤中的铅，从而降低土壤溶液中DTPA可提取态铅的质量分数。
图 3 生物质炭对土壤有效态砷和DTPA可提取态铅的影响Figure 3 Effect of biochars on concentrations of the soil available arsenic and DTPA-extractable lead
图 4 土壤理化性质、酶活性和有效态砷、DTPA可提取态铅得相关性分析Figure 4 Correlation analysis of soil physicochemical properties, enzyme activities, and available arsenic and DTPA-extractable lead2.4 生物质炭对土壤酶活性的影响
由图5可知：除RB1处理外，RB3、MB1、MB3处理相较于对照显著提升了β-葡萄糖甘酶(分别提高17.3%、21.7%和37.7%)和酸性磷酸酶(分别提高了14.4%、8.0%和9.8%)的活性(P＜0.05，图5A~B)。同时，施用MB显著增强了β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶的活性(P＜0.05，图5C)。在RB3和MB1处理下，土壤中β-木聚糖苷酶的活性分别显著提高了18.5%和6.4% (P＜0.05，图5D)。总体而言，MB提高了各类酶的活性，从大到小依次为β-葡萄糖甘酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶、酸性磷酸酶、β-木聚糖苷酶活性。土壤酶活性是衡量土壤微生物活性的重要指标，反映了土壤中物质代谢的活跃程度[27]。β-葡萄糖甘酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶和β-木聚糖苷酶作为水解酶，在土壤的碳氮循环中扮演关键角色，催化糖类和蛋白质的分解[35]。β-葡萄糖苷酶主要参与土壤纤维素的降解和碳循环过程，与土壤有机质质量分数呈正相关[36−37]。本研究中，4种施炭处理均增加了土壤有机质质量分数，并伴随着β-葡萄糖苷酶活性的显著提升。郑慧芳等[38]的研究表明：生物质炭施用量的增加可以显著提升土壤β-葡萄糖苷酶活性，促进土壤生物化学反应，加快养分循环，从而提高土壤养分的可利用性。酸性磷酸酶主要参与土壤有机磷的矿化，影响土壤有机磷的分解转化及其生物有效性[39]。与对照相比，MB1和MB3处理分别使酸性磷酸酶活性提高了7.4%和9.8%，表明不同比例和类型的生物质炭对土壤酶活性的影响不同。总体而言，RB1施用量下土壤酶活性降低，而其他处理则显示土壤酶活性升高。这是由于RB1处理下的土壤有机质、速效磷质量分数和pH相对较低(图2)，直接影响了土壤酶的活性。相关分析表明：土壤有机质、速效磷质量分数和pH与酶活性呈正相关关系(图4)。然而，RB1处理下的土壤有机质、速效磷质量分数和pH与对照相比有所提高，但土壤酶活性却有所降低，具体机理还需进一步探讨。β-葡萄糖苷酶活性与土壤有机质质量分数正相关，而酸性磷酸酶主要参与土壤有机磷的矿化过程，其活性直接关联土壤有机磷的分解和转化。同时，β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶和β-木聚糖苷酶的活性也受土壤pH的影响。由于这些因素的共同作用，在RB1处理下，土壤酶活性降低。与对照相比，在其他处理中，由于土壤有机质、速效磷质量分数和pH相对较高，土壤酶活性表现出上升趋势。
2.5 生物质炭对大蒜生物量、养分及重金属质量分数的影响
图6显示：与对照相比，在4种施炭处理下，大蒜地上部分生物量均显著增加，锰改性生物质炭处理下的地下部分生物量均显著增加(P＜0.05)。尤其在MB3处理下，大蒜地上部分和地下部分生物量的增加最为显著，地上部分增加了25.8%。对于地下部分，与对照相比，MB处理使大蒜的生物量显著提高，其中MB1和MB3处理下的大蒜生物量分别增加了21.6%和37.2% (P＜0.05)。这是由于MB对土壤中重金属(如砷和铅)的钝化作用降低了它们对土壤和植物的毒害效应。此外，生物质炭(特别是MB)富含中微量元素(铁、锰、锌等，图1)，施用后显著提高了土壤中磷、钾等养分的有效性，直接提升了土壤肥力，促进了植物对这些养分的吸收，进而促进了作物的生长。MB的施用还提高了土壤pH和有机质质量分数，进一步促进了大蒜的生长。谭笑[40]的研究表明：在MB处理下，水稻的地下部分和地上部分鲜质量以及千粒重均有所增加。李双建等[41]的研究也发现：在减少施肥量的同时施用生物质炭，并不会降低大蒜产量。相反，生物质炭的施用能够降低土壤容重，提高土壤孔隙度，为作物根系提供更大的生长空间，从而增强其生理功能，最终提高作物产量。这些结果进一步说明了生物质炭在提高作物生产力方面的作用。
本研究将大蒜划分为3个部分：生长60 d收获的第1茬大蒜叶片、生长120 d的第2茬大蒜叶片以及持续120 d生长的大蒜根系。由图6可知：第2茬大蒜叶片中的全氮质量分数是根系的近2倍，且第1茬大蒜叶片的全氮质量分数高于第2茬。与对照相比，施加MB处理使第1茬大蒜叶片的全氮质量分数较高，特别是在MB3处理下，提高了8.1% (图7A)。第2茬大蒜叶片的全氮质量分数有所下降。WOLDETSADIK等[42]的研究发现：施用不同量的生物质炭会显著减少第1个生长季中生菜Lactuca sativa var. ramosa叶片的全氮质量分数，但第2个生长季的全氮质量分数。这可能是因为生物质炭的强吸附能力导致土壤中铵离子(NH4+)的降低，从而限制了作物对氮素的吸收[43]。此外，4种施炭处理均显著提高了大蒜中的全钾质量分数(P＜0.05)，且叶片中的钾整体高于根系。另外，第2茬大蒜中的全钾质量分数高于第1茬(图7B)。这一方面是因为生物质炭本身含有钾元素，施用后可以直接提高土壤中速效钾；另一方面，MB的吸附能力增强，施用后能有效降低土壤中钾的淋溶损失，提升土壤中可交换性钾质量分数[44]，进而促进地上部分对土壤中钾的吸收。同时，4种施炭处理都提高了大蒜叶片的全磷质量分数，而根系全磷量则有所降低(图7C)。生物质炭的施用提高了土壤pH和阳离子交换量，同时提高了土壤中磷素有效性[45]。根系对磷元素的吸收过程受到土壤元素生物有效性的控制，以及土壤-溶液-根界面元素迁移扩散速率和根系吸收不同离子时的离子竞争作用等多种因素的影响[45]。生物质炭丰富的孔隙结构能吸附和固持土壤中的养分，从而提高养分利用效率[46]，促进植物养分吸收。MB的添加提高了土壤有效磷质量分数。有效磷以PO4 3−离子形式存在，容易形成难溶性的磷酸盐[34]，并且需要经过土壤微生物的长时间分解和转化才能被植物吸收利用，因此，在较短时间内种植的大蒜根系中的含磷量有所降低。
图 7 生物质炭对不同生长期大蒜根系和叶片全氮、全磷和全钾质量分数的影响Figure 7 Effect of biochar on the total nitrogen, total phosphorus, and total potassium contents of the garlic roots and leaves at different growth stages与对照相比，4种施炭处理显著降低了大蒜叶片和根系中的砷质量分数(P＜0.05)。施用RB对2茬大蒜叶片中砷质量分数的影响不显著，但施用MB后，第2茬大蒜叶片中的砷质量分数显著低于第1茬(图8A)。同时，与对照相比，MB1和MB3处理使大蒜根系中的铅质量分数分别降低了23.8%和32.1%。在不同生物质炭处理下，第2茬大蒜叶片中的铅质量分数显著低于第1茬，且大蒜根系中砷和铅质量分数普遍高于叶片部分。在RB3处理下，大蒜根系中的铅质量分数高于其他处理，这可能是因为提高生物质炭的投加量反而降低了其吸附量(图8B)。陈志良等[47]的研究显示：当生物质炭的投加量从1 g·L−1增加到50 g·L−1的时，其对Cu(Ⅱ)的吸附量从11.0 mg·g−1降低到1.18 mg·g−1。这可能是由于高质量分数的生物质炭颗粒形成微小的团聚体，从而减少了有效吸附面积。与RB相比，施用MB更有效地降低了大蒜植株中砷和铅质量分数，且根系中的砷和铅质量分数显著高于叶片部分。此外，随着施炭量增加，大蒜中的砷和铅质量分数呈降低趋势(图8)。CARBONELL-BARRCHINA等[48]的研究发现：土壤中砷铅等重金属过高会对植物产生生理毒害，植物会启动自我保护机制，将这些重金属固定在根系中以阻碍其向地上部分的迁移。研究表明：生物质炭能够通过吸附固定土壤中的重金属，减少土壤中重金属的可交换态比例，从而修复土壤，减少植物对重金属的吸收[49]。董盼盼等[50]的研究发现：添加生物质炭能够加强芦苇Phragmites australis对重金属铅的固定作用。富含羟基基团的锰氧化物通过络合、沉淀等多种机制，实现对砷、镉和铅的同步钝化[51]。然而，本研究中，RB处理下第2茬大蒜叶片中的砷质量分数高于第1茬，而MB处理的结果相反。这表明随着时间的增加，MB表面附着的锰氧化物颗粒变得更加稳定，对砷离子的吸附也更为强烈，从而更有效地固定土壤中的砷，使得植物中砷质量分数降低。此外，改性过程中的2次热解作用使得锰改性生物质炭具有更高的芳化程度和更多潜在的活性吸附位点，从而提高了对砷和铅等元素的固定效果。董双快等[52]研究发现：铁锰改性生物质炭对小白菜Brassica rapa var. glabra可食部分和根系吸收砷的抑制作用较强，添加改性生物质炭能够抑制小白菜根对土壤中砷的富集，且在土壤中，高锰酸钾与砷发生的氧化还原反应能生成难溶的化合物，从而也减少了植物对砷的吸收。本研究虽然使用了2种生物质炭和2种施用比例，但大蒜中的的砷和铅质量分数仍未达到食用安全水平，这可能是由于施用比例或环境因素等的影响，具体原因还需进一步探索。
图 8 生物质炭对大蒜根系、叶片砷和铅质量分数的影响Figure 8 Effect of biochars on arsenic and lead contents in the garlic roots and shoots3. 结论
MB处理比RB处理提高土壤pH的作用更明显，更有效地提高了土壤有机质和速效养分质量分数。特别是在MB3处理下，提高土壤有效磷、速效钾质量分数和pH的作用最为显著。此外，MB处理显著增加了大蒜的地上和地下部分生物量，尤其在MB3处理下，生物量分别提升了25.8%和37.2%。大蒜叶片氮质量分数也在MB3处理下显著提高了8.1%，其他处理对大蒜叶片磷质量分数的影响不明显。所有施炭处理都显著提高了大蒜中的钾质量分数。MB3处理下，土壤中DTPA可提取态铅质量分数降低了28.3%，表明MB处理对土壤有效铅的降低效果更为显著。MB1处理下，土壤中有效态砷质量分数降低了11.5%。这揭示了生物质炭具有吸附和固定重金属的强大潜力。MB处理有效提高了土壤酶活性，减少了大蒜中砷和铅的积累。相比对照，MB3和RB3处理分别使β-葡萄糖甘酶和酸性磷酸酶活性提高了37.7%、17.3%和9.8%、14.4%。在MB1和MB3处理下，大蒜根系中铅质量分数分别降低了23.8%和32.1%，且施用生物质炭显著降低了第2茬大蒜叶片中砷的质量分数。总体而言，锰改性生物质炭在修复砷铅复合污染土壤方面的表现优于原始生物质炭，在降低铅质量分数方面效果更显著，但对砷的影响效果仍有待进一步探讨。锰改性生物质炭在重金属污染土壤修复中的应用前景仍需在实际生产中不断验证，同时需解决锰改性生物质炭的成本高，造成环境二次污染和回收利用等问题。
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图 1 不同退化阶段土壤细菌门干季(A)、湿季(B)相对丰度
Figure 1 Composition of dry (A) and wet (B) season bacteria phylum in soil at different degradation stages
图 2 不同退化阶段土壤细菌属干、湿季群落组成
Figure 2 Composition of dry and wet season bacteria phylum in soil at different degradation stages
图 3 干季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 3 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in dry season
图 4 湿季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 4 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in wet season
表 1 样地基本信息
Table 1. Basic information of the sampling sites
湿地类型 经度(N) 纬度(E) 积水深度/cm 优势植物 沼泽湿地(SW) 27°50′43.46″ 99°39′07.86″ 8.5~23.0 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Myripophyllum spicatum、篦齿眼子菜
Potamogeton pectinatus沼泽化草甸(SM) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −19.3~5.5 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅薹草
Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis草甸(M) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −154.0~−123.0 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae 
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表 2 不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数
Table 2. Diversity index of soil bacterial community at different degradation stages
湿地
类型季节 丰富度
指数香农
指数艾斯
指数Chao1
指数辛普森
指数沼泽
湿地干季 4056 Bc 6.16 Ab 5668.94 Bb 5368.14 Bb 0.0135 Aa 湿季 4201 Ac 6.20 Ac 6095.66 Ac 5789.86 Ac 0.0118 Aa 沼泽化
草甸干季 5352 Bb 6.68 Aa 7046.88 Ba 6631.88 Ba 0.0061 Ab 湿季 5697 Aa 7.14 Aa 8095.30 Aa 8121.55 Aa 0.0049 Ab 草甸 干季 5451 Aa 6.83 Aa 7059.57 Aa 6655.28 Aa 0.0041 Bc 湿季 4915 Bb 6.27 Bb 6673.81 Bb 6398.10 Ab 0.0130 Aa 说明：表中数据为平均值。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。
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表 3 不同退化阶段土壤理化性质
Table 3. Soil physical and chemical characteristics at different degradation stages
湿地类型 干湿季 含水量/% 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 沼泽湿地 干季 106.15±0.47 Ba 138.20±4.29 Aa 9.22±0.20 Ba 0.64±0.01 Ac 10.76±0.36 Ab 湿季 117.15±0.60 Aa 144.40±2.52 Aa 11.98±0.29 Aa 0.57±0.01 Aa 9.13±0.20 Ab 沼泽化草甸 干季 23.60±1.52 Bb 81.31±1.45 Bb 4.93±0.31 Ab 0.94±0.02 Aa 11.77±0.29 Aa 湿季 79.31±0.91 Ab 108.28±1.37 Ab 5.83±0.31 Ab 0.56±0.02 Ba 7.82±0.15 Bc 草甸 干季 20.24±1.04 Bb 48.63±6.60 Bc 1.17±0.04 Bc 0.73±0.01 Ab 7.38±0.18 Ac 湿季 25.41±0.50 Ac 54.89±2.13 Ac 3.52±0.05 Ac 0.37±0.02 Bb 13.83±0.13 Aa 湿地类型 干湿季 碳氮比 pH 速效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 沼泽湿地 干季 8.75±0.37 Bb 7.92±0.01 Aa 627.75±2.29 Aa 6.78±0.16 Ab 176.76±0.93 Bb 湿季 14.59±0.55 Aa 7.87±0.02 Aa 494.61±7.02 Ba 7.15±0.20 Ab 297.36±9.03 Ab 沼泽化草甸 干季 9.81±0.47 Ab 6.97±0.04 Bb 414.85±1.37 Bb 7.82±0.14 Ba 225.16±1.29 Ba 湿季 5.27±0.13 Bc 7.82±0.11 Aa 458.39±3.36 Ab 11.88±1.21 Aa 620.46±4.70 Aa 草甸 干季 24.22±3.30 Aa 5.92±0.12 Ac 308.92±1.36 Ac 3.87±0.14 Bc 104.35±1.44 Ac 湿季 9.05±0.35 Bb 5.65±0.08 Ab 300.84±3.44 Ac 4.75±0.05 Ac 149.04±8.64 Ac 说明：表中数据为平均值±标准误。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。
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表 4 土壤主要理化因子与细菌群落多样性的相关性分析
Table 4. Correlation analysis between main soil physical and chemical factors and bacterial community diversity
项目 干季 湿季 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 含水量 −0.99** −0.92** −0.99** −0.99** 0.98** − − − − − 有机质 −0.87** −0.89** −0.85** −0.85** 0.93** − − − − − 全氮 −0.91** −0.90** −0.89** −0.89** 0.96** −0.67* − − − − 全磷 − − 0.71* 0.70* − − − − − − 全钾 − − − − − 0.72* 0.88** 0.83** 0.85** −0.84** 碳氮比 − − − − −0.70* −0.96** −0.79* −0.91** −0.90** − pH −0.86** −0.83** −0.83** −0.83** 0.91** − − − − − 速效氮 −0.96** −0.93** −0.95** −0.94** 0.99** − − − − − 速效磷 − − − − − − 0.88** 0.79* 0.81** −0.90** 速效钾 − − − − − 0.68* 0.91** 0.82** 0.84** −0.91** 说明：*表示显著相关(P＜0. 05)；**表示极显著相关(P＜0. 01)；−表示不相关(P＞0.05)。
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