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海拔高度与昆虫的物种多样性关系密切，不同海拔高度的同类昆虫物种多样性各不相同[1]。鳞翅目Lepidopte蛾类昆虫经过长时间的协同进化，已成为维持生态平衡的重要指示类群之一，是具有重要科研价值的一类昆虫[2]。大蛾类作为翅展大于25 mm的蛾类，是重要的访花和传粉昆虫[3]，同时大蛾类的部分昆虫也是主要的农林害虫，如枯叶蛾科Lasiocampidae的松毛虫属Dendrolimus昆虫每年对松林面积的破坏性大，已成为全世界森林中危害最严重的一类害虫[4−6]。鉴于此，本研究在浙江天目山国家级自然保护区内对不同海拔高度的大蛾类种群多样性及时间动态进行了研究，以期为天目山保护区昆虫资源数据提供参考。
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浙江天目山国家级自然保护区位于杭州市临安区(30°18′~30°24′N，119°23′~119°29′E)，最高峰仙人顶海拔为1 506.0 m。该区属亚热带季风气候，年均气温为8.1~14.3 ℃，年均降水量为1 100.0~1 900.0 mm。区内植被类型多样且随着海拔梯度的变化而发生显著变化[7]。
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在研究区内，每隔200 m的海拔梯度设置1个样点，共设置8个样点，分别为海拔0~200、200~400、400~600、600~800、800~1 000、1 000~1 200、1 200~1 400、1 400~1 506 m。白天时段在各个海拔梯度通过网捕法捕捉大蛾类幼虫和成虫，幼虫放在室内饲养再根据成虫的形态特征进行鉴定。夜晚时段(20:00—24:00)在各个海拔梯度中选取距林缘50~100 m、地势相对平坦的空地，放置1个灯诱帐篷[规格大小为1.2 m×1.2 m×1.8 m，光源为2 000 W (12 000 mA)续航75 h的户外充电照明灯]进行灯诱，并收集大蛾类昆虫。从5月开始，每周对各个样点的大蛾类标本收集并统计，共持续4个月，以每个月为单位对该月所采集的大蛾类进行分析、鉴定和统计。
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采用Simpson指数、Shannon指数、Pielou均匀度和Margalef丰富度指数进行大蛾类种群多样性分析，统计每个样地中出现的物种数和个体数。多样性指数计算参考文献[8−9]。
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利用对数正态分布模型对不同海拔梯度上大蛾类种群的种-多度进行分析，模型表达式为${{{S}}_{{{(R)}}}} = {S _0}\exp ( - {\alpha ^2}{R^2})$。其中：S(R)是R倍程中的物种数量，S0是对数正态分布的众数倍程物种数，α是与分布有关的参数[10]。
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种群相似性用Jaccard相似性系数和系统聚类进行表征。①Jaccard相似性系数计算公式为C=c/(a+b+c)。其中：C为种群Jaccard相似性系数，a、b分别为2个生境所具有的物种数，c为2个生境中共有的物种数[11]。②系统聚类计算公式为${{d}}_{{ij}}=\sqrt{\left[{{\displaystyle \sum ({{X}}_{{ik}}-{{X}}_{{jk}})}}^{\text{2}}\right]}$。其中：dij为i种群与j种群之间的欧氏距离，Xik为i种群中第k个指标的值，Xjk为j种群中第k个指标的值[12]。
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用Excel对大蛾类昆虫进行统计，并进行多样性分析，通过SPSS 21对大蛾类种群的物种数进行系统聚类和差异显著性检验，用Origin 2022对物种进行时间动态和种-多度关系分析。
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从8个海拔梯度中共采集大蛾类昆虫标本3 367只，隶属25科269种。草螟科Crambidae、尺蛾科Geometridae、夜蛾科Noctuidae和天蛾科Sphingidae的个体数均超过总标本数的10%，其中尺蛾科个体数最多，有615只，占总个体数的18.3%。尺蛾科、天蛾科在每个海拔梯度上占总数比例都较多。箩纹蛾科Brahmaeidae的个体数量最少。
从表1可见：不同海拔的物种数各不相同，从低海拔到高海拔总体呈先增加后减小的趋势。随着海拔的升高，物种数和个体数逐渐增加，在800 m处达到最大值，随后随着海拔的升高，物种数和个体数逐渐减少。
表 1 天目山不同海拔下大蛾类种群的组成
Table 1. Composition of large moth species at different altitudes of Mount Tianmu
科名 0~200 m 200~400 m 400~600 m 600~800 m 800~1 000 m 1 000~1 200 m 1 200~1 400 m 1 400~1 600 m 个体总
数/只S N S N S N S N S N S N S N S N 斑蛾科Zygaenidae 1 2 0 0 1 6 1 12 1 5 0 0 0 0 0 0 25 波纹蛾科Thyatiridae 1 9 1 11 2 10 2 25 2 20 1 6 1 1 0 0 82 蚕蛾科Bombycidae 1 3 1 8 1 3 2 12 1 4 1 5 1 1 0 0 36 草螟科Crambidae 15 29 16 43 25 53 26 69 23 71 15 44 7 21 3 8 338 尺蛾科Geometridae 19 49 20 65 31 89 53 116 57 122 34 93 22 53 11 28 615 刺蛾科Limacodidae 1 2 1 4 3 15 4 12 3 10 1 1 0 0 0 0 44 大蚕蛾科Saturniidae 2 8 4 15 7 30 8 45 7 30 4 14 5 14 0 0 156 带蛾科Thaumetopoeidae 0 0 1 2 1 4 1 9 1 7 0 0 0 0 0 0 22 灯蛾科Arctiidae 1 3 1 12 1 7 2 25 2 18 1 1 0 0 1 2 68 毒蛾科Lymantriidae 2 6 2 13 3 20 4 31 3 15 2 6 1 1 0 0 92 凤蛾科Epicopeiidae 1 2 0 0 1 1 1 1 1 4 0 0 0 0 0 0 8 钩蛾科Drepanidae 3 7 4 8 7 16 9 27 7 22 1 4 2 3 0 0 87 卷蛾科Tortricidae 1 9 1 7 0 0 1 7 1 3 0 0 0 0 0 0 26 枯叶蛾科Lasiocampidae 1 3 3 13 8 23 9 31 6 21 5 16 2 5 0 0 112 瘤蛾科Nolidae 1 3 2 6 3 13 3 22 3 13 2 4 0 0 0 0 61 箩纹蛾科Brahmaeidae 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 0 0 0 0 0 0 3 螟蛾科Pyralidae 2 7 4 15 5 23 6 56 5 47 6 27 2 8 3 8 191 木蠹蛾科Cossidae 2 10 1 2 2 8 3 9 1 8 1 1 0 0 0 0 38 裳蛾科Erebidae 2 7 4 15 7 25 11 40 9 27 6 13 1 3 0 0 130 苔蛾科Lithosiidae 1 2 1 10 1 20 1 43 1 28 1 34 1 6 0 0 143 天蛾科Sphingidae 12 28 13 35 24 56 31 112 30 113 26 80 8 20 5 13 457 网蛾科Thyrididae 1 4 2 11 3 20 3 20 2 14 1 4 1 1 0 0 74 燕蛾科Uraniidae 0 0 1 2 2 10 2 18 1 8 0 0 0 0 0 0 38 夜蛾科Noctuidae 5 16 7 22 11 47 35 79 40 78 23 59 17 36 2 11 348 舟蛾科Notodontidae 2 8 4 13 3 13 11 55 14 61 2 15 1 7 1 1 173 S合计 77 94 152 229 222 131 72 26 269 N合计 217 332 512 877 751 427 180 71 3367 S占比/% 28.62 34.94 56.51 85.13 82.53 49.44 26.77 9.67 N占比/% 6.44 9.86 15.21 26.05 22.30 12.68 5.35 2.10 说明：S. 物种数(种)；N. 个体数(只)。各海拔梯度之间有相同物种。 -
从表2可见：不同海拔梯度下，大蛾类种群的Simpson指数和Shannon指数从高到低依次为海拔600~800、400~600、800~1 000、200~400、0~200、1 000~1 200、1 200~1 400、1 400~1 600 m，在海拔 1 000 m以上差异显著(P＜0.05)。Pielou均匀度在海拔800 m以上差异显著(P＜0.05)。Margalef丰富度在海拔1 000 m以上差异显著(P＜0.05)。
表 2 天目山不同海拔梯度下大蛾类种群多样性指数
Table 2. Large moth population diversity index under different altitude gradients of Mount Tianmu
海拔/m Simpson指数 Shannon指数 Pielou均匀度 Margalef丰富度 0~200 0.869±0.040 bc 2.322±0.310 bc 0.345±0.040 b 3.903±0.400 a 200~400 0.901±0.010 abc 2.565±0.120 ab 0.381±0.010 a 3.617±0.160 a 400~600 0.910±0.010 ab 2.634±0.080 a 0.391±0.010 a 3.527±0.200 a 600~800 0.922±0.000 a 2.769±0.200 a 0.411±0.020 a 3.542±0.180 a 800~1 000 0.902±0.010 abc 2.605±0.090 ab 0.387±0.010 a 3.625±0.180 a 1 000~1 200 0.857±0.030 c 2.195±0.160 c 0.326±0.020 b 2.972±0.190 b 1 200~1 400 0.791±0.060 d 1.816±0.310 d 0.269±0.040 c 2.696±0.230 b 1 400~1 600 0.646±0.030 e 1.242±0.070 e 0.188±0.010 d 1.408±0.110 c 说明：数值为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同海拔间差异显著(P＜0.05)。 -
8个海拔梯度的种-多度曲线中，海拔600~800、800~1 000、1 000~1 200 m趋向于对数正态分布模型(图1)，拟合以上3个海拔梯度，发现海拔在800~1 000 m处的拟合度最高，说明在海拔800~1 000 m处的环境条件最优越，即优势类群和稀有类群都较少，常见种较多。其他海拔梯度符合生态位优先占领假说。
图 1 天目山不同海拔高度大蛾类种-多度曲线
Figure 1. Large moth species-multidegree curves at different altitudes of Mount Tianmu
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从表3可见：8个海拔梯度下大蛾类种群呈现中等相似，且差异不显著。其中海拔600~1 000 m的大蛾类种群与其他海拔的大蛾类种群相似性最高，而海拔1 400~1 600 m的大蛾类种群与其他海拔大蛾类种群相似性低。表明高海拔地区对大蛾类种群的影响较明显。
表 3 不同海拔天目山大蛾类种群相似性系数
Table 3. Similarity coefficients of large moth population at different altitudes of Mount Tianmu
海拔/m 0~200 m 200~400 m 400~600 m 600~800 m 800~1 000 m 1 000~1 200 m 1 200~1 400 m 1 400~1 600 m 0~200 1.000 0.833 0.875 0.880 0.880 0.864 0.682 0.318 200~400 1.000 0.875 0.880 0.880 0.864 0.682 0.318 400~600 1.000 0.657 0.657 0.826 0.652 0.304 600~800 1.000 0.900 0.760 0.600 0.280 800~1 000 1.000 0.760 0.600 0.280 1 000~1 200 1.000 0.789 0.368 1 200~1 400 1.000 0.467 1 400~1 600 1.000 -
从图2可见：海拔200~400、1 000~1 400 m的大蛾类种群聚为一类；海拔0~200、1 400~1 600 m的种群聚为一类；海拔400~1 000 m的种群聚为一类。可见，海拔400~1 000 m处的环境保护相对较好，种群结构稳定，不同海拔高度的大蛾类种群系统聚类与相似性分析结果类似。
图 2 天目山不同海拔系统聚类分析
Figure 2. Continental distance clustering analysis at different altitudes of Mount Tianmu
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如图3所示：5月共采集大蛾类标本708只，隶属22科168种，6月共采集大蛾类标本795只，隶属24科203种，7月共采集大蛾类标本996只，隶属24科256种，8月共采集大蛾类标本868只，隶属23科171种。通过对比分析发现：7月大蛾类的物种数和个体数均最大，5月最小。其中，7和8月大蛾类种群的物种数和个体数存在差异。
图 3 不同月份大蛾类的物种数和个体数
Figure 3. Number of species and individuals of large moth in different months
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如表4所示：天目山大蛾类种群的Simpson指数、Shannon指数、Pielou均匀度和Margalef丰富度的变化趋势一致，均在5和6月逐渐递增，7月最大，之后开始下降。说明大蛾类种群的物种数和个体数在均匀度指数上都是先增加后减少，均匀度越高则多样性越稳定，均匀度从大到小依次为7、6、5、8月。
表 4 不同月份大蛾类种群多样性
Table 4. New diversity of large moth species in different months
月份 个体
数/只Simpson
指数Shannon
指数Pielou
均匀度Margalef
丰富度5 708 0.798 2.162 0.329 2.668 6 795 0.819 2.263 0.339 3.231 7 996 0.819 2.438 0.353 3.534 8 868 0.788 2.210 0.327 2.876 -
本研究表明：天目山大蛾类种群多样性随着海拔高度的上升呈先增加后减少的趋势，在海拔600~800 m达到最大值。这与张瀚文等[1]的研究结果不一致，但与孙儒泳[13]的研究结果类似。这可能与天目山不同海拔的森林环境效益有关[14]。海拔0~400 m由于在保护区外，人为干扰严重，导致天目山生物多样性降低。海拔400~1 000 m在保护区内，物种多样性增加[15]。海拔1 000~1 600 m由于人为防火道的设立，再加上高大乔木的植被类型逐渐转换为落叶矮林和毛竹Phyllostachys edulis林，大蛾类种群的生物多样性降低。
除此之外，本研究还发现许多西部以及中部地区分布的大蛾类，例如粉红边尺蛾Leptomiza crenularia、灰沙黄碟尺蛾Thinopteryx delectans和白肩天蛾Rhagastis mongoliana mongoliana等[16]。此外还发现了青球箩纹蛾Brahmaea hearseyi、胖夜蛾Orthogonia sera、修虎蛾Sarbanissa transiens、平背天蛾Cechenena minor、椴六点天蛾Marumba dyras、金双点螟Orybina regalis等常见且种群数较少的大蛾类种类，这些物种对生境质量要求较高，森林环境变化对该大蛾类多样性影响明显[17]。由此可见天目山大蛾类物种丰富，生态环境较好，为绝大多数生物提供了较好的栖息地[18]。
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中度干扰假说是指中等条件有利于提高大蛾类种群稳定性[19]，对天目山8个不同海拔梯度的大蛾类种群多样性分析发现：人为环境的干扰也是影响大蛾类种群稳定的重要因素。在海拔600~1 000 m的梯度上，由于受到轻度人为干扰，大蛾类个体数量、物种数和多样性指数较高，大蛾类种群较稳定。海拔0~600、1 200~1 600 m梯度上分别受到重度人为干扰和无人为干扰，大蛾类个体数、物种数和多样性指数较低，大蛾类种群不稳定，这也印证了中度干扰有利于提高大蛾类种群稳定性。
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天目山大蛾类种群不同月份的个体数和物种数的变化趋势基本一致。这种现象可能与天目山气温变化和植被群落丰富度有关[20]。7月的物种数和个体数最多，其次是6、5、8月，这可能是7月是常绿阔叶林植被生长最为茂盛的阶段，此阶段更适宜大蛾类种群的发育繁殖。表明大蛾类种群对环境变化敏感，物种数差距大的同时多样性指数和均匀度指数也存在一定的差异，因此将大蛾类种群作为指示生物，对天目山海拔梯度的比较分析具有一定的代表性。
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浙江天目山国家级自然保护区管理局杨淑贞教授级高级工程师对本研究给予大力支持，在此感谢！
Population diversity and temporal dynamics of large moths at different altitudes in Mount Tianmu
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摘要:
目的 阐明浙江天目山大蛾类种群在不同海拔上的关系以及时间动态变化，为天目山昆虫调查提供理论依据。 方法 采用灯诱法，于2022年5—8月在浙江天目山国家级自然保护区内，对不同海拔高度的大蛾类昆虫进行采集，并对大蛾类种群及时间动态进行了研究。 结果 共采集大蛾类昆虫3 367只，隶属25科269种。优势类群为尺蛾科Geometridae、草螟科Crambidae、天蛾科Sphingidae和夜蛾科Noctuidae。在海拔600~1 200 m内，大蛾类种群的Simpson指数、Shannon指数、Margalef丰富度指数和Pielou均匀度指数均较高，总体呈正相关。在海拔600~1 200 m梯度上，大蛾类的种-多度曲线趋向对数正态分布，其余海拔梯度符合生态位优先占领假说。7月的大蛾类物种数和个体数最多，稳定性较强。 结论 天目山的大蛾类种群对时间敏感，5—8月大蛾类物种和个体数先增加后减少；大蛾类种群多样性随着海拔的升高先增加后减少，中低海拔梯度间的相似性系数呈中等相似和极相似水平。图3表4参20 Abstract:Objective With the clarification of the relationships and temporal dynamics of large moth species in Mount Tianmu in Zhejiang Province, this paper aims to provide a theoretical basis for the insect investigation in Mount Tianmu. Method Large moth specimens were collected from Zhejiang Mount Tianmu National Nature Reserve at different altitudes during the four-month period from May to August in 2022 before a systematic analysis was conducted of them and their population temporal dynamics. Result A total of 3367 large moth specimens were collected, belonging to 269 species of 25 families. The dominant taxa were the families Geometidae, Crambidae, Sphingidae and Noctuidae. At the altitude ranges of 600 − 1 200 m, the Simpson index, Shannon index, Margalef richness index and Pielou uniformity index were high, and the overall correlation was positive. The species-multidegree curve of large moths tended to be lognormal distribution at this altitude gradient, and the rest of altitude gradients were consistent with the niche priority occupation hypothesis. The number of large moth species was the largest with the strongest stability in July. Conclusion The large moth species were sensitive to time in Mount Tianmu with the number of species and individuals of them increasing at first and then decreasing from May to August. Species diversity of large moths increased at first and then decreased with the increase of altitude, and the similarity coefficient between medium and low altitude gradients was at medium and high levels. [Ch, 3 fig. 4 tab. 20 ref.] -
Key words:
- altitude /
- large moth population /
- diversity analysis /
- temporal dynamics /
- Mount Tianmu
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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus病在亚洲和欧洲造成严重的生态和经济损失[1-2]，伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola (EV菌)是松材线虫的内寄生真菌，产生的新月形孢子能侵染并杀死松材线虫，在松材线虫的生物防治方面具有良好的应用前景[3]。同时，EV菌亦可侵染拟松材线虫B. mucronatus、水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi等线虫。研究表明：EV真菌胞内存在共生细菌[4]，共生细菌对真菌的生物学和生态学具有重要的作用，如Rhizopus microsporus胞内的共生细菌Burkholderia能产生植物毒素根霉素，然后由宿主真菌分泌到环境中，导致水稻枯萎病[5]。菌丝内的共生微生物(细菌或病毒)是重要的能直接或间接改变真菌和宿主关系的互作生物[6-8]，提高宿主真菌的生态适应性[9-10]。存在共生细菌的真菌对碳氮源如何响应，其代谢产物发生何种变化，目前尚未见相关报道。
代谢组学是系统生物学研究中非常重要的一个环节，旨在研究生物体或组织，甚至单个细胞的全部小分子代谢物成分及其动态变化[11]。通过对代谢物质的分析，可以从生物样本中检测并筛选出具有重要生物学意义和显著差异的代谢物质，并以此为基础研究生物体的代谢过程和变化机制[12]。对EV菌在不同碳、氮培养条件下代谢物的变化进行分析，明确显著差异代谢物，特别是重要的信号分子，不仅为EV菌的应用提供重要理论基础，而且对深入研究内共生细菌在EV菌的功能亦具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 菌株
伊氏杀线虫真菌Esteya vermicola CBS115803购于荷兰菌物保存中心。
1.2 培养基
碳培养基为24 g 马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，Becton， Dickinson and Company，美国)和10 g琼脂溶于1 L双蒸水。氮培养基为5 g酵母粉(OXOID公司，英国)和10 g琼脂溶于1 L双蒸水。
1.3 仪器和试剂
Nano高分辨液质联用分析仪QE (Thermo Q-Exactive，德国)；赛多利斯BSA124S电子天平；真空浓缩仪(Labogene MaixVac Alpha, 丹麦)；Sigma 3-30KS高速离心机，KQ5 200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；色谱级甲醇(Fisher，美国)。
1.4 处理
配制碳、氮固体培养基，培养基凝固后放入已灭菌的尼龙膜(孔径3 μm，赛多利斯)，接种EV菌后于25 ℃培养7 d。将长满菌丝和孢子的尼龙膜用无菌镊子取出，用超纯水冲洗尼龙膜，再用无菌的吸水纸吸掉尼龙膜接触培养基面的水分，而后将菌丝和孢子刮入2 mL圆底灭菌干燥离心管，装样品前后分别称量离心管的质量，迅速将样品管放入液氮中淬灭后于−80 ℃保存。每处理设置5次生物学重复，编号依次为C1~C5和N1~N5。加入冷冻洁净无菌的直径为3 mm的钢珠2个，液氮冷冻条件下使用莱驰RETSCH MM 400研磨2 min。将研磨好的样品管置于干冰上，加入2 mL预冷的体积分数为80%甲醇于−80 ℃冰箱静置1 h，4 ℃、14 000 g离心20 min后将上清液转移至另一相同体积离心管，真空浓缩干燥样品后于−80 ℃保存。用300 μL体积分数为90%甲醇超声复溶并经0.45 μm的滤膜过滤，完成亲水代谢产物提取。
1.5 HPLC-MS分析
采用非靶标的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对样品进行测定和代谢物识别。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm)。流动相：0.1%甲酸-水溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)。洗脱条件：0~0.5 min，95%B；0.5~7.0 min，95%~65% B；7.0~8.0 min，65%~40% B；8.0~9.0 min，40%B；9.0~9.1 min，40%~95%B；9.1~12.0 min，95%B。质谱参数条件：鞘气，310 275 Pa；辅助气，103 425 Pa；喷雾电压，4 000 V (正)/3 500 V (负)；离子传输管温度：350 ℃。在采集软件(Xcalibur 4.0.27，Thermo)的控制下，采用一级质谱全扫描(全MS)结合自动触发二级质谱扫描(MS/MS)模式，使用阴、阳离子模式2种电离方式采集质谱数据。运行时间：0~18 min。分辨率：全MS，170000；MS/MS，17500。
1.6 代谢物注释分析
对原始数据进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，最终得到1个保留时间、质荷比和代谢物信号(峰面积)的数据矩阵。将处理后的代谢物信号与一级和二级数据库进行匹配，将其中二级得分＜30的化合物可信予以剔除。分析时10份样品共插入3个质量对照(QC)样本以考察整个分析过程中仪器的稳定性，QC样本每种化合物的峰面积的变异系数若＞30%，则予以剔除。未检出值设定为0，缺失值由其余重复样品的均值填补。
1.7 差异代谢物筛选
由Metaboanalyst 4.0在线软件(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)完成。利用对数转换和pareto缩放对各代谢物相对含量进行标准化处理。使用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判别法(PLS-DA)评估不同处理的分组情况。结合以下2个标准对2种培养基的阴阳离子模式的差异化合物进行筛选：经FDR (false discovery rate)校正的t检验的P＜0.05；正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)中变量投影重要性(variable influence on projection，VIP)得分＞1。
1.8 代谢通路分析
代谢通路分析由Metaboanalyst 4.0 (
https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/upload/PathUploadView.xhtml )中的代谢通路分析模块(pathway analysis module)完成。该分析将选定的差异代谢物与KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库(2019年10月)和人类代谢组数据库(HMDB)进行匹配，然后选择酵母Saccharomyces cerevisiae的代谢通路库作为参照进行富集分析和拓扑分析。富集分析中采用参数超几何法(hypergeometric test)检验每个代谢通路的显著性(P＜0.05)；拓扑分析中差异显著性检验的方法为相对介数中心性(relative-betweeness centrality)。2. 结果与分析
2.1 阴阳离子模式下鉴定的化合物
阳离子模式下鉴定到的化合物多于阴离子模式下鉴定的化合物。阴、阳离子模式分别检测出279和461种化合物，其中74种为2种模式共同检出，共计666种化合物。通过质量控制过滤处理，阴、阳离子模式分别有176和362种化合物，其中2种模式共同含有40种化合物，共计498种化合物。数据总的缺失值的比例平均为0.74%：阴离子模式下，碳和氮培养基下的代谢物缺失率均为0.23%；阳离子模式下，碳培养基下的缺失率为2.38%，高于氮培养基0.11%。
2.2 组间差异分析
阴离子和阳离子模式下EV菌菌丝体代谢物的主成分分析得分图(图1A~B)显示：前2个主成分分别解释了94.9% (主成分1为92.5%，主成分2为2.4%)和92.5% (主成分1为89.5%，主成分2为3.0%)的变异。2种离子模式下EV菌代谢谱在碳、氮培养基培养后差异大，分组明显。偏最小二乘法判别法的分组结果(图1C~D)与主成分分析法结果一致。
图 1 碳、氮培养条件下EV菌代谢物的PCA和PLS-DA分析Figure 1 PCA and PLS-DA of EV metabolites under carbon and nitrogen culture conditions2.3 差异化合物
采用火山图的形式进行差异化合物展示，见图2。t检验差异显著(P＜0.05)的化合物共有444种，占总数的89.2%；阴离子和阳离子模式分别有162和310种，28种为2种模式共有。VIP＞1的化合物共有469种，占总数的94.2%；阴离子和阳离子模式分别有167和334种，32种为2种模式共有。利用VIP＞1筛选出的化合物包含t检验法的筛选结果，表明后者更严格，且更符合统计要求。
图 2 碳、氮培养条件下EV菌的差异代谢物Figure 2 Differential metabolites of EV bacteria under carbon and nitrogen culture conditions以碳为对照组，在氮组中上调代谢物的数量是下调的3.4倍，分别为342和102种；上调和下调代谢物分别有309和86种匹配到HMDB数据库，有159和71种匹配到KEGG数据库。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是在氮培养下大量产生的特有代谢物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是代谢物在氮培养条件下显著上调(表1)。
表 1 部分差异化合物Table 1 Part of significantly different metabolites化合物名称 质荷比 保留时间/min 二级数据库得分 变化倍数 P KEGG编号 磷酸胍基乙酸酯 198.03 9.86 62 12.46 1.13×10−13 C03166 对甲酚硫酸盐 187.01 6.17 53 12.41 8.88×10−15 邻氨基苯甲酸酯 136.04 2.00 50 9.93 1.67×10−8 C00108 尿酸 190.05 1.29 40 8.26 6.26×10−7 C01717 尼古丁 163.12 4.68 44 5.51 1.14×10−6 C16150 4-羟基-2-喹啉羧酸 188.03 5.76 30 5.48 9.62×10−8 C01717 烟酸 124.04 3.50 41 5.17 1.71×10−7 C00253 尿囊素 159.05 5.46 50 5.09 2.53×10−4 C01551 吲哚丙烯酸 188.07 7.98 98 4.20 4.68×10−8 2-吡咯烷酮 86.06 3.79 41 4.10 2.57×10−5 C11118 咪唑乙酸 127.05 9.62 69 3.54 1.56×10−7 C02835 组胺 112.09 5.74 45 3.34 2.79×10−8 C00388 谷胱甘肽 306.08 1.02 58 3.26 5.97×10−4 C00051 光色素 243.09 1.58 70 3.00 2.79×10−4 C01727 肌肽 227.11 12.66 55 2.40 3.30×10−5 C00386 甜菜碱醛 102.09 6.73 68 2.25 9.68×10−3 C00576 吲哚 118.07 8.32 57 2.12 4.40×10−3 C00463 苹果酸 133.01 0.90 43 1.90 2.86×10−5 C00711 甜菜碱 118.09 8.30 51 1.88 2.79×10−8 C00719 胍基乙酸d 118.06 8.26 38 1.87 1.19×10−3 C00581 葫芦巴碱 138.06 9.05 38 1.59 1.71×10−7 C01004 海藻糖 341.11 1.04 78 1.34 6.16×10−5 C01083 左旋肉碱 162.11 9.31 72 1.34 2.97×10−6 C00318 邻乙酰左旋肉碱 204.12 8.54 73 1.32 1.69×10−6 C02571 茶碱 181.07 2.24 55 −1.64 6.07×10−7 C07130 二乙醇胺 106.09 8.16 45 −1.73 1.42×10−4 C06772 去甲肾上腺素 170.08 5.83 57 −2.40 1.52×10−5 C00547 阿魏酸盐 193.05 5.36 32 −3.58 2.87×10−5 C01494 核糖醇 151.06 1.01 46 −4.08 3.13×10−8 C00474 甲基咪唑乙酸 141.07 9.52 41 −4.51 2.90×10−8 C05828 赤藓糖醇 121.05 1.04 75 −5.20 2.80×10−5 C00503 2.4 代谢通路分析
由表2和图3可见：利用KEGG数据库对氮培养中上调和下调的显著差异代谢产物进行富集分析。上调代谢产物主要富集到氨基酸代谢通路，包括氨酰基tRNA的生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，精氨酸生物合成，牛磺酸和低牛磺酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。下调的显著差异代谢产物主要涉及糖类代谢通路，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、淀粉和蔗糖代谢。
表 2 碳、氮培养条件下EV菌差异代谢物富集到的KEGG通路Table 2 Enriched KEGG pathways by differential metabolites of EV under carbon and nitrogen culture conditions代谢通路编号 代谢通路名称 匹配情况 P 影响大小 上调 sce00970 氨酰基tRNA的生物合成 18/46 4.38×10−4 0.11 sce00330 精氨酸和脯氨酸代谢 10/25 7.53×10−3 0.33 sce00220 精氨酸生物合成 8/18 8.05×10−3 0.60 sce00430 牛磺酸和低牛磺酸代谢 4/7 2.28×10−2 1.00 sce00250 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 8/22 3.06×10−2 0.81 下调 sce00520 氨基糖和核苷酸糖代谢 8/24 3.41×10−4 0.48 sce00052 半乳糖代谢 5/17 8.98×10−3 0.82 sce00040 戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化 4/12 1.22×10−2 0.27 sce00500 淀粉和蔗糖代谢 4/15 2.79×10−2 0.35 说明：匹配情况为匹配化合物个数/通路化合物总数 
图 3 差异代谢产物富集到的显著代谢通路Figure 3 Significant metabolic pathways enriched by differential metabolites3. 讨论
本研究在代谢组水平探究含内共生细菌的生防真菌EV菌对不同碳氮培养基的化学响应，鉴定到一些差异显著的化合物，尤其是在氮源培养基中特有的代谢产物，并定位到重要代谢途径上。磷酸胍基乙酸酯和对甲酚硫酸盐是在氮培养下EV菌大量产生的特有代谢物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是氮培养条件下显著上调的代谢物。对甲酚硫酸盐是细菌代谢酪氨酸的产物[13]。已有研究证实：拟杆菌科Bacteroidaceae、双歧杆菌科Bifidobacteriaceae、梭菌科Clostridiaceae、肠杆菌科Enterobacteriaceae、肠球菌科Enterococcaceae、优杆菌科Eubacteriaceae、梭杆菌科Fusobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳杆菌科Lactobacillaceae、紫单胞菌科Porphyromonadaceae、葡萄球菌科Staphylococcaceae、疣微菌科Ruminococcaceae和韦荣氏菌科Veillonellaceae等细菌是对甲酚硫酸盐的产生菌[14]。已有研究表明：细菌也可以降解对甲酚[15]，真菌Trichosporon cutaneum和Aspergillus fumigatus也可以利用对甲酚作为碳源[16-17]。因此推测：对甲酚硫酸盐可能是在高氮源培养下，由于碳源严重缺乏，EV菌胞内共生细菌代谢酪氨酸产生对甲酚或对甲酚硫酸盐，从而将其做为碳源进一步利用。
多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌(迄今为止共有85种)都会产生大量的吲哚。作为细胞间信号分子，吲哚控制细菌生理的多个方面，例如孢子形成、质粒稳定性、耐药性、生物膜形成和吲哚产生细菌的毒力[18]。在细菌中，吲哚由氨基酸色氨酸的降解产物产生。吲哚是细菌Ⅲ型分泌系统表达的信号分子[19]。EV真菌细菌共生体可产生吲哚，根据上述目前的研究只在细菌发现吲哚的产生，因此我们推测胞内细菌可能是吲哚的产生者，细菌可以利用吲哚这一信号分子协调两者行为，以在真菌胞内生存。
前期研究表明：EV菌基因组中含有比其他杀线虫真菌，如Arthrobotrys oligospora、Dactylellina haptotyla、Drechmeria coniospora更多的尿囊素转运蛋白[20]。此外，EV菌胞内的共生细菌属于假单孢属Pseudomonas[6]。尿囊素是腺嘌呤和鸟嘌呤代谢的中间产物，尿囊素可以被某些真菌、细菌和植物用作碳和氮的来源，尿囊素或尿囊素通路的衍生物可能有助于提高真菌向宿主植物提供氮的能力[21]。如在一些外生菌根真菌中，已鉴定出尿囊素/尿囊酸转运蛋白[21-22]。研究发现：假单孢属的细菌和酵母Saccharomyces cerevisiae也可以降解尿囊素[23-24]。在氮源充足的氮培养条件下，尿囊素代谢产物约是碳培养条件下的32倍，因此，尿囊素很可能是EV菌供给胞内共生细菌氮源的一种形式。
海藻糖在自然界中分布广泛，包括细菌、真菌、植物、无脊椎动物和哺乳动物。由于其特殊的物理特性，海藻糖能够保护细胞的完整性免受各种环境损害和营养限制。细菌可以使用海藻糖作为碳和能量的唯一来源，一些分枝杆菌中海藻糖可作为细胞壁的结构成分，而酵母细胞在很大程度上不能以海藻糖为碳源生长[25]。在根瘤菌-豆科Leguminosae植物共生期间，海藻糖在根瘤发育过程中被储存在根瘤中，并成为细菌的主要碳水化合物，而与所供应的碳源和氮源类型无关[26]。内源性海藻糖在碳缺乏或在给定培养基中碳源耗尽后被动员。海藻糖很可能是EV共生细菌的一种碳源，在碳源缺乏时作为储备能源(氮培养下产生的海藻糖是碳培养下的2.5倍)。
光色素是核黄素的光敏分解产物。关于光色素的酶促转化路径已在假单胞菌等细菌中进行研究[27]。已有研究认为：光色素是细菌群感效应的信号分子[28]，是能影响植物生长的细菌信号分子[29]，同时也是共生的信号分子[30-31]。不同的营养条件(如氮和磷)可改变细菌产生光色素的浓度[30]。本研究使用的氮源是有机氮源。在该氮培养下产生的光色素是碳培养下的8倍，氮培养条件下光色素的产量远高于碳培养条件，不同于前人报道的高浓度硝酸盐降低光色素的产量[30]。
差异最显著的代谢物多数未能富集到显著的代谢通路，原因在于这些化合物的代谢通路尚未研究透彻，或者它们是EV菌的特异化合物，尚未包括在参照数据库中。无论以真菌还是细菌数据库为参照，富集到的显著代谢通路基本一致，均与氨基酸和糖类代谢相关，而这些通路是真菌和细菌共有的，无法区分内共生细菌对其真菌宿主代谢的影响。笔者曾试图利用多种抗生素去除内共生细菌以解决该问题，并未获得成功，需要更深入的研究。
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图 1 天目山不同海拔高度大蛾类种-多度曲线
Figure 1 Large moth species-multidegree curves at different altitudes of Mount Tianmu
图 2 天目山不同海拔系统聚类分析
Figure 2 Continental distance clustering analysis at different altitudes of Mount Tianmu
图 3 不同月份大蛾类的物种数和个体数
Figure 3 Number of species and individuals of large moth in different months
表 1 天目山不同海拔下大蛾类种群的组成
Table 1. Composition of large moth species at different altitudes of Mount Tianmu
科名 0~200 m 200~400 m 400~600 m 600~800 m 800~1 000 m 1 000~1 200 m 1 200~1 400 m 1 400~1 600 m 个体总
数/只S N S N S N S N S N S N S N S N 斑蛾科Zygaenidae 1 2 0 0 1 6 1 12 1 5 0 0 0 0 0 0 25 波纹蛾科Thyatiridae 1 9 1 11 2 10 2 25 2 20 1 6 1 1 0 0 82 蚕蛾科Bombycidae 1 3 1 8 1 3 2 12 1 4 1 5 1 1 0 0 36 草螟科Crambidae 15 29 16 43 25 53 26 69 23 71 15 44 7 21 3 8 338 尺蛾科Geometridae 19 49 20 65 31 89 53 116 57 122 34 93 22 53 11 28 615 刺蛾科Limacodidae 1 2 1 4 3 15 4 12 3 10 1 1 0 0 0 0 44 大蚕蛾科Saturniidae 2 8 4 15 7 30 8 45 7 30 4 14 5 14 0 0 156 带蛾科Thaumetopoeidae 0 0 1 2 1 4 1 9 1 7 0 0 0 0 0 0 22 灯蛾科Arctiidae 1 3 1 12 1 7 2 25 2 18 1 1 0 0 1 2 68 毒蛾科Lymantriidae 2 6 2 13 3 20 4 31 3 15 2 6 1 1 0 0 92 凤蛾科Epicopeiidae 1 2 0 0 1 1 1 1 1 4 0 0 0 0 0 0 8 钩蛾科Drepanidae 3 7 4 8 7 16 9 27 7 22 1 4 2 3 0 0 87 卷蛾科Tortricidae 1 9 1 7 0 0 1 7 1 3 0 0 0 0 0 0 26 枯叶蛾科Lasiocampidae 1 3 3 13 8 23 9 31 6 21 5 16 2 5 0 0 112 瘤蛾科Nolidae 1 3 2 6 3 13 3 22 3 13 2 4 0 0 0 0 61 箩纹蛾科Brahmaeidae 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 0 0 0 0 0 0 3 螟蛾科Pyralidae 2 7 4 15 5 23 6 56 5 47 6 27 2 8 3 8 191 木蠹蛾科Cossidae 2 10 1 2 2 8 3 9 1 8 1 1 0 0 0 0 38 裳蛾科Erebidae 2 7 4 15 7 25 11 40 9 27 6 13 1 3 0 0 130 苔蛾科Lithosiidae 1 2 1 10 1 20 1 43 1 28 1 34 1 6 0 0 143 天蛾科Sphingidae 12 28 13 35 24 56 31 112 30 113 26 80 8 20 5 13 457 网蛾科Thyrididae 1 4 2 11 3 20 3 20 2 14 1 4 1 1 0 0 74 燕蛾科Uraniidae 0 0 1 2 2 10 2 18 1 8 0 0 0 0 0 0 38 夜蛾科Noctuidae 5 16 7 22 11 47 35 79 40 78 23 59 17 36 2 11 348 舟蛾科Notodontidae 2 8 4 13 3 13 11 55 14 61 2 15 1 7 1 1 173 S合计 77 94 152 229 222 131 72 26 269 N合计 217 332 512 877 751 427 180 71 3367 S占比/% 28.62 34.94 56.51 85.13 82.53 49.44 26.77 9.67 N占比/% 6.44 9.86 15.21 26.05 22.30 12.68 5.35 2.10 说明：S. 物种数(种)；N. 个体数(只)。各海拔梯度之间有相同物种。 
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表 2 天目山不同海拔梯度下大蛾类种群多样性指数
Table 2. Large moth population diversity index under different altitude gradients of Mount Tianmu
海拔/m Simpson指数 Shannon指数 Pielou均匀度 Margalef丰富度 0~200 0.869±0.040 bc 2.322±0.310 bc 0.345±0.040 b 3.903±0.400 a 200~400 0.901±0.010 abc 2.565±0.120 ab 0.381±0.010 a 3.617±0.160 a 400~600 0.910±0.010 ab 2.634±0.080 a 0.391±0.010 a 3.527±0.200 a 600~800 0.922±0.000 a 2.769±0.200 a 0.411±0.020 a 3.542±0.180 a 800~1 000 0.902±0.010 abc 2.605±0.090 ab 0.387±0.010 a 3.625±0.180 a 1 000~1 200 0.857±0.030 c 2.195±0.160 c 0.326±0.020 b 2.972±0.190 b 1 200~1 400 0.791±0.060 d 1.816±0.310 d 0.269±0.040 c 2.696±0.230 b 1 400~1 600 0.646±0.030 e 1.242±0.070 e 0.188±0.010 d 1.408±0.110 c 说明：数值为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同海拔间差异显著(P＜0.05)。
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表 3 不同海拔天目山大蛾类种群相似性系数
Table 3. Similarity coefficients of large moth population at different altitudes of Mount Tianmu
海拔/m 0~200 m 200~400 m 400~600 m 600~800 m 800~1 000 m 1 000~1 200 m 1 200~1 400 m 1 400~1 600 m 0~200 1.000 0.833 0.875 0.880 0.880 0.864 0.682 0.318 200~400 1.000 0.875 0.880 0.880 0.864 0.682 0.318 400~600 1.000 0.657 0.657 0.826 0.652 0.304 600~800 1.000 0.900 0.760 0.600 0.280 800~1 000 1.000 0.760 0.600 0.280 1 000~1 200 1.000 0.789 0.368 1 200~1 400 1.000 0.467 1 400~1 600 1.000
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表 4 不同月份大蛾类种群多样性
Table 4. New diversity of large moth species in different months
月份 个体
数/只Simpson
指数Shannon
指数Pielou
均匀度Margalef
丰富度5 708 0.798 2.162 0.329 2.668 6 795 0.819 2.263 0.339 3.231 7 996 0.819 2.438 0.353 3.534 8 868 0.788 2.210 0.327 2.876
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