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核桃Julgans regia是胡桃科Juglandaceae核桃属Juglans核桃组植物[1]。中国种植核桃的历史可追溯到3 000 a前，且核桃分布广泛[2]，品种繁多，产量高。中国为核桃六大主产国之一[3]。有关研究显示，在城区内大面积种植核桃，并搭配其他园林植物，可有效减轻颗粒物污染浓度。核桃具有极高的生态价值[4]。核桃木材外观优美、质地坚硬、材性优良，可做家具、木地板等；核桃青皮中的萘醌类物质可作染料，黄酮类物质可作抗氧化药品[5]。核桃果实富含蛋白质、磷脂以及维生素B1等能增强细胞活力、提高脑神经功能的物质，具有极高的药用价值，被称为“21世纪的超级食品”[6−7]。
恶劣的生长环境会导致核桃停止发育甚至死亡，如重度干旱环境等[8]。中国干旱、半干旱区面积约占国土面积的1/3以上，干旱地区降水稀少，水资源匮乏，无法满足核桃生长需求[9−10]。目前研究发现，抗旱关键酶基因包括α糖类、脯氨酸合成酶、甜菜碱，抗旱相关联蛋白包括LEA (late embryogenesis abundant)家族蛋白、蛋白激酶SnRK2等，其中LEA 第二家族成员脱水素蛋白(dehydrin, DHN)最早于受水分胁迫的水稻Oryza sativa中被发现，后来被证实广泛存在于植物细胞中[11]。许多研究都表明：非生物逆境胁迫下，植物中DHN基因的表达和积累与植物适应逆境的能力相关。如刘慧春等[12]将牡丹Paeonia suffruticosa PsDHN1基因转入拟南芥Arabidopsis thaliana中，发现转基因拟南芥耐涝抗旱水平明显优于野生型。史学英等[13]将从小麦Triticum aestivum中获得的DHN14基因转入大肠埃希菌Escherichia coli，发现可以提高在低温、干旱、金属离子等非生物胁迫下大肠埃希菌的存活率。LIU等[14]将玉米Zea mays中提取的ZmDHN13转入烟草Nicotiana tabacum，发现可显著提升转基因烟草对氧化损伤的耐受性。DHN可以结合金属离子，从根本上减少活性氧(ROS)的产生；DHN还可以结合DNA，保护其不受外界环境压力带来的损害；DHN非特异性地与生物膜结合，从而维持生物膜结构的稳定性等[15]。
在全球干旱的大背景下，水资源短缺仍会是未来中国甚至全球面临的主要问题，因此，研究植物的抗旱机制及挖掘抗旱基因都具有重要意义[16]。本研究分析了核桃脱水素JrDHN基因对干旱逆境胁迫的响应机制，为该基因进一步应用于核桃抗旱分子标记辅助育种提供参考依据，为利用基因工程手段培育抗旱核桃新品种提供理论依据。
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野生型核桃(WT)来自浙江农业大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室的奇异核桃J. hindsii×J. regia苗。前期已获得奇异核桃JrDHN过表达体胚，并萌发获得JrDHN过表达株系幼苗，后经扩繁并分为JrDHN1、JrDHN2、JrDHN3等3个株系，获得每株系50株生长健壮，长势一致的组培苗后，进行后续阳性鉴定及干旱胁迫试验(图1)。核桃苗于培养室中培养，培养室温度为(25±2) ℃，湿度为80%~85%，光照强度为15 000~20 001 lx，光照周期黑暗8 h/光照16 h。
图 1 核桃JrDHN过表达株系培养图
Figure 1. Culture diagram of JrDHN overexpressed in walnut
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选用北京天根生化科技有限公司的多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒提取核桃体胚的 RNA，基因克隆及后续的验证过程采用 TaKaRa 公司的 cDNA 反转录试剂盒。以反转录cDNA为模板进行荧光定量PCR (qPCR)表达分析，采用NCBI网站在线设计引物，引物见表1。qPCR反应体系为：TB Green 0.5 μL，F/R primer 0.2 μL，cDNA 0.4 μL，ddH2O 4.2 μL。反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。
表 1 qPCR引物
Table 1. qPCR primers
引物 序列(5′→3′) Actin-F ATGATGTCAAGGTTAAGGACTC Actin-R CACAATGATCTCAGCTCCG QJrDHN-F ATTCAGCTCACCGACGAACA QJrDHN-R CTCCTCATGCTGCTGCTTCT -
在体式荧光显微镜下观察再生JrDHN过表达植株茎和茎横切中绿色荧光标记蛋白(GFP)荧光激发情况，散发绿色荧光的植株为阳性植株。
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配置质量分数为5%PEG
8000 的DKW固体培养基，模拟干旱胁迫处理，分别设置模拟干旱胁迫时间分别为7、14、21、28 d的处理组，以培养于DKW正常培养基(001)中的核桃体苗为对照组，每组设置3个生物学重复。 -
在模拟干旱环境中处理0和14 d后，分别剪取同一部位WT和JrDHN过表达植株的叶片，在叶片下表面涂抹1层指甲油，风干后撕下盖上盖玻片在生物显微镜下观察并拍照。取0 d叶片加石英砂研磨，在显微镜下观察并记录叶绿体形态。
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分别剪取干旱胁迫处理7、14、21、28 d的JrDHN过表达株系和WT叶片，于大试管中加入20 mL配置好的DAB (1.0 g·L−1)、NBT (0.5 g·L−1)染液。室温下避光染色1~3 h，加入30 mL 体积分数为95%的乙醇，将大试管置于100 ℃沸水中水浴加热15 min，将叶绿素完全洗脱干净，之后固定拍照。
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分别取WT及JrDHN1干旱胁迫7、14、21、28 d的叶片0.1 g，加入10 mL 体积分数为 95%的乙醇溶液。黑暗条件下浸提48 h。以体积分数为95%乙醇为空白对照，测定波长663和646 nm处的吸光度，按叶绿素总质量分数=[20.2D(645)+8.2D(663)]×[V/(1 000W)]公式计算，其中V表示叶绿素提取液总体积，W表示所用叶片鲜质量。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及超氧阴离子自由基(O2·−)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)均使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行测定。具体方法见使用说明书。
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Ca2+与 CaM形成的复合物可以与线粒体膜上的 NADKc结合，驱动RBOH蛋白产生细胞外ROS[17]，从而促进胞外ROS向胞内转移[18]。通过这种方式，可以改变细胞质中信号成分的氧化还原状态，从而调节多种蛋白质和转录因子[19]，后续可以调节一系列抗旱相关基因的表达，如ADH、SOD、POD基因等[20]。因此，对WT及JrDHN1在干旱胁迫28 d下核桃基因组中的ABA信号转导通路途径中的关键节点基因MYB、ADH、CAM表达量进行qPCR检测。测定方法同上。
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从图2A可以看出：在白光视野下，WT和JrDHN1、2、3过表达株系的形态相似；在蓝色激发光(488 nm)下，WT的茎及横切面无荧光激发，JrDHN1、2、3过表达株系在蓝色激发光下呈现绿色荧光。以上表明JrDHN1、2、3过表达株系体内均表达了GFP荧光蛋白，为阳性植株。
图 2 核桃JrDHN基因过表达株系阳性鉴定
Figure 2. Positive identification of walnut JrDHN gene overexpression strain
实时荧光定量PCR结果(图2B)显示：核桃JrDHN过表达再生株系JrDHN基因相对表达量均显著高于野生型(P＜0.05)，JrDHN1株系的相对表达量为野生型的2.55倍，JrDHN2株系的相对表达量为野生型的1.72倍，JrDHN3株系的相对表达量为野生型的1.49倍，差异均显著。JrDHN1、2、3之间基因表达量差异不显著，但JrDHN1株系过表达量最高。
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由图3可见：WT和3个JrDHN过表达株系在001培养条件下均能正常生长，28 d时其表型无明显差异。在PEG处理下，随着胁迫时间延长，WT和过表达株系叶片逐渐黄化脱落。干旱胁迫处理14 d时，WT叶片大部分已经脱落，而JrDHN过表达株系叶片脱落较少，初步说明JrDHN过表达株系的抗旱能力强于WT。
图 3 植株试管幼苗表型分析
Figure 3. Phenotype of test-tube plant let under drought stress
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如图4所示：在0 d时，WT及JrDHN1、2、3的气孔开度(宽长比)分别为0.57、0.46、0.45、0.51。3种JrDHN过表达株系的气孔开度与WT差异不显著。而在PEG胁迫14 d时，WT和JrDHN 过表达株系气孔开度均缩小，其中WT气孔开度为0.46，JrDHN1、2、3气孔开度分别为0.15、0.23、0.26，JrDHN过表达株系的气孔开度显著低于WT (P＜0.05)，其中，JrDHN1的气孔开度显著低于JrDHN3 (P＜0.05)。说明过表达JrDHN基因可降低植株在干旱胁迫下的气孔开度，从而提高核桃对干旱的耐受能力。
图 4 干旱胁迫下气孔表型及开度分析
Figure 4. Analysis of stomatal phenotype and stomatal opening under drought stress
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在显微镜下观察发现：3个核桃 JrDHN 过表达株系叶肉细胞中的叶绿体更致密(图5A)。JrDHN过表达株系中叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率显著高于WT (P＜0.05)，WT叶绿体表面积与单层细胞表面积的平均比率为0.65，3个JrDHN过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率分别为0.77、0.76、0.78，与WT相比分别增加了18.5%、17%、20%(图5B)。进一步分析发现，在胁迫0 d时， WT及JrDHN过表达株系的叶绿素质量分数无显著差异(图5C)。随着干旱胁迫时间的延长，WT及JrDHN1中的叶绿素质量分数均出现下降趋势。但在处理7 d后，WT中的叶绿素质量分数迅速下降到0.39 mg·g−1，而此时JrDHN1中的叶绿素质量分数为0.61 mg·g−1，显著高于WT。在此后的14~28 d，WT叶绿素质量分数下降渐缓，分别为0.33、0.25、0.15 mg·g−1，JrDHN1中的绿叶素质量分数分别为0.35、0.31、0.25 mg·g−1，JrDHN1在整个干旱胁迫处理中叶绿素的质量分数均高于WT。综上所述，JrDHN 基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 5 干旱处理后核桃苗叶绿体叶及绿素质量分数的变化
Figure 5. Changes of chlorophyll shape and content of walnut after drought treatment
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由图6A~C显示：在干旱胁迫条件下，3种抗氧化酶活性伴随着胁迫时间延长均呈现先上升后下降的趋势。0 d时，WT 和JrDHN1 的SOD、POD、CAT活性无显著性差异；在14 d时酶活性达到最大值，其中 JrDHN1与WT的SOD及POD活性差异极显著(P＜0.01)，CAT活性差异显著(P＜0.05)；JrDHN1的抗氧化酶活性在干旱胁迫7~28 d均显著高于WT (P＜0.05)。由图6D显示：随着 干旱 胁迫处理时间的增加，各株系的MDA 质量摩尔浓度逐渐上升。0 d时，WT 和 JrDHN1 植株内的MDA质量摩尔浓度没有显著差异；在14和28 d时 JrDHN1的 MDA质量摩尔浓度极显著低于WT (P＜0.01)；7和21 d时， JrDHN1 MDA质量摩尔浓度均显著低于WT。综上表明，过表达JrDHN 基因可使植株的抗氧化酶活性显著升高，减少植物体内脯氨酸的积累，从而提高核桃的抗干旱胁迫能力。
图 6 干旱处理后核桃JrDHN1抗氧化酶活性及丙二醛质量摩尔浓度变化
Figure 6. Changes of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content in walnut JrDHN1 after drought treatment
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由图7A和图7B可见：0 d时，核桃 WT及JrDHN1的 NBT染色后叶片颜色均为浅黄色，无差异；随着干旱胁迫时间的增加，DAB染色表型为叶片的黄色逐渐加深，在28 d时 WT 叶片完全为棕褐色，而 JrDHN1染色比 WT 浅；NBT染色表型为叶片的蓝色逐渐加深，WT 叶片的颜色加深程度比JrDHN1 突变体株系叶片的颜色深，且至28 d被完全染为深蓝色，JrDHN1仍有部分区域为浅蓝色或无色。通过量化的方式对颜色的灰度值进行测定，灰度值越大代表颜色越深，发现干旱处理7~28 d，JrDHN1灰度值均显著低于WT，与肉眼观察的结果相符(图7C和图7D)。进一步分析发现：随着干旱胁迫时间的增加，WT及JrDHN1中的H2O2 和O2·−质量摩尔浓度也逐渐增多，在第28 天达到最大值。0 d时，WT和JrDHN1中的 H2O2 和O2·−质量摩尔浓度无显著差异；28 d时，WT中的 H2O2 和O2·−质量摩尔浓度均显著低于WT (P＜0.05)；在7 和28 d时，JrDHN1中的H2O2质量摩尔浓度与WT差异极显著(P＜0.01)，在14和21 d时H2O2质量摩尔浓度则显著低于WT (P＜0.05)，而7 ~28 d时，JrDHN1与WT的O2·−质量摩尔浓度均差异极显著(P＜0.01)(图7E和图7F)。综上所述，过表达JrDHN 基因显著降低核桃植株中的H2O2和O2·−的积累，从而提高其抗旱能力。
图 7 干旱处理后核桃JrDHN1 ROS变化
Figure 7. ROS content changes of walnut JrDHN1 after drought treatment
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荧光定量qPCR 检测结果(图8)显示：各株系MYB、ADH、CAM的表达量均呈先上升后下降的趋势，且各基因的表达量均在14 d时明显增高，这与抗旱表型出现的时间一致。14 d时，MYB的表达量最高，为WT的18.8倍，ADH和CAM基因分别为WT的15.0和13.2倍。综合分析表明，过表达JrDHN基因可以提高MYB、ADH，CAM基因的表达量，提升脱落酸(ABA)信号转导通路对干旱胁迫的响应，从而增强植株抗旱性。
图 8 干旱处理后JrDHN1相关抗逆基因表达量分析
Figure 8. Analysis of JrDHN1-related stress resistance gene expression after drought treatment
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脱水素(dehydrins, DHNs)为晚期胚胎丰富(late embryogenesis abundant, LEA)蛋白的一个分支，广泛存在于高等植物体内，并当植物处于干旱等胁迫环境时可以在细胞中迅速积累，引起植物的一系列变化，抵御外界胁迫环境[21]。研究发现：脱水素可以通过提高叶绿素水平来提高干旱胁迫下的光合作用，从而保护植物细胞[22]。本研究结果显示：干旱胁迫0 d时，JrDHN过表达株系和WT叶绿素质量分数差异不显著；随着胁迫时间的增加，过表达株系叶绿素质量分数始终显著高于WT，说明过表达JrDHN基因可以提高干旱胁迫过程中核桃叶片中的叶绿素水平，从而提高光合作用，增强植株抗旱性。将从早花白子莲Agapanthus praecox中提取到的脱水素基因ApY2SK2 和ApSK3转入拟南芥，转基因拟南芥相比野生型在干旱胁迫下的光合能力显著提升[23]，与本研究的结果相似。在铁皮石斛Dendrobium officinale中的研究也发现：高DHN表达量可以增加干旱胁迫条件下光合作用相关基因的表达量，从而提高植株光合作用水平来抵御干旱[24]。
抗氧化酶系统是植物遭受环境胁迫时重要的防御体系。当植物遭受干旱胁迫时，ROS的积累会触发该防御系统，从而保护植物减少胁迫环境带来的危害[25]。用体积分数为15%的PEG 6000溶液模拟干旱胁迫处理4个不同的葡萄Vitis vinifera品种，结果表明，随着干旱时间的增加，4个不同葡萄品种的叶绿素水平均逐渐降低，MDA含量上升，4个品种的SOD、POD、CAT以不同的变化幅度呈现先增长后降低的变化趋势[26]。用体积分数5%的PEGDKW培养基模拟干旱胁迫环境，随着干旱时间的延长，与WT相比，沉默JrGA20ox1基因表达能使核桃株系的抗氧化酶SOD、POD、CAT活性呈先升高后降低的趋势，同时减少MDA和ROS的积累，从而提高植株抗旱能力[27]。本研究通过对JrDHN过表达株系生理指标测定及化学组织染色得出：随着干旱时间的延长，WT及JrDHN过表达株系的抗氧化酶活性呈先升高后降低的趋势，这与前文的研究结果类似；JrDHN过表达植株的抗氧化酶活性始终显著高于WT，ROS及MDA水平始终显著低于WT。这表明过表达JrDHN可以提高核桃体内的抗氧化酶活性，减少ROS及MDA的积累，从而提高植株的抗旱能力。之前的研究也显示了类似的结果，以体积分数10% PEG处理烟草时，脱水素可以降低ROS在植物细胞中的积累，减少MDA的产生，同时增强抗氧化酶活性，从而提升植株对干旱胁迫的耐受性[28]。CHIAPPETTA等[29]研究发现：将野生油橄榄Olea europaea中提取到的OesDHN基因转入烟草后提高了烟草对干旱胁迫的耐受性。干旱胁迫下，小麦中TabHLH49转录因子可提高WYZ2DHN基因的表达量，从而提高小麦的耐受性[30]。在拟南芥中过表达CdDHN 4-L和CdDHN4-S 均可以导致两者清除活性氧的能力升高，从而更好地抵御干旱胁迫[31]。在甘蓝型油菜Brassica napus中的研究发现BnaMYB11、BnaMYB26、BnaMYB30和BnaMYB4基因在干旱处理后显著上调，通过木质素合成，从而响应干旱胁迫[32]。褪黑素能通过调节抗氧化剂和氧化还原相关成分ADH的mRNA水平，从而调节渗透保护，增强植株耐旱性[33]。EcCaM基因的过表达使拟南芥能够耐受PEG诱导的干旱和盐胁迫[34]。本研究结果也表明：过表达JrDHN基因可以提高MYB、ADH、CAM基因的表达量，从而增强植株抗旱性。
核桃作为营养价值较高的经济作物，其种质资源的优化及品种的选育备受关注。在全球干旱的大背景下，培育抗旱耐旱的核桃品种具有重要意义，因此，通过探究JrDHN 过表达核桃植株对干旱的响应机制，可为选育抗旱核桃品种提供理论价值和实践意义。
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本研究发现：过表达JrDHN转基因核桃苗在PEG模拟干旱胁迫下的表型、光合能力和抗氧化能力均强于WT，过表达JrDHN基因在模拟干旱胁迫下可以有效提升抗氧化酶系统活力，清除活性氧，减少细胞受到的损伤，从而提高植株的抗旱性。综上所述，过表达JrDHN基因核桃的抗旱性要强于非转基因核桃。
Response of dehydrin JrDHN gene in walnut to drought stress
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摘要:
目的 探究奇异核桃Juglans hindsii × J. regia JrDHN过表达株系在干旱过程中体内的生理与分子响应及其分子机制，为培育核桃J. regia抗旱品种提供理论依据。 方法 对生长健壮的过表达JrDHN核桃苗（JrDHN1、2、3）进行不同时间的聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫处理，野生型奇异核桃苗(WT)为对照。从核桃苗的表型、抗氧化酶活性、活性氧含量等多方面观察过表达JrDHN株系对干旱胁迫的响应。通过荧光定量PCR (qPCR)对体内的抗旱相关基因MYB、ADH、CAM做了表达量分析。 结果 阳性植株经qPCR验证，证实JrDHN基因在核桃苗中过表达，在JrDHN1、2、3中的表达量分别为WT的2.55、1.72、1.49倍；干旱处理0~28 d下过表达株系的表型均优于WT，干旱处理14 d时，JrDHN过表达株系的气孔开度比均显著低于WT；抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均呈先升高后降低的趋势，且在14 d时达到最大值，其中JrDHN1的过氧化酶活性均高于WT，SOD及POD差异极显著(P＜0.01)，CAT活性差异显著(P＜0.05)；干旱处理28 d时叶绿素质量分数达到最小值，此时JrDHN过表达株系叶绿素极显著高于WT (P＜0.01)；丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子自由基(O2·−)含量随着干旱时间的延长呈逐渐上升趋势，在28 d时达到最大值，JrDHN1 的MDA、H2O2和O2·−含量均极显著低于WT；抗旱相关基因MYB、ADH、CAM的表达量均呈先上升后下降的趋势，14 d时，MYB、ADH、CA基因表达量均显著高于WT (P＜0.05)。 结论 JrDHN过表达转基因核桃苗在PEG模拟干旱胁迫下的表型、光合能力和抗氧化能力均强于WT，JrDHN在模拟干旱胁迫下可以有效提升抗氧化酶系统活力，清除活性氧，减少细胞受到的损伤，从而提高植株的抗旱性。图8表1参34 Abstract:Objective This purpose was to investigate the physiological and molecular responses, as well as the molecular mechanisms, of Juglans hindsii×J. regia overexpressing line JrDHN during drought stress, to provide theoretical basis for breeding drought-resistant J. regia (walnut) cultivars. Method Healthy overexpressing walnut JrDHN were subjected to drought stress at different time points. The response of the overexpressing JrDHN line to drought stress was observed from various aspects including phenotype, antioxidant enzyme activity, and reactive oxygen species content. Quantitative PCR was conducted to analyze the expression levels of drought-related genes MYB, ADH, and CAM in plant tissues, exploring the molecular mechanism by which overexpression of JrDHN gene affects plant drought resistance. Result The results confirmed the overexpression of JrDHN gene in walnut seedlings, with expression levels in JrDHN1, 2, 3 being 2.55, 1.72, and 1.49 times higher than the WT respectively. Phenotypic traits of the overexpressing JrDHN line were superior to WT after 1−4 weeks of drought treatment, with significantly lower stomatal aperture in the overexpressing JrDHN line compared to WT after 2 weeks of drought treatment. The activities of antioxidant enzymes (SOD, POD, CAT) showed an initial increase followed by a decrease trend, reaching maximum values at 2 weeks, with SOD and POD activities in JrDHN1 significantly higher than WT (P＜0.01), and CAT activity showing significant difference (P＜0.05). Chlorophyll content reached its minimum after 4 weeks of drought treatment, with significantly higher levels in the overexpressing JrDHN line compared to WT. Levels of MDA, H2O2, and O2·− increased gradually with prolonged drought stress, reaching maximum values at 4 weeks, with significantly lower levels in JrDHN1 compared to WT. Expression levels of drought-related genes MYB, ADH, CAM showed an initial increase followed by a decrease trend, with significantly higher levels in the overexpressing JrDHN line compared to WT after 2 weeks. Conclusion The overexpressing JrDHN transgenic walnut seedlings exhibited superior phenotype, photosynthetic capacity, and antioxidant capacity under PEG-simulated drought stress compared to WT. Overexpression of JrDHN gene in walnut seedlings effectively enhanced the activity of antioxidant enzyme system, scavenged reactive oxygen species, reduced cell damage, thereby improving plant drought resistance. [Ch, 8 fig. 1 tab. 34 ref.] -
Key words:
- walnut /
- drought /
- JrDHN /
- overexpression /
- functional analysis
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无距虾脊兰Calanthe tsoongiana为兰科Orchidaceae虾脊兰属Calanthe地生草本，花朵娇艳，造型独特，受到人们的喜爱。近些年来，由于人为破坏，以及自身繁殖困难，导致野生无距虾脊兰种群数量锐减，现已被列为极度濒危等级[1]。
植物和真菌之间的互惠共生是自然界中普遍存在的现象[2]。兰科菌根真菌是一类与兰科植物形成共生关系并生成菌丝团的真菌，隶属于根系内生真菌，对兰科植物生长起促进作用[3]。研究表明：兰科植物的整个生命活动都需要菌根真菌的参与，菌根真菌不仅可以帮助兰花种子萌发[4−5]，也在其生长发育过程中扮演着重要的角色。它可以吸收土壤中的矿质元素、有机物等，在侵染兰科植物后被宿主细胞分解并向其传输营养物质[6−7]，若缺乏菌根真菌，兰科植物将无法长期存活。除了菌根真菌，兰科植物中非菌根真菌的数量也十分庞大，远远超过了菌根真菌。镰孢属Fusarium、木霉属Trichoderma和青霉属Penicillinum是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长[8−10]。由此可见，非菌根真菌的作用也不容忽视。兰科菌根真菌不仅广泛存在于根系内，也存在于植株周围土壤中，且距离植株越远，其相对丰度越低[11−12]，但也有研究表明：菌根真菌少量或者不存在于土壤中[13−14]。蒋玉玲等[15]研究表明：通过对周围土壤中真菌类群的分析，可推断兰科植物能否长期在此生存。因此，研究根际土壤真菌类群对兰科植物保育十分重要。
目前，虾脊兰属植物的研究集中在分类鉴别、育种和繁殖等方面，具体有资源调查、遗传多样性研究、化学与药用价值研究、快速繁育以及引种驯化等等[16−17]。国内外对虾脊兰属根系内生真菌多样性研究较少，尚处于初步阶段，未得到系统且全面的数据，尤其是无距虾脊兰还未见相关报道。鉴于此，本研究以浙江省天目山野生无距虾脊兰为材料，通过分析无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌多样性，明确其优势真菌和共有真菌类群，以期为无距虾脊兰资源有效保护提供科学参考。
1. 材料与方法
1.1 研究地点与样品采集
所用材料采自浙江天目山国家级自然保护区内无距虾脊兰野生居群(海拔550 m，30°21′47″N，119°25′30″E)。该研究区属亚热带季风气候，雨水充沛，年降水量达1 870 mm，相对湿度较大，自然条件优越。
无距虾脊兰生长在海拔450~1 450 m的阔叶混交林下，生长周期可分为萌芽期、花期、果期和衰亡期[18]。选择未遭到破坏、分布集中且长势一致的植株，分别于2、5、7和11月进行根段采集。每次选取9株植株，每株取3~4个长约4~5 cm的根段，用根围土包裹装入采样袋，做好标记并放入4 ℃冰箱保存。
1.2 研究方法
1.2.1 样品处理
取出根系并用流水冲洗干净，无菌水冲泡，用体积分数为70%的乙醇洗涤2 min，质量分数为2.5%的次氯酸钠浸泡5 min，体积分数为70%的乙醇洗涤30 s，再经无菌水冲洗2~3次，用无菌滤纸吸去多余水分后转入液氮中紧急速冻。初步处理完成，置于−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.2 根际土提取
在超净台上抖掉根围土，保留附着在根系1 mm左右的根际土。用无菌镊子将根系转移至装有磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中，全温摇床下震荡20 min，挑出根系，将剩余悬浮液6 000 r·min−1高速离心20 min，弃上清液得到根际土。做好标签记录，将离心管放入液氮，待其彻底急速冷冻后，放入−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.3 DNA提取及PCR扩增
使用DNA提取试剂盒提取无距虾脊兰根系与根际土壤DNA，提取后利用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，引物合成和测序由上海美吉生物医药科技有限公司进行。
PCR 仪采用ABI Gene Amp® 9700型，每个样本3个重复，20.0 μL PCR反应体系为10.0 μL 2× ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye 1，2.0 μL DNA模板，ddH2O补至20.0 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。同一样本的PCR产物混合后用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物使用Illumina MiSeq平台进行测序。
1.2.4 序列分析与处理
首先根据overlap关系利用FLASH (v1.2.11)软件对Illumina测序得到的原始数据进行拼接，并通过FASTP (v.0.19.6)软件对序列质量进行质控、过滤和优化。区分样本后，在97%相似度水平下使用UPARSE (v11.0)软件对优化序列进行分类操作单元(OTU)聚类分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于97%相似水平下采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列与UNITE (v.8.0)数据库进行分类学比对。
基于OTU聚类分析结果，通过Mothur (v1.30.2)软件进行多样性指数分析，从而得到所有样本群落中物种的丰富度、覆盖度和多样性等信息。根据分类学分析结果，通过Qiime (v1.9.1)软件生成各分类学水平丰度表，进行Beta多样性距离计算，找出各样本在某一分类学水平上的优势物种、样本中各优势物种的相对丰度以及不同样本中物种的组成相似性，并利用R语言(version 3.3.1)工具统计和作图，将差异和距离通过二维坐标图呈现出来，从总体上反映各组样本之间的差异和组内样本之间的变异度大小。基于Kruskal-Wallis秩和检验(Kruskal-Wallis H test)，通过R (version 3.3.1)的stats包和python的scipy包运用DP的方法计算影响大小(effect size)，从而找出多组样本的物种进行差异显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 无距虾脊兰根系内生真菌多样性分析
无距虾脊兰萌芽期根系测序共获得31 987条优化序列。由图1可知：在门水平上担子菌门Basidiomycota和被孢霉门Mortierellomycota占比较大，属于萌芽期根系内生真菌优势门；在属水平上，被孢霉属Mortierella和红菇属Russula真菌序列占比相差不大，共同作为该时期优势内生真菌。花期根系测序共获得51 913条优化序列。其中，担子菌门为最大优势菌门；在属水平上，粗糙孔菌属Trechispora为该时期优势内生真菌。相较于萌芽期，花期真菌类群中担子菌门和子囊菌门Ascomycota相对丰度分别为萌芽期的1.33和1.97倍，被孢霉门、被孢霉属和红菇属的相对丰度呈现下降趋势，分别减少了67.82%、67.39%和75.70%。
图 1 不同时期无距虾脊兰根系内生真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 1 Community composition of root endophytic fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level果期根系测序共获得43 793条优化序列。其中担子菌门真菌在数量上占绝对优势；在属水平上，蜡壳耳属Sebacina为该时期优势内生真菌。相较于花期，担子菌门、子囊菌门、被孢霉门和红菇属相对丰度变化不大，但Saitozyma、锁瑚菌属Clavulina相对丰度有所增加，由原来占比不足3.00%增长到13.09%和10.29%，蜡壳耳属增加了67.30%。衰亡期根系测序共获得30 000条优化序列。该时期，子囊菌门属于优势菌门，镰孢属为优势内生真菌，相较于其他3个时期，衰亡期根系内生真菌多样性整体出现骤降现象。
2.2 无距虾脊兰根际土壤真菌多样性分析
在萌芽期，无距虾脊兰根际土壤测序共获得31 673条优化序列。由图2可知：萌芽期根际土壤与根系在门水平上真菌类群一致，但相对丰度稍有变化；在属水平上，红菇属相对丰度明显下降，占比仅为3.55%，其余真菌相对丰度较小，被孢霉属为该时期根际土壤优势真菌。
图 2 不同时期无距虾脊兰根际土壤真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 2 Community composition of rhizosphere soil fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level在花期，根际土壤测序共获得41 062条优化序列。与同时期根系内生真菌相比，担子菌门相对丰度减少，子囊菌门相对丰度增加。在属水平上，根际土壤和根系真菌类群相对丰度明显不同，其中青霉属Penicillium为该时期根际土壤优势真菌。相较于萌芽期根际土壤真菌，花期子囊菌门和罗兹菌门Rozellomycota相对丰度分别为萌芽期的1.34和4.74倍，担子菌门、被孢霉门真菌相对丰度分别减少了31.93%和67.82%。
在果期，根际土壤测序共获得47 863条优化序列。与根系内生真菌相比，门水平上子囊菌门和担子菌门变化最大，在属水平上，Paraboeremia仅存在于根际土壤真菌中，且占比较大，为该时期根际土壤优势真菌。相较于花期根际土壤真菌，果期子囊菌门、被孢霉门、Paraboeremia和Saitozyma相对丰度分别为花期的1.34、1.61、4.03和1.07倍，担子菌门和罗兹菌门相对丰度分别降低到花期的89.45%和42.21%。
在衰亡期，根际土壤测序共获得28 997条优化序列。在门水平上，担子菌门为根系内生真菌的5.61倍，根系内生真菌无被孢霉门，而在根际土壤中其真菌序列占7.29%。在属水平上，各真菌相对丰度差别较大，其中Paraboeremia为该时期根际土壤优势真菌。相较于果期根际土壤真菌，蜡壳耳属仅存在于衰亡期根际土壤中，担子菌门和被孢霉属真菌相对丰度分别为果期的1.53和1.31倍，Saitozyma相对丰度降低到果期的32.32%。
2.3 不同时期真菌群落差异性分析
通过对无距虾脊兰根际土壤与根系测序分析，发现不同生长发育时期物种注释结果存在较大差别，具体差异见表1。其中萌芽期根际土壤和根系优势真菌分别为被孢霉属和红菇属，花期优势真菌分别为青霉属和粗糙孔菌属，果期优势真菌分别为Paraboeremia和蜡壳耳属，衰亡期优势真菌分别为Paraboeremia和镰孢属，不同生长发育时期优势真菌不同。
表 1 物种注释结果统计Table 1 Species annotation results statistics生长
时期优化序
列/条门/个 纲/个 目/个 科/个 属/个 萌芽期 63 660 11 41 91 193 359 花期 92 975 13 46 101 217 367 果期 91 656 12 48 108 224 377 衰亡期 58 997 8 33 75 162 264 在门水平上，子囊菌门真菌在萌芽期、花期和果期的根际土壤与根系中存在显著差异；而被孢霉门真菌则在萌芽期与衰亡期的根际土壤和根系中存在显著差异(图3A，P＜0.05)。在属水平上，被孢霉属、红菇属、罗兹菌门未分类属以及青霉属在萌芽期的根际土壤与根系真菌上差异较为明显。由图4可知：有虫草菌属Cordyceps等321个属为4个时期共有真菌；裸盖菇属Psilocybe等29个属为萌芽期和花期共有真菌，复膜孢酵母属Saccharomycopsis等43个属为花期和果期共有真菌，Melanopsamma等36个属为果期和衰亡期共有真菌，Stenella等23个属为衰亡期和萌芽期共有真菌。
图 3 根际土壤真菌与根系内生真菌在门(A)、属(B)水平下差异显著的类群Figure 3 The endophytic fungi in rhizosphere soil and root were different at phylum (A) and genus (B) level
图 4 属水平不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌分布韦恩图Figure 4 Venn diagram of endophytic fungi distribution in rhizosphere soil and root at genus level at different periods从表2可见：果期根系内生真菌的ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Sobs指数最高，其次是花期，然后是萌芽期，衰亡期Alpha指数最低。意味着果期根系内生真菌多样性和丰富度最高，衰亡期根系内生真菌多样性和丰富度最低。在无距虾脊兰根际土壤真菌中，花期Alpha多样性指数高于其他3个时期，果期ACE指数、Chao指数和Sobs指数高于萌芽期和衰亡期，萌芽期和衰亡期Alpha多样性指数相对一致。综合来讲，花期的根际土壤真菌多样性和丰富度最高，果期次之。
表 2 Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity indexes样本 Alpha多样性指数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Sobs指数 Coverage指数 MG 1 983±26 c 1 379±81 ab 3.734±0.522 b 680±104 cd 0.964±0.004 a HG 4 078±3 043 bc 2 337±50 ab 3.724±1.606 b 987±423 bcd 0.968±0.009 a GG 8 681±439 ab 4 499±351 ab 4.221±0.501 b 1 342±161 abc 0.926±0.006 b SG 817±292 c 630±308 b 3.298±0.788 b 210±31 d 0.990±0.005 a MT 4 642±3 043 bc 3 057±1 539 a 5.042±0.191 a 1 243±322 abc 0.926±0.017 b HT 12 860±9 858 a 7 178±4 937 a 5.423±0.221 b 1 926±847 a 0.891±0.027 c GT 6 559±1 695 abc 4 109±826 ab 4.713±1.078 b 1 580±398 ab 0.931±0.017 b ST 5 182±642 abc 3 323±465 ab 4.713±0.684 b 1 198±229 abc 0.908±0.014 bc 说明：数据均为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同样本间差异显著(P＜0.05)。MG. 萌芽期根系；HG. 花期根系；GG. 果期根系；SG. 衰亡期根系；MT. 萌芽期根际土壤；HT. 花期根际土壤；GT. 果期根际土壤；ST. 衰亡期根际土壤。 在同一时期中，萌芽期、花期和衰亡期根际土壤真菌的Alpha多样性指数均高于根系内生真菌，说明在该时期根际土壤真菌多样性和丰富度高于根系内生真菌。果期根系内生真菌ACE指数、Chao指数高于根际土壤真菌，但是根际土壤真菌Shannon指数和Sobs指数高于根系内生真菌。
为了进一步明确无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌和根系内生真菌群落结构的差异，本研究采用主成分分析(PCA)分析其真菌群落的相似性和差异性。PCA结果显示：无距虾脊兰在花期、果期、萌芽期、衰亡期有明显的聚类区分(图5A)，主成分1解释了差异的12.92%，主成分2解释了差异的7.73%。其中在主成分1轴上花期区分较为明显，主成分2轴上果期区分较为明显，萌芽期和衰亡期距离较近，意味着衰亡期和萌芽期根际土壤真菌、根系内生真菌类群相似度高，进一步说明无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌群落在整个生长发育时期存在阶段性差异。由图5B可知：4个时期根系内生真菌相较于根际土壤真菌，距离较近，意味着根际土壤真菌彼此间真菌类群差异较大，其中花期和果期尤为明显。另外，在每个时期中根际土壤与根系之间彼此分开较远，相较于各自内部样品之间两者真菌类群差别较为明显，其中根系样品之间内生真菌类群差别小于根际土壤。
图 5 根际土壤真菌与根系内生真菌群落主成分分析Figure 5 Principal component analysis of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi3. 讨论
本研究表明：无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌优势菌门均为担子菌门和子囊菌门。根际土壤真菌类群与根系内生真菌类群相互重叠存在一定相似性，说明有一部分根系内生真菌来自根际土壤真菌。推测由于根系与根际土壤长期互相接触，彼此真菌类群相互影响[19]，且根系对根际土壤真菌具有一定的选择性等原因造成的[20]。从另一方面来讲，彼此之间也相互独立具有一定差异性，根际土壤真菌群落的丰富度、均匀度以及多样性均高于根系内生真菌。在根际处根系经常与其他根系、土壤微生物互作，从而导致了根际土壤真菌多样性高于根内真菌。
在根系内生真菌中，真菌多样性和丰富度从萌芽期到果期依次递增，并在果期达到顶峰，衰亡期又急剧下降。而根际土壤真菌类群变化情况却与之相差较大，从萌芽期到花期逐渐增加，在花期达到顶峰后逐渐下降，衰亡期与萌芽期真菌多样性和丰富度变化相对平稳。这与吕立新等[21]的观点相吻合，夏季真菌多样性高于春季和秋季，随着季节变化，温度、土壤含水量等环境因子相继发生变化，真菌群落结构也随之发生变化。YOKOYA等[22]在研究兰花时也发现了在雨季分离出的真菌，在旱季不一定出现，而同一类真菌的相对丰度也不尽相同。花期为无距虾脊兰生长初期，此时温度适宜、光线充足，周围伴生植物数量增加，土壤和根际土壤真菌丰富度也相应增加。无距虾脊兰果期为每年的7—9月，此时温度高，周围植物数量相较于花期会有所减少，所以果期根际土壤真菌丰富度少于花期。而根系内生真菌出现上述差异情况可能是从萌芽期到果期，无距虾脊兰生长发育需要大量营养物质持续输入，且夏季温度高，需要增加自身抗逆性，因此根系内生真菌种类和丰富度显著增加并在果期达到顶峰。随着冬季的到来，周围植物逐渐进入休眠期，植被凋落物、土壤微生物的分解等都会使土壤有机质增加，从而促进微生物的生长，造成衰亡期真菌群落丰富度的降低[23]。
兰科植物在自然状态下无法自主萌发，内生真菌通过向兰科植物传输营养物质，从而促进种子萌发和原球茎的分化[24]。李孟凯等[25]用镰孢属菌液处理过的铁皮石斛Dendrobium officinale种子胚膨大，种皮有被假根冲破的迹象。内生真菌对兰科植物的促生作用在生长期也有体现。王亚妮[26]研究发现：接种了内生真菌的铁皮石斛，其鲜质量、移栽成活率相比对照均有所增加；此外，张霞[27]研究表明：接种内生真菌的铁皮石斛，其抗旱性明显增强。由此可见，内生真菌在兰科植物生长发育过程中的作用不可忽视。本研究显示：无距虾脊兰不同时期优势真菌及相对丰度不同，推测兰科植物在相应生长期会选择对自己生长益处最大的真菌共生。有研究表明：在碳的需求方面，果期需求是花期的2倍[28]，而花期的优势真菌不能满足果期对生长素等方面的需求，所以不同时期优势真菌的相对丰度会随之发生变化，也进一步证实了内生真菌极易受周围环境和生长阶段影响[29]。
镰孢属和青霉属是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长。这2种真菌类群在花期和衰亡期属于优势真菌，由此可以推测：镰孢属和青霉属在无距虾脊兰中同样可以促进其生长，并提高其抗病性。庄鑫等[30]研究不同地点朝鲜淫羊藿Epimedium brevicornu生长时期内生真菌表明：蜡壳耳属真菌与淫羊藿中黄酮类化学成分含量成正比，证明蜡壳耳属真菌可以促进植物对磷元素的吸收，促进植物生长，同时增强植株抗灰霉病的能力。被孢霉属真菌被证实在生物分解以及土壤养分转化的过程中发挥重要作用[31]。红菇属曾被认定为菌根真菌，并与多种兰科植物存在共生关系[32]。上述几类真菌均为无距虾脊兰不同时期的优势真菌，但是这几类优势真菌是否与无距虾脊兰菌根真菌存在共生关系，是否对无距虾脊兰生长发育过程中起促进作用，还需采用石蜡切片观察是否在根细胞中形成菌丝结，并结合共生培养视植株的生长状况而定。然而，另外一些公认的菌根真菌，如胶膜菌科Tulasnellaceae在本研究中尚未见到，有研究表明可能与DNA测序区域有关[33]，在后续实验进行高通量测序时可以采取不同的引物。除此之外，可能与植物种类有关，有些真菌广泛存在于多种植物体内，而有些真菌却只与某种特定植物产生共生关系[34]。
4. 结论
本研究表明：在不同生长发育时期，无距虾脊兰真菌群落多样性和丰富度存在较大差异。根际土壤真菌多样性高于根系内生真菌，花期根际土壤真菌多样性最高，果期根系内生真菌最丰富。不同时期优势真菌差别较大，萌芽期根际土壤和根系内生优势真菌分别为被孢霉属、红菇属，花期优势真菌分别为青霉属、粗糙孔菌属，果期分别为Paraboeremia、蜡壳耳属，衰亡期分别为Paraboeremia、镰孢属。
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图 2 核桃JrDHN基因过表达株系阳性鉴定
Figure 2 Positive identification of walnut JrDHN gene overexpression strain
图 4 干旱胁迫下气孔表型及开度分析
Figure 4 Analysis of stomatal phenotype and stomatal opening under drought stress
图 5 干旱处理后核桃苗叶绿体叶及绿素质量分数的变化
Figure 5 Changes of chlorophyll shape and content of walnut after drought treatment
图 6 干旱处理后核桃JrDHN1抗氧化酶活性及丙二醛质量摩尔浓度变化
Figure 6 Changes of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content in walnut JrDHN1 after drought treatment
图 7 干旱处理后核桃JrDHN1 ROS变化
Figure 7 ROS content changes of walnut JrDHN1 after drought treatment
图 8 干旱处理后JrDHN1相关抗逆基因表达量分析
Figure 8 Analysis of JrDHN1-related stress resistance gene expression after drought treatment
表 1 qPCR引物
Table 1. qPCR primers
引物 序列(5′→3′) Actin-F ATGATGTCAAGGTTAAGGACTC Actin-R CACAATGATCTCAGCTCCG QJrDHN-F ATTCAGCTCACCGACGAACA QJrDHN-R CTCCTCATGCTGCTGCTTCT 
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[1] 孟佳, 方晓璞, 史宣明, 等. 我国核桃产业发展现状、问题与建议[J]. 中国油脂, 2023, 48(1): 84 − 86, 103. MENG Jia, FANG Xiaopu, SHI Xuanming, et al. Situation, problems and suggestions on the development of walnut industry in China[J]. China Oils and Fats, 2023, 48(1): 84 − 86, 103. [2] 马庆国, 乐佳兴, 宋晓波, 等. 新中国果树科学研究70年:核桃[J]. 果树学报, 2019, 36(10): 1360 − 1368. MA Qingguo, LE Jiaxing, SONG Xiaobo, et al. Fruit scientific research in New China in the past 70 years: walnut[J]. Journal of Fruit Science, 2019, 36(10): 1360 − 1368. [3] 王磊, 曹亚龙, 孟海军, 等. 国内外核桃品种选育研究进展[J]. 果树学报, 2022, 39(12): 2406 − 2417. WANG Lei, CAO Yalong, MENG Haijun, et al. Research progress in walnut variety breeding at home and abroad[J]. Journal of Fruit Science, 2022, 39(12): 2406 − 2417. [4] 胡梦玲, 彭小东, 阿丽亚·拜都热拉, 等. 城乡特色核桃防护林树种配置结构对空气颗粒物及温湿度的影响[J]. 南方农业学报, 2021, 52(5): 1310 − 1318. HU Mengling, PENG Xiaodong, Aliya Baidourela, et al. Influence of special Juglans regia shelterbelts species configuration structure on air particulate, matter, temperature and humidity in urban and rural areas[J]. Journal of Southern Agriculture, 2021, 52(5): 1310 − 1318. [5] 张翰生, 昌秦湘, 康建忠, 等. 核桃的营养价值及其开发利用研究进展[J]. 浙江农业学报, 2024, 36(4): 905 − 919. ZHANG Hansheng, CHANG Qinxiang, KANG Jianzhong. Research progress on nutritional value and utilization of walnut [J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2024, 36(4): 905 − 919. [6] 何国庆, 俞春, 饶盈, 等. 山核桃果实成熟过程中矿质元素及脂肪酸组分变化[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(6): 1208 − 1216. HE Guoqing, YU Chunlian, RAO Ying, et al. Dynamic changes in composition of mineral elements and fatty acids for hickory nuts (Carya cathayensis) during maturity[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(6): 1208 − 1216. [7] 怀婷婷, 卫伟, 刘春晓, 等. 核桃产业和贸易现状及发展建议[J]. 安徽农业科学, 2023, 51(18): 203 − 208. HUAI Tingting, WEI Wei, LIU Chunxiao, et al. Walnut industry and trade status and development suggestions[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2023, 51(18): 203 − 208. [8] 李剑威, 晏舒蕾, 黄元城, 等. 薄壳山核桃幼苗对干旱胁迫的生理生化响应[J]. 核农学报, 2020, 34(10): 2326 − 2334. LI Jianwei, YAN Shulei, HUANG Yuancheng, et al. Physiological and biochemical responses of pecan seedlings to drought stress[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2020, 34(10): 2326 − 2334. [9] 陈硕, 赵文武, 韩逸. 中国干旱半干旱区植被降水利用效率时空变化特征及影响因素分析[J]. 生态学报, 2023, 43(24): 10295 − 10307. CHEN Shuo, ZHAO Wenwu, HAN Yi. Spatio-temporal variation of vegetation precipitation use efficiency and influencing factors in arid and semi-arid areas of China[J]. Acta Ecologica Sinica, 2023, 43(24): 10295 − 10307. [10] 陈兰兰, 王丽, 吴亚娟, 等. 植物响应干旱胁迫的分子和微生态机制 [J/OL]. 分子植物育种, 2023-04-07 [2024-05-07]. doi: 46.1068.S.20230406.1634.006. CHEN Lanlan, WANG Li, WU Yajuan, et al. Molecular and microecological mechanisms of plant responses to drought stress [J/OL]. Molecular Plant Breeding, 2023-04-07 [2024-05-07]. doi: 46.1068.S.20230406.1634.006. [11] 张林生, 赵文明. LEA蛋白与植物的抗旱性[J]. 植物生理学通讯, 2003(1): 61 − 66. ZHANG Linsheng, ZHAO Wenming. LEA protein functions to tolerance drought of the plant[J]. Plant Physiology Journal, 2003(1): 61 − 66. [12] 刘慧春, 张加强, 马广莹, 等. 牡丹PsDHN1基因克隆及转基因拟南芥的耐涝性分析[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2021, 47(3): 335 − 346. LIU Huichun, ZHANG Jiaqiang, MA Guangying, et al. Cloning of PsDHN1 gene of Paeonia suffruticosa and waterlogging tolerance analysis of transgenic Arabidopsis with PsDHN1 gene[J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences), 2021, 47(3): 335 − 346. [13] 史学英, 田野, 李核, 等. 小麦K_2型脱水蛋白DHN14响应非生物胁迫的功能分析 [J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2019, 47(5): 23 − 31, 41. SHI Xueying, TIAN Ye, LI He, et al. Functional analysis of K2-type wheat dehydrin DHN14 under abiotic stresses [J]. Journal of Northwest A&F University (Natural Science Edition),2019, 47(5): 23 − 31, 41. [14] LIU Yang, LI Daxing, SONG Qiping, et al. The maize late embryogenesis abundant protein ZmDHN13 positively regulates copper tolerance in transgenic yeast and tobacco[J]. Crop Journal, 2019, 7(3): 403 − 410. [15] 张萌, 姜文婷, 王雪纯, 等. 日本落叶松谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)酶学特性与抗逆性研究[J]. 北京林业大学学报, 2019, 7(3): 403 − 410. ZHANG Meng, JIANG Wenting, WANG Xuechun, et al. Studies on enzymatic properties and stress resistance of glutathione peroxidase (GPX) from Larix kaempferi[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 7(3): 403 − 410. [16] 卓露, 林晓华, 薛山, 等. 植物耐干机制研究进展[J]. 华中农业大学学报, 2023, 42(5): 28 − 34. ZHUO Lu, LIN Xiaohua, XUE Shan, et al. Progress on studying mechanism of plant drought tolerance[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2023, 42(5): 28 − 34. [17] MAUREL C, TOURNAIRE-ROUX C, VERDOUCQ L, et al. Hormonal and environmental signaling pathways target membrane water transport[J]. Plant Physiology, 2021, 187(4): 2056 − 2070. [18] FICHMAN Y, MITTLER R. Integration of electric, calcium, reactive oxygen species and hydraulic signals during rapid systemic signaling in plants[J]. The Plant Journal, 2021, 107(1): 7 − 20. [19] RAZA A, SALEHI H, RAHMAN M A, et al. Plant hormones and neurotransmitter interactions mediate antioxidant defenses under induced oxidative stress in plants [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2022 , 9 (13): 872[2024-04-05]. doi: 10.3389/fpls.2022.961872. [20] ZHAO Xiaoping, LIU Hanyu, YONG Hui, et al. Effects of exogenous sucrose on root physiology and transcriptome of Malus baccata Borkh. under sub-low root-zone temperature [J/OL]. Scientia Horticulturae, 2024, 337 : 113474[2024-04-05]. doi: 10.1016/j.scienta.2024.113474. [21] RIYAZUDDIN R, NISHA N, SINGH K, et al. Involvement of dehydrin proteins in mitigating the negative effects of drought stress in plants [J]. Plant Cell Reports, 2022, 41 (3): 519 − 533. [22] YANG Zhou, SHENG Jiangyuan, LÜ Ke, et al. Y2SK2 and SK3 type dehydrins from Agapanthus praecox can improve plant stress tolerance and act as multifunctional protectants[J]. Plant Science, 2019, 284: 143 − 160. [23] GUPTA K, JHA B, AGARWAL P K. A dehydration-responsive element binding (DREB) transcription factor from the succulent halophyte Salicornia brachiata enhances abiotic stress tolerance in transgenic tobacco[J]. Marine Biotechnology, 2014, 16(6): 657 − 673. [24] HUANG Hui, JIAO Yixue, TONG Yang, et al.Comparative analysis of drought-responsive biochemical and transcriptomic mechanisms in two Dendrobium officinale genotypes [J/OL]. Industrial Crops and Products, 2023, 199 : 116766 [2024-04-05]. doi: 10.1016/j.indcrop.2023.116766. [25] 杨舒贻, 陈晓阳, 惠文凯, 等. 逆境胁迫下植物抗氧化酶系统响应研究进展[J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2016, 45(5): 481 − 489. YANG Shuyi, CHEN Xiaoyang, HUI Wenkai, et al. Progress in responses of antioxidant enzyme systems in plant to environmental stresses[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2016, 45(5): 481 − 489. [26] 邬燕, 刘志华, 刘钊. PEG模拟干旱胁迫下4种葡萄生理指标的变化及其抗旱性评价[J]. 分子植物育种, 2020, 18(4): 1319 − 1325. WU Yan, LIU Zhihua, LIU Zhao. Changes of physiological indexes and drought resistance evaluation of 4 grapes variety under PEG simulated drought stress[J]. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(4): 1319 − 1325. [27] 魏广利. 核桃赤霉素2-ODDs家族氧化酶基因的克隆与功能分析[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2021. WEI Guangli. Family Oxidase Gene in Walnut Gene Cloning and Functional Analysis of Gibberellin 2-ODDs [D]. Hangzhou: Zhejiang A&F University, 2021. [28] ADUSE S, NKACHUKWU P, AUNG H, et al. Over-expression of a melon Y3SK2-Type LEA gene confers drought and salt tolerance in transgenic tobacco plants [J/OL]. Plants, 2020, 9 (12): 1749[2024-04-05]. doi: 10.3390/plants9121749. [29] CHIAPPETTA A, MUTO A, BRUNO L, et al. A dehydrin gene isolated from feral olive enhances drought tolerance in Arabidopsis transgenic plants [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2015, 6 : 392[2024-04-05]. doi: 10.3389/fpls.2015.00392. [30] LIU Hao, YANG Ying, LIU Danan, et al. Transcription factor TabHLH49 positively regulates dehydrin WZY2 gene expression and enhances drought stress tolerance in wheat [J/OL]. BMC Plant Biology, 2020, 20 (1): 259[2024-04-05]. doi: 10.1186/s12870-020-02474-5. [31] ZHANG Di, LV Aimin, YANG Tianchen, et al. Protective functions of alternative splicing transcripts (CdDHN4-L and CdDHN4-S) of CdDHN4 from bermudagrass under multiple abiotic stresses [J/OL]. Gene, 2020, 763 (suppl): 100033[2024-04-05]. doi: 10.1016/j.gene.2020.100033. [32] LUO Dingfan, MEI Desheng, WEI Wenliang, et al. Identification and phylogenetic analysis of the R2R3-MYB subfamily in Brassica napus [J/OL]. Plants, 12 (4): 886 [2024-04-05]. doi: 10.3390/plants12040886. [33] RIYAZUDDIN R, NISHA N, SINGH K, et al. Involvement of dehydrin proteins in mitigating the negative effects of drought stress in plants[J]. Plant Cell Reports, 2022, 41(3): 519 − 533. [34] JAMRA G, AGARWAL A, SINGH N, et al. Ectopic expression of finger millet calmodulin confers drought and salinity tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Reports, 2021, 40(11): 2205 − 2223. 期刊类型引用(1)
1. 宋佳佳，王大伟，杨静，史正军，石纯，杨海艳. 竹基氧化纤维薄膜材料的制备及性能研究. 生物质化学工程. 2024(05): 37-44 . 
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