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毛竹Phyllostachys edulis为竹亚科Bambusoideae刚竹属Phyllostachys的散生竹种，广泛分布于东亚和东南亚，其种植面积高达460多万hm2[1]。由于生长速度快并且富含纤维素和半纤维素，毛竹是中国重要的固碳植物和工业原料来源[2−3]。毛竹的种下分类群具有丰富的变型和栽培变型，主要表现在秆型和秆色等方面的变异[4]。毛竹的秆色变异栽培种是优良的园林观赏竹类资源，主要包括花毛竹Ph. edulis f. taokiang、黄皮毛竹Ph. edulis f. holochrysa、绿槽毛竹Ph. edulis f. bicolor、黄槽毛竹Ph. edulis f. luteosulcata和绿槽龟甲竹Ph. edulis f. lücaoguijiazhu等。
高等植物的叶绿体是半自主的细胞器，具有相对保守的遗传体系[5]。叶绿体基因组为母系遗传物质，结构保守，进化速率均衡，分别可以应用于目级、科级、属级、种级的系统发育关系重建[6]。HUANG等[7]通过叶绿体基因组系统进化分析，将11个榕属Ficus物种根据不同亚属进一步划分为3个支系，同时发现榕属与桑属Morus植物的属间亲缘关系。ZHANG等[8]通过对17个孩儿参Pseudostellaria heterophylla品种的完整叶绿体基因组序列分析，发现中国种群被聚类为单系群，其中不开花的品种形成了独立的亚支系，并且揭示了孩儿参的种内变异，进一步支持了叶绿体基因组可以阐明近缘物种之间亲缘关系的观点。迄今为止，绿槽毛竹[9]、厚壁毛竹Ph. edulis f. pachyloen[10]、青龙竹Ph. edulis f. curviculmis[11]和龟甲竹Ph. edulis f. tubiformis[12]的叶绿体基因组已发布；这些毛竹种下分类群的叶绿体基因组大小均为139 678 bp，包含126~132个基因，其中包括84~85个蛋白质编码基因、8个rRNA和34~39个tRNA。黄槽毛竹是毛竹中秆色变异类型的重要栽培类型，表现为茎秆节间槽部失绿而秆壁绿色，具有较好的观赏价值[13]。黄槽毛竹的叶绿体基因组资料未见报道，并且毛竹种下分类群的叶绿体基因组之间的比较缺乏研究。本研究将对黄槽毛竹的叶绿体基因组进行组装注释，分析其基因组特征，并比较与其他毛竹种下分类群之间的叶绿体遗传信息差异和系统进化关系。
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黄槽毛竹新鲜竹青采集于浙江农林大学东湖校区翠竹园(30°26′N, 119°72′E)。黄槽毛竹取植物枝条标本(编号LIUX202301)，保存在浙江农林大学林业与生物技术学院植物标本室。
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取2 g新鲜竹青进行液氮研磨，随后转移到离心管，配合天根Plant Genomic DNA Kit (Cat.#DP305-03)试剂盒和其建议的操作流程进行基因组DNA提取。对检验合格后的DNA样品进行二代测序文库构建。在Illumina HiSeq
4000 平台测序DNA测序，测序深度为60×。原始数据可经国家基因库生命大数据平台(CNGBdb)的样本编号CNS0314191获取。 -
利用fastp[14]对二代测序数据进行过滤，去除接头和切除低质量的数据，具体参数设置为“-w 16 -5 25 -3 25 --length_required 50 --average_qual 25 -z 9”；通过GetOrganelle[15]对清洗后的数据进行叶绿体基因组进行组装；参数设置为“-F embplant_pt -o output -R 10 -t 10 -k 21,45,85,105”。原始数据上传至美国国家生物技术信息中心(NCBI) GenBank (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov )，登录号为OR597504。使用CPGAVAS2对叶绿体基因组进行注释。使用CHLOROPLOT在线软件(https://irscope.shinyapps.io/Chloroplot/ )绘制基因组图谱。 -
利用MISA[16]在线软件检测简单重复序列，相应参数设置为：单核苷酸重复≥10，二核苷酸≥5，三核苷酸重复≥4，四、五和六核苷酸重复≥3。采用REPuter在线软件(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)验证黄槽毛竹的重复序列，包括正向重复序列(F)、反向重复序列(R)、互补重复序列(C)以及回文重复序列(P)，设置参数为“Minimal repeat size = 15 bp，Edit distance ≥ 3 bp”。
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边界收缩与扩张分析使用Genepioneer平台(
http://cloud.genepioneer.com:9929/ )的CPJSdraw-边界图绘制-v1.0.0功能进行绘制。利用mVISTA进行多序列变异分析，比对运算模式设置为Shuffle-LAGAN，可视化参数设置为Y轴起始坐标为0。核苷酸多样性分析使用JSHYCloud平台(http://cloud.genepioneer.com:9929 )进行分析绘制。 -
序列比对使用软件Mafft v7.490[17]，参数设置为默认条件。系统发育进化关系重建分别采用了贝叶斯推理法和最大似然法。贝叶斯推理法所采用的软件为MrBayes v3.2.7 (
https://mybiosoftware.com/mrbayes-3-1-2-bayesian-inference-phylogeny.html )，参数设置为“ngen=1 000 000, samplefreq=100, nchains = 4, temp = 0.1, burnin=2 500”。最大似然法采用了IQ-TREE v2.0.7[18]进行运算，最佳进化模型为程序自动选择。构建系统发育树所用分类群及其序列数据登录号：毛竹原变种Phyllostachys edulis f. pubescens (HQ337796)、黄槽毛竹(OR597504)、花毛竹(SRR6705383)、青龙竹(MW007169)、绿槽毛竹(OM084949)、黄皮毛竹(SRR6705382)、厚壁毛竹(MN537809)、淡竹Ph. nigra var. henonis (HQ154129)、筇竹Ph. glauca (MT657329)、红壳雷竹Ph. incarnata (OL457160)、桂竹Ph. reticulata (MN537808)、麻竹Dendrocalamus latifloru (FJ970916)、瓜多竹Guadua amplexifolia (KM365071)、巴西玉米竺Raddia brasiliensis (KJ870998)和莪莉竹Olyra latifolia (KF515509)。花毛竹和黄皮毛竹的基因组序列分别由NCBI获取的原始测序数据经GetOrganelle组装得到。 -
黄槽毛竹绿色组织的二代测序获得42.78 Gb的原始数据，包含了285 198 507对读段。原始数据被清洗后，获得283 052 833对长度大于50 bp且平均碱基质量值大于25的读段。经GetOrganelle组装获得黄槽毛竹叶绿体基因组序列大小为139 678 bp。该叶绿体基因组具有典型的环状四分体结构，由大单拷贝区域(LSR)、小单拷贝区域(SSR)、2个反向互补重复区域(IRs)等4个部分组成，其中LSR长度为83 212 bp，SSR长度为12 870 bp，2个IRs (IRA和IRB)长度为43 596 bp (图1)。整个叶绿体基因组中GC含量为38.88%，LSC、SSC和IRs区域GC含量分别为36.97%、33.17%和44.22%，其中IRs区域GC含量明显高于2个单拷贝区域。
图 1 黄槽毛竹叶绿体基因组图谱
Figure 1. Genome map of the chloroplast of Ph. edulis f. luteosulcata
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黄槽毛竹叶绿体基因组总共包含132个基因，包括85个蛋白质编码基因、39个tRNA、8个rRNA (表1)。根据生物学功能可以将85个蛋白质编码基因分为以下三大类：与光合作用相关基因共50个；与表达相关基因共31个；其他基因共4个。该基因组中共12个基因具有内含子结构[ndhA、ndhB(2)、petB、petD、atpF、rpl16、rpl2(2)、ycf3、rps16和rpoC2]，1个蛋白质编码基因含有反式剪接基因(rps12)。由于绿槽毛竹具有绿色的节间秆槽和黄色的节间秆壁，与黄槽毛竹的秆色表型相反，本研究比较了黄槽毛竹、绿槽毛竹和毛竹原变种的叶绿体基因组信息，发现黄槽毛竹叶绿体基因组的蛋白质编码基因、tRNA与毛竹原变种有所差异(表2)，相较于绿槽毛竹及毛竹原变种，黄槽毛竹的蛋白质编码基因缺少2个ycf68。黄槽毛竹叶绿体基因组的蛋白质编码基因数量也同毛竹原变种有所不同，前者比后者多1个编码基因rps12。
表 1 黄槽毛竹叶绿体基因组的基因列表
Table 1. Gene of the Ph. edulis f. luteosulcata chloroplast genome
基因类别 基因分组 基因列表 光合作用基因 ATP合酶亚基 atpA、atpB、atpE 、 atpF*、atpH 、atpI 依赖ATP的Clp蛋白酶蛋白水解亚基 clpP 光合系统Ⅱ亚基 psbA、psbB、psbC、psbD、psbE 、psbF、psbH、psbI 、psbJ、psbK 、psbL、psbM 、psbN 、psbT 、psbZ NADH脱氢酶亚基 ndhA*、ndhB*、ndhB*、ndhC 、ndhD 、ndhE 、ndhF 、ndhG、ndhH 、ndhI 、ndhJ 、ndhK 细胞色b/f 复合物亚基 petA、petB*、petD*、petG 、petL 、petN 光合系统Ⅰ亚基 psaA、psaB、psaC 、psaI 、psaJ 光合系统Ⅰ组件 ycf2、 pafI (ycf3)** 、ycf2 光合系统Ⅱ组件 pafⅡ (ycf4) 二磷酸核酮糖羧化酶亚基 rbcL 表达相关基因 核糖体大亚基 rpl14、rpl16*、rpl20、rpl22、rpl23、rpl23 、rpl32 、rpl33 、rpl36、rpl2*、rpl2* 依赖DNA的RNA 聚合酶 rpoA、rpoB 、rpoC1 、rpoC2* 核糖体小亚基 rps2、rps3、rps4、rps7、rps7、rps8、rps11、rps12 、rps12、rps14、rps15、rps15、rps16*、rps18、rps19、rps19 rRNA基因 rrn16S、rrn23S 、rrn4.5S、rrn5S 、rrn5S、rrn4.5S、rrn23S、rrn16S tRNA基因 trnA-UGC*、trnA-UGC*、trnC-GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC、trnH-GUG、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-CAU、trnI-GAU*、trnI-GAU*、trnK-UUU*、trnL-CAA、trnL-CAA、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU、trnM-CAU、trnM-CAU、trnN-GUU、trnN-GUU、trnP-UGG、trnQ-UUG、trnR-ACG、trnR-ACG、trnR-UCU、trnS-CGA*、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC、trnV-GAC、trnV-UAC*、trnW-CCA、trnY-GUA 其他基因 C型细胞色素合成基因 ccsA 胞膜蛋白 cemA 成熟酶 matK 翻译起始因子 infA 说明：加粗代表多拷贝的基因；*表示带1个内含子的基因；**表示带2个内含子的基因。 表 2 黄槽毛竹和绿槽毛竹、毛竹原变种的叶绿体基因差异
Table 2. Chloroplast gene differences among Ph. edulis f. luteosulcata, Ph. edulis f. bicolor, and Ph. edulis var. pubescens
项目 黄槽毛竹 毛竹 绿槽毛竹 蛋白编码基因数量 85 84 83 转运RNA数量 − − − 核糖体RNA数量 − − − 蛋白质编码基因差异 rps12 (2)、ycf2 (2) rps12、ycf68(2) rps12、ycf68 转运RNA差异 trnG-GCC、trnS-CGA trnG-UCC、trnG-UCC trnG-GCC、trnG-UCC 说明：(2)代表拷贝数为2；−表示未检测到。 -
根据黄槽毛竹叶绿体基因组RSCU(图2A)显示：共有64种密码子编码20种氨基酸，密码子中UUA的RSCU为最高值(1.97)，CUG为最低值(0.33)。RSCU＞1的有32个，其中以A/U结尾的密码子有30个，提示密码子偏好使用以A/U结尾的密码子。重复序列按照不同的排列方式可分为正向重复序列、反向重复序列、回文重复序列和互补重复序列4种类型。黄槽毛竹叶绿体基因组中共检测出49个重复序列，其中40个为正向重复序列，9个为回文重复序列，未发现反向和互补重复序列。所有重复序列长度为30~100 bp，其中序列长度在30~60 bp的重复序列占比较高，为85.7%。此外，在基因组中共检测出55个SSR位点(图2B)，包括34个单核苷酸重复序列、4个二核苷酸重复序列、3个三核苷酸重复序列、13个四核苷酸重复序列和1个五核苷酸重复序列，其中简单重复序列最多的类型为A/T，共23个。
图 2 黄槽毛竹叶绿体基因组的重复分析
Figure 2. Repeat analysis of chloroplast genomes of Ph. edulis f. luteosulcata
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高等植物的叶绿体通常为典型的四分体结构，但是常常发生SSC和LSC的扩张和收缩，导致四分体的边界发生变化。对黄槽毛竹与其他毛竹变型等7个种下分类群的叶绿体基因组四分体边界进行了分析(图3A)显示：黄槽毛竹叶绿体基因组四分体边界的扩张和收缩与其他分类群的高度一致，并且前者边界基因也与其他的高度统一。然而，黄槽毛竹、青龙竹和黄皮毛竹与其他毛竹种下分类群之间存在着边界编码基因编码长度不一致的情况，如前三者的rps19编码长度为216 bp，其他毛竹种下分类群的该基因编码282 bp。mVISTA分析显示(图3B)：对比毛竹原变种，黄槽毛竹以及其他毛竹种下分类群的叶绿体基因组变异程度较低，仅在psbC、ycf3基因编码区与非编码区之间(psbA附近)具有一定程度的序列差异。此外，基于CPGview鉴定黄槽毛竹、毛竹原变种和绿槽毛竹之间的顺式剪切基因，黄槽毛竹有12个，后两者有11个。其中黄槽毛竹较后两者多获得rpoC2的顺式剪切形式(图4A)。将核苷酸多样性(Pi)截断点设定为Pi≥0.04，在7个毛竹种下分类群的基因组序列比对中发现了3个高变异区域(图4B)。这些高变异区均位于蛋白编码基因ndhF附近，主要表现在叶绿体基因组ndhF和rpl32之间的SSC区。这些变异区域将可以用于毛竹种下分类群的分子鉴定依据。上述序列数据表明：毛竹种下分类群之间的序列变异较低，但不同分类群之间仍具有一些共有和特异的变异特征。
图 3 黄槽毛竹与其他毛竹变型的叶绿体基因组序列变异比较
Figure 3. Comparison of chloroplast genome sequence variation between Ph. edulis f. luteosulcata and other subspecies in moso bamboo
图 4 黄槽毛竹与其他毛竹变型的顺式剪切基因比较和叶绿体基因组核苷酸多样性(Pi)分析
Figure 4. Comparison of the cis-splicing genes and analysis of nucleotide diversity (Pi) of cp genomes between Ph. edulis f. luteosulcata and other subspecies in moso bamboo
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为了进一步了解黄槽毛竹在竹子分类群内进化关系，利用毛竹种下分类群(毛竹原变种、绿槽毛竹、厚壁毛竹、青龙竹、黄皮毛竹、花毛竹和黄槽毛竹)，4个刚竹属物种(淡竹、筇竹、红壳雷竹和桂竹)，麻竹、瓜多竹、外类群草本竹巴西玉米竺和莪莉竹的叶绿体全基因组进行系统进化树的重建。贝叶斯推理法重建的系统进化树(图5)显示：毛竹种下分类群为单系且毛竹分类群与淡竹为姐妹。毛竹分类群之中，黄槽毛竹与毛竹原变种为姐妹关系，两者与花毛竹和青龙竹组成的分支为姐妹关系。秆色变异表型与黄槽毛竹呈“反转”状态的绿槽毛竹和黄槽毛竹以及毛竹原变种之间，并没有组成一支，而是与黄皮毛竹组成姐妹类群。厚壁毛竹与本研究分析的其他6个毛竹种下分类群的为姐妹关系。
图 5 基于叶绿体全基因组序列重建的黄槽毛竹在刚竹属中的系统进化关系
Figure 5. Phylogenetic relationship of Ph. edulis f. luteosulcata based on whole-chloroplast genome sequences
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植物叶绿体基因组已被广泛应用于植物分类、分子进化以及系统发育等相关研究。竹亚科作为禾本科中唯一木质化结构的类群，其种群数量较多、分布较广且有性繁殖周期长，因此在系统分类学上造成分类困难[19]。在分子水平上，黄槽毛竹所属的木本竹进化相对缓慢，较低的分子进化速度可能会使系统发育研究复杂化，因此对于这些较低阶元分类群，叶绿体系统发育基因组学是较好的解决方案[20]。叶绿体作为来源于蓝藻菌的独立细胞器[21]，具有较为保守的特性，叶绿体基因组在包含大量遗传信息的同时相对于核基因组和线粒体基因组序列大小适中，便于测序；其次，核酸取代率相对较慢，进化速率保守，为深层研究植物系统发育和物种鉴定提供基础[22]。
高等植物的叶绿体基因组通常为闭合的环形四分体结构，长度为108~165 kb，约包含80个编码基因[23]。本研究测序结果显示：黄槽毛竹的叶绿体基因组核苷酸序列为139 678 bp，为典型的四分体结构；这与竹子叶绿体基因组的长度接近且结构形式一致[9, 24]。黄槽毛竹叶绿体基因组共注释132个基因，包含85个蛋白质编码基因。这与系统发育分析所显示关系最近的毛竹原变种的编码基因数量差异较小，后者84个[19]。但最近报道的绿槽毛竹叶绿体基因组包含了85个蛋白编码基因[9]。本研究对黄槽毛竹、毛竹原变种和绿槽毛竹的叶绿体蛋白编码基因的结构分析发现：三者之间的rpoC2存在顺式剪切结构的差异；并且三者之间的tRNA和蛋白质编码基因类型也有所差异。虽然毛竹种下分类群的叶绿体基因组的四分体边界保持一致，但是边界的蛋白编码基因rps19的编码长度分为216和282 bp两大类。此外，叶绿体基因组的mVISTA分析也支持毛竹种下分类群之间也存在序列变异的区域，并且核苷酸多样性分析显示高变异区均位于叶绿体基因组SSC区的ndhF和rpl32之间。综合上述序列比较的信息，rpoC2的顺式剪切、rps19编码区长度以及高核酸多样性的ndhF和ndhF-rpl32区间等，可以用于毛竹种下分类群鉴定的潜在DNA片段。这些结果显示毛竹种下分类群的叶绿体基因组序列特征具有多样性。
重复序列广泛分布于叶绿体基因组中，能够通过特异结合蛋白质促使核酸形成复杂结构[7, 21]。本研究黄槽毛竹叶绿体基因组中的SSR分析显示：相对于二、三、四、五和六核苷酸重复相比，单核苷酸重复出现的频次更高，AT/TA以及TC是最常见的二核苷酸重复基序，而GC/CG较少或并不存在。这与VIEIRA等[25]研究的20种热带木本竹结果相同。密码子在叶绿体基因组中也起着关键作用，本研究相对同义密码子使用频率显示：RSCU值＞1的有32个，其中以A/U结尾的密码子有30个，提示密码子偏好使用以A/U结尾的密码子，这与其他竹类叶绿体基因组的分析一致[26]。
叶绿体全基因组能够较好地鉴定种间及以上分类群，但偶见利用于种内群体的鉴定，如朴树Celtis sinensis [27]。本研究利用全基因组序列重建了7个毛竹种下分类群的系统发育关系。结果显示：毛竹种下分类群为单系(100/90，后验概率/最大似然法自展值）。然而，JING等[9]研究显示：毛竹种下分类群与淡竹、筇竹和桂竹形成并系。本研究的系统发育分析显示：这3个物种并不与毛竹分类群形成并系。这可能是由于采样类群不一致甚至序列比对的结果差异所导致。因此，毛竹种下分类群具争议性的系统发育关系仍待更为全面和深入的研究。本研究重建的系统发育关系表明：黄槽毛竹与毛竹原变种亲缘关系最近，暗示两者有共同的起源；与黄槽毛竹表型相反的绿槽毛竹与黄皮毛竹为姐妹关系，表明两者有共同的最近祖先。目前，通过叶绿体全基因组序列重建的进化树在毛竹种下分类群之间的系统发育关系鉴定分辨率较低，仅能有效鉴定厚壁毛竹(厚壁毛竹+6个分类群)和黄皮毛竹(黄皮毛竹+绿槽毛竹)的分支。
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黄槽毛竹的叶绿体基因组是长度为139 678 bp的双环DNA，包含132个基因。这些基因包括85个蛋白质编码基因、8个核糖体RNA(rRNA)以及39个转运RNA(tRNA)。该基因组偏好使用以A/U碱基结尾的密码子，且简单重复序列最多的类型为A/T。在系统发育分析方面，黄槽毛竹与其他毛竹种下分类群共同构成了单系分支，且与毛竹原变种具有最近的亲缘关系。种下分类群的叶绿体基因组比较分析发现毛竹种下分类群之间存在序列差异。
Chloroplast genome of Phyllostachys edulis f. luteosulcata and comparison of chloroplast genome sequence of subspecies of Ph. edulis
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摘要:
目的 对黄槽毛竹Phyllostachys edulis f. luteosulcata叶绿体基因组进行组装、注释和分析，并与其他毛竹Ph. edulis种下分类群比较叶绿体遗传信息差异和系统进化关系。 方法 利用高通量二代测序数据组装了黄槽毛竹的叶绿体基因组序列并进行了基因结构注释，通过生物信息学分析软件进行其组成、密码子偏好性、重复序列等分析。通过序列比对和系统进化分析，比较不同毛竹种下分类群的系统进化关系和基因组序列差异。 结果 黄槽毛竹的叶绿体基因组是长度为139 678 bp，包含132个基因的双环DNA；包含蛋白质编码基因85个、核糖体RNA (rRNA) 8个和转运RNA (tRNA) 39个。该基因组的最优密码子偏好使用以A/U碱基结尾，包含49个重复序列、55个简单重复序列(SSR)位点，其中简单重复序列最多的类型为A/T。利用叶绿体基因组序列构建的系统发育分析显示：黄槽毛竹与其他毛竹种下分类群共同组成单系分支，且与毛竹原变种Ph. edulis var. pubescens亲缘关系最近。基于7个毛竹种下分类群的叶绿体基因组序列和编码基因特征分析显示：毛竹种下分类群之间存在着编码基因数量和结构差异，编码区和非编码区存在较低程度序列变异。 结论 首次对毛竹种下分类群的叶绿体基因组进行比较分析，并揭示了这些种下分类群存在着一定程度的序列差异。这些变异资料可以用于毛竹种下分类群的鉴定比较。图5表2参27 Abstract:Objective This study aims to sequence, assemble, annotate, and analyze the chloroplast genome of Phyllostachys edulis f. luteosulcata. The research also involves comparing its chloroplast genetic information and phylogenetic relationships with those of other subspecies of Ph. edulis (moso bamboo). Method High-throughput sequencing data were used to assemble and annotate the complete chloroplast genome of Ph. edulis f. luteosulcata. Subsequently, we analyze the composition, codon preference, and repetitive sequences of the genome. Furthermore, sequence comparison and phylogenetic analysis were conducted to compare the phylogenetic relationships and genome sequence differences among different subspecies of moso bamboo. Result The chloroplast genome of Ph. edulis f. luteosulcata is a double-loop DNA of 139 678 bp in length containing 132 genes, including 85 protein-coding genes, eight ribosomal RNAs (rRNAs), and 39 transfer RNAs (tRNAs). The codon preference for this genome has an A/U base at the end. There are 49 repetitive sequences with the most common type being A/T and 55 Simple Sequence Repeat (SSR) sites. Phylogenetic analyses constructed using the chloroplast genome sequences showed that Ph. edulis f. luteulosulcata is in a monophyletic branch together with other subspecies of Ph. edulis and is closely related to the original variety of Ph. edulis var. pubescens. The analysis of chloroplast genome sequence and coding gene characteristics showed that there were differences in the number and structure of coding genes and low degree of sequence variation among the subspecies of Ph. edulis. Conclusion This study is the first to comparatively analyze the chloroplast genomes of subspecies of Ph. edulis and reveals a degree of sequence variation in these subspecies of Ph. edulis. This variation information would be available for the identification and comparison of subspecies of Ph. edulis. [Ch, 5 fig. 2 tab. 27 ref.] -
十字花科Brassicaceae植物主产北温带，约375属3 200种。在中国主要集中于西南、西北、东北高山以及丘陵地区[1]，其中萝卜属Raphanus与芸薹属Brassica植物是中国最重要的蔬菜与油料作物，该科部分种类还可作为药用、观赏用、染料用或食用[2]。植物表皮蜡质是覆盖在陆生植物地上部器官表面的脂质成分，也存在于木栓的基质、愈伤组织、花粉粒以及种皮中[3]，其疏水结构在植物表面起极其重要的防卫功能，在植物与周围环境的相互作用中发挥着重要作用[4]。本研究从十字花科植物蜡质类型、结构、成分、含量、功能、遗传特性、合成与转运途径、分子机制等方面进行综述，为十字花科植物的蜡质代谢研究提供参考。
1. 十字花科植物蜡质的类型及其功能
1.1 十字花科植物蜡质的形态和成分
1.1.1 蜡质的形态结构
十字花科植物的蜡质呈片状、柱状和网状等26种形态类型，不同种类植物的蜡质形态不同[5]。徐秀萍等[6]采用扫描电镜(SEM)观察拟南芥Arabidopsis thaliana表皮蜡质，发现主要呈杆状，少量呈片状、管状、碟状和伞状。李红莲[7]发现：红菜薹Brassica campestris表皮蜡质为片状和网状构成的不规则三维结构。李帅等[8]发现：甘蓝型油菜‘中双11’Brassica napus‘Zhongshuang 11’叶表皮蜡质结构主要为杆状和颗粒状(小片状)。牟香丽等[9]发现：不同生长时期甘蓝Brassica oleracea var. capitata表皮蜡质呈现不同结构，苗期大多为颗粒状、片状和针状，结球期则较多为圆柱状和片状，成熟期以片状和针状为主。张曦[10]发现白菜Brassica pekinensis成熟叶片蜡质大多呈现出棒状且前端有圆形突起。
1.1.2 蜡质的化学成分
十字花科植物蜡质主要为超长链脂肪酸及其衍生物，包括烷烃、脂肪酸、醇、醛、酮的同系物，偶尔会出现环状化合物，如甾醇或三萜类化合物等[11]。蜡质通常使用三氯甲烷、正己烷等有机溶剂提取，采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术鉴定成分[12]。植物表皮蜡质各成分占比不同。如白菜[10]成熟叶片蜡质的主要成分中酮类占1.02%，醇类占8.33%，烷烃占55.09%，酯类占26.34%。不同种类植物的表皮蜡质成分含量也存在差异[13]。如甘蓝型油菜‘中双11’叶[8]表皮蜡质成分中烷烃为8.24 μg·cm−2，次级醇为1.72 μg·cm−2，酮为1.62 μg·cm−2，初级醇为0.57 μg·cm−2，脂肪酸为0.10 μg·cm−2，醛为0.79 μg·cm−2，未知成分为9.33 μg·cm−2，总量为22.37 μg·cm−2；拟南芥[14]茎秆的表皮蜡质中初级醇为0.58 μg·cm−2，脂肪酸为0.10 μg·cm−2，醛为1.90 μg·cm−2，烷烃为13.13 μg·cm−2，次级醇为3.83 μg·cm−2，酮为5.95 μg·cm−2，总含量为28.99 μg·cm−2。而普通白菜自交不亲和系13S106[15]叶片的蜡质成分中烷烃为13.60 μg·cm−2，醛为0.90 μg·cm−2，醇为3.20 μg·cm−2，酮为8.30 μg·cm−2，脂肪酸为1.20 μg·cm−2，蜡酯为2.40 μg·cm−2。在上述不同十字花科物种中，蜡质主要成分均为烷烃，次要成分则有所不同。
1.2 十字花科植物蜡质的功能
十字花科植物表皮蜡质在维持水分平衡、反射紫外线、减少外来机械损伤、降低低温伤害、抵御细菌真菌入侵、防止昆虫侵食等抵抗生物与非生物胁迫中起着重要作用[16]，同时兼具影响叶片和果实着色、防止果实开裂和植株育性等生理功能[17]。
1.2.1 抗低温胁迫
低温胁迫易引起植物酶活性降低、细胞膜结构改变、细胞失水、代谢紊乱等，对植物生长发育造成多种负面影响[18]。倪郁等[19]发现：4 ℃低温胁迫下拟南芥生长发育缓慢、叶色变深，蜡质晶体的分布密度、大小、形态等发生改变。唐帅等[20]发现：4 ℃低温胁迫下拟南芥叶片表皮蜡质成分增加，烷烃、脂肪酸、醛、初级醇和酮相对含量分别增加54.34%、29.61%、54.40%、24.07%和137.80%；荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测显示蜡质相关基因的表达水平显著提高，说明拟南芥通过提高蜡质含量来缓解低温胁迫，预防低温对植物内部组织的伤害。
1.2.2 抗紫外线胁迫
紫外线中UV-B波长为280~315 nm，可对植物表面造成损伤。PRUDNIKOVA等[21]发现：过量UV-B处理会造成植株干质量降低，叶面积减小，净光合速率下降及花期变短等。宋超[14]发现：UV-B胁迫下拟南芥蜡质相对含量明显增加，蜡质相关基因CER3、CER4、KCS1表达量显著提高，其中CER4基因的相对表达增加了13.80倍，CER1和WIN1表达量降低。此外，UV-B胁迫下拟南芥蜡质晶体结构发生熔融，晶体由杆状变成片状，蜡质覆盖面积增加，蒸腾作用减少，从而达到反射更多紫外线的效果。
1.2.3 抗干旱胁迫
植物蜡质作为疏水屏障，在限制非气孔水分散失中扮演重要角色[22-23]。柴凌燕[24]发现：拟南芥过量表达蜡质相关转录因子WIN1可提高蜡质合成量，调节表皮渗透性，增强植株耐旱性。LÜ等[25]发现：拟南芥CER9编码一种与植物抗旱性相关的决定因子，该因子缺失可以增加蜡质合成，阻塞更多的气孔，抑制蒸腾作用。周燕等[26]发现：甘蓝型油菜中BnWIN2C01的特异性表达影响了叶片蜡质合成，从而影响植株水分平衡。
1.2.4 抗败育
花粉发育异常会导致植株减产或杂交不育，蜡质是花粉表面含油层的重要成分，在植物生殖发育方面发挥重要作用。KOCH等[27]发现：蜡质不仅影响植物叶片和果实的形态、发育，还影响植株花粉的发育情况。刘艳艳等[28]发现：FAX1基因缺失会抑制拟南芥营养生长，造成植株矮小、茎纤细、花粉稀少、角果短小等，同时还影响花粉壁的发育与花粉的育性，进而影响授粉过程。徐法青[29]发现：拟南芥CER3基因参与花粉脂质的合成或转运，该脂质的缺失会影响花粉与柱头的识别，阻断水合作用，最终导致雄性不育。
1.2.5 抗病虫害
蜡质可以减少叶片表面水分，减少病菌停留和降低病菌入侵。JU等[30]发现：蜡质的晶体结构可促使水分形成水滴以便滑落，并带走叶片表面的灰尘、污染物和病菌等。SURVILA等[31]发现：相较于正常植株，拟南芥蜡质缺失植株表面细菌更多，更易发生病害。蜡质在植物抵抗虫害方面也起着重要作用，它可通过光的反射，改变植物表现出的颜色，影响昆虫视觉，减少昆虫取食和产卵。BOHINC等[32]以8种基因型甘蓝为对象进行田间试验，发现蜡质对甘蓝跳甲Phyllotreta spp.和菜椿Eurydema spp.的生存有抑制作用，且蜡质含量越高，植株上甘蓝跳甲和菜椿越少。
2. 十字花科植物蜡质遗传特性
十字花科植物蜡质缺失表型明显，表面无蜡质覆盖的植株呈现叶色亮绿等性状，包括单基因隐性遗传、单基因显性遗传和双基因隐性遗传等3种遗传特性。
2.1 单基因隐性遗传
ANSTEY等[33]在青花菜Brassica oleracea var. italica中发现了十字花科植物中第1个符合单基因隐性遗传规律的蜡质缺失突变体。刘泽洲等[34]发现：甘蓝蜡粉缺失突变体10Q-961符合单基因隐性遗传规律。李红莲等[7]对无蜡质红菜薹与有蜡质红菜薹杂交建立6世代群体并进行研究，发现蜡质缺失突变体符合隐性遗传规律。王灿洁等[15]发现红菜薹自交系13S106蜡质缺失性状受隐性单基因控制。
2.2 单基因显性遗传
蒲媛媛等[35]发现：甘蓝型油菜光叶突变体GL的蜡质缺失性状受单个显性基因控制。刘东明[36]发现：甘蓝10Q-974亮绿性状符合单基因显性遗传规律，突变基因 BoGL1位于8号染色体177 kb的区间内，与基因Bol018504的表达相关。
2.3 双基因隐性遗传
周熙荣等[37]发现：甘蓝型油菜杂交F2中出现少数蜡质缺失的植株，其无蜡质性状由2对隐性基因控制。莫鉴国等[38]对加拿大引进的无蜡质甘蓝型油菜种质材料‘Nilla’进行研究，发现其蜡质缺失性状也是受2对隐性基因控制。
3. 十字花科植物蜡质合成分子机制
3.1 蜡质合成途径
十字花科植物蜡质合成C16~C18脂肪酸合成、C20~C34超长链脂肪酸合成、超长链脂肪酸衍生物合成等3个途径(图1)。合成相关酶如表1所示。
表 1 拟南芥参与蜡质生物合成的酶Table 1 Enzymes involved in wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana序号 酶 缩略符 基因 参考文献 1 乙酰辅酶A羧化酶 ACC ACC1，ACC2 [39] 2 酰基载体蛋白硫解酶 FAT FATA，FATB [40] 3 长链酰基辅酶A合成酶 LACS LACS1，LACS2，LACS4 [41-44] 4 β-酮酰辅酶A合成酶 KCS FAE1，CER6，KCS1，FDH [45-46] 5 β-酮酰辅酶A还原酶 KCR KCR2 [11] 6 β-羟酰-酰基辅酶A脱水酶 HCD PAS1，PAS2 [47-48] 7 反式烯酰辅酶A还原酶 ECR CER10 [49] 8 脂肪酰辅酶A还原酶 FAR CER4 [50] 9 蜡酯合成酶 WS WSD1 [51] 10 脂肪酰辅酶A还原酶 FAR CER3 [52] 11 醛脱羰酶 AD CER1 [53-54] 12 中链烷烃羟化酶 MAH MAH1 [55] 3.1.1 C16~C18脂肪酸合成
C16~C18脂肪酸在质体中合成，初始反应物乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶的作用下，以每次增加2个碳原子的方式延长碳链，形成C16~C18的酰基载体蛋白[39]，然后在酰基载体蛋白硫酯酶(FAT)作用下水解生成C16~C18脂肪酸[40]。脂肪酸经长链酰基碳烯A合成酶(LACS)催化后以脂肪酰辅酶A的形式进入内质网中[41]，进行下一步反应。ZHAO等[42]发现：拟南芥的9个LACS基因中，LACS1和LACS2参与蜡质的合成。LÜ等[43]和JESSEN等[44]进一步发现：LACS1和LACS4参与花粉外被长链脂肪酸的合成。
3.1.2 C20~C34超长链脂肪酸合成
C20~C34超长链脂肪酸合成场所是内质网。C16~C18脂肪酰辅酶A与丙二酰辅酶A通过脂肪酸延伸酶复合物(FAE)进行合成，每次循环增加2个碳原子，多次循环延伸碳链，最终形成C20~C34超长链脂肪酸，其中丙二酰辅酶A由乙酰辅酶A于细胞质中经过乙酰辅酶A羧化酶催化形成。该反应中的FAE属于多酶复合体，包括β-酮酰辅酶A合成酶(KCS)，β-酮酰辅酶A还原酶(KCR)，反式烯酰辅酶A还原酶(ECR)和β-羟酰-酰基辅酶A脱水酶(HCD)4种酶，其中KCS是该反应的关键酶，对反应底物具有特异性。QUIST等[45]发现：拟南芥KCS基因分为FAE1类和ELO类，前者包含FAE1、CER6、KCS1和FDH等4个亚组，而ELO类基因功能还未见报道。SUH等[46]发现：拟南芥与蜡质相关的基因有KCS1、KCS2、KCS13、KCS10、KCS20和CER6等；拟南芥中的KCR基因有KCR1和KCR2等2种，KCR1没有功能，KCR2参与超长链脂肪酸的合成。ZHAO等[47]发现：相比野生型，cer10突变体器官小，蜡质少；CER10基因在表皮和种子中有ECR功能活性，参与超长链脂肪酸合成。目前对HCD的研究较少，BACH等[48]发现：pas2-1突变体的蜡质含量明显少于野生型，PAS2基因功能完全丧失会最终导致胚死亡，推测PAS2在超长链脂肪酸合成和生物发育中起到非常关键的作用。ROUDIER等[49]发现：内质网中的PAS1和PAS2，KCR和ECR存在蛋白互作，并认为PAS1在多酶复合体中扮演分子构架的角色。
3.1.3 超长链脂肪酸衍生物合成
同位素示踪和气相色谱质谱技术已经验证了超长链脂肪酸通过酰基还原途径和脱羰基途径衍生出其他蜡质成分。酰基还原途径也叫醇合成途径，超长链脂肪酰辅酶A经脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)还原产生初级醇，初级醇与C16~C18脂肪酸辅酶A经蜡酯合成酶(WS)缩合产生蜡酯。拟南芥通过酰基还原途径产生的蜡质相对含量约为20%。 CER4基因编码的酰基辅酶A还原酶在该途径中起到关键作用，主要将拟南芥表皮和根部脂肪酸还原成初级醇。ROWLAND等[50]发现：拟南芥cer4突变体茎中醇与蜡酯含量显著降低。LI等[51]发现：拟南芥wsd1突变体蜡酯含量明显少于野生型。脱羰基途径也叫烷烃合成途径，超长链脂肪酰辅酶A经脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)还原产生的醛经醛脱羰酶脱羰产生烷烃，经中链烷烃羟化酶(MAH)1次羟化产生次级醇，再次羟化生成酮。拟南芥约80%的蜡质组分由该途径产生。BERNARD等[52]发现：拟南芥cer3突变体中醛含量减少，说明CER3基因在产生醛的过程起着重要作用。OSHIMA等[53]和刘秀林[54]发现：拟南芥cer1突变体茎表皮蜡质组分中烷烃含量减少，而醛含量增加，说明CER1编码的酶参与烷烃产生。GREER等[55]发现：MAH1是烷烃羟化酶，拟南芥mah1突变体中次级醇和酮的含量显著减少。
3.2 蜡质转运途径
内质网上经过各种酶加工修饰合成的蜡质成分会先转运到细胞膜，再通过转运蛋白进行跨膜运输，最后经脂质转移蛋白跨细胞壁转运到角质层，转运途径及转运蛋白见图2和表2。
表 2 拟南芥参与蜡质转运的蛋白Table 2 Waxy transport proteins in Arabidopsis thaliana3.2.1 细胞内的蜡质转运
目前对蜡质从内质网转运到质膜有2种推测：①蜡质通过内质网与质膜内侧接触的部分直接进行运输；②蜡质先进入内质网分泌的囊泡，再经高尔基体转运到细胞膜内侧[56]。
3.2.2 蜡质的跨膜运输
蜡质到达质膜后利用相关转运蛋白进行跨膜运输。ABCG11和ABCG12是拟南芥中2个蜡质转运相关的半分子转运蛋白，LUO等[57]发现：ABCG11通过与另1个ABCG11结合形成同源二聚体或是与其他半分子转运蛋白结合形成异源二聚体来转运蜡质分子。BIRD等[58]发现：abcg11突变体生长速度减缓，表皮蜡质含量减少。QUILICHINI等[59]发现：ABCG12基因编码定位在质膜上的ABC转运蛋白，ABCG12基因的缺失导致拟南芥表皮部位的蜡质显著减少，而细胞内蜡质总含量并没有显著变化，说明该基因缺失只影响了质膜中的蜡质转运过程，而细胞内蜡质合成并没有受阻。
3.2.3 蜡质转移到角质层
到达细胞膜外的蜡质由脂质转移蛋白(LTPs)转运到角质层。LTPG1是一种脂质转移蛋白，包含8个保守的半胱氨酸，形成疏水囊泡。DeBONO等[60]发现：ltpg1突变体的茎和角果表皮蜡质C29烷烃含量减少，但其他蜡质成分不存在显著差异，说明突变体缺失的蛋白可能对C29烷烃转移具有专一性。孙伟[61]发现：Th-nsLTP是一个非特异性脂转移蛋白，通过参与小盐芥表皮蜡质转移过程，使表皮蜡质含量减少，晶体结构从杆状转为柱状。
4. 展望
十字花科植物蜡质形成分子机制极其复杂，今后可从以下几个方面深入探究。①当前对蜡质形态结构与成分含量的研究都是独立的，若能寻找不同蜡质成分形成晶体过程中的空间折叠规律，将有助于探明蜡质成分与蜡质结构复杂多样性背后的具体对应关系。②目前在蜡质合成与转运方面研究较多，但在外界环境条件如低温、干旱或光照强度对蜡质合成影响方面的研究较少，需要更多的相关研究阐明环境影响蜡质合成的机制。③培育蜡质过量的新品种对于研究蜡质形成分子机制及抗病育种都具有重要意义。
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图 2 黄槽毛竹叶绿体基因组的重复分析
Figure 2 Repeat analysis of chloroplast genomes of Ph. edulis f. luteosulcata
图 3 黄槽毛竹与其他毛竹变型的叶绿体基因组序列变异比较
Figure 3 Comparison of chloroplast genome sequence variation between Ph. edulis f. luteosulcata and other subspecies in moso bamboo
图 4 黄槽毛竹与其他毛竹变型的顺式剪切基因比较和叶绿体基因组核苷酸多样性(Pi)分析
Figure 4 Comparison of the cis-splicing genes and analysis of nucleotide diversity (Pi) of cp genomes between Ph. edulis f. luteosulcata and other subspecies in moso bamboo
图 5 基于叶绿体全基因组序列重建的黄槽毛竹在刚竹属中的系统进化关系
Figure 5 Phylogenetic relationship of Ph. edulis f. luteosulcata based on whole-chloroplast genome sequences
表 1 黄槽毛竹叶绿体基因组的基因列表
Table 1. Gene of the Ph. edulis f. luteosulcata chloroplast genome
基因类别 基因分组 基因列表 光合作用基因 ATP合酶亚基 atpA、atpB、atpE 、 atpF*、atpH 、atpI 依赖ATP的Clp蛋白酶蛋白水解亚基 clpP 光合系统Ⅱ亚基 psbA、psbB、psbC、psbD、psbE 、psbF、psbH、psbI 、psbJ、psbK 、psbL、psbM 、psbN 、psbT 、psbZ NADH脱氢酶亚基 ndhA*、ndhB*、ndhB*、ndhC 、ndhD 、ndhE 、ndhF 、ndhG、ndhH 、ndhI 、ndhJ 、ndhK 细胞色b/f 复合物亚基 petA、petB*、petD*、petG 、petL 、petN 光合系统Ⅰ亚基 psaA、psaB、psaC 、psaI 、psaJ 光合系统Ⅰ组件 ycf2、 pafI (ycf3)** 、ycf2 光合系统Ⅱ组件 pafⅡ (ycf4) 二磷酸核酮糖羧化酶亚基 rbcL 表达相关基因 核糖体大亚基 rpl14、rpl16*、rpl20、rpl22、rpl23、rpl23 、rpl32 、rpl33 、rpl36、rpl2*、rpl2* 依赖DNA的RNA 聚合酶 rpoA、rpoB 、rpoC1 、rpoC2* 核糖体小亚基 rps2、rps3、rps4、rps7、rps7、rps8、rps11、rps12 、rps12、rps14、rps15、rps15、rps16*、rps18、rps19、rps19 rRNA基因 rrn16S、rrn23S 、rrn4.5S、rrn5S 、rrn5S、rrn4.5S、rrn23S、rrn16S tRNA基因 trnA-UGC*、trnA-UGC*、trnC-GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC、trnH-GUG、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-CAU、trnI-GAU*、trnI-GAU*、trnK-UUU*、trnL-CAA、trnL-CAA、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU、trnM-CAU、trnM-CAU、trnN-GUU、trnN-GUU、trnP-UGG、trnQ-UUG、trnR-ACG、trnR-ACG、trnR-UCU、trnS-CGA*、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC、trnV-GAC、trnV-UAC*、trnW-CCA、trnY-GUA 其他基因 C型细胞色素合成基因 ccsA 胞膜蛋白 cemA 成熟酶 matK 翻译起始因子 infA 说明：加粗代表多拷贝的基因；*表示带1个内含子的基因；**表示带2个内含子的基因。 
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表 2 黄槽毛竹和绿槽毛竹、毛竹原变种的叶绿体基因差异
Table 2. Chloroplast gene differences among Ph. edulis f. luteosulcata, Ph. edulis f. bicolor, and Ph. edulis var. pubescens
项目 黄槽毛竹 毛竹 绿槽毛竹 蛋白编码基因数量 85 84 83 转运RNA数量 − − − 核糖体RNA数量 − − − 蛋白质编码基因差异 rps12 (2)、ycf2 (2) rps12、ycf68(2) rps12、ycf68 转运RNA差异 trnG-GCC、trnS-CGA trnG-UCC、trnG-UCC trnG-GCC、trnG-UCC 说明：(2)代表拷贝数为2；−表示未检测到。
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20240110
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