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湿地是地球上物种最丰富、生产力最高、生态系统服务功能最强的生态系统，被誉为“地球之肾”，在维持物种多样性、净化水质、调节生态系统平衡等方面发挥重要作用[1−2]。近年来，全球变化及人为干扰导致湿地大面积退化[3]，引起湿地结构、功能及生态过程的一系列变化，并影响土壤质地、结构、养分状况、酸碱性及溶氧量，最终对土壤微生物群落组成、结构及多样性产生一系列的调控作用[4]。
细菌作为湿地生态系统中的重要组成部分，主要参与土壤形成、凋落物分解、养分供应及生态系统养分循环[5]，能够作为土壤生态系统变化的预警指标[6]，对湿地生态系统结构及功能的维持与稳定起着不容忽视的作用。前人研究表明：高寒湿地和鄱阳湖湿地退化，导致土壤蓄水保肥能力降低、养分流失、碳氮转化速率减慢，显著抑制土壤细菌群落多样性[7−8]。但也有一些研究表明：人为干扰引起湿地排干、水分流失、土壤酸化及土壤养分供给改变，能够导致湿地土壤细菌多样性增加[9−10]。另外，三江平原湿地退化引起的土壤酸碱度及含水量变化仅影响土壤细菌群落组成，而对细菌多样性无显著影响[11]。可见，土壤细菌群落对湿地土壤理化性质变化的响应，存在不确定性。这种不确定性可能与全球变化、区域气候、湿地类型及人为活动干扰密切相关。因此，探明“不同退化阶段—土壤理化环境—细菌群落结构和多样性”之间的耦合关系，对于理解全球气候变化和人为干扰引起的湿地退化对土壤细菌群落的影响机制，具有十分重要的科学意义。
纳帕海高原湿地地处青藏高原香格里拉县内，其特殊的闭合—半闭合地形孕育着丰富的生物多样性，是全球生物多样性保护的重点区域[12]。近20多年来，在喀斯特作用和人为干扰的叠加影响下，该区湖水外泄，湖面面积大幅度减小，沼泽湿地逐渐旱化为沼泽化草甸和草甸，导致湿地水文和理化环境发生改变，进而影响土壤细菌群落结构及多样性[13]。本研究选取纳帕海不同退化阶段高原湿地类型(沼泽湿地、沼泽化草甸和草甸)为研究对象，运用Illumina高通量测序技术，揭示不同退化阶段湿地的土壤细菌群落结构及多样性干湿季变化特征，并分析细菌群落结构及多样性与土壤理化性质变化之间的关系，从而阐明土壤细菌群落对纳帕海高原湿地退化过程的响应规律，以期为理解人为干扰及全球气候变化加剧背景下高原退化湿地的土壤微生物多样性保育提供关键数据支撑。
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纳帕海湿地(27°49′~27°55′N，99°37′~99°43′E)地处滇西北横断山区香格里拉县，面积为3100 hm2，海拔为3260 m[12]，是中国典型的高原季节性湿地，属于冷凉湿润的高原气候[14]。该区域年平均气温为5.4 ℃，最热月平均气温为13.2 ℃，最冷月平均气温为−3.8 ℃；干湿季节分明，雨季(5—10月)降雨量高达495.9 mm；干季(11月至翌年4月)降雨量仅占全年的20%[13]。在人为和自然因素的共同作用下，沼泽湿地(常年淹水)逐步向沼泽化草甸(季节性淹水)和草甸(无积水)退化。
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于2015年1月(干季)和8月(湿季)，在每种退化湿地样带中分别随机布设3个10 m×10 m样地(表1)，每个样地内按对角线法布设5个采样点(4个顶角和1个中心)，分别采集各点样品并混合为1个土样，共采集18份土壤样品。去除各样点地表2 cm厚的覆盖物，然后用土钻钻取0~20 cm土层土样，去除石砾、残根后混合，并用四分法取适量土壤装入无菌自封袋，贴好标签装入便携式冰箱尽快带回实验室(沼泽湿地常年淹水，用特质采样器采样[15])。将带回的土样约100 g用于测定土壤自然含水率，约1 kg经自然风干、磨细过100目和10目筛后用于测定土壤基本性质，约200 g于−70 ℃下冷冻保存，用于土壤DNA提取和细菌高通量测序。
表 1 样地基本信息
Table 1. Basic information of the sampling sites
湿地类型 经度(N) 纬度(E) 积水深度/cm 优势植物 沼泽湿地(SW) 27°50′43.46″ 99°39′07.86″ 8.5~23.0 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Myripophyllum spicatum、篦齿眼子菜
Potamogeton pectinatus沼泽化草甸(SM) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −19.3~5.5 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅薹草
Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis草甸(M) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −154.0~−123.0 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae -
土壤理化性质测定参照鲍士旦[16]方法，其中：土壤自然含水率采用烘干法；pH采用电位法(水土比为1.0∶2.5)；有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法；全氮采用硫酸-高氯酸消化开氏定氮法；全磷采用硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法；全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法；速效氮采用碱解扩散吸收法；速效磷采用0.030 mol·L−1氟化铵-0.025 mol·L−1盐酸浸提钼蓝比色法；速效钾采用1.000 mol·L−1中性醋酸铵浸提火焰光度法。
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用Soil DNA KIT试剂盒提取土壤总DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。每份混合土样各提取3个DNA，充分混合后送往上海生工生物有限公司完成细菌高通量测序。利用引物341F[CCCTACA2CGACGCTCTTCCGATTG(barcode)CCTACGGGGGAG]和805R[GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTATATC]对细菌V3~V4区进行扩增，扩增过程分2轮。第1轮：10×PCR缓冲液5.0 μL，10 mmol·L−1dNTPs 0.5 μL，DNA模板10 ng，上游、下游引物各0.5 μL，Plantium Taq (5×16.67 mkat·L−1) 0.5 μL；扩增条件为：94 ℃预变性3 min，5个循环(94 ℃变性30 s、45 ℃退火20 s、65 ℃延伸30 s)，20个循环(94 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。第2轮：DNA模板为20 ng，其他反应体系与第1轮一致；扩增条件为：95 ℃预变性30 s，5个循环(95 ℃变性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR扩增结束后，将纯化质检合格的扩增产物按1∶1等量混合，利用Miseq台式测序仪2×300 bp双端测序(paired-end)[13]。
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实验数据用Excel 2007整理。数据分析前用SPSS 26进行正态分析和方差齐性检验(P＜0.05)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各样地变量之间的差异显著性，成对样本t检验比较干湿季之间的差异显著性。利用Mothur软件将相似性大于97%的序列归为同一种可操作分类单元(OTU)，并计算Alpha多样性指数：丰富度指数(Richness)、香农指数 (Shannon)、艾斯指数(ACE)、赵氏指数(Chao1)、辛普森指数(Simpson)[13]。以理化因子为环境变量，细菌群落相对丰度为物种数据，采用Mantel分析理化因子对细菌群落结构的影响。
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高通量测序结果显示：在干季和湿季共检测到相对丰度＞1% 的细菌门主要有变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、厚壁菌门Firmicutes、绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、浮霉菌门Planctomycetes和未分类细菌门。其中，变形菌门是纳帕海高原湿地优势菌门，相对丰度高达35.92%，芽单胞菌门Gemmatimonadetes为干季特有菌门(图1)。
图 1 不同退化阶段土壤细菌门干季(A)、湿季(B)相对丰度
Figure 1. Composition of dry (A) and wet (B) season bacteria phylum in soil at different degradation stages
不同退化阶段土壤细菌门相对丰度差异显著(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加11.04%、49.10%和72.31%，绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少40.89%和55.50%；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度分别增加205.38%、260.76%、188.17%、135.31%和182.18%，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少30.34%、46.55%和67.16%。在湿季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门相对丰度分别增加17.98%、45.84%和223.54%，厚壁菌门和绿弯菌门相对丰度分别减少73.17%和35.39% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门相对丰度分别增加216.33%、194.30%、294.56%和624.73%，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少88.63%和52.65%。
不同退化阶段土壤细菌门相对丰度干湿季节存在显著差异(P＜0.05)。沼泽湿地的变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度为干季大于湿季，湿季分别减少了23.15%、23.89%和24.53%；厚壁菌门为湿季大于干季，是干季的3.70倍。沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和放线菌门相对丰度在湿季分别减少了18.35%、25.56%、42.39%和54.50%；拟杆菌门相对丰度在湿季显著增加(P＜0.05)，是干季的7.46倍。草甸的酸杆菌门相对丰度在湿季减少了21.17%；浮霉菌门相对丰度在湿季增加了1.79倍。
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在属水平上，共检测到相对丰度＞0.01%的细菌属有酸杆菌属(Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属Pseudomonas、芽单胞菌属Gemmatimonas、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Povalibacter、Subdivision、Spartobacteria和未分类菌属。除此之外，酸杆菌属(Gp1、Gp16)、Paenisporosarcina、芽孢杆菌属Bacillus和放线菌属Gaiella为干季特有菌属；梭菌属Clostridium、尼龙菌属Flavobacterium、溶杆菌属Lysobacter、地杆菌属Pedobacter、马塞菌属Massilia和出芽菌属Gemmata为湿季特有菌属。未分类菌属为纳帕海高原湿地优势菌属，相对丰度高达20.64% (图2)。
图 2 不同退化阶段土壤细菌属干、湿季群落组成
Figure 2. Composition of dry and wet season bacteria phylum in soil at different degradation stages
湿地退化显著影响土壤细菌属相对丰度(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的假单胞菌属、Paenisporosarcina属相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加9.34、455.50倍，Povalibacter属相对丰度显著减少77.29% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌属(GP16)、假单胞菌属、Spartobacteria属相对丰度分别增加409.35、9.54和30.86倍，Povalibacter属和未分类菌属相对丰度分别减少80.06%和41.25%。在湿季，沼泽化草甸的尼龙菌属、溶杆菌属、地杆菌属相对丰度分别增加5.87、228.50和197.98倍，梭菌属相对丰度显著减少76.28% (P＜0.05)；草甸的出芽菌属相对丰度显著增加116.75倍(P＜0.05)，未分类菌属和梭菌属相对丰度分别减少33.49%和99.34%。
不同退化阶段的共有菌属因干湿季节变化而存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的未分类菌属相对丰度均为干季大于湿季，在湿季分别减少21.59%和26.61%。沼泽化草甸中的假单胞菌属相对丰度在湿季减少79.75%；鞘氨醇单胞菌属相对丰度在湿季增加了95.78%。
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由表2可见：湿地退化显著影响土壤细菌群落多样性(P＜0.05)。在干季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地显著增加(P＜0.05)，沼泽化草甸与草甸间差异不显著(P＞0.05)；在湿季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地也显著增加，且沼泽化草甸显著高于草甸(P＜0.05)。不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数在季节变化上存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的丰富度指数、艾斯指数和Chao1指数均为湿季大于干季；草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数均为干季大于湿季，辛普森指数相反，且差异显著(P＜0.05)。
表 2 不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数
Table 2. Diversity index of soil bacterial community at different degradation stages
湿地
类型季节 丰富度
指数香农
指数艾斯
指数Chao1
指数辛普森
指数沼泽
湿地干季 4056 Bc 6.16 Ab 5668.94 Bb 5368.14 Bb 0.0135 Aa 湿季 4201 Ac 6.20 Ac 6095.66 Ac 5789.86 Ac 0.0118 Aa 沼泽化
草甸干季 5352 Bb 6.68 Aa 7046.88 Ba 6631.88 Ba 0.0061 Ab 湿季 5697 Aa 7.14 Aa 8095.30 Aa 8121.55 Aa 0.0049 Ab 草甸 干季 5451 Aa 6.83 Aa 7059.57 Aa 6655.28 Aa 0.0041 Bc 湿季 4915 Bb 6.27 Bb 6673.81 Bb 6398.10 Ab 0.0130 Aa 说明：表中数据为平均值。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 -
由表3可知：湿地退化显著改变土壤理化性质(P＜0.05)。湿地退化使土壤含水量以及有机质、全氮和速效氮质量分数显著减少(P＜0.05)。干季的沼泽化草甸分别减少77.77%、41.16%、46.53%和33.91%，草甸分别减少80.93%、64.81%、87.31%和50.79%；湿季的沼泽化草甸分别减少32.30%、25.01%、51.34%和7.32%，草甸分别减少78.31%、61.99%、70.62%和39.18%，且土壤逐渐酸化。土壤磷、钾养分及碳氮比的变化趋势有所差异。较沼泽湿地，在干季，沼泽化草甸土壤全磷、全钾、速效磷、速效钾质量分数分别增加46.88%、9.39%、15.34%和27.38%；草甸土壤全磷质量分数及碳氮比分别增加14.06%和176.80%，全钾、速效磷及速效钾质量分数分别减少31.41%、42.92%和40.97%。在湿季，沼泽化草甸土壤全钾质量分数和碳氮比分别减少14.35%和63.88%，速效磷及速效钾质量分数分别增加66.15%和108.66%；草甸土壤全磷、速效磷、速效钾质量分数及碳氮比分别减少30.09%、33.57%、49.88%和37.97%，全钾质量分数显著增加51.48% (P＜0.05)。
表 3 不同退化阶段土壤理化性质
Table 3. Soil physical and chemical characteristics at different degradation stages
湿地类型 干湿季 含水量/% 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 沼泽湿地 干季 106.15±0.47 Ba 138.20±4.29 Aa 9.22±0.20 Ba 0.64±0.01 Ac 10.76±0.36 Ab 湿季 117.15±0.60 Aa 144.40±2.52 Aa 11.98±0.29 Aa 0.57±0.01 Aa 9.13±0.20 Ab 沼泽化草甸 干季 23.60±1.52 Bb 81.31±1.45 Bb 4.93±0.31 Ab 0.94±0.02 Aa 11.77±0.29 Aa 湿季 79.31±0.91 Ab 108.28±1.37 Ab 5.83±0.31 Ab 0.56±0.02 Ba 7.82±0.15 Bc 草甸 干季 20.24±1.04 Bb 48.63±6.60 Bc 1.17±0.04 Bc 0.73±0.01 Ab 7.38±0.18 Ac 湿季 25.41±0.50 Ac 54.89±2.13 Ac 3.52±0.05 Ac 0.37±0.02 Bb 13.83±0.13 Aa 湿地类型 干湿季 碳氮比 pH 速效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 沼泽湿地 干季 8.75±0.37 Bb 7.92±0.01 Aa 627.75±2.29 Aa 6.78±0.16 Ab 176.76±0.93 Bb 湿季 14.59±0.55 Aa 7.87±0.02 Aa 494.61±7.02 Ba 7.15±0.20 Ab 297.36±9.03 Ab 沼泽化草甸 干季 9.81±0.47 Ab 6.97±0.04 Bb 414.85±1.37 Bb 7.82±0.14 Ba 225.16±1.29 Ba 湿季 5.27±0.13 Bc 7.82±0.11 Aa 458.39±3.36 Ab 11.88±1.21 Aa 620.46±4.70 Aa 草甸 干季 24.22±3.30 Aa 5.92±0.12 Ac 308.92±1.36 Ac 3.87±0.14 Bc 104.35±1.44 Ac 湿季 9.05±0.35 Bb 5.65±0.08 Ab 300.84±3.44 Ac 4.75±0.05 Ac 149.04±8.64 Ac 说明：表中数据为平均值±标准误。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 干湿季节变化显著影响土壤理化性质的变化规律(P＜0.05)。沼泽湿地土壤含水量以及全氮、碳氮比、速效钾质量分数均为湿季大于干季，湿季分别增加10.36%、29.93%、40.03%和68.23%；速效氮在湿季显著减少21.21%(P＜0.05)。沼泽化草甸土壤含水量以及有机质、速效氮、速效磷和速效钾质量分数在湿季比干季分别增加236.06%、33.17%、10.50%、51.92%和175.56%；全磷、全钾质量分数和碳氮比在湿季分别减少40.43%、33.56%和46.28%；湿季pH升高，土壤偏碱性。草甸土壤含水量以及有机质、全氮、速效磷质量分数在湿季比干季分别增加25.54%、12.87%、200.85%和22.74%；全磷质量分数和碳氮比分别减少49.32%和62.63%。
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干季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mantel分析结果如图3所示。门水平上，土壤全氮、全钾、速效钾质量分数及pH和土壤细菌门的曼特尔显著值最小(P＜0.01)，说明土壤pH以及氮和钾质量分数的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，全氮质量分数和pH与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门呈显著负相关(r=−0.93~−0.70，P＜0.05)，与变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门呈显著正相关(r=0.67~0.90，P＜0.05)。全钾和速效钾质量分数与变形菌门、厚壁菌门呈极显著正相关(r=0.85~0.98，P＜0.01)，与酸杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.97~−0.79，P＜0.05)。
图 3 干季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 3. Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in dry season
属水平上，土壤氮、磷、钾质量分数以及pH的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，全氮、速效氮质量分数以及pH与酸杆菌属(Gp1、Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属、芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.93~−0.67，P＜0.05)，与Gp16属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.72~0.91，P＜0.05)。速效磷、速效钾质量分数与酸杆菌属(Gp1、Gp4)、鞘氨醇单胞菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈极显著负相关(r=−0.97~−0.80)，与未分类菌属呈极显著正相关(r=0.81~0.96，P＜0.01)。
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湿季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mentel分析结果如图4所示。门水平上，有机质、氮和磷质量分数及含水量、pH的高低是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，含水量、pH以及有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.98~−0.74，P＜0.05)，有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量与厚壁菌门、绿弯菌门呈显著正相关(r=0.75~0.96，P＜0.05)。
图 4 湿季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 4. Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in wet season
属水平上，有机质、氮、磷质量分数以及pH、含水量、碳氮比是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数以及含水量、pH 与假单胞菌属、芽单胞菌属、Gp4属、Gp7属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.97~−0.71，P＜0.05)，与梭菌属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.79~0.96，P＜0.05)；碳氮比与尼龙菌属、Subdivision、溶杆菌属、地杆菌属、马塞菌属呈显著负相关(r=−0.90~−0.68，P＜0.05)，与梭菌属和Povalibacter呈显著正相关(r=0.76~0.78，P＜0.05)。
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对土壤理化因子与细菌多样性指数进行Pearson相关性分析，结果如表4所示。在干季，丰富度指数、香农指数、艾斯指数、Chao1指数与有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量呈极显著负相关(r=−0.99~−0.83，P＜0.01)。可见：土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量是影响干季土壤细菌多样性的主控因子，且对细菌多样性起抑制作用。
表 4 土壤主要理化因子与细菌群落多样性的相关性分析
Table 4. Correlation analysis between main soil physical and chemical factors and bacterial community diversity
项目 干季 湿季 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 含水量 −0.99** −0.92** −0.99** −0.99** 0.98** − − − − − 有机质 −0.87** −0.89** −0.85** −0.85** 0.93** − − − − − 全氮 −0.91** −0.90** −0.89** −0.89** 0.96** −0.67* − − − − 全磷 − − 0.71* 0.70* − − − − − − 全钾 − − − − − 0.72* 0.88** 0.83** 0.85** −0.84** 碳氮比 − − − − −0.70* −0.96** −0.79* −0.91** −0.90** − pH −0.86** −0.83** −0.83** −0.83** 0.91** − − − − − 速效氮 −0.96** −0.93** −0.95** −0.94** 0.99** − − − − − 速效磷 − − − − − − 0.88** 0.79* 0.81** −0.90** 速效钾 − − − − − 0.68* 0.91** 0.82** 0.84** −0.91** 说明：*表示显著相关(P＜0. 05)；**表示极显著相关(P＜0. 01)；−表示不相关(P＞0.05)。 在湿季，香农指数、艾斯指数、Chao1指数与土壤全钾、速效钾、速效磷质量分数呈显著正相关(r=0.79~0.91，P＜0.05)，与碳氮比呈显著负相关(r=−0.91~−0.79，P＜0.05)，是影响湿季土壤细菌多样性的主控因子。其中，全钾、速效钾、速效磷质量分数对细菌多样性起促进作用，而碳氮比起抑制作用。
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土壤细菌作为微生物群落中数量最丰富、种类最多、生物量最大的功能类群，能够对高原湿地退化引起的土壤微域环境变化产生敏感响应[17]。变形菌门是纳帕海湿地的主要优势类群，与李金业等[18]、李玉倩等[19]研究结果一致。变形菌门的生态幅广、适宜能力强，能在不同退化湿地环境中形成较为稳定的生态位，但其喜弱碱特性会影响其相对丰度的变化[20]。本研究中，在轻度退化的弱碱沼泽化草甸土壤中变形菌门相对丰度显著增加。酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度均随湿地退化程度的加深而增加。酸杆菌属嗜酸菌、寡营养类群，其胞外多糖与补偿溶质的产生与积累使其更适应于含水量低、酸性较强、养分较低的退化草甸土壤[21]；放线菌门、疣微菌门Spartobacteria属和浮霉菌门等属好气性细菌，喜欢通气良好的环境，湿地退化导致土壤含水量减少，土壤孔隙度、通气状况得到改善，促进其相对丰度的显著增加[22]；疣微菌门是高寒沙化草甸的特有菌群，主要通过磷来维持其群落机制和养分平衡[23]，故在磷分较丰富的退化草甸土壤中相对丰度较高。本研究发现：湿地退化会抑制绿弯菌门的生长繁殖，这是因为该菌门属兼性厌氧菌，在养分匮乏的条件下进行光能自养，但仍以无光或有光且缺氧条件下的化学能或光能异养生长为主[24]，湿地退化导致土壤水分减少而抑制其相对丰度增加。综上所述，湿地退化过程中土壤含水量减少，使得土壤通气透水性得到改善，促进好气性细菌类群大量繁殖。
干湿季节交替通过调节水分、温度以及细菌对土壤养分的利用关系从而改变土壤细菌群落组成[25]。本研究发现：厚壁菌门在沼泽湿地中为湿季大于干季，而在沼泽化草甸中为干季大于湿季。厚壁菌属厌氧快速生长型菌群，具有固碳作用，大多存在于动物肠道中[26]。湿季雨水冲刷，厚壁菌门随动物粪便流入沼泽湿地，相对丰度增加，同时动物粪便的输入可直接刺激其相对丰度的增加；而沼泽化草甸的有机底物相对较低，干季丰富的凋落物为厚壁菌门提供充足碳源，相对丰度较湿季增加。梭菌属为湿季特有菌属，在沼泽湿地中占优势，相对丰度高达22.60%。该菌属是来自厚壁菌门的专性厌氧铁还原菌，在严格厌氧条件下才能生存，主要通过还原铁获取生长能量[27]，沼泽湿地常年淹水，湿季适宜的温度和充足的有机底物可促进其快速生长；而在干季，养分较少、温度相对较低，有利于厌氧寡营养绿弯菌门聚集[28]。拟杆菌门(尼龙菌属)在湿季沼泽化草甸显著增加，这主要与其需氧特性和水生环境的生物学特性有关[29]。酸杆菌门具有降解植物残体多聚物的能力[21]，干季植物枯死，凋落物的分解为酸杆菌的繁殖及降解提供更好的养分条件[30]，故相对丰度呈现干季大于湿季的变化趋势。芽单胞菌门在干季相对丰度较低，在湿季则未检测到，进一步表明了芽单胞菌属好氧菌，适宜生存于较为干燥的环境中[31−32]。因此，干湿季更替显著影响好养厌养、需氧厌氧细菌群落分布格局。
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高原湿地退化通过影响水热条件、土壤结构、土壤养分，进而影响土壤细菌群落多样性[33]。本研究中，沼泽化草甸和草甸土壤的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数显著高于沼泽湿地，说明湿地退化会促进细菌多样性的增加。这可能是沼泽湿地有机底物常年积累，但由于其土壤处于厌氧状况，不利于微生物对养分的矿化，难为大多数细菌提供直接能量来源[34]，因此，细菌多样性较沼泽化草甸和草甸细菌低。另一方面，湿地在退化过程中，土壤孔隙度、通气状况得到改善，碱性减弱、凋落物分解加快，农药化肥的残留以及牛粪的输入为细菌生命活动提供物质源泉[35]，有利于好氧喜酸细菌大量繁殖，从而导致细菌多样性较沼泽湿地高。另外，湿地退化导致植被类型呈现挺水植物—湿中生植物—旱生植物的演替格局[12]，地上凋落物、根系分泌物的增加直接为土壤细菌提供可利用的碳氮及其他养分，细菌多样性增加[13]。
干湿季节更替引起的降雨量和温湿度变化，可能影响土壤理化性质及酶活性变化，进而调控土壤细菌群落多样性的干湿季变化[36]。本研究中，沼泽湿地和沼泽化草甸土壤细菌的丰富度指数、艾斯指数湿季显著高于干季，而草甸则为干季显著高于湿季。原因可能是沼泽湿地和沼泽化草甸淹水较多导致通气透水性差，抑制了需氧细菌对有机质的降解[24]。但在湿季，由于温度升高，细菌酶活性增强，溶解氧降低[37]，刺激细菌大量繁殖，导致湿季细菌多样性高于干季。相较于沼泽湿地和沼泽化草甸，草甸土壤含水量低，通气透水性好，为需氧细菌提供良好的微氧环境[34]。特别是湿季放牧和旅游增加，土壤细菌多样性会因牲畜和游客践踏引起的土壤板结和理化性质变化，而导致细菌多样性湿季低于干季[38]。因此，干湿季节更替使得纳帕海不同退化阶段土壤细菌群落多样性存在差异。
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湿地退化过程中土壤水分状况变化，直接或间接导致土壤环境厌氧-需氧界面通气性、酸碱性和养分状况的改变，进而显著影响土壤细菌群落结构及多样性[39−40]。纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤含水量是影响干季土壤细菌群落结构和多样性变化的主要因子，由于沼泽湿地—沼泽化草甸—草甸演替过程中，土壤含水量减少，土壤质地疏松和溶解氧增加，有利于土壤养分分解，从而促进需氧菌的繁殖，细菌多样性增加。牛佳等[41]指出：水分是影响土壤细菌群落结构的主要因子，通过调节土壤酸碱度及养分分布格局，进而影响细菌群落结构组成。本研究中，土壤含水量与全氮、有机质、速效氮质量分数以及pH呈显著正相关，并随湿地退化而显著减少。pH高低决定整个湿地生态系统元素循环反应体系的酸碱度[42]，显著影响细菌群落组成。湿地退化过程中，土壤酸化使得土壤碳氮磷养分有效性发生改变[43]，从而影响土壤细菌群落分布格局。Mantel分析结果显示：pH同土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量显著促进酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门和疣微菌门相对丰度增加，而抑制变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度增加。原因是变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门属于固碳微生物，具有好氧喜弱碱特性[44]，湿地退化，碳氮质量分数降低不利于细菌生长繁殖。这与林春英等[7]在高寒沼泽湿地退化研究中得出的结论相似。
不同退化阶段土壤碳氮比增加对湿季细菌多样性增加起抑制作用。李杰[45]研究得出：碳氮比通过调节微生物分解进程进而调节土壤养分有效性，高碳氮比抑制土壤微生物活性从而缓解有机质分解，而低碳氮比加快微生物对有机质的分解、转化。本研究中，高原湿地退化过程中，土壤碳氮比降低，细菌可利用养分转化速率加快[46]，细菌多样性增加；但湿地退化引起的土壤有机质减少也会导致土壤细菌可利用碳源减少，使得绝大部分共养厌氧细菌相对丰度下降(厚壁菌门、变形菌门)。Mantel分析结果显示：土壤含水量及碳、氮质量分数减少，显著抑制厚壁菌门、绿弯菌门和梭菌属相对丰度的增加；磷促进变形菌门、拟杆菌门(尼龙菌属)和地杆菌属相对丰度的增加。原因是湿地退化，土壤碳氮质量分数及含水量减少，厌氧需养菌受到抑制[47]；同时，湿地退化引起的土壤酸化可刺激铁铝氧化物释放磷元素，进而促进喜磷细菌(变形菌门、拟杆菌门以及尼龙菌属和地杆菌属)大量繁殖。综上所述，湿地退化引起土壤养分状况、含水量及酸碱度改变，通过影响土壤细菌的养分需求和代谢过程，进而调控纳帕海高原湿地土壤细菌多样性。
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纳帕海高原湿地退化显著影响土壤理化环境的时空异质性，进而调控土壤细菌群落结构及多样性。湿地退化引起土壤有机质、氮质量分数以及水分、pH减小，导致酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门、疣微菌门相对丰度显著增加，绿弯菌门相对丰度显著减少及变形菌门、厚壁菌门(梭菌属)和拟杆菌门(尼龙菌属)干湿季差异，进而导致退化湿地土壤细菌多样性较沼泽湿地显著增加。因此，湿地退化导致土壤水分、酸碱度及土壤养分供给状况发生改变，从而显著影响土壤细菌群落结构及多样性。
Response of soil bacterial community to wetland degradation in the Napahai Plateau
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摘要:
目的 探明高原退化湿地土壤细菌群落结构及多样性的时空动态特征，为理解土壤微生物群落对高原湿地退化的响应过程及机制提供关键数据支撑。 方法 以纳帕海高原不同湿地退化阶段(沼泽湿地、沼泽化草甸、草甸)为研究对象，采用Illumina高通量测序技术，探测土壤细菌群落组成及多样性的干湿季变化规律。 结果 ①共检测到土壤细菌10门21属，其中变形菌门Proteobacteria和未分类菌属为优势门和属，相对丰度分别达35.92%和20.64%。②相较于原生沼泽湿地，沼泽化草甸的变形菌门和酸杆菌门Acidobacteria相对丰度分别增加14.06%和47.72%，绿弯菌门Chloroflexi相对丰度显著减少38.54% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌门、放线菌门Actinobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia和浮霉菌门Planctomycetes相对丰度分别增加了210.15%、231.37%、229.55%和315.22%。上述菌门相对丰度均为干季大于湿季。沼泽化草甸的厚壁菌门Firmicutes相对丰度在干季显著增加72.38%，在湿季显著减少73.17% (P＜0.05)；而拟杆菌门Bacteroidetes相对丰度在干季显著减少55.50%，在湿季显著增加223.54% (P＜0.05)。③沼泽化草甸和草甸的Shannon指数较原生沼泽湿地显著增加(P＜0.05)，且沼泽湿地和沼泽化草甸表现为湿季大于干季，草甸则表现为干季大于湿季。④Mantel分析结果表明：干季细菌群落结构组成由土壤pH和氮、磷、钾质量分数调控，湿季则由含水量、有机质、氮磷及pH调控；Pearson相关性分析结果表明：含水量、有机质、氮和pH是影响干季土壤细菌多样性的主控因子；湿季则为磷、钾和碳氮比。 结论 高原湿地退化导致土壤含水量和pH减小，进而影响土壤碳、氮、磷和钾养分状况，最终调控土壤细菌群落组成和多样性的干湿季变化。图4表4参47 Abstract:Objective This study aims to explore the spatiotemporal dynamic characteristics of soil bacterial structure and diversity in plateau degraded wetlands, so as to provide key data support for understanding the response process and mechanism of soil microbial communities to plateau wetland degradation. Method Illumina high-throughput sequencing technology was used to detect the dry and wet seasonal changes of soil bacterial community composition and diversity during different wetland degradation stages (swamp wetlands, swamp meadows, and meadows) in the Napahai Plateau. Result (1) A total of 10 phyla and 21 genus of soil bacteria were detected, dominated by Proteobacteria and unclassified genera, with relative abundance of 35.92% and 20.64%, respectively. (2) Compared with native swamp wetlands, the relative abundance of Proteobacteria and Acidobacteria in swamp meadows increased by 14.06% and 47.72%, respectively, while that of Chloroflexi significantly decreased by 38.54% (P＜ 0.05). The relative abundance of Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia and Planctomycetes in meadows increased by 210.15%, 231.37%, 229.55% and 315.22%, respectively. The relative abundance of above phyla was greater in the dry season than in the wet season. The relative abundance of Firmicutes in swamp meadows significantly increased by 72.38% in the dry season and decreased by 73.17% in the wet season (P＜ 0.05). The relative abundance of Bacteroidetes in meadows significantly decreased by 55.50% in the dry season and increased by 223.54% in the wet season (P＜0.05). (3) The Shannon index of swamp meadows and meadows significantly increased compared with native swamp wetlands (P＜0.05). The Shannon indices in swamp wetlands and marsh meadows were higher in the wet season than in the dry season, while those in meadows showed an opposite pattern. (4) Mantel test indicated that the composition of bacterial community structure in the dry season was regulated by soil pH and the concentrations of nitrogen, phosphorus and potassium, while in wet season it was mainly regulated by soil water content, organic matter, nitrogen, phosphorus and pH. The Pearson correlation analysis showed that the controlling factors affecting bacterial diversity in the dry season were soil water content, organic matter, nitrogen and pH, while those in the wet season were soil phosphorus and potassium and carbon nitrogen ratio. Conclusion The degradation of plateau wetlands leads to a decrease in soil moisture and pH, which in turn affects the nutrient status of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and potassium, ultimately regulating the dry and wet season changes in soil bacterial community composition and diversity. [Ch, 4 fig. 4 tab. 47 ref.] -
Key words:
- Napahai /
- wetland degradation /
- soil bacteria /
- community diversity /
- dry and wet seasons
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香果树Emmenopterys henryi为茜草科Rubiaceae香果树属Emmenopterys高大落叶乔木，是中国特有的第四纪孑遗植物之一，零星分布在中国西北、华中、华东、华南和西南等15个省(自治区)[1−2]。目前，香果树的野外生存受到一定的威胁，已经被列为国家Ⅱ级重点保护植物[3]。过去几十年，国内学者对香果树进行了广泛的研究[4]，但对于香果树生境土壤微生物的研究几乎空白。土壤微生物作为陆地生物多样性的重要组分，不仅在陆地生态系统物质循环和能量流动过程中起着重要作用[5]，还通过植物-微生物反馈影响着植物的代谢、功能性状及其对环境胁迫的适应能力，从而影响植物的健康和多样性[6−7]。细菌和真菌是土壤中最重要的两大微生物类群，一般来说真菌对环境胁迫的抗性更强，而细菌对资源水平波动的适应性更强[8]。因此，学者普遍认为资源质量低的环境中微生物群落往往以真菌为主，资源不稳定或资源水平高的环境中微生物群落往往以细菌为主[9]。香果树喜生于海拔430~1 630 m处岩石裸露度高、土层浅薄的山谷林中[10]。在这种严苛的环境中，微生物常对珍稀植物的生长和繁育过程起着更为重要的促生作用[11]。有学者已经从香果树营养器官中筛选到了多种具溶磷、解钾、分泌吲哚乙酸或具有2种以上功能的真菌[12]。除提高土壤养分可利用率和刺激植物释放激素外，微生物还可以有效抑制植物病害的发生[11, 13]。活体植物根系周围既是病原微生物的聚集地，也是共生抗病微生物的聚集地，因此植物体周围的微生物多样性和物种组成对于该植物的生存和繁衍具有重要影响[14]。然而，目前香果树生境微生物多样性和物种组成时空变化格局及机制仍未得到深入了解。
微生物多样性和物种组成的时空变化格局受多种生态因素的影响，这些因素相互作用，但主控因素仍然不明[15]。海拔是影响土壤微生物多样性的重要因素[16]。不同森林生态系统中表层土壤微生物普遍呈现海拔变化格局，但对于土壤微生物组成和多样性沿海拔变化的趋势至今没有统一定论[10, 14]。其主要原因在于各种生态因子，如土壤温度、湿度、土壤理化性质和植被类型，都会随海拔的升高而改变，进而对土壤微生物群落造成不同影响[16−17]。虽然土壤特性对微生物多样性的影响一直受到关注[15]，但研究多围绕土壤养分含量，很少分析土壤物理性质等对微生物多样性的影响。此外，植物可以通过凋落物和根系分泌物对土壤微生物产生直接影响，也可以通过改变土壤理化性质对土壤微生物产生间接影响[18−19]。植物群落的物种组成或多样性与群落中土壤微生物物种组或多样性呈显著相关[20−21]。同时，空间距离对土壤微生物多样性的影响也不容忽视。除了微生物多样性本身，样本间土壤理化性质和植被特征的相似性也都与空间距离有关。因此，需要尽可能同时检验这些生物和非生物因素(包括空间因素)对珍稀植物生境土壤微生物多样性的影响。
为探究香果树生境土壤微生物多样性和物种组成时空变化信息以及造成这些变化的主控因素，本研究利用高通量测序技术检测浙江九龙山国家级自然保护区香果树生境土壤细菌和真菌的多样性格局，并分析香果树生物因素和环境因素对这些格局的影响，以期为香果树的保护和繁育提供科学依据。
1. 研究地区与方法
1.1 研究区概况
浙江九龙山国家级自然保护区位于浙、闽、赣交界处的丽水遂昌西南部(28°19′10″~28°24′43″N，118°49′38″~118°55′03″E)。该区气候属中亚热带湿润季风气候，四季分明，雨量充足，光照适宜，气候具有垂直地带性，年内雨季和干季交替明显，南北坡气候存在差异[20]。2021年平均气温为16.3 ℃，年降水量为2 171.5 mm；2022年平均气温为16.0 ℃，年降水量为2 064.2 mm。土壤属富铝土纲，红壤土类，包括老红壤、红壤、黄红壤和红黄壤等亚类，随着海拔的变化，各亚类按序替代。土壤中有机质、全氮及钾素丰富，有机质转化迅速，腐殖质组成以富里酸占优势[22]。植被以亚热带常绿阔叶林为主，该区也是香果树在浙江的主要分布地之一[22−23]。
1.2 样地设置与植被调查
2021年7—10月，在九龙山国家级自然保护区内的大岩前、岩背坑、陈坑、源大坑、内阴坑、内北坪等6处香果树分布地共设置34个样地。每个样地都是以1株香果树为圆心，15 m为半径的圆。定位每个样地的海拔和地理坐标，测量样地所在山坡的坡向，测量样地内所有胸径大于2.5 cm的乔、灌木的胸径及与样地中心香果树的距离，并鉴定物种。
1.3 土壤样品采集
分别于2021年11月中旬(24个样地)和2022年10月底(10个样地)分2次采集了34个样地的土壤样品。采样时在中心香果树冠幅范围内去除表层凋落物后任意采集5份土壤(深度0~15 cm)进行混合，剔除碎石等杂物。将采集土样放入提前标记好的无菌密封袋密封，置于冰盒内带回实验室。在实验室去除可见根系和动植物残体，一部分用于微生物高通量测序，另一部分自然风干后过2 mm土筛，用于土壤理化性质测定。
1.4 土壤理化性质测定
土壤理化性质分析参考《土壤分析技术规范》[24]。采用电位法测定土壤pH，外加热重铬酸钾容量法测定有机质，凯氏蒸馏法测定全氮，碱解扩散法测定碱解氮，盐酸-氯化铵浸提-钼锑抗比色法测定速效磷，醋酸铵浸提-火焰光度法测定速效钾；采用指测法确定土壤质地；采用比重瓶法结合环刀法测定和计算土壤总孔隙度。
1.5 微生物多样性测定
土壤样品保存在干冰中送至实验室后，使用土壤DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA)进行土壤微生物总DNA抽提，并利用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳对抽提的总DNA纯度和浓度进行检测。本研究采用通用引物338F和806R扩增细菌16S rDNA基因的V3~V4区域；采用引物ITS1F和ITS2R扩增真菌ITS1区域。每个样本3个重复，重复的PCR扩增产物混合后经检测、回收、纯化和荧光定量后构建Miseq文库，并进行双向测序。原始序列数据经拼接、过滤质控和去除嵌合体等步骤后，得到高质量的有效序列数。在97％相似性水平下，划分所有序列的操作分类单元(OTU)[18]。
1.6 数据分析
1.6.1 微生物α多样性分析
Shannon-Wiener指数和Simpson指数是衡量群落α多样性最常用的指数[25]，但这2个指数在比较不同群落α多样性的差异时，群落间的多样性差异程度容易失真[26]。为了更好地揭示不同样地间α多样性变化的影响因素，本研究使用Shannon-Wiener指数当量(H')和Simpson指数当量(D')(即保持多样性指数值不变，群落内物种都具有相同多度时，群落中预期的物种数量)来表征香果树生境土壤细菌和真菌的α多样性。本研究分别统计所有土样细菌、真菌的OTU数量和门类，并计算每个土样细菌和真菌的Shannon-Wiener指数、Simpson指数及其当量。用t检验比较2个年份土壤细菌和真菌的H'和D'。
为分析不同样地土壤微生物α多样性差异与地形、土壤理化性质以及香果树大小的关系，本研究以各样地土壤细菌和真菌的H'或D'作为应变量，以样地的海拔、坡向、土壤理化性质、样地中心香果树的胸高断面积、树木α多样性作为自变量进行回归分析。取坡向的正弦和余弦值作为自变量来提取坡向的信息。同时，考虑到样地间的空间自相关，以及不同取样年份造成的影响，本研究将香果树分布地和取样年份作为随机效应加入回归方程，建立线性混合效应模型。利用F检验对各自变量固定效应的显著性进行检验。
1.6.2 土壤微生物β多样性分析
采用基于丰度的Sorenson相异性指数作为配对样本之间的β多样性(即样本之间的微生物组成的差异，Btotal)的度量，并将β多样性分解为物种周转组分(Repl)和物种丰富度差异组分(Rich)[23]。当Rich/Btotal大于50%时，表明β多样性主要由物种丰富度差异组分主导，Repl/Btotal大于50%时，表明β多样性主要由物种周转组分主导[25]。
利用偏Mantel检验，在控制样地空间距离条件下，分析取样年份与香果树生境土壤微生物β多样性及其组分的Spearman相关；或控制取样年份条件下，分析样地间空间距离与香果树生境土壤微生物β多样性及其组分的相关性。同时控制样地空间距离和取样年份的情况下，分析其他因子与土壤微生物β多样性及其组分的关系。
最后，通过方差分解，探究对香果树生境土壤微生物β多样性及其组分有显著影响因素的相对重要性[25]。该分析以土壤样本细菌或真菌β多样性及其2个组分为响应变量，以地形、土壤理化性质、样地树木物种组成、中心香果树胸高断面积、取样年份或样地空间距离等因素作为解释变量。本研究依据最低残差原则选择“最好”的因素组合，去除共线性因子。空间距离因子由邻体矩阵主坐标分析(PCNM)引入，选择正相关的PCNM特征值作为空间因子指标[25]。以树种组成矩阵主坐标排序(PCoA)的前10个排序轴(含总变异的89.3%)作为代表各样地树种组成的变量。
1.6.3 数据分析
所有数据分析都在R软件中完成。α多样性指数计算、偏Mantel检验、PCNM分析和方差分解采用vegan程序包，线性混合效应模型分析通过lme4程序包，β多样性分解通过adespatial程序包，PCoA排序通过ade程序包实现。
2. 结果与分析
2.1 土壤微生物α多样性及其变化
本研究从香果树生境土壤中共检测到8 750个细菌OTUs和10 968个真菌OTUs，其中8 612个可注释的细菌OTUs归属于38个门类，7 742个可注释的真菌OTUs归属于17个门类。2021年采集的24个土壤样品共检测到6 935个细菌OTUs和9 198个真菌OTUs，其中6 838个可注释的细菌OTUs归属于37个门类，6 554个可注释的真菌OTUs归属于16个门类；2022年采集的10个土壤样品共检测到4 168个细菌OTUs和4 592个真菌OTUs，其中4 096个可注释的细菌OTUs归属于37个门类，3 432个可注释的真菌OTUs归属于15个门类。
从图1可见：每个土壤样品细菌的Shannon-Wiener指数为4.82~6.37，均值为5.87，Simpson指数为0.95~0.99，均值为0.98；真菌Shannon-Wiener指数为3.84~5.56，均值为4.88，Simpson指数为0.92~0.99，均值为0.97。2021年采集的土壤细菌H'显著高于2022年(P＜0.05)，但D'无显著差异；真菌的H'和D'在2个取样年份间差异不显著。
图 1 不同年份土壤微生物α多样性差异Figure 1 Alpha diversity differences of soil microbes in different sampling years线性混合效应模型分析表明：香果树生境土壤细菌H'与海拔呈显著负相关(P＜0.05)，即随着海拔上升，土壤细菌H'下降(图2A)，而土壤细菌D'与海拔无关。海拔及其二次方对土壤真菌H'和D'都有显著影响(P＜0.05)，随着海拔的上升，香果树生境土壤真菌α多样性呈现先下降后上升的趋势(图2B和图2C)。模型分析表明：样地坡向与土壤细菌和真菌α多样性都无显著关系。土壤理化性质中，速效钾与细菌D'呈显著负相关(P＜0.05)；pH与细菌H'呈显著正相关(P＜0.05)；碱解氮与真菌H'、D'都呈显著负相关(P＜0.05)；其余性质都与真菌和细菌的α多样性无显著关系。植物因子中，仅中心香果树胸高面积与土壤真菌D'呈显著正相关(P＜0.05)，土壤细菌、真菌α多样性都与样地树种多样性无关(表1)。
图 2 九龙山香果树生境土壤微生物α多样性随海拔的变化Figure 2 Changes of α diversity indices of microbes in soil of E. henryi stand along with altitude表 1 生物和环境因子对香果树生境土壤微生物α多样性的影响Table 1 Influence of biotic and abiotic factors on α diversity of soil microbes in habitat of E. henryi影响因素 细菌H' 细菌D' 真菌H' 真菌D' 回归系数 P 回归系数 P 回归系数 P 回归系数 P 坡向正弦 0.00 1.00 0.01 0.95 0.18 0.38 0.12 0.10 坡向余弦 0.01 0.97 0.18 0.33 −0.25 0.29 −0.11 0.99 土壤质地 −0.06 0.88 −0.10 0.65 −0.05 0.86 −0.07 0.90 总孔隙度 0.11 0.42 0.10 0.46 0.12 0.36 0.14 0.38 有机质 −0.43 0.56 0.10 0.90 −0.78 0.40 −0.14 0.86 全氮 1.21 0.17 0.61 0.54 1.41 0.20 0.40 0.71 速效钾 0.88 0.11 −0.65 0.05 0.93 0.17 1.00 0.11 速效磷 1.28 0.19 1.36 0.18 −0.60 0.61 −0.55 0.60 碱解氮 −0.87 0.12 −1.00 0.09 −0.37 0.03 −0.73 0.02 pH 0.82 0.00 0.09 0.67 −0.06 0.83 −0.10 0.69 中心香果树胸高断面积 0.09 0.64 −0.11 0.60 0.15 0.56 0.42 0.05 树种多样性 0.25 0.24 0.26 0.18 0.14 0.60 0.19 0.37 2.2 土壤微生物β多样性及其组分特征
九龙山香果树生境土壤细菌β多样性为0.19~0.72，均值为0.39，其中物种周转组分为0.08~0.66，均值0.27，物种丰富度差异组分为0~0.43，均值为0.12 (图3A)。物种周转组分对土壤细菌β多样性的贡献达70.2%，而物种丰富度差异组分对土壤细菌β多样性的贡献占29.8%。香果树生境土壤真菌β多样性为0.49~0.96，均值为0.72，其中物种周转组分为0.37~0.92，均值为0.61，物种丰富度差异组分为0~0.41，均值为0.11 (图3B)。物种周转组分对土壤真菌β多样性的贡献高达85.1%，而物种丰富度差异组分对土壤真菌β多样性的贡献仅占14.9%。
图 3 九龙山香果树生境土壤微生物β多样性的三维分布Figure 3 Triangular plot of microbes communities in soil of E. henryi stands in Jiulongshan2.3 土壤微生物β多样性及其组分的影响因素
偏Mantel检验表明：控制取样年份后，样地空间距离与土壤微生物β多样性及其物种周转组分都显著相关(P＜0.05，表2)；控制样地间空间距离后，仅土壤微生物物种丰富度与取样年份有关(表2)。取样年份解释了土壤细菌物种丰富度的42% (图4A)，但仅解释了土壤真菌的8% (图4B)。
表 2 九龙山香果树生境土壤微生物β多样性与各环境因子的偏Spearman相关Table 2 Partial spearman correlations between soil microbes β diversity and various environmental factors in E. henryi stands in Jiulongshan影响因素 细菌 真菌 β多样性 物种周转 物种丰富度差异 β多样性 物种周转 物种丰富度差异 相关系数 P 相关系数 P 相关系数 P 相关系数 P 相关系数 P 相关系数 P 空间距离 0.32 0.00 0.27 0.01 0.01 0.42 0.30 0.01 0.29 0.00 −0.04 0.64 年份 0.06 0.21 −0.38 1.00 0.65 0.00 0.02 0.42 −0.37 1.00 0.50 0.00 海拔 −0.06 0.73 −0.20 0.99 0.10 0.08 0.09 0.20 −0.27 1.00 0.33 0.00 坡向 0.02 0.28 −0.00 0.50 0.02 0.24 0.02 0.23 0.05 0.08 −0.02 0.65 土壤理化性质 0.46 0.00 0.39 0.00 0.01 0.25 0.43 0.00 0.26 0.02 0.12 0.13 质地 0.05 0.53 −0.06 0.77 0.05 0.43 0.02 0.44 0.06 0.29 0.06 0.38 总孔隙度 0.34 0.01 0.34 0.01 0.02 0.57 0.25 0.05 0.22 0.03 −0.04 0.87 有机质 0.45 0.00 0.41 0.00 −0.03 0.62 0.29 0.01 0.27 0.01 0.01 0.40 全氮 0.34 0.00 0.28 0.01 0.06 0.24 0.26 0.02 0.21 0.03 0.04 0.27 速效钾 0.31 0.01 0.31 0.00 −0.03 0.63 0.24 0.03 0.21 0.02 −0.03 0.61 速效磷 0.33 0.01 0.27 0.01 0.06 0.25 0.25 0.04 0.22 0.02 −0.01 0.49 碱解氮 0.24 0.01 0.18 0.04 0.01 0.43 0.35 0.00 0.14 0.09 0.15 0.06 pH 0.47 0.00 0.42 0.00 0.01 0.43 0.33 0.00 0.27 0.00 −0.02 0.53 中心香果树胸高断面积 0.08 0.21 −0.03 0.58 0.08 0.13 0.01 0.44 −0.21 0.99 0.18 0.03 树种组成 0.20 0.02 0.19 0.03 −0.06 0.76 0.23 0.02 0.13 0.09 0.01 0.45 
图 4 九龙山香果树生境环境因子对土壤微生物β多样性及其组分解释度的方差分解结果Figure 4 Variance partitioning results of β diversity and its components of soil bacteria or fungi in E. henryi stands in Jiulongshan interpreted by biotic and abiotic factors偏Mantel检验发现：控制采样年份和样地空间距离后，土壤细菌β多样性与土壤理化性质差异(总孔隙度、有机质、全氮、速效钾、速效磷、碱解氮和pH)以及树种组成显著相关(P＜0.05，表2)。土壤理化性质、树种组成和空间结构共解释九龙山香果树生境土壤细菌β多样性52%的变异，其中土壤理化性质差异解释了26%，树种组成解释了12%，空间结构仅解释10%，土壤理化性质和树种组成共同解释额外10%的细菌β多样性(图4C)。土壤细菌物种周转与土壤理化性质(尤其是有机质、全氮、速效钾、速效磷和pH)及树种组成显著相关(P＜0.05，表2)。样地的空间结构并不能单独解释土壤细菌的物种周转。土壤理化性质和树种组成共解释了44%的土壤细菌物种周转，其中土壤理化性质解释了36%，树种组成解释了18% (图4D)。土壤细菌物种丰富度差异与海拔、坡向、土壤理化性质、香果树种组成的相关性不显著(表2)。
控制取样年份和样地空间距离后，土壤真菌β多样性与土壤理化性质(总孔隙度、有机质、全氮、速效钾、速效磷、碱解氮和pH)及树种组成显著相关(P＜0.05，表2)。土壤理化性质、树种组成和空间结构共解释了九龙山香果树生境土壤34%的真菌β多样性，其中树种组成解释了13%，土壤理化性质和空间结构各自解释了11%和10%的真菌β多样性，土壤理化性质和树种组成共同解释额外7% (图4E)。土壤真菌物种周转与土壤理化性质(总孔隙度、有机质、全氮、速效钾、速效磷和pH值)显著相关(P＜0.05，表2)。土壤理化性质和空间结构共同解释了15%的土壤真菌物种周转，其中土壤理化性质和空间结构分别解释了5%和11% (图4F)。土壤真菌物种丰富度仅与海拔和中心香果树胸高断面积显著相关(P＜0.05，表2)。海拔和取样年份交互作用解释了51%的土壤真菌物种丰富度差异，海拔和取样年份分别独立解释9%和8%的土壤真菌物种丰富度差异。中心香果树胸高断面积不能单独解释土壤真菌物种丰富度差异。
3. 讨论
3.1 九龙山香果树生境土壤微生物多样性
植物与微生物之间存在复杂的相互作用[11]。近年来，对森林土壤微生物多样性的研究较深入[27]，但对珍稀濒危植物体内或生境中的微生物研究较少[11−12]。本研究分析表明：九龙山香果树生境土壤细菌α多样性高于真菌α多样性，且土壤微生物多样性显著高于该地树木的多样性[25]。这一特征符合森林土壤微生物多样性的基本规律[28]。极高的细菌和真菌多样性是出现宿主专一的病原微生物和共生菌的基础。专一的植物-微生物相互作用有助于缓解珍稀植物受到的环境胁迫[11]。从不同气候带森林土壤微生物多样性比较来看，九龙山国家级自然保护区香果树生境土壤细菌α多样性较其他地方低，而真菌α多样性较其他地方高[28]。这可能与香果树生境岩石裸露度高且土层浅薄的特性有关。在这种资源质量低的环境中，真菌种类丰富的微生物群落常体现出优势，丰富的真菌物种有利于维持环境中矿质资源的供给，改善植物的生存环境[8−9]。同时，本研究也发现：随着生境条件的变化，香果树生境中细菌群落的物种组成最为稳定，而真菌群落的物种组成变化较大[25]。植物、真菌和细菌群落在环境梯度上都是以发生物种周转为主，物种周转对于真菌群落的β多样性尤为重要。
3.2 香果树生境土壤α多样性的影响因素
本研究发现：2021年土壤细菌的H'显著高于2022年，而其余类群和多样性指数在不同年份间差异不显著。2022年土壤细菌群落H'显著降低，说明群落中不少稀有物种丧失或者丰度发生变化。已有研究表明：降水能显著影响森林土壤微生物群落的结构，且对细菌的影响尤为明显[29]。2022年6—8月，九龙山地区经历了明显的干旱过程，全年降水量比2021年下降了107.3 mm (5%)。降水的改变应该是九龙山香果树生境土壤细菌多样性降低的重要因素。
除了气候因素外，海拔和坡向是影响土壤微生物α多样性的重要因素[30−31]。有研究表明：土壤微生物α多样性在南坡和北坡对海拔变化的响应不同[31]。然而，本研究结果显示：九龙山香果树生境土壤微生物α多样性与坡向无关。海拔因子极其复杂，许多生态因子，如温度、湿度、辐射、植被等，都会随海拔的变化而改变，生态因子在海拔梯度上的变化比在纬度梯度上的变化快1 000倍[30]。目前，土壤微生物α多样性沿海拔梯度的变化模式主要包括单调递减、单调递增、单峰、下凹和无趋势等5种[31]。本研究表明：九龙山香果树生境细菌和真菌α多样性随海拔上升呈不同的变化趋势。
土壤理化性质是影响土壤微生物生存和繁殖的最直接因素，而且微生物的活动也影响着土壤理化性质，因此土壤理化性质与微生物多样性之间存在紧密联系[15]。九龙山香果树生境土壤pH全部小于6，属于酸性至强酸性土壤。细菌D'与土壤pH呈正相关，说明土壤酸性越低，细菌多样性越高，部分细菌类群不能在强酸性环境中生存。本研究发现：细菌D'与土壤速效钾呈负相关关系，可能有以下2种解释：首先，九龙山香果树生境中部分细菌类群可能不喜速效钾较高的生境；其次，生境中可能存在大量消耗速效钾的细菌类群，导致生境中速效钾降低。具体原因有待从细菌功能生态的角度进行深入研究。此外，本研究土壤碱解氮与真菌多样性之间呈显著负相关。主要原因在于真菌以利用分解程度低的凋落物为主，而在凋落物层较厚的环境中氮素多以有机态大分子形式存在，碱解氮质量分数常较低[11]。
在较大的地理尺度上或不同植被类型(或演替阶段)中，土壤微生物与植物多样性之间常存在紧密的正相关[32]。本研究的地理尺度较小，且限于单一的香果树群落，群落类型单一，因此并未检测到树木多样性与土壤微生物多样性之间的关系。然而，本研究依然发现样地中心香果树胸高断面积与其周围土壤真菌的D'之间呈显著正相关。有研究表明：不同树种的大树周围，土壤能以不同的速率积累病原真菌或菌根真菌[14]。如果积累的真菌种类大多为病原真菌，将导致香果树强烈的负密度制约效应，而积累多种菌根真菌，将有利于香果树幼苗从母树周围得到正反馈。珍稀植物如何招募并组装根内微生物，直接关系到其种群复壮前景[11]。张红芳等[12]已从香果树体内分离到了82株具溶磷效果和36株具解钾活性的内生真菌，说明有益真菌促进香果树种群维持和复壮是有可能的。
3.3 香果树生境土壤β多样性的影响因素
本研究发现：香果树生境土壤细菌和真菌群落的物种组成存在显著的空间正相关，即距离越近微生物群落的物种组成越相似。然而，微生物群落的空间结构并不完全由土壤理化性质和植物群落的空间自相关来解释。样地空间结构仅各独立解释了10%的细菌和真菌β多样性。其他具有空间自相关结构的生境因素，如土壤温度、湿度等，对于九龙山香果树生境土壤微生物物种组成具有重要影响。另外，取样年份对细菌和真菌群落的物种丰富度差异具有显著影响，说明气候波动对细菌和真菌群落物种丰富度的年际变化具有重要影响。树种是影响土壤微生物群落物种组成的重要因素[19]。在九龙山，土壤真菌、细菌β多样性以及细菌的物种周转组分与香果树群落的树种组成呈显著相关，且这一关系不能完全由香果树群落的树种组成的空间自相关因素解释。植物群落的树种组成差异促进了不同香果树生境土壤细菌和真菌群落间的物种替代。土壤是微生物生存的直接环境，土壤理化性质对土壤微生物β多样性具有重要影响[19]。本研究表明：土壤理化性质显著影响细菌和真菌群落β多样性及其物种周转组分，具有较高的独立和总和解释度。说明群落间土壤异质性是导致九龙山香果树生境土壤微生物(尤其是细菌) β多样性和物种周转的主要因素。除了重要的养分因子外，本研究还表明：影响土壤通气性、养分释放和移动以及热特性的土壤孔隙度对细菌和真菌群落的β多样性及其物种周转具有重要影响。虽然海拔梯度显著影响九龙山香果树生境土壤微生物α多样性，但是其对β多样性的影响很小。地形因素中，海拔差异仅与真菌群落物种丰富度差异显著相关，而坡向差异与细菌和真菌的β多样性及其2个组分都无显著关系。今后有必要进一步深入研究地形因子对土壤微生物α和β多样性影响的差异及其机制。
4. 结论
取样年份、海拔、土壤理化性质、中心香果树胸高断面积以及树种组成对浙江九龙山香果树生境土壤微生物群落的α和β多样性具有重要影响。细菌和真菌群落α多样性沿海拔梯度呈现不同的变化规律。此外，细菌和真菌群落β多样性体现出明显的空间结构。
5. 致谢
感谢遂昌县气象局提供九龙山区气象数据。
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图 1 不同退化阶段土壤细菌门干季(A)、湿季(B)相对丰度
Figure 1 Composition of dry (A) and wet (B) season bacteria phylum in soil at different degradation stages
图 2 不同退化阶段土壤细菌属干、湿季群落组成
Figure 2 Composition of dry and wet season bacteria phylum in soil at different degradation stages
图 3 干季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 3 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in dry season
图 4 湿季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析
Figure 4 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in wet season
表 1 样地基本信息
Table 1. Basic information of the sampling sites
湿地类型 经度(N) 纬度(E) 积水深度/cm 优势植物 沼泽湿地(SW) 27°50′43.46″ 99°39′07.86″ 8.5~23.0 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Myripophyllum spicatum、篦齿眼子菜
Potamogeton pectinatus沼泽化草甸(SM) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −19.3~5.5 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅薹草
Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis草甸(M) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −154.0~−123.0 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae 
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表 2 不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数
Table 2. Diversity index of soil bacterial community at different degradation stages
湿地
类型季节 丰富度
指数香农
指数艾斯
指数Chao1
指数辛普森
指数沼泽
湿地干季 4056 Bc 6.16 Ab 5668.94 Bb 5368.14 Bb 0.0135 Aa 湿季 4201 Ac 6.20 Ac 6095.66 Ac 5789.86 Ac 0.0118 Aa 沼泽化
草甸干季 5352 Bb 6.68 Aa 7046.88 Ba 6631.88 Ba 0.0061 Ab 湿季 5697 Aa 7.14 Aa 8095.30 Aa 8121.55 Aa 0.0049 Ab 草甸 干季 5451 Aa 6.83 Aa 7059.57 Aa 6655.28 Aa 0.0041 Bc 湿季 4915 Bb 6.27 Bb 6673.81 Bb 6398.10 Ab 0.0130 Aa 说明：表中数据为平均值。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。
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表 3 不同退化阶段土壤理化性质
Table 3. Soil physical and chemical characteristics at different degradation stages
湿地类型 干湿季 含水量/% 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 沼泽湿地 干季 106.15±0.47 Ba 138.20±4.29 Aa 9.22±0.20 Ba 0.64±0.01 Ac 10.76±0.36 Ab 湿季 117.15±0.60 Aa 144.40±2.52 Aa 11.98±0.29 Aa 0.57±0.01 Aa 9.13±0.20 Ab 沼泽化草甸 干季 23.60±1.52 Bb 81.31±1.45 Bb 4.93±0.31 Ab 0.94±0.02 Aa 11.77±0.29 Aa 湿季 79.31±0.91 Ab 108.28±1.37 Ab 5.83±0.31 Ab 0.56±0.02 Ba 7.82±0.15 Bc 草甸 干季 20.24±1.04 Bb 48.63±6.60 Bc 1.17±0.04 Bc 0.73±0.01 Ab 7.38±0.18 Ac 湿季 25.41±0.50 Ac 54.89±2.13 Ac 3.52±0.05 Ac 0.37±0.02 Bb 13.83±0.13 Aa 湿地类型 干湿季 碳氮比 pH 速效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 沼泽湿地 干季 8.75±0.37 Bb 7.92±0.01 Aa 627.75±2.29 Aa 6.78±0.16 Ab 176.76±0.93 Bb 湿季 14.59±0.55 Aa 7.87±0.02 Aa 494.61±7.02 Ba 7.15±0.20 Ab 297.36±9.03 Ab 沼泽化草甸 干季 9.81±0.47 Ab 6.97±0.04 Bb 414.85±1.37 Bb 7.82±0.14 Ba 225.16±1.29 Ba 湿季 5.27±0.13 Bc 7.82±0.11 Aa 458.39±3.36 Ab 11.88±1.21 Aa 620.46±4.70 Aa 草甸 干季 24.22±3.30 Aa 5.92±0.12 Ac 308.92±1.36 Ac 3.87±0.14 Bc 104.35±1.44 Ac 湿季 9.05±0.35 Bb 5.65±0.08 Ab 300.84±3.44 Ac 4.75±0.05 Ac 149.04±8.64 Ac 说明：表中数据为平均值±标准误。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。
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表 4 土壤主要理化因子与细菌群落多样性的相关性分析
Table 4. Correlation analysis between main soil physical and chemical factors and bacterial community diversity
项目 干季 湿季 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 含水量 −0.99** −0.92** −0.99** −0.99** 0.98** − − − − − 有机质 −0.87** −0.89** −0.85** −0.85** 0.93** − − − − − 全氮 −0.91** −0.90** −0.89** −0.89** 0.96** −0.67* − − − − 全磷 − − 0.71* 0.70* − − − − − − 全钾 − − − − − 0.72* 0.88** 0.83** 0.85** −0.84** 碳氮比 − − − − −0.70* −0.96** −0.79* −0.91** −0.90** − pH −0.86** −0.83** −0.83** −0.83** 0.91** − − − − − 速效氮 −0.96** −0.93** −0.95** −0.94** 0.99** − − − − − 速效磷 − − − − − − 0.88** 0.79* 0.81** −0.90** 速效钾 − − − − − 0.68* 0.91** 0.82** 0.84** −0.91** 说明：*表示显著相关(P＜0. 05)；**表示极显著相关(P＜0. 01)；−表示不相关(P＞0.05)。
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