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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus病是20 世纪80 年代初传入中国的一种毁灭性森林病害，其传播速度快，防治难度大，危害中国松林面积超180 万 hm2，其中，马尾松Pinus massoniana最易受感染，松材线虫病对中国马尾松林业经济发展造成了极大破坏[1]。马尾松具有速生、耐旱等优良特点，松林面积达804 万 hm2，是中国南方荒山造林的先锋树种[2]。近40 a的林业生产实践和研究发现，松树种间和种内不同个体对松材线虫病的抗性存在较大差异，且马尾松群体中存在抗病基因型，因此选育抗性品种是当前治理松材线虫病害最经济有效的途径之一[3]。自2001年开始，中国开展了马尾松松材线虫病抗性育种研究，现已收集保存一批抗松材线虫病马尾松种质资源 [4−6]。种质资源是遗传改良的物质基础，种质资源收集保存的越多，其群体遗传多样性越高，但收集保存的成本也越高。FRANKEL等[7]提出核心种质的概念，即用最小的遗传资源数量和最小的遗传冗余最大限度地代表整个遗传资源的多样性。通过构建核心种质，能最大限度地去除重复和遗传关系较近的种质材料，加强现有抗性马尾松种质资源的有效保护利用，降低管理成本[8]。分子标记法是林木遗传多样性分析、种质资源评价和核心种质库构建常用的方法[9−13]。其中简单序列重复(SSR)分子标记具有多等位基因、共显性和高度多态性等优点，能够直观反映不同种质间遗传信息差异，在遗传育种中得到广泛应用[14]。LÜ等[15]利用 SSR 分子标记数据研究了桉树Eucalyptus cloeziana的遗传多样性并构建了核心种质；唐玉娟等[16]利用12对 SSR 引物对杧果Mangifera indica种质资源的遗传多样性进行分析并构建了分子身份证；HU等[17]利用 SSR 分子标记技术对猕猴桃Actinidia chinensis的遗传多样性进行研究，构建了猕猴桃核心种质。
本研究利用 SSR 分子标记技术对前期筛选获得的103份抗松材线虫病马尾松种质和安徽省林业科学研究院审定的高抗良种进行遗传多样性及亲缘关系分析，并基于M策略和随机取样策略构建核心种质，通过分析不同构建策略的核心种质确定抗性马尾松核心种质的最适取样比例，为抗性马尾松种质资源的合理开发和利用以及挖掘优异基因提供理论支撑。
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2018年，在国家马尾松种质资源库中依据松脂和抗性的关系，从1 207株树中选择120份候选抗性马尾松无性系，同年在松材线虫病重灾区严重感染林分中收集健康树242份，并将所有无性系嫁接保存于浙江省临海市林业技术推广和场圃旅游服务总站(28°88′N，121°01′E)。2018—2020年连续3 a高强度对收集区内的候选抗性马尾松无性系进行人工接种松材线虫测定，筛选存活健康株系，共获得103份抗性马尾松无性系，另取安徽省林业科学研究院审定的抗松材线虫病良种(为目前中国所有的抗松材线虫病良种)作为对照。合计114份，其中浙江37份、江西26份、安徽42份、福建6份、贵州1份、广西2份。采集抗性样株幼嫩针叶，在−80 ℃冰箱中保存，各试验材料编号及来源见表1。
表 1 材料编号及来源
Table 1. Test materials’ number and source
编号 来源 编号 来源 编号 来源 编号 来源 1 广西贵港 35 安徽黄山 DAC12 浙江临海 HGS5 浙江临海 2 广西桂平 36 安徽黄山 DAC13 浙江临海 HGS6 浙江临海 3 贵州黎平 37 安徽全椒 DAC15 浙江临海 HGS8 浙江临海 4 福建南平 38 安徽泾县 DAC17 浙江临海 HGS9 浙江临海 6 福建南平 39 安徽休宁 DAC18 浙江临海 HGY1 浙江临海 7 安徽休宁 40 安徽休宁 DAC19 浙江临海 LS001 浙江临海 9 安徽休宁 41 安徽休宁 DAC20 浙江临海 LS003 浙江临海 10 安徽祁县 42 安徽休宁 DAC21 浙江临海 LS005 浙江临海 11 福建南平 43 安徽休宁 DAC22 浙江临海 LS007 浙江临海 12 浙江淳安 44 安徽休宁 DAC23 浙江临海 LS008 浙江临海 13 浙江淳安 45 安徽休宁 DAC24 浙江临海 LS009 浙江临海 14 福建南平 46 安徽休宁 DAC26 浙江临海 LS010 浙江临海 15 浙江松阳 47 安徽休宁 DAC34 浙江临海 XJ003 江西峡江 17 福建南平 48 安徽休宁 DLS27 浙江临海 XJ004 江西峡江 19 江西婺源 49 安徽休宁 DLS28 浙江临海 XJ005 江西峡江 20 福建南平 71 江西分宜 DLS29 浙江临海 XJ014 江西峡江 21 安徽广德 114 江西分宜 DLS30 浙江临海 AH1 安徽广德 22 安徽广德 161 江西分宜 DLS31 浙江临海 AH2 安徽滁州 23 安徽广德 231 江西分宜 DLS32 浙江临海 AH3 安徽黄山 24 安徽广德 242 江西分宜 DLS33 浙江临海 AH4 安徽休宁 25 安徽广德 305 江西分宜 DLS35 浙江临海 AH5 安徽广德 26 安徽广德 355 江西分宜 DLS36 浙江临海 AH6 安徽广德 27 安徽广德 398 江西分宜 DLS37 浙江临海 AH7 安徽广德 28 安徽广德 413 江西分宜 DLS38 浙江临海 AH8 安徽泾县 29 安徽广德 461 江西分宜 DLS40 浙江临海 AH9 安徽广德 30 安徽和县 473 江西分宜 HGS11 浙江临海 AH10 安徽休宁 31 安徽和县 485 江西分宜 HGS2 浙江临海 AH11 安徽广德 32 安徽和县 486 江西分宜 HGS3 浙江临海 34 安徽和县 490 江西分宜 HGS4 浙江临海 说明：AH1~AH11为 安徽省林业科学研究院审定的马尾松抗松材线虫病良种皖马抗1~11号。 -
马尾松针叶基因组DNA采用北京艾德莱生物科技有限公司生产的改良CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取。利用超微量分光光度计，根据在260 nm的吸光度D(260)和D(260)/D(280)确定DNA样品的纯度和质量浓度，经检验合格后的DNA用TE溶液或去离子水(灭菌后)稀释至20~50 mg·L−1，置于−20 ℃的冰箱保存备用。
参考董虹妤等[18]和YANG等[19]使用的马尾松 SSR 引物，用质量浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选条带清晰且多态性较高的SSR引物(图1)，最终筛选出具有高多态性引物14对(表2)，引物序列由浙江尚亚生物技术有限公司合成。
图 1 引物多态性检测图
Figure 1. Primer polymorphism detection diagram
表 2 14对SSR引物信息
Table 2. 14 pairs of SSR primer information
编号 引物名称 正向引物(5´→3´) 反向引物(5´→3´) 1 H03 CTCCAAAGGCGAGACTGC ACGAAAGCCAAGCTGAAC 2 D04 AGGATGGTATGGTCGTGG CCCTTCTTCGCTCTGTGA 3 H04 AAGAAGCGATCTGAGATGACTAA CTGTCATTGATTGTTTCCTTTTG 4 B05 CCGTGCCTTCAGCATCTTCT CAGTGGATCTGTCACCTCCTCAT 5 F05 AGAAGAAGAGCAGCAGTTTC GGTTTTCCATTGTTCTCACT 6 H05 GTGCCTTCAGCATCTTCTAC ATCTGTCACCTCCTCATCTT 7 B06 TATTAGCACCCCTCCAAAG TGGGGTAGAAGAATCGTAAGT 8 D06 GATTCGGCTTCGTGACCTT CCCCCATAACCCCTGTC 9 F06 AAGGACTTACAGAGGTTGGGTT GCTGCGACGAGCGTTTCT 10 H06 TTCCTACCGCTGGGTTCTTG GACCTGACCTCGGGCATTAC 11 D07 TCGCCTGGGCTTTGTCTG GCGGGTTGCATATTTGGTG 12 F07 CAGCATCTTCTACATCTGAGTC CAATCAAAAAGACTACATCACT 13 H07 CACCATCGGTTTCTCCATC CTCAATCAAAAAGACTACATCACT 14 D08 TGCTTTCAGAAGGATAAGGGGT AAATACAATACTGGGTTTCGCC -
利用选取的14对 SSR 引物对114份马尾松DNA样本进行PCR扩增，设定本研究的反应体系为25.0 μL：2×Taq Plus Master Mix (Nazyme Code：P211-03)12.5 μL，引物F和R (10 μmol·L−1)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增反应在Takara PCR Thermal cycler上进行，其程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。所得PCR产物采用Qsep100全自动毛细管电泳核酸分析仪进行检测和基因分型。
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利用GenAlex 6.5[20]计算各位点的遗传多样性参数，包括等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon’s多样性指数(I)、近交系数(Fis)、固定指数(F)和基因流(Nm)，并对收集的抗松材线虫病马尾松种质进行主坐标分析(PCoA)。采用Cervus 2.0[21]获得微卫星位点的多态信息含量(PIC)。利用Structure 2.3.4[22]对抗性马尾松种质资源进行分类，推测最佳聚类组群数目，确定群体结构，并对各亚群的遗传多样性参数进行分子方差分析(AMOVA)。
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对抗松材线虫病马尾松种质进行群体结构分析后，利用Power Core[23]和Core Finder[24]对各亚群基于不同算法构建核心种质。其中，Power Core是利用随机取样策略和启发式算法，寻找从初始阶段到最终阶段的最优路径进行核心集合选择；Core Finder基于NP-完全覆盖问题，采用拉斯维加斯式(LasVegas-style)随机算法的M策略进行样本选择。在构建核心种质过程中，Power Core和Core Finder会自动生成合理的取样比例。最后利用SPSS 26.0和Excel中t检验对原有种质与核心种质各遗传多样性指标进行差异显著性分析，同时运用PCoA和Powermarker[25]对所构建的核心种质构建UPGMA进化树，确认构建的核心种质的代表性。
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由表3可知：14对 SSR 引物在114份抗松材线虫病马尾松样本中共检测出115个等位位点，Na为5~11，平均为8.17。所有材料的Ne为3.45~8.05，平均为5.54。Ho和He的分别为0~0.57和0.51~0.73，He均值(0.64)高于Ho均值(0.06)，Fis平均为0.92，综合表明该抗性马尾松种质中存在杂合子缺失现象。PIC为0.82~0.95，平均为0.9，I为1.15~1.90，平均为1.51，表明所选引物多态性高。
表 3 不同SSR位点的遗传多样性统计
Table 3. Genetic diversity of different SSR microsatellite loci
位点 Na Ne Ho He PIC I Fis F Nm H03 5 3.54 0.00 0.59 0.83 1.18 1.00 1.00 0.68 D04 7 4.62 0.01 0.62 0.89 1.38 0.98 0.98 0.60 H04 9 5.51 0.04 0.65 0.93 1.55 0.94 0.95 0.70 B05 8 5.93 0.00 0.66 0.92 1.57 0.99 0.99 0.78 F05 6 3.57 0.00 0.51 0.82 1.15 0.99 0.99 0.43 H05 9 6.46 0.00 0.66 0.95 1.59 1.00 1.00 0.63 B06 9 5.87 0.01 0.65 0.92 1.54 0.99 0.99 0.67 D06 7 4.72 0.00 0.62 0.90 1.39 1.00 1.00 0.55 F06 7 5.09 0.02 0.64 0.93 1.47 0.98 0.98 0.62 H06 11 8.05 0.57 0.73 0.93 1.90 0.21 0.19 0.92 D07 10 6.35 0.01 0.66 0.93 1.62 0.98 0.98 0.64 F07 10 6.99 0.02 0.68 0.93 1.70 0.97 0.98 0.69 H07 11 7.45 0.14 0.70 0.93 1.79 0.79 0.76 0.76 D08 6 3.45 0.00 0.60 0.82 1.25 0.99 0.99 0.50 平均 8.17 5.54 0.06 0.64 0.90 1.51 0.92 0.91 0.66 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；PIC. 多态信息含量；I. Shannon’s多样性指数；Fis. 居群近交系数；F. 固定指数；Nm. 基因流。 -
Structure分析得出的结果经Structure Haevester处理后发现(图2A)：lnP(D)(马尔科夫链不作数迭代后所得的对数似然值)持续增大，没有拐点，可用∆K [L(K)在连续K之间变化率的增量]来确定最优分组数(K)。由图2B可知：当K=4时，∆K取得最大值，表明参试的114份马尾松样本被划分为4个亚群。亚群Ⅰ(绿色)包含了12份种质资源，其中2份来自广西，1份来自贵州，3份来自福建，2份来自安徽，4份来自浙江；亚群Ⅱ(黄色)包含24份种质资源，其中8份来自安徽，7份来自江西，9份来自浙江，该亚群有12份抗性马尾松种质掺杂有来自红色部分的基因；亚群Ⅲ(红色)包含了29份种质资源，其中10份来自安徽(均为皖马抗良种)，8份来自江西，11份来自浙江，共有12份抗性马尾松种质掺杂有来自黄色部分的基因；亚群Ⅳ(蓝色)包含49份种质资源，其中2份来自福建，21份来自安徽(其中1份为皖马抗良种)，11份来自江西，15份来自浙江(图3)。由Structure输出的分组结果可知(表4)：筛选获得的抗性马尾松种质中有75.4%的个体样本隶属不同亚群的比例(Q)＞0.8，仅有12.3%的个体Q＜0.6，表明抗性马尾松种质群体结构较强，不同来源的个体被聚在相同的遗传结构中表明不同省间的马尾松存在基因渗入现象。
图 2 lnP(D)和∆K随K变化的折线图
Figure 2. Line plots of lnP(D) and ∆K as a function of K
图 3 114份抗性马尾松样本的Structure聚类图
Figure 3. Structure cluster diagram of 114 samples of resistant P. massoniana
表 4 各亚群基因型情况
Table 4. Number of genotypes in each cluster
亚群 各亚群种质数量 各亚群基因型数 Q＜0.6 Q＞0.8 Ⅰ 12 0 12 Ⅱ 24 9 12 Ⅲ 29 5 17 Ⅳ 49 0 45 说明：Q为样本隶属不同亚群的比例。 基于遗传距离矩阵对抗性马尾松材料进行主坐标分析(PCoA)。由图4可知：全部马尾松种质资源可大致分为3组，主坐标1和2分别解释了位点信息数据中10.45%和6.74%的变异。基于抗性马尾松114份样本主坐标分析图可知：大部分地理来源一致的抗性马尾松种质分布比较集中，但来自安徽、江西、浙江的部分抗性马尾松种质在3个组中均有分布。结合群体结构分析结果可知：114份抗性马尾松种质资源的分布情况基本符合群体结构分析。
图 4 抗性马尾松114份样本主坐标分析
Figure 4. Principal coordinate analysis of 114 samples
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由表5可见：抗性马尾松种质各亚群的遗传多样性整体水平较高。亚群Ⅳ的等位基因数在4个亚群中最大(13.43)，亚群Ⅰ具有最低的等位基因数(6.07)。抗性马尾松4个亚群所包含的马尾松个体数不同，但亚群间遗传多样性水平差异不明显。亚群Ⅳ的Ne最高，为7.14，而最低的是亚群Ⅰ，为4.87。亚群Ⅳ的Ho和He均最高，但与具有最小值的亚群Ⅲ差异不显著，分别高0.03和0.15。
表 5 马尾松各亚群遗传多样性水平
Table 5. Genetic diversity parameters for all populations of resistant P. massoniana
亚群 样本量/份 Na Ne I Ho He F Ⅰ 12 6.07 4.87 1.64 0.06 0.78 0.93 Ⅱ 24 9.57 6.48 1.88 0.08 0.78 0.91 Ⅲ 29 7.50 4.88 1.59 0.03 0.70 0.96 Ⅳ 49 13.43 7.14 2.16 0.06 0.85 0.93 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；I. Shannon’s多样性指数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；F. 固定指数。 AMOVA方差分析表明(表6)：抗性马尾松遗传变异14%存在于亚群间，而亚群内变异为80%，表明亚群内的遗传变异是抗性马尾松变异的主要来源。4个亚群间FST为0.143，表明亚群间存在中等程度遗传分化。
表 6 基于微卫星数据的遗传变异分析
Table 6. Analysis of molecular variance from microsatellite data using GenALEx
变异
来源自由度 方差
总和平均
方差方差
分量变异百
分比/%P 亚群间 3 184.865 61.622 0.957 14 ＜0.01 亚群内 110 1 216.328 11.058 5.323 80 ＜0.01 FST 0.143 说明：FST为遗传分化系数。 -
利用M策略和随机取样策略构建核心种质的遗传多样性指标见表7。结果显示：基于随机取样策略的Power Core和基于M策略的Core Finder分别筛选得到的核心种质均保留了原有种质100%的等位基因数。但Core Finder核心种质包含的种质(72份)少于Power Core (79份)，且两者间各遗传多样性参数差异不显著(P＞0.05)。综合以上分析表明：选择M策略抽取72份抗性马尾松种质能够以最小的种质份数最大程度地代表收集区内抗性马尾松种质资源的遗传多样性。利用M策略构建的核心种质中包含广西2份(100.0%)、贵州1份(100.0%)、福建4份(66.7%)、安徽33份(其中4份为皖马抗良种)(78.6%)、江西8份(30.8%)和浙江24份(64.8%)种质材料。
表 7 不同策略构建的核心种质遗传多样性指标比较
Table 7. Comparisons of genetic diversity index of core collections constructed by different tactics
构建方法 种质数/份 Na Ne I Ho He F Nm PIC 原有种质 114 115 5.54 1.51 0.06 0.64 0.91 0.66 0.90 M策略 72 115 5.30 1.43 0.06 0.63 0.91 0.61 0.92 随机取样策略 79 115 5.53 1.48 0.06 0.64 0.91 0.65 0.92 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；PIC. 多态性信息含量；I. Shannon’s多样性指数；Fis. 居群近交系数；F. 固定指数；Nm. 基因流。* P＜0.05， **P＜0.01。 由表8可见：构建的72份抗性马尾松核心种质占114份原有种质的63.16%，其Na均值、Ne均值、I均值分别占原有种质相应遗传参数的100.00%、95.67%和94.96%。t检验结果表明：列入研究的抗性马尾松种质与入选的核心种质的遗传多样性无显著差异(P＞0.05)，说明本研究基于M策略构建的抗性马尾松核心种质能充分代表列入研究的原抗性马尾松种质资源的遗传多样性，剔除了与114份原有种质重复或亲缘关系较近的材料。
表 8 72份抗性马尾松核心种质与114份原有种质遗传多样性对比
Table 8. Comparison of genetic diversity between 72 core germplasm and 114 original germplasm of resistant P. massoniana
种质 种质数/份 Na Ne I Ho He F Nm PIC 原有种质 114 25.29 5.54 1.51 0.06 0.64 0.91 0.66 0.90 核心种质 72 25.29 5.30 1.43 0.06 0.63 0.91 0.61 0.92 保留比例/% 63.16 100.00 95.67 94.96 100.00 98.12 99.57 92.54 100.00 t 0.000 −0.652 −1.428 0.059 −0.826 −0.052 0.014 −0.152 P 1.000 0.525 0.177 0.953 0.424 0.960 0.989 0.882 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；PIC. 多态信息含量；I. Shannon’s多样性指数；Fis. 居群近交系数；F. 固定指数；Nm. 基因流。 PCoA分析(图5)显示：抗性马尾松核心种质均匀分布在整个马尾松种质资源中，表明本研究所构建的抗性马尾松核心种质具有很好的代表性。UPGMA进化树(图6)显示：72份抗性马尾松可分为3个类群，其中类群Ⅰ的11份抗性马尾松种质全部位于亚群Ⅰ(91.7%)，类群Ⅱ的30份抗性马尾松种质全部位于亚群Ⅳ(61.2%)，类群Ⅲ的抗性马尾松种质18份位于亚群Ⅱ(75.0%)，其余13份位于亚群Ⅲ(44.8%)。结合结构分析可知：位于亚群Ⅱ中混杂有黄色和红色的核心种质与亚群Ⅲ中的核心种质聚为一个亚类，亚群Ⅱ中以黄色为主的核心种质聚为另一个亚类，但抗性马尾松核心种质的UPGMA聚类结果与列入研究的原有种质结构分析和PCoA分析结果基本一致，进一步对核心种质进行了确认。
图 5 72份核心种质与114份原有种质主坐标分析
Figure 5. Principal coordinate analysis of 72 core germplasm and 114 original germplasm
图 6 72份抗性马尾松核心种质的UPGMA聚类图
Figure 6. UPGMA clustering map of 72 samples of resistant P. massoniana
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遗传多样性在生物育种工作中至关重要，是评价生物多样性的重要组成部分，物种的遗传多样性越高或遗传变异越丰富，其对环境变化的适应能力也就越强[26]。本研究利用14对 SSR 引物对经高强度人工接种松材线虫后存活下来的103份马尾松种质和安徽省林业科学研究院审定的11份高抗良种进行遗传多样性和群体结构分析。Na是衡量SSR位点多态性高低的重要指标，其中所有种质的平均Na为8.17，高于沈敬理等[27]利用SSR分子标记技术对131个马尾松无性系的研究(Na=3.67)，可能是本研究选择的 SSR 引物具有较高多态性和基因分型检测手段不一样造成的。Ne、He、I等是评价遗传多样性的重要指标。高景斌等[28]利用 SCAR 分子标记对抗性马尾松材料进行遗传多样性研究，其Ne和I分别为1.51和0.46；YANG等[19]运用20对 SSR 引物分析马尾松二代亲本种质的遗传多样性，其Ne为3.01， I为1.26，PIC为0.89；董虹妤等[18]对选自马尾松第2代育种群体的12份马尾松材料运用13对 SSR 引物进行研究，其中Na和I分别为3.17和0.47。与上述研究结果相比，本研究所选择的14对 SSR 引物能有效用于检测马尾松的遗传多样性(Ne=5.54、He=0.64、I=1.51、PIC=0.90)，同时表明筛选获得的103份抗性马尾松种质和安徽省林业科学研究院审定的11份良种具有丰富的遗传多样性，在未来的抗性育种进程中具有很大的遗传增益潜力。
Structure结构分析、UPGMA聚类分析和PCoA分析被广泛应用于推断植物的群体结构，但三者的统计原理不同。PCoA分析是一种非约束性的数据降维方法，通过对特征值和特征向量进行排序来寻找主坐标，从而有效地绘制所分析的样本；Structure结构分析基于贝叶斯模型的计算方法，根据基因型信息对多组样本进行分类；UPGMA聚类分析利用非加权组平均法对参试样本进行层次聚类。PCoA和UPGMA聚类分析可直观看到材料间的分类关系，但Structure结构分析能清晰地反映材料间的遗传背景和基因交流情况[29−30]。总体而言，Structure结构分析、UPGMA聚类分析和PCoA分析相辅相成，两两使用有助于全面了解不同样本间的遗传差异。本研究Structure结构分析结果表明：114份抗性马尾松种质资源被分成4个亚群，而PCoA分析将所有抗性马尾松种质划分为3组，将结构分析所得4个亚群中的亚群Ⅱ和亚群Ⅲ合并为一组，可能是因为这2个亚群中的部分抗性马尾松种质Q＜0.6，存在一定频率的基因交流和渗透。在结构分析中，每个亚群内都包含来自不同地区的个体，地理来源一致的抗性马尾松种质并没有完全聚在一起，这可能是由于不同地区育种者之间亲本交换或频繁的人工引种，导致新环境中种质的遗传信息发生了改变。安徽省林业科学研究院审定的11份抗松材线虫病良种是中国所有的抗松材线虫病马尾松优良种质，已在安徽省松材线虫病疫区进行了大面积的林相改造和造林，在松材线虫病防控中发挥了重要作用。这11份抗松材线虫病良种主要分布在亚群Ⅲ中，仅与19份抗性马尾松种质聚为一个亚群，这表明本研究筛选获得的大部分抗性马尾松优良品系与审定的良种遗传关系较远，具有较低的遗传相似性。因此，本研究筛选获得的103份抗性马尾松种质与审定的11份良种遗传信息同质性程度较低，且具有较高的遗传多样性，可保障今后营造的抗性林在生态系统上具有较强的稳定性。
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传统的核心种质构建方法是对比不同种质资源在植物学、形态学等性状上的差异来剔除亲缘关系相近的样本并且抽取核心种质，但表型性状容易受到外界因素影响而表现不稳定[31]。基于分子标记数据构建核心种质可减少温度、气候、环境等外界因素的影响，能够很好地作为植物形态和生理特性的有效补充。本研究根据SSR分子标记基因分型数据，利用Core Finder和Power Core，基于M策略和随机取样策略构建抗松材线虫病马尾松核心种质。综合对比分析不同构建策略，得到72份抗性马尾松核心种质，其保留了列入研究的原有种质全部的等位基因数，且各遗传多样性参数如Ne、I、He、PIC分别为5.30、1.43、0.63、0.92，均与114份原有种质的遗传多样性参数无显著差异(P＞0.05)。本研究构建的72份抗性马尾松核心种质在广西、贵州、福建、安徽、江西和浙江6省中均有分布，但江西抗性马尾松核心种质抽取比例为30.8%，低于其他省份抗性马尾松种质的入选比例，表明该省抗性马尾松样本存在较高的遗传相似性。结合结构分析可知：72份抗性马尾松核心种质全面涵盖了列入研究的抗性马尾松种质的4个亚群，亚群Ⅲ抗性马尾松核心种质入选比例最低(44.8%)，表明该亚群抗性马尾松种质遗传信息比较一致；亚群Ⅰ的抗性马尾松核心种质入选比例最高(91.7%)，表明该亚群可能存在最丰富的遗传多样性。
取样比例的大小是核心种质库能否构建成功的重要因素。WANG等[32]和ESCEIBANO等[33]认为核心种质取样比例为5%~40%，大多数为5%~15%。李魁鹏等[34]利用SSR分子标记从864份杉木Cunninghamia lanceolata中筛选获得了80份核心种质，占原有种质的9.3%；黄小凤等[35]利用SNP分子标记从221份荔枝Litchi chinensis品种(品系)中获得了44份核心种质，占原有种质的20%；张馨芳等[36]基于SSR分子标记数据，从161份板栗Yanshan chestnut中构建了含46份种质的核心种质，取样比例为28.6%。但本研究核心种质取样比例为63.13%，高于其他木本植物的取样比例。李自超等[37]认为核心种质取样比例通常由原有种质的数量、群体结构和遗传多样性水平等决定，对于遗传多样性丰富、原有种质数量较小的群体，可适当增大取样比例。
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利用14对 SSR 引物对114份抗松材线虫病马尾松种质的遗传多样性分析表明：所选抗性马尾松种质具有丰富的遗传多样性(Na=8.17，Ne=5.54，He=0.64，I=1.51，PIC=0.90)，且本研究筛选的103份抗性马尾松材料遗传结构简单、遗传变异丰富，可用于开展马尾松重要性状的关联分析研究。根据SSR分子标记数据基于M策略构建了含有72份材料的抗性马尾松核心种质，保留了列入研究的原有种质100%的等位基因。经过t检验、PCoA分析和UPGMA聚类分析，构建的抗性马尾松核心种质与列入研究的原有种质之间无显著差异，剔除了遗传相近的材料，具有良好的代表性。
Genetic diversity analysis and core collection of pinewood nematodiasis-resistant Pinus massoniana germplasm resources
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摘要:
目的 对来自安徽省林业科学研究院和异地保存在浙江省临海市林业技术推广和场圃旅游服务总站的114份抗松材线虫Bursaphelenchus xylophilus病马尾松Pinus massoniana种质进行遗传多样性与群体结构分析，构建抗性马尾松核心种质库。 方法 对114份抗性马尾松种质进行检测，使用分子生物学软件计算遗传多样性参数，并进行主坐标(PCoA)和群体结构分析。利用M策略和随机取样策略分别构建核心种质，分析不同核心种质的的遗传多样性参数，确定最适合的构建方法。 结果 114份抗性马尾松种质共检测到115个等位基因，平均有效等位基因数(Ne)为5.54，平均Shannon’s多样性指数(I)为1.51，平均多态信息含量(PIC)为0.90，结果表明其具有较高的遗传多样性水平。群体结构分析将114份抗性马尾松种质分为4个亚群，主坐标分析结果与上述基本一致。根据遗传多样性参数和抽样数量综合考虑，M策略构建的核心种质能以最小的种质数保留原有种质最大的遗传多样性，为最佳的取样策略。利用该策略得到了72份核心种质，其保留了原有种质100%的等位基因数，Ne、I、期望杂合度(He)、PIC等遗传参数的保留率分别为95.67%、94.96%、98.12%和100.00%，将构建的核心种质与原有种质进行t检验、PCoA分析和UPGMA聚类分析，结果表明两者间的遗传多样性无显著差异。 结论 114份抗性马尾松种质遗传多样性水平较高，构建的72份抗性马尾松核心种质，去除了遗传冗余，有利于抗性马尾松种质资源的有效保护和科学利用，可为优异基因发掘和新品种选育提供参考。图7表8参37 Abstract:Objective This study, with analyses conducted of the genetic diversity and population structure of 114 germplasm resources of pinewood nematodiasis-resistant Pinus massoniana from Anhui Academy of Forestry and Forestry Technology Extension and Farm tourism Service Center of Linhai in Zhejiang Province, and the construction of a core collection of the germplasm resources, is aimed to provide a theoretical basis for the scientific management and efficient utilization of germplasm resources of P. massoniana. Method First, a total of 114 resistant P. massoniana germplasms were detected before their principal co-ordinates analysis (PCoA), population structure and genetic diversity parameters were calculated by bioinformatics software. Then, the core collection was constructed by using M strategy and random sampling strategy so that a comparative analysis was conducted of the genetic diversity indicators of different core collection in order to determine the most suitable construction method. Result 115 alleles were detected in 114 resistant P. massoniana germplasms, with an average effective allele number (Ne) of 5.54, an average Shannon’s diversity index (I) of 1.51, and an average PIC value of 0.90 for polymorphic information content, which had a high genetic diversity. The population structure analysis based on Structure software showed that the 114 resistant P. massoniana germplasm resources were divided into four subgroups, and the result of principal coordinate analysis was basically consistent with the above. Based on the genetic diversity parameters and the sampling quantity, the core collection constructed by the M strategy could retain the maximum genetic diversity of the original germplasm with the minimum sampling quantity, which was the optimal sampling strategy. 72 core collections were obtained using this strategy, which retained 100% alleles of the original germplasm, with the ration rates of Ne, I, expected heterozygosity (He), PIC being 95.67%, 94.96%, 98.12%, 100.00%. No significant difference in genetic diversity was shown between the constructed core germplasm and the original germplasm according to the PCoA and UPGMA cluster analysis. Conclusion The level of genetic diversity of 114 resistant P. massoniana germplasm was high. The 72 core germplasm of resistant P. massoniana were constructed to remove genetic redundancy, which is conducive to the effective conservation and scientific utilization of resistant P. massoniana germplasm resources, and lays the foundation for excellent gene discovery and new cultivar selection. [Ch, 7 fig. 8 tab. 37 ref.] -
Key words:
- Pinus massoniana /
- pine wood nematodiasis-resistance /
- SSR /
- genetic diversity /
- core collection
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梅Prunus mume隶属于蔷薇科Rosaceae李属Prunus，原产中国南方，距今已有 3 000 多年的栽培历史[1]。目前，食用花卉的风潮日益兴起，花茶越来越受到欢迎，百合Lilium、菊花Chrysanthemum×morifolium、桂花Osmanthus fragrans等食用花卉已被应用于较多产业[2] ，梅花茶等相关制品具有巨大的开发前景和市场。梅花营养丰富，主要包括黄酮类、苯丙烷类、有机酸类、挥发性物质等化学成分，其中绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷质量分数较高[3]。以异槲皮苷、金丝桃苷为代表的黄酮类化合物具有抗炎、抗抑郁等药理作用，以绿原酸为代表的苯丙烷类化合物具有抗氧化、抑制黑色素形成等作用[4−5]。采摘后的梅花鲜花容易发生虫蛀、霉变，干燥加工能有效避免鲜花变质[6]。在干燥过程中，花茶的色、香、味和活性成分易受影响，干燥方式是梅花花茶品质最关键的影响因素。目前国内对梅花干燥制茶方面的研究相对缺乏，不同干燥方法对梅花花茶各方面品质的影响的研究报道甚少。
自然干燥、热风干燥、微波干燥等传统干燥方式[7]操作简单、成本低、耗时短，但存在品质差等缺陷。真空冷冻干燥是将物料降温冻结，在真空条件下使物料中的水分由冰直接升华为水蒸气被排除的技术[8]。它可使干制品最大限度地保持原有的色、香、味品质及营养成分，但设备投资大、能耗高、干燥时间长[9]。吴一超等[10]采用5种干燥方式对丹参Salvia miltiorrhiza茎叶干燥，得出真空冷冻干燥有利于保存丹参茎叶的酚酸及抗氧化活性成分，但成本高，仅适用于生产高品质的产品，40 ℃烘干法简便、高效、成本低，适合丹参茎叶的规模化加工。复合干燥是将多种干燥方式结合起来，优化干燥工艺，实现优势互补[11]。商涛等[12]采用微波热风联合干燥与热风干燥、微波干燥对比，结果表明：干燥时间、总色差值最小，黄芩苷质量分数和综合质量评分最高。WANG 等[13]采用不同温度热风干燥和微波结合热风干燥处理菊花，结果表明微波 30 s 与热风 75 ℃联合干燥后的菊花含有较高活性成分，整体构象变化小。由上述研究结果可知：真空冷冻干燥与复合干燥相较于其他干燥方式具有明显优势，但这2种方法的优劣以及对梅花进行干燥处理的效果未见报道。
本研究采用热风干燥法、微波干燥法、复合干燥法、真空冷冻干燥法对不同品种的梅花鲜花进行处理，测定了不同干燥处理后梅花的收缩率、花色表型等外在特征，以及花色成分、挥发性成分、抗氧化能力、绿原酸等指标。进一步使用熵权与变异系数组合赋权法计算耦合权重系数进行综合评分，并利用加权逼近理想解排序法(weighted approximation ideal solution ranking method，TOPSIS)验证评价模型[14]，获得最优的干燥方式，为梅花花茶的制作提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学梅花种质资源库选择‘东方朱砂’‘Dongfang Zhusha’、‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’、‘晓红宫粉’‘Xiaohong Gongfen’、‘粉皮宫粉’‘Fenpi Gongfen’、‘粉台玉蝶’‘Fentai Yudie’、‘月光玉蝶’‘Yueguang Yudie’、‘久观绿萼’‘Jiuguang Lve’、‘素玉绿萼’‘Suyu Lve’等8个品种盛开期花朵作为试验材料。所有梅花花朵性状正常，花色鲜艳均匀，采摘时环境温度为0~15 ℃。
1.2 干燥处理
梅花干燥处理采用包括热风干燥法、微波干燥法、复合干燥法及真空冷冻干燥法。热风干燥法：将新鲜的花朵置于60 ℃热风烘箱中，烘干3 h。微波干燥法：将样品置于微波炉中，设置功率为300 W，干燥20 min。复合干燥法：首先将样品置于功率为300 W的微波炉中，干燥10 min，然后取出样品置于60 ℃热风烘箱中，时间1 h。真空冷冻干燥法：将真空冷冻干燥机设置温度为−66 ℃、气压为4 Pa，取鲜样置于其中干燥22 h。对照组(ck)为鲜样梅花样品。
1.3 色表型测定
使用英国皇家园艺协会比色卡(RHSCC)进行比对测定。用色差仪(COLOR READER CR-10 PLUS)测定梅花花瓣的色差参数，包括亮度(L*)、红度(a*)、黄度(b*)、彩度(C*)值和色调角(h)。根据滕彩玲等[15]的方法计算色差值，公式如下：$ \Delta E = \sqrt {{{\left( {L - {L_0}} \right)}^2} + {{\left( {a - {a_0}} \right)}^2} + {{\left( {b - {b_0}} \right)}^2}} $。其中：∆E表示总色差，L、a、b分别表示样品的亮度值、红绿值、黄蓝值，L0、a0、b0分别表示对照样品的亮度值、红绿值、黄蓝值。
1.4 失水率与收缩率
根据刘盼盼等[16]的方法计算失水率。用游标卡尺测量梅花干燥前后最大直径，取平均值，6次生物学重复。收缩率计算公式为S=(dg−dt)/dg。其中：S为收缩率；dg和 dt分别为新鲜样品和干制样品的最大直径(cm)。
1.5 抗氧化性测定
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力根据TURKOGLU等[17]的方法测定。2,2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力根据THANA等[18]的方法测定并做调整。根据不同浓度与相应的清除率分别计算半数抑制质量浓度(IC50)，比较抗氧化能力强弱。
1.6 挥发性成分分析
每次取3 朵梅花花朵放入22 mL的采样瓶，密封瓶盖平衡10 min。将固相微萃取SPME纤维头插入采样瓶中，置于花朵上方2 cm，吸附30 min，重复3 次。色谱条件与质谱条件根据ZHANG等[19]和HAO等[20]的方法并做调整。
1.7 花色成分分析
称取0.3 g花瓣并研磨成粉末，加入提取液(三氟乙酸∶甲醇∶甲酸∶水=1∶70∶2∶27，体积比)中，置于 4 ℃ 冰箱内提取24 h，使用超声波设备超声处理20 min，使用转速为4 000 r·min−1的离心机离心10 min，将上清液用0.22 μm 孔径的尼龙微孔滤器过滤后，用于花青素苷与类黄酮的定性及定量分析。采用UPLC-Triple-TOF/MS液质联用仪进行测定，色谱柱为waters HISS-SB C18 (100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，进样量为2 μL，柱温为25 ℃，流速为 0.4 mL·min−1。流动相组成为A：体积分数为0.1%甲酸水，B：体积分数为0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度为0~11.0 min，0~95%B；11.0~12.0 min，95%B；12.0~12.1 min，95%~5%B；12.1~15.0 min，5%B。在 520、350 nm波长下获得色谱图。
1.8 营养成分分析
可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250法测定[21]；新绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷与金丝桃苷质量分数根据1.7成分分析方法测定。
1.9 熵权-变异系数法计算及 TOPSIS 法验证
使用熵权与变异系数组合赋权法计算耦合权重系数，进行综合评分，比主观权重更加可靠客观[22]，可避免单一客观权重分配不合理的问题。选择失水率、收缩率、色差值、DPPH和ABTS自由基清除能力、总黄酮质量分数等作为评价指标，根据LIU等[23]的方法计算熵权法权重(wj1)。根据李叶贝等[24]的方法计算评价指标的变异系数法权重(wj2)。根据拉格朗日乘子法，得到优化后的耦合权重(wj)。为了避免评价的主观性[25]，以原始数据和耦合权重的乘积作为评价数据，计算得到不同干燥方法与最优方案和最劣方案的距离C+和C−，以及待评价方案与正理想解的相对接近程度C，根据C的大小评价不同干燥方式的优劣。
2. 结果与分析
2.1 干燥后梅花表型变化
不同品种的梅花经不同方法干燥处理后，其外观特征如图1所示。比色卡测定结果(表1)表明：8个不同品种的梅花花色范围为 61B~155C，分为白色、粉红色、紫红色等3个色系。经干燥处理后，白色系品种梅花，转变为黄绿色系，花色范围为2D~N199D；粉红色和紫红色系品种梅花转变为紫红色系，花色范围为64A~84C。白色系‘粉台玉蝶’‘月光玉蝶’‘久观绿萼’‘素玉绿萼’，紫红色系‘骨红朱砂’的色差值测定结果(图2)表明：微波干燥后花色色差值最大，最大值为真空冷冻后的 3.49 倍；粉红色系‘晓红宫粉’‘粉皮宫粉’在热风干燥后花色色差值最大，色泽变化最大。对比其他3种干燥方法，真空冷冻干燥在‘东方朱砂’‘晓红宫粉’‘粉台玉蝶’‘月光玉蝶’‘久观绿萼’品种上保持色泽和形态上表现最佳，色差值显著低于其他3种干燥方法。
图 1 不同干燥方法处理后梅花的形态Figure 1 Morphology of P. mume flowers after different drying methods表 1 不同干燥方法处理后梅花花色变化Table 1 Changes of flower color after different drying methods品种 花色 对照 热风
干燥微波
干燥复合
干燥真空冷
冻干燥‘东方朱砂’ 61B N79B N79A 79N N79B ‘骨红朱砂’ N66C 64A N79D 70B 64 ‘晓红宫粉’ 65A N75A 84C N80D N75B ‘粉皮宫粉’ 65C N74C 84C 77D 75A ‘粉台玉蝶’ NN155B 155A N199D 150D 155A ‘月光玉蝶’ NN155C N155C 157B N155D NN155B ‘久观绿萼’ 155C 4D 2D 155C 155A ‘素玉绿萼’ NN155B 155A 8D 4D 155A 
图 2 不同干燥方法处理后梅花的色差值Figure 2 Color difference of P. mume flowers after different drying metheds由图3A可知：真空冷冻干燥后梅花的失水率为70.1%~79.7%，表明失水率较低且干燥效率低，其余3种干燥方法失水率均在79.3%以上，其中复合干燥后梅花的失水率显著高于其他3种干燥方法(P＜0.05)，最大失水率为84.7%。图3B 结果表明：真空冷冻干燥后梅花的收缩率显著小于其他3种干燥方式(P＜0.05)，为7.2%~28.7%，微波干燥后梅花的收缩率最大，为39.7%~47.4%。低温干燥特性能够更好地保持梅花的原有形态。
图 3 不同干燥方法处理后梅花的失水率(A)及收缩率(B)变化Figure 3 Changes of water loss rate (A) and shrinkage rate (B) of P. mume flowers after different drying metheds2.2 干燥后花色主要成分变化
2.2.1 总黄酮质量分数变化
不同干燥方法处理后，梅花总黄酮质量分数出现了不同程度的损失(图4)。相较于其他干燥方法，真空冷冻干燥对黄酮的保留效果最好，其总黄酮质量分数为 6.46~9.10 mg·g−1，显著高于热风干燥与微波干燥(P＜0.05)，微波干燥后梅花总黄酮损失量达到74.5%。复合干燥的保留效果也较好。说明真空冷冻干燥对于保留梅花中的黄酮成分效果较好，并且相对于微波干燥，保留了更多的黄酮化合物，可能是高温对黄酮类化合物造成影响。
图 4 不同干燥方法处理前后梅花总黄酮质量分数Figure 4 Total flavone content of P. mume flowers before and after different drying metheds2.2.2 花青苷质量分数变化
仅在‘东方朱砂’‘骨红朱砂’‘晓红宫粉’和‘粉皮宫粉’中共检测出了6种花青苷，包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)、矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3Ru)、芍药花素-3-O-葡萄糖苷(Pn3G)、芍药花素-3-O-芸香糖苷(Pn3Ru)、飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷(Dp3Ruh)、矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷(Pt3Ru5h)。4个白色系品种中未检测到花青苷。由图5可知：梅花鲜样颜色越深花青苷总质量分数越高。梅花在不同干燥方法处理后花青苷总质量分数有显著差异(P＜0.05)。‘东方朱砂’真空冷冻干燥后的花青苷质量分数最高，达到2.63 mg·g−1，这可能是由于低温干燥技术有效减少了花青苷的热降解。与之相比，热风干燥和微波干燥的花青苷损失较大。花青苷质量分数与总黄酮质量分数变化趋势一致，温度越高、干燥时间越长对类黄酮和花青苷质量分数的影响越明显。推测温度和干燥时间可能对梅花中类黄酮和花青苷质量分数变化具有较大的影响。
图 5 不同干燥方法处理前后梅花的总花青苷质量分数Figure 5 Total anthocyanin content of P. mume flowers before and after different drying metheds表2表明：‘东方朱砂’检测到 6 种花青苷，其余3个品种中，检测出除Pt3Ru5h外的 5种花青苷。紫红色系‘东方朱砂’所含的6种花青苷中，Cy3G、Cy3Ru、Pn3G占总花青苷比例较大，是主要的花青苷组成成分，其中，Cy3Ru质量分数最高，且在复合干燥后的梅花中质量分数显著高于其他干燥方法(P＜0.05)。Cy3G和Pn3G质量分数分别在‘晓红宫粉’‘骨红朱砂’‘粉皮宫粉’中最高，均在真空冷冻干燥保留率最高。Pt3Ru5h只在‘东方朱砂’中被检测出，且在真空冷冻干燥后梅花中保留率最高。
表 2 不同干燥方法处理前后梅花花青苷组成及质量分数Table 2 Composition and content of anthocyanin in P. mume flowers before and after different drying methods品种 干燥方法 花青苷/(μg·g−1 ) Cy3G Cy3Ru Pn3G Pn3Ru Pn3Ru Pt3Ru5h ‘东方朱砂’ 对照 841.71±34.39 a 1 027.57±23.45 a 961.74±18.22 a 227.72±29.11 a 130.19±1.09 a 192.58±1.46 a 热风干燥 400.75±5.87 d 723.73±15.10 c 509.53±5.24 d 158.79±5.02 b 113.67±12.52 ab 127.39±5.79 c 微波干燥 464.20±15.80 c 617.52±7.30 d 508.77±15.26 d 100.32±10.42 c 92.19±20.83 b 126.93±6.97 c 复合干燥 571.18±14.74 b 840.66±16.28 b 692.89±44.69 c 145.47±5.46 b 126.78±0.93 a 160.19±17.22 b 真空冷冻干燥 575.79±5.60 b 827.60±9.85 b 775.04±13.32 b 157.75±21.72 b 117.91±15.1 a 174.76±1.24 b ‘骨红朱砂’ 对照 564.92±13.66 a 496.45±3.02 a 774.52±19.56 a 63.51±1.61 a 63.32±0.70 a － 热风干燥 424.35±15.82 c 357.86±29.59 c 493.59±15.76 c 47.37±2.21 c 51.91±1.49 c － 微波干燥 352.38±26.86 d 275.21±37.52 d 462.78±19.02 d 46.43±0.20 c 50.58±2.90 c － 复合干燥 452.85±6.76 b 428.39±12.83 b 555.72±14.56 b 51.09±2.53 b 56.97±2.22 b － 真空冷冻干燥 478.79±12.68 b 401.86±5.03 b 585.24±19.34 b 52.87±0.62 b 59.45±2.44 b － ‘晓红宫粉’ 对照 94.87±12.12 a 56.21±8.51 a 89.89±13.31 a 57.87±1.65 a 60.02±1.89 a － 热风干燥 57.85±2.58 c 35.28±2.90 b 68.27±1.29 b 33.03±1.68 c 42.12±0.85 d － 微波干燥 29.93±1.58 d 21.17±0.30 c 42.66±4.48 c 22.80±1.63 d 27.43±2.01 e － 复合干燥 69.90±2.39 b 37.63±4.39 b 64.46±3.00 b 37.62±1.74 b 47.27±1.58 c － 真空冷冻干燥 71.37±2.64 b 39.72±2.76 b 75.04±1.53 b 40.09±2.65 b 50.79±1.18 b － ‘粉皮宫粉’ 对照 77.44±6.27 a 38.79±1.36 a 88.49±3.42 a 39.86±0.70 a 51.80±1.71 a － 热风干燥 52.84±3.36 c 23.81±1.81 b 52.65±1.74 d 23.92±1.11 c 24.04±1.25 c － 微波干燥 47.59±1.50 c 19.84±1.56 c 48.16±1.92 e 21.87±1.27 d 22.96±0.32 c － 复合干燥 72.49±3.47 b 26.32±1.66 b 57.47±3.32 c 25.47±0.98 c 32.95±1.96 b － 真空冷冻干燥 68.73±3.34 b 25.92±1.69 b 64.74±0.33 b 28.90±0.57 b 35.09±2.47 b － 说明：同列不同字母表示同一品种不同干燥方法间差异显著(P＜0.05)。Cy3G. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷； Cy3Ru. 矢车菊素-3-O-芸香糖苷； Pn3G. 芍药花素-3-O-葡萄糖苷；Pn3Ru. 芍药花素-3-O-芸香糖苷；Pn3Ru. 飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷；Pt3Ru5h. 矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷。－表示未检测到该成分。 2.3 干燥后挥发性成分变化
从8个梅花品种中鉴定出27种挥发物，这些挥发性成分主要包括醛类、酯类、有机酸、醇类和脂肪类化合物。酯类化合物在梅花花香成分中质量分数最高，苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯等是梅花挥发物的主要成分[26]。由挥发性成分测定结果可知(图6)：复合干燥和真空冷冻干燥在保留挥发性成分上具有明显优势，特别是在保留醛类和酯类这2类主要香气成分方面，这2种干燥方法表现出更佳的效果，复合干燥组的总保留率最高，达到50%以上。热风干燥组梅花的香气成分保留结果不稳定，部分梅花品种在热风干燥后挥发性成分保留少。8个梅花品种鲜样挥发性成分中除了‘粉皮宫粉’中检测到壬醛，其余品种只在干燥后检测到壬醛，说明在干燥处理后产生壬醛，梅花香气特征可能发生了改变。
图 6 不同干燥方法处理前后梅花挥发性成分相对含量Figure 6 Relative contents of volatile components of P. mume flowers before and after different drying metheds2.4 干燥后梅花抗氧化活性变化
表3和表4结果对比表明：干燥后梅花提取液对2种自由基清除能力一致。不同干燥方法处理后的梅花提取液清除DPPH和ABTS自由基的IC50均有所增加，并且存在显著差异(P＜0.05)，说明梅花提取液在干燥后对自由基的清除能力降低，并且不同干燥方法对自由基清除能力影响不同。
表 3 不同干燥方法处理前后梅花清除DPPH自由基的IC50Table 3 IC50 values of DPPH free radical scavenging of P. mume flowers before and after different drying methods品种 清除DPPH自由基的IC50/(mg·L−1) 对照 热风干燥 微波干燥 复合干燥 真空冷冻干燥 ‘东方朱砂’ 180.40±1.79 d 238.26±2.42 b 269.67±6.88 a 230.03±3.19 b 191.17±7.67 c ‘骨红朱砂’ 176.99±4.79 c 233.66±5.16 b 269.69±7.17 a 223.33±9.63 b 221.11±4.24 b ‘晓红宫粉’ 193.60±6.25 d 236.42±7.01 b 271.22±4.34 a 214.05±2.44 c 204.24±3.71 c ‘粉皮宫粉’ 186.91±7.98 d 242.91±7.63 b 292.69±3.39 a 222.02±1.34 c 197.54±6.29 d ‘月光玉蝶’ 171.70±2.90 d 241.20±7.81 b 273.73±9.35 a 229.67±1.03 b 208.39±6.02 c ‘粉台玉蝶’ 183.50±2.91 e 232.37±3.88 b 257.62±8.40 a 209.38±2.37 c 197.30±3.15 d ‘素玉绿萼’ 168.43±3.62 e 221.55±0.82 b 234.17±7.48 a 208.39±6.12 c 193.95±4.62 d ‘久观绿萼’ 155.31±5.20 d 229.09±6.76 b 249.32±12.28 a 190.41±4.72 c 189.24±1.65 c 说明：同行不同字母表示同一品种不同干燥方法间差异显著(P＜0.05)。 表 4 不同干燥方法处理前后梅花清除ABST自由基的IC50Table 4 IC50 value of ABST free radical scavenging of P. mume flowers before and after different drying methods品种 清除ABST自由基的IC50/(mg·L−1) 对照 热风干燥 微波干燥 复合干燥 真空冷冻干燥 ‘东方朱砂’ 431.89±1.85 c 528.86±2.95 a 520.90±6.88 a 464.79±5.46 b 454.21±11.33 b ‘骨红朱砂’ 430.89±9.98 c 464.71±6.51 b 494.48±17.93 a 463.13±2.78 b 457.54±5.77 b ‘晓红宫粉’ 436.85±4.07 d 521.48±7.59 b 536.05±9.34 a 470.58±7.23 c 473.88±3.00 c ‘粉皮宫粉’ 423.26±3.85 d 470.38±7.51 b 519.48±5.67 a 463.42±4.80 bc 458.63±6.59 c ‘月光玉蝶’ 435.44±0.87 d 523.76±3.58 b 537.67±7.33 a 467.46±4.29 c 468.04±5.26 c ‘粉台玉蝶’ 434.56±1.98 d 471.71±1.28 c 520.86±5.47 a 469.50±4.63 c 478.67±3.32 b ‘素玉绿萼’ 428.30±5.57 d 490.43±7.95 b 510.52±18.91 a 454.54±5.22 c 452.54±7.60 c ‘久观绿萼’ 410.93±4.46 d 470.38±7.51 b 519.48±5.67 a 459.79±10.02 b 447.29±4.69 c 说明：同行不同字母表示同一品种不同干燥方式间差异显著(P＜0.05)。 除‘骨红朱砂’外，与其他干燥方法相比，真空冷冻干燥后的梅花提取液清除DPPH、ABST自由基的IC50值显著低于热风干燥与微波干燥(P＜0.05)，与复合干燥差异小。真空冷冻干燥后的梅花提取液对DPPH自由基的清除能力是微波干燥后的1.2~1.5倍。复合干燥与真空冷冻干燥后梅花提取液清除ABTS自由基的IC50约为447.29~478.67 mg·L−1。真空冷冻干燥与复合干燥后的梅花提取液对DPPH、ABST自由基清除能力较强。可能由于真空冷冻干燥低温和缺氧的特点，有效减少了抗氧化物的降解，从而保持了更高的抗氧化活性。
2.5 有效成分分析
2.5.1 可溶性蛋白质量分数分析
由图7可知：不同干燥方法处理对梅花可溶性蛋白的保留有显著影响。‘月光玉蝶’‘粉台玉蝶’中复合干燥组可溶性蛋白损失显著小于其他干燥方法(P＜0.05)，损失量分别为26.08、7.92 mg·g−1，‘东方朱砂’‘骨红朱砂’‘晓红宫粉’‘粉皮宫粉’‘久观绿萼’‘素玉绿萼’中，真空冷冻干燥组可溶性蛋白质量分数损失小于其他3种干燥方法，损失量分别为4.91、31.86、3.34、5.38、5.26、3.70 mg·g−1。
图 7 不同干燥方法处理前后梅花的可溶性蛋白质量分数损失量Figure 7 Difference in soluble protein content of P. mume flowers before and after treatment with different drying methods2.5.2 新绿原酸、绿原酸、金丝桃苷、芦丁与异槲皮苷的质量分数变化
新绿原酸、绿原酸是梅花鲜花的主要酚类物质，其质量分数高于黄酮类化合物芦丁、异槲皮苷与金丝桃苷。由图8可知：真空冷冻干燥在所有干燥方法中保留效果最佳，尤其是大部分品种的绿原酸和异槲皮苷质量分数均显著高于除对照外的其他干燥方法(P＜0.05)。复合干燥虽然保留效果略低于真空冷冻干燥，但显著高于热风干燥和微波干燥。
图 8 不同干燥方法处理前后梅花中新绿原酸(A)、绿原酸(B)、芦丁(C)、金丝桃苷(D)及异槲皮苷质量分数(E)的变化Figure 8 Changes of contents of neochlorogenic acid (A), chlorogenic acid (B), rutin (C), hyperoside (D) and isoquercitrin (E) in P. mume flowers before and after different drying methods2.6 综合评价
由上述分析可知：不同干燥方法处理对梅花品质指标的影响不同。熵权-变异系数综合评分和TOPSIS法计算结果如表5和表6所示：4种干燥方法的熵权-变异系数综合评分由高到低依次为真空冷冻干燥法、复合干燥法、热风干燥法和微波干燥法。通过TOPSIS排序法进行验证，结果与熵权-变异系数法分析结果基本一致，TOPSIS排序法中C越大排名越高，真空冷冻干燥法与复合干燥法品质优于热风干燥法和微波干燥法。综合来说真空冷冻干燥法干燥后梅花品质最优，复合干燥法干燥后次之。
表 5 不同干燥方法处理后熵权-变异系数法各梅花指标权重Table 5 Weights of indexes of the P. mume flowers entropy weight-coefficient of variation method after different drying methods品种 指标名称 wj1 wj2 wj 品种 指标名称 wj1 wj2 wj ‘东方朱砂’ 失水率 0.074 6 0.054 0 0.079 8 ‘骨红朱砂’ 失水率 0.072 3 0.054 0 0.079 5 收缩率 0.081 6 0.033 4 0.065 7 收缩率 0.100 3 0.022 4 0.060 3 色差值 0.094 2 0.026 8 0.063 2 色差值 0.072 5 0.050 3 0.076 8 DPPH 0.078 3 0.037 4 0.068 0 DPPH 0.072 7 0.051 2 0.077 6 ABST 0.086 1 0.038 5 0.072 4 ABST 0.072 5 0.050 4 0.076 9 总黄酮 0.078 5 0.040 0 0.070 5 总黄酮 0.076 2 0.043 2 0.073 0 总花青素 0.087 0 0.032 2 0.066 5 总花青素 0.080 9 0.036 9 0.069 5 挥发性分成保留率 0.080 5 0.039 2 0.070 6 挥发性分成保留率 0.094 7 0.028 5 0.066 1 新绿原酸 0.077 0 0.044 9 0.073 9 新绿原酸 0.073 1 0.045 9 0.073 7 绿原酸 0.079 8 0.041 8 0.072 6 绿原酸 0.072 9 0.046 8 0.074 3 芦丁 0.080 2 0.042 9 0.073 7 芦丁 0.075 8 0.042 0 0.071 8 金丝桃苷 0.082 2 0.033 0 0.065 5 金丝桃苷 0.082 9 0.035 8 0.069 3 异槲皮苷 0.075 9 0.050 0 0.077 4 异槲皮苷 0.078 2 0.039 5 0.070 7 可溶性蛋白 0.074 4 0.055 0 0.080 4 可溶性蛋白 0.101 8 0.022 2 0.060 5 ‘晓红宫粉’ 失水率 0.076 6 0.063 7 0.081 2 ‘粉皮宫粉’ 失水率 0.076 1 0.041 3 0.072 4 收缩率 0.083 6 0.037 0 0.064 6 收缩率 0.075 4 0.037 6 0.068 8 色差值 0.079 4 0.043 2 0.068 1 色差值 0.081 3 0.032 7 0.066 6 DPPH 0.078 4 0.050 6 0.073 2 DPPH 0.074 0 0.042 9 0.072 7 ABST 0.084 2 0.046 3 0.072 6 ABST 0.072 5 0.051 6 0.079 0 总黄酮 0.082 3 0.042 3 0.068 5 总黄酮 0.073 6 0.048 8 0.077 4 总花青素 0.077 2 0.054 3 0.075 2 总花青素 0.078 1 0.040 3 0.072 4 挥发性分成保留率 0.080 2 0.045 3 0.070 1 挥发性分成保留率 0.072 5 0.050 4 0.078 1 新绿原酸 0.080 4 0.043 7 0.068 9 新绿原酸 0.092 8 0.027 4 0.065 1 绿原酸 0.079 1 0.048 8 0.072 2 绿原酸 0.089 6 0.027 1 0.063 6 芦丁 0.093 8 0.030 4 0.062 0 芦丁 0.072 4 0.052 3 0.079 5 金丝桃苷 0.084 5 0.045 8 0.072 3 金丝桃苷 0.079 9 0.039 6 0.072 6 异槲皮苷 0.076 7 0.061 3 0.079 6 异槲皮苷 0.098 4 0.023 6 0.062 2 可溶性蛋白 0.077 9 0.048 6 0.071 5 可溶性蛋白 0.090 3 0.032 3 0.069 7 ‘月光玉蝶’ 失水率 0.081 1 0.046 8 0.081 0 ‘粉台玉蝶’ 失水率 0.080 1 0.047 6 0.079 2 收缩率 0.100 3 0.026 2 0.067 4 收缩率 0.106 4 0.025 4 0.066 7 色差值 0.082 8 0.038 1 0.073 9 色差值 0.082 2 0.045 0 0.078 0 DPPH 0.080 6 0.043 4 0.077 8 DPPH 0.082 1 0.045 5 0.078 5 ABST 0.087 6 0.043 7 0.081 4 ABST 0.079 1 0.057 0 0.086 2 总黄酮 0.088 7 0.038 3 0.076 6 总黄酮 0.102 1 0.036 9 0.078 8 含量花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 挥发性分成保留率 0.083 2 0.040 0 0.075 8 挥发性分成保留率 0.082 2 0.041 1 0.074 6 新绿原酸 0.080 6 0.046 1 0.080 1 新绿原酸 0.094 8 0.036 2 0.075 2 绿原酸 0.080 8 0.049 1 0.082 8 绿原酸 0.085 5 0.044 6 0.079 3 芦丁 0.092 0 0.040 4 0.080 1 芦丁 0.083 0 0.045 2 0.078 6 金丝桃苷 0.093 0 0.037 5 0.077 6 金丝桃苷 0.085 1 0.045 1 0.079 5 异槲皮苷 0.092 5 0.031 1 0.070 5 异槲皮苷 0.094 7 0.032 3 0.071 0 可溶性蛋白 0.097 6 0.033 2 0.074 9 可溶性蛋白 0.084 5 0.039 8 0.074 5 ‘素玉绿萼’ 失水率 0.083 7 0.061 3 0.082 2 ‘久观绿萼’ 失水率 0.083 6 0.055 6 0.080 1 收缩率 0.087 1 0.046 4 0.073 0 收缩率 0.089 1 0.042 4 0.072 2 色差值 0.084 2 0.058 4 0.080 5 色差值 0.086 5 0.045 9 0.074 0 DPPH 0.089 1 0.045 1 0.072 8 DPPH 0.088 0 0.052 5 0.079 8 ABST 0.088 6 0.053 3 0.078 9 ABST 0.083 3 0.056 8 0.080 8 总黄酮 0.090 3 0.050 6 0.077 6 总黄酮 0.086 7 0.046 0 0.074 2 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 挥发性分成保留率 0.088 6 0.046 2 0.073 4 挥发性分成保留率 0.106 5 0.045 3 0.081 6 新绿原酸 0.093 3 0.045 8 0.075 0 新绿原酸 0.084 4 0.054 7 0.079 8 绿原酸 0.086 9 0.050 0 0.075 7 绿原酸 0.087 3 0.052 8 0.079 8 芦丁 0.090 0 0.051 5 0.078 2 芦丁 0.089 6 0.039 7 0.070 0 金丝桃苷 0.088 0 0.050 1 0.076 3 金丝桃苷 0.089 8 0.050 4 0.079 0 异槲皮苷 0.095 7 0.047 4 0.077 3 异槲皮苷 0.086 6 0.048 9 0.076 4 可溶性蛋白 0.084 3 0.055 9 0.078 8 可溶性蛋白 0.087 0 0.043 8 0.072 5 表 6 不同干燥方法处理后梅花熵权-变异系数综合评分和TOPSIS排序结果Table 6 Comprehensive score and TOPSIS ranking results of entropy-coefficient of variation of P. mume after different drying motheds品种 干燥方法 熵权-变异系数
综合排名TOPSIS排名 品种 干燥方法 熵权-变异系数
综合排名TOPSIS排名 综合评分 排名 C 排名 综合评分 排名 C 排名 ‘东方朱砂’ 热风干燥法 783.50 3 0.501 0 3 ‘骨红朱砂’ 热风干燥法 952.51 3 0.367 5 4 微波干燥法 619.09 4 0.392 3 4 微波干燥法 735.31 4 0.416 1 3 复合干燥法 975.78 2 0.649 3 1 复合干燥法 1276.55 2 0.581 2 1 真空冷冻干燥法 1049.36 1 0.595 0 2 真空冷冻干燥法 1340.41 1 0.552 8 2 ‘晓红宫粉’ 热风干燥法 723.16 3 0.508 3 3 ‘粉皮宫粉’ 热风干燥法 783.50 3 0.378 6 3 微波干燥法 564.06 4 0.413 6 4 微波干燥法 619.09 4 0.417 8 4 复合干燥法 912.86 2 0.598 5 1 复合干燥法 975.78 2 0.565 1 2 真空冷冻干燥法 1045.04 1 0.582 4 2 真空冷冻干燥法 1049.36 1 0.626 6 1 ‘月光玉蝶’ 热风干燥法 590.06 3 0.393 3 4 ‘粉台玉蝶’ 热风干燥法 722.06 3 0.283 0 4 微波干燥法 501.93 4 0.450 8 3 微波干燥法 707.76 4 0.422 5 3 复合干燥法 852.84 2 0.620 7 1 复合干燥法 975.07 2 0.555 4 2 真空冷冻干燥法 953.14 1 0.550 9 2 真空冷冻干燥法 1016.84 1 0.586 4 1 ‘素玉绿萼’ 热风干燥法 812.27 3 0.432 2 3 ‘久观绿萼’ 热风干燥法 877.24 3 0.423 7 3 微波干燥法 713.61 4 0.435 2 4 微波干燥法 706.09 4 0.505 1 4 复合干燥法 1016.70 2 0.580 5 1 复合干燥法 1041.97 2 0.464 3 2 真空冷冻干燥法 1048.38 1 0.564 1 2 真空冷冻干燥法 1150.98 1 0.576 4 1 3. 讨论
梅花具有多种香气成分和气味品质、独特的花色花形以及药用价值，这些特点赋予梅花极大的开发潜力[27]。本研究应用热风干燥、微波干燥、复合干燥和真空冷冻干燥4种不同干燥方法处理梅花，综合考虑了表型、花色、花香成分等因素，对比分析了不同干燥方法对梅花品质的影响。结果显示：干燥方法对梅花的理化属性产生较大的影响。与 ZHANG等[28]的研究一致。真空冷冻干燥的梅花在保持色泽和细胞结构上表现最佳，具较强的清除DHHP和ABST自由基能力，显示出强大的抗氧化能力。复合干燥法能保留梅花活性成分，提升抗氧化能力。这与SHI等[29]的研究结果相符。本研究中，复合干燥法在保留挥发性物质方面表现最佳，不仅提高了梅花的香气质量，还缩短了干燥时间，减少了有效成分的降解。此外，真空冷冻干燥法和复合干燥法处理后的梅花在保留总黄酮、总花青素、绿原酸等有效成分方面均表现出优势。在评估不同梅花品种的质量时，‘绿萼’品种表现出最强的抗氧化能力且各营养成分较高，而‘朱砂’品种在保留花色方面最为突出，并且其花青素质量分数较高。综合评分结果显示：‘骨红朱砂’‘久观绿萼’评分最高，因此，这2个梅花品种适用于梅花花茶的开发。
4. 结论
本研究选取8个梅花品种，采用4种不同干燥方法对梅花鲜花进行研究发现：真空冷冻干燥后的梅花品质最优，复合干燥次之。真空冷冻干燥在品质保持方面表现最佳，但较高的设备成本和长时间的干燥过程限制了其大规模应用。相比之下，复合干燥结合了不同干燥方法的优点，不仅保持了梅花的品质，还缩短了加工时间，为大批量生产提供了可能。可以进一步拓展梅花品种的选择范围，优化复合干燥条件，以提升梅花茶的整体品质。此外，本研究选用了色差值、抗氧化能力和总黄酮质量分数等指标进行综合评价，可以考虑引入更多与梅花品质相关的生化和生理指标，构建更为全面的梅花品质评价体系。
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图 3 114份抗性马尾松样本的Structure聚类图
Figure 3 Structure cluster diagram of 114 samples of resistant P. massoniana
图 5 72份核心种质与114份原有种质主坐标分析
Figure 5 Principal coordinate analysis of 72 core germplasm and 114 original germplasm
图 6 72份抗性马尾松核心种质的UPGMA聚类图
Figure 6 UPGMA clustering map of 72 samples of resistant P. massoniana
表 1 材料编号及来源
Table 1. Test materials’ number and source
编号 来源 编号 来源 编号 来源 编号 来源 1 广西贵港 35 安徽黄山 DAC12 浙江临海 HGS5 浙江临海 2 广西桂平 36 安徽黄山 DAC13 浙江临海 HGS6 浙江临海 3 贵州黎平 37 安徽全椒 DAC15 浙江临海 HGS8 浙江临海 4 福建南平 38 安徽泾县 DAC17 浙江临海 HGS9 浙江临海 6 福建南平 39 安徽休宁 DAC18 浙江临海 HGY1 浙江临海 7 安徽休宁 40 安徽休宁 DAC19 浙江临海 LS001 浙江临海 9 安徽休宁 41 安徽休宁 DAC20 浙江临海 LS003 浙江临海 10 安徽祁县 42 安徽休宁 DAC21 浙江临海 LS005 浙江临海 11 福建南平 43 安徽休宁 DAC22 浙江临海 LS007 浙江临海 12 浙江淳安 44 安徽休宁 DAC23 浙江临海 LS008 浙江临海 13 浙江淳安 45 安徽休宁 DAC24 浙江临海 LS009 浙江临海 14 福建南平 46 安徽休宁 DAC26 浙江临海 LS010 浙江临海 15 浙江松阳 47 安徽休宁 DAC34 浙江临海 XJ003 江西峡江 17 福建南平 48 安徽休宁 DLS27 浙江临海 XJ004 江西峡江 19 江西婺源 49 安徽休宁 DLS28 浙江临海 XJ005 江西峡江 20 福建南平 71 江西分宜 DLS29 浙江临海 XJ014 江西峡江 21 安徽广德 114 江西分宜 DLS30 浙江临海 AH1 安徽广德 22 安徽广德 161 江西分宜 DLS31 浙江临海 AH2 安徽滁州 23 安徽广德 231 江西分宜 DLS32 浙江临海 AH3 安徽黄山 24 安徽广德 242 江西分宜 DLS33 浙江临海 AH4 安徽休宁 25 安徽广德 305 江西分宜 DLS35 浙江临海 AH5 安徽广德 26 安徽广德 355 江西分宜 DLS36 浙江临海 AH6 安徽广德 27 安徽广德 398 江西分宜 DLS37 浙江临海 AH7 安徽广德 28 安徽广德 413 江西分宜 DLS38 浙江临海 AH8 安徽泾县 29 安徽广德 461 江西分宜 DLS40 浙江临海 AH9 安徽广德 30 安徽和县 473 江西分宜 HGS11 浙江临海 AH10 安徽休宁 31 安徽和县 485 江西分宜 HGS2 浙江临海 AH11 安徽广德 32 安徽和县 486 江西分宜 HGS3 浙江临海 34 安徽和县 490 江西分宜 HGS4 浙江临海 说明：AH1~AH11为 安徽省林业科学研究院审定的马尾松抗松材线虫病良种皖马抗1~11号。 
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表 2 14对SSR引物信息
Table 2. 14 pairs of SSR primer information
编号 引物名称 正向引物(5´→3´) 反向引物(5´→3´) 1 H03 CTCCAAAGGCGAGACTGC ACGAAAGCCAAGCTGAAC 2 D04 AGGATGGTATGGTCGTGG CCCTTCTTCGCTCTGTGA 3 H04 AAGAAGCGATCTGAGATGACTAA CTGTCATTGATTGTTTCCTTTTG 4 B05 CCGTGCCTTCAGCATCTTCT CAGTGGATCTGTCACCTCCTCAT 5 F05 AGAAGAAGAGCAGCAGTTTC GGTTTTCCATTGTTCTCACT 6 H05 GTGCCTTCAGCATCTTCTAC ATCTGTCACCTCCTCATCTT 7 B06 TATTAGCACCCCTCCAAAG TGGGGTAGAAGAATCGTAAGT 8 D06 GATTCGGCTTCGTGACCTT CCCCCATAACCCCTGTC 9 F06 AAGGACTTACAGAGGTTGGGTT GCTGCGACGAGCGTTTCT 10 H06 TTCCTACCGCTGGGTTCTTG GACCTGACCTCGGGCATTAC 11 D07 TCGCCTGGGCTTTGTCTG GCGGGTTGCATATTTGGTG 12 F07 CAGCATCTTCTACATCTGAGTC CAATCAAAAAGACTACATCACT 13 H07 CACCATCGGTTTCTCCATC CTCAATCAAAAAGACTACATCACT 14 D08 TGCTTTCAGAAGGATAAGGGGT AAATACAATACTGGGTTTCGCC
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表 3 不同SSR位点的遗传多样性统计
Table 3. Genetic diversity of different SSR microsatellite loci
位点 Na Ne Ho He PIC I Fis F Nm H03 5 3.54 0.00 0.59 0.83 1.18 1.00 1.00 0.68 D04 7 4.62 0.01 0.62 0.89 1.38 0.98 0.98 0.60 H04 9 5.51 0.04 0.65 0.93 1.55 0.94 0.95 0.70 B05 8 5.93 0.00 0.66 0.92 1.57 0.99 0.99 0.78 F05 6 3.57 0.00 0.51 0.82 1.15 0.99 0.99 0.43 H05 9 6.46 0.00 0.66 0.95 1.59 1.00 1.00 0.63 B06 9 5.87 0.01 0.65 0.92 1.54 0.99 0.99 0.67 D06 7 4.72 0.00 0.62 0.90 1.39 1.00 1.00 0.55 F06 7 5.09 0.02 0.64 0.93 1.47 0.98 0.98 0.62 H06 11 8.05 0.57 0.73 0.93 1.90 0.21 0.19 0.92 D07 10 6.35 0.01 0.66 0.93 1.62 0.98 0.98 0.64 F07 10 6.99 0.02 0.68 0.93 1.70 0.97 0.98 0.69 H07 11 7.45 0.14 0.70 0.93 1.79 0.79 0.76 0.76 D08 6 3.45 0.00 0.60 0.82 1.25 0.99 0.99 0.50 平均 8.17 5.54 0.06 0.64 0.90 1.51 0.92 0.91 0.66 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；PIC. 多态信息含量；I. Shannon’s多样性指数；Fis. 居群近交系数；F. 固定指数；Nm. 基因流。
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表 4 各亚群基因型情况
Table 4. Number of genotypes in each cluster
亚群 各亚群种质数量 各亚群基因型数 Q＜0.6 Q＞0.8 Ⅰ 12 0 12 Ⅱ 24 9 12 Ⅲ 29 5 17 Ⅳ 49 0 45 说明：Q为样本隶属不同亚群的比例。
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表 5 马尾松各亚群遗传多样性水平
Table 5. Genetic diversity parameters for all populations of resistant P. massoniana
亚群 样本量/份 Na Ne I Ho He F Ⅰ 12 6.07 4.87 1.64 0.06 0.78 0.93 Ⅱ 24 9.57 6.48 1.88 0.08 0.78 0.91 Ⅲ 29 7.50 4.88 1.59 0.03 0.70 0.96 Ⅳ 49 13.43 7.14 2.16 0.06 0.85 0.93 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；I. Shannon’s多样性指数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；F. 固定指数。
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表 6 基于微卫星数据的遗传变异分析
Table 6. Analysis of molecular variance from microsatellite data using GenALEx
变异
来源自由度 方差
总和平均
方差方差
分量变异百
分比/%P 亚群间 3 184.865 61.622 0.957 14 ＜0.01 亚群内 110 1 216.328 11.058 5.323 80 ＜0.01 FST 0.143 说明：FST为遗传分化系数。
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表 7 不同策略构建的核心种质遗传多样性指标比较
Table 7. Comparisons of genetic diversity index of core collections constructed by different tactics
构建方法 种质数/份 Na Ne I Ho He F Nm PIC 原有种质 114 115 5.54 1.51 0.06 0.64 0.91 0.66 0.90 M策略 72 115 5.30 1.43 0.06 0.63 0.91 0.61 0.92 随机取样策略 79 115 5.53 1.48 0.06 0.64 0.91 0.65 0.92 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；PIC. 多态性信息含量；I. Shannon’s多样性指数；Fis. 居群近交系数；F. 固定指数；Nm. 基因流。* P＜0.05， **P＜0.01。
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表 8 72份抗性马尾松核心种质与114份原有种质遗传多样性对比
Table 8. Comparison of genetic diversity between 72 core germplasm and 114 original germplasm of resistant P. massoniana
种质 种质数/份 Na Ne I Ho He F Nm PIC 原有种质 114 25.29 5.54 1.51 0.06 0.64 0.91 0.66 0.90 核心种质 72 25.29 5.30 1.43 0.06 0.63 0.91 0.61 0.92 保留比例/% 63.16 100.00 95.67 94.96 100.00 98.12 99.57 92.54 100.00 t 0.000 −0.652 −1.428 0.059 −0.826 −0.052 0.014 −0.152 P 1.000 0.525 0.177 0.953 0.424 0.960 0.989 0.882 说明：Na. 等位基因数；Ne. 有效等位基因数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度；PIC. 多态信息含量；I. Shannon’s多样性指数；Fis. 居群近交系数；F. 固定指数；Nm. 基因流。
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